Способ получения плюрипотентных стволовых клеток


 


Владельцы патента RU 2565548:

Журавлёв Дмитрий Андреевич (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения плюрипотентных стволовых клеток, включающий процесс дедифференцировки соматических клеток, культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, и культивирование стволовых клеток в отсутствие указанного агента. При этом процесс дедифференцировки соматических клеток проводят посредством их модификации с помощью факторов перепрограммирования в среде, содержащей ингибитор метилтрансферазы GSK126, а культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, проводят в среде, содержащей белки Вах и Bak. Изобретение позволяет получать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, способные к полному дозреванию и способные дифференцироваться в клетки с низкой вероятностью развития их канцерогенеза, а также увеличение скорости получения плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных клеток, впоследствии полученных из них. 7 з.п. ф-лы, 4 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при искусственном получении и выращивании живых тканей и также при лечении раковых клеток.

Существующие пути перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки (Nature, Volume 465, Number 7299, pp. 665-836, 10.06.2010) сопровождаются рядом недостатков.

Пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в оплодотворенную яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро, является очень сложным процессом и включает в себя стадию клонированных эмбрионов.

Слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками требует уже изначально выделенных плюрипотентных стволовых клеток.

Модификация соматической клетки, индуцирующая ее превращение в стволовую, с помощью: генетического материала, кодирующего белковые репрограммирующие факторы, рекомбинантных белков, микроРНК, синтетической самореплицирующейся полицистронной РНК и низкомолекулярных биологически активных веществ, в большинстве случаев является очень длительным процессом. Полное перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые может занять целый месяц.

Общим недостатком всех известных методов перепрограммирования является то, что формируемые из полученных плюрипотентных стволовых клеток дифференцированные клетки получаются недозрелыми и склонными к образованию злокачественной опухоли, что связано с внезапной активацией в зрелых клетках, из которых выводятся недифференцированные клетки, «стволовых» генов, многие из которых управляют клеточным делением.

Исключением не является также и наиболее эффективный способ перепрограммирования клеток с помощью 4-х факторов Яманаки: Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус (Cell, Volume 126, Issue 4, p. 663-676, 25.08.2006).

Известен способ дифференцирования, преобразующий человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭС) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы, инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401, 11.11.2006).

Основная проблема данного способа заключается в том, что выделение стволовых клеток из эмбриона несовместимо с его дальнейшим развитием.

Известен способ выделения линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека, включающий следующие стадии: выделение человеческих бластоцистов, выделение клеток из внутренней клеточной массы бластоцистов, нанесение внутренней клеточной массы бластоцистов на эмбриональные фибробласты, при котором полученная внутренняя клеточная масса формирует массив клеток, диссоциацию полученного массива в диссоциированные клетки, нанесение диссоциированных клеток на эмбриональные клетки-фидеры, подготовку колонии клеток с плотной морфологической структурой, крупными ядрами и ядрышками, и культивирование клеток приготовленной колонии с получением линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека (US 6200806 B1, C12N 5/073, 13.03.2001).

Многостадийность и сложность данного процесса усугубляется тем, что эмбриональные стволовые клетки человека культивируются в очень специфических условиях, малейшее нарушение которых приводит к отсутствию результата.

Наиболее близким аналогом является способ получения клеток дефинитивной эндодермы, мезодермы, эктодермы или эндодермы, включающий культивирование стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки (деметилирующего агента, ингибитора деацетилазы гистонов или их сочетания) и последующее культивирование стволовых клеток в отсутствие агента с получением таким образом клеток дефинитивной эндодермы, мезодермы, эктодермы или эндодермы. Стволовые клетки могут быть получены посредством дедифференцировки соматических клеток. Деметилирующий агент может представлять собой 5-азацитидин или 5-аза-2′-дезоксицитидин. Ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) может быть выбран из группы, состоящей из: трихостатина А, вориностата (SAHA), белиностата (PXD101), LAQ824/LBH589, трапоксина В, энтиностата (MS-275), CI994, моцетиностата (MGCD0103), фенилбутирата, вальпроевой кислоты, изовалерата, валерата, вальпроата, никотинамида, дигидрокумарина, нафтопиранона и 2-гидроксинафтальдегидов, апицидина, FK228 и натрия бутирата (WO 2010065679 A1, C12N 5/071, 10.06.2010).

Основным недостатком всех описанных способов является большая вероятность возникновения канцерогенеза дифференцированных клеток, что связано с нарушенным процессом клеточного деления и апоптоза.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, способных к полному дозреванию и способных дифференцироваться в клетки с низкой вероятностью развития их канцерогенеза, а также увеличение скорости получения плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных клеток, впоследствии полученных из них.

Технический результат достигается предложенным способом получения плюрипотентных стволовых клеток, включающим процесс дедифференцировки соматических клеток, культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, и культивирование стволовых клеток в отсутствие указанного агента, при этом процесс дедифференцировки соматических клеток проводят посредством их модификации с помощью факторов перепрограммирования в среде, содержащей ингибитор метилтрансферазы GSK126, а культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, проводят в среде, содержащей белки Bax и Bak.

Предпочтительно, чтобы плотность монослоя индуцируемых клеток непосредственно перед процессом дедифференцировки составляла 30-60%. В данном случае предпочтительно, чтобы концентрация ингибитора метилтрансферазы GSK126 в среде составляла 0,8-2 мас.%.

Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно проводить также в присутствии ингибитора пролиферации.

В качестве ингибитора пролиферации предпочтительно использовать по меньшей мере одну пептидную цепь глобина.

Культивирование стволовых клеток предпочтительно проводить в присутствии монооксида азота.

Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно проводить в присутствии по меньшей мере одного ингибитора апоптоза.

В качестве ингибитора апоптоза предпочтительно использовать ингибитор FLIP.

Необходимость введения в среду дедифференцировки соматических клеток ингибитора метилтрансферазы GSK126 объясняется следующим. Наличие метки H3K9me3 препятствует перепрограммированию соматических клеток в индуцированные стволовые, так как мешает посадке белковых репрограммирующих факторов плюрипотенции на гены мишени. В связи с этим модификацию клеток необходимо проводить при высоком содержании маркера репрессии H3K27me3, который исключает работу препятствующего процессу маркера репрессии H3K9me3, а также, помимо всего прочего, способствует сохранению эпигенетической памяти в процессе деления клетки, что позволяет избежать канцерогенных и деструктивных явлений в клетках. Это можно подтвердить тем, что установка маркера H3K27me3 обычно происходит в промежуток клеточного цикла до репликации ДНК.

Кроме того, следует отметить, что триметилирование лизина 27 в гистоне Н3 (H3K27me3) в принципе является необходимым условием перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые, однако присутствие данного маркера в малом количестве не только тормозит процесс перепрограммирования, но и еще чревато дальнейшим образованием в дифференцированных клетках воспалительных процессов.

В связи с вышеописанным во время дедифференцировки соматических клеток возникает необходимость искусственной установки маркера H3K27me3. Это можно осуществить посредством введения в среду дедифференцировки N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамида (ингибитора метилтрансферазы GSK126).

Ингибитор метилтрансферазы GSK126 способствует образованию метилтрансферазы гистонов EZH2, входящей в состав комплекса PRC2 белковой группы policomb. Образовавшаяся субъединица EZH2 в свою очередь осуществляет тройное метилирование гистона Н3 с образованием маркера репрессии H3K27me3.

Согласно иммунофлюрисцентному анализу, большинство колоний индуцированных плюрипотентных клеток, полученных иными способами, отличными от предложенного, дают средней силы сигнал о наличии H3K27me3 в ядрах 40-100% клеток в колонии. В таком случае при наиболее стабильной плотности монослоя индуцируемых клеток в начале процесса дедифференцировки 30-60% для образования необходимого количества метилтрансферазы гистонов EZH2 предпочтительно, чтобы концентрация ингибитора метилтрансферазы GSK126 в среде составляла 0,8-2 мас.%.

Касательно совершенствования последующего культивирования и дифференцировки стволовых клеток следует отметить следующее. Известно, что в организме среднестатистического взрослого человека в результате апоптоза ежедневно погибает порядка 50-70 миллиардов клеток. Для среднестатистического ребенка в возрасте от 8 до 14 лет число клеток, погибших путем апоптоза, составляет порядка 20-30 миллиардов в день. Суммарная масса клеток, которые на протяжении 1 года жизни подвергаются разрушению, эквивалентна массе тела человека. При этом восполнение утраченных клеток обеспечивается за счет пролиферации - увеличения клеточной популяции путем деления.

Наиболее перспективным способом получения плюрипотентных стволовых клеток является модификация соматических клеток, индуцирующая их превращение в стволовые с помощью факторов перепрограммирования - рекомбинантных белков, микроРНК, синтетической самореплицирующейся полицистронной РНК или низкомолекулярных биологически активных веществ.

Одними из известных вышеупомянутых факторов являются факторы Яманаки (Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус).

Также существуют факторы перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, позволяющие преобразовать взрослые клетки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, способные поддерживать свою жизнеспособность на высоком уровне в течение нескольких месяцев. В число указанных соединений входят семь факторов:

- вальпроевая кислота или ингибитор гистондезацетилазы, которая способствует активации генов плюрипотентности и репрессии генов линейной дифференцировки;

- GSK3 - ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3. Ингибирование GSK3 имитирует активацию сигнального пути Wnt, в результате чего β-катенин, избежав деградации, входит в ядро, где активирует синтез ферментативной субъединицы теломеразы;

- Е-616452 - ингибитор трансформирующего ростового фактора бета TGF-[бета], который в ходе перепрограммирования заменяет Sox2, активируя Nanog;

- транилципромин - ингибитор моноаминоксидазы или ингибитор деметилазы, которая избирательно удаляет метальные группы с лизина в положении Лиз4 или Лиз9 гистона Н3. Действуя на хроматин, транилципромин вызывает глобальное увеличение Н3К4 метилирования и, как следствие этого, дерепрессию генов. Ингибиторы деметилазы обладают способностью подавлять избыточную пролиферацию клеток и таким образом подавлять развитие раковых опухолей;

- форсколин - препарат, активирующий аденилатциклазу - фермент, катализирующий превращение АТФ в цАМФ;

- 3-деазанепланоцин - ингибитор гидролазы S-аденозилгомоцистеина, который вызывает разрушение репрессорного комплекса PRC2 и ингибирующее метилирование гистонов;

- PD-0325901 - высокоизбирательный и сильнодействующий синтетический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы МЕК, избирательно фосфорилирующей серин/треонин и остатки тирозина в активационной петле ее субстратов.

Разнообразие существующих методов перепрограммирования позволяет предложенным способом получать стволовые клетки из клеток любой зрелости - как малодифференцированных, так и дефинитивно. Например, известно, что с использованием факторов Яманаки можно дедифференцировать фибробласты любой зрелости (Журнал Nature Cell Biology, 2006 Aug 25, volume 126(4), page 663).

Общая проблема всех известных способов индуцирования стволовых клеток заключается в том, что получаемые из них дифференцированные клетки оказываются недозрелыми и соответствуют примерно второму месяцу развития плода.

У естественных зрелых клеток и полученных лабораторным путем около сотни генов работают по-разному. Половина из них в норме активна только в стволовых клетках, и со временем эти гены прекращают свою деятельность. У дифференцированных же клеток, полученных искусственно, эти гены продолжают работать. Более того, внезапная активация в зрелых клетках «стволовых» генов, многие из которых управляют клеточным делением, чревата возникновением злокачественной опухоли.

Причиной возникновения злокачественных опухолей является нарушение апоптоза и процесса деления клеток. В качестве основной причины данной патологии были рассмотрены соматические мутации гена, кодирующего белок р53. Порядка 50% искусственно трансформированных клеток экспрессируют мутантную форму р53.

Регуляция деления и апоптоза клеток и доведение их "до кондиции" до пересадки в человеческий организм наравне с увеличением количества маркера репрессии H3K27me3 в период дедифференцировки позволят решить проблему "недозревания" и возникновения раковых клеток.

Культивирование полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, позволит сделать эпигенетический статус клеток «подвижным», то есть с помощью механизмов, не затрагивающих последовательности ДНК, обеспечит изменчивость экспрессии генов (фенотипа клетки).

В качестве агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, можно использовать, например, как указано в прототипе, деметилирующий агент, ингибитор деацетилазы гистонов или их сочетание. Ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) может представлять собой трихостатин А, вориностат (SAHA), белиностат (PXD101), LAQ824/LBH589, трапоксин В, энтиностат (MS-275), CI994, моцетиностат (MGCD0103), фенилбутират, вальпроевую кислоту, изовалерат, валерат, вальпроат, никотинамид, дигидрокумарин, нафтопиранон и 2-гидроксинафтальдегид, апицидин, FK228 и натрия бутират. Ингибитор HDAC может представлять собой трихостатин A (TSA). Деметилирующий агент может представлять собой 5-азацитидин или 5-аза-2′-дезоксицитидин. Необходимое количество агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, варьируется в зависимости от его активности, вида и концентрации получаемых клеток в среде культивирования.

Для того чтобы скорость разрушения клеток не превышала скорость поглощения их разрушенного материала соседними клетками, что, в свою очередь, приводит к воспалительным процессам, необходимо урегулировать проницаемость наружной мембраны митохондрий клеток, отвечающую за поглощение и переработку отмершего материала. Существенную роль в повышении проницаемости наружной мембраны митохондрий играют белки Bax и Bak. Они встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются. При этом нарушается целостность внешней мембраны митохондрий.

Функционирование белков Вах и Bak зависит от их предварительной активации, например, белками Bid и Bim, которые относятся к подсемейству ВН3 белков. С другой стороны, активация и функционирование Bax и Bak может блокироваться антиапоптотическими белками семейства Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 и др. В свою очередь, антиапоптотические белки также могут блокироваться белками-депрессорами (например, Bad), относящимися к подсемейству ВН3 белков. В итоге достигается комбинированная регуляция мембранной проницаемости митохондрий и, соответственно, апоптоза за счет взаимодействия апоптотических, антиапоптотических, а также ВН3 белков-активаторов и депрессоров. Регуляция функций ВН3 белков осуществляется на уровне транскрипции, стабильности молекул, при взаимодействии с другими белками и при различных модификациях.

Несмотря на то что на данном этапе невозможно установить все причины нарушения апоптоза, добавление белков bax и bak в среду культивации способно выровнять скорость разрушения и поглощения отмерших клеток за счет регуляции проницаемости наружной мембраны митохондрий. Кроме того, в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, это позволит «вылечить» ген ТР53, нарушенная модификация которого обнаружена в клетках около 50% раковых опухолей.

Данное явление можно объяснить следующим. На наличие и частоту мутаций гена ТР53 существенно влияют факторы окружающей среды, в том числе изменение параметров апоптоза, которое можно спровоцировать белками bax и bak. Повышение активности гена ТР53 в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, может повышать восприимчивость клеток к сигналам входа в апоптоз через опосредованное влияние белка р53 на экспрессию генов bax и bcl2. Такие р53-опосредованные изменения экспрессии генов bax и bcl2 могут изменять соотношение количества белков Вах и Bcl2, тем самым переводя клетку в состояние повышенной чувствительности к апоптозу. Таким образом, помимо химического выравнивания скорости разрушения и поглощения клеток, белки bax и bak через непосредственное влияние на апоптоз способны также оказывать обратное воздействие на ген ТР53, которое заключается в предварительном повреждении гена с его последующей нормальной структуризацией.

Если культивирование стволовых клеток проводить в присутствии монооксида азота, это позволит несложным способом создать стрессовый стимул для гена ТР53, таким образом спровоцировав его дополнительную активацию для последующего лечения.

При этом монооксид азота можно добавлять в атмосферу культивирования как перед стадией культивирования в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клеток, так и перед стадией культивирования в его отсутствии. Функцию создания стрессового стимула для гена ТР53 он будет выполнять в любом случае, а предпочтительное время его действия будет зависеть от вида и количества получаемых клеток.

При этом следует отметить, что вследствие строгого "посттрансляционного контроля активации белка р53", непосредственно сама по себе высокая концентрация белка р53 не ведет к собственной активации и лечению гена ТР53.

Для ускорения "выздоровления" индуцированных плюрипотентных стволовых клеток их культивирование в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, а также культивирование в отсутствие указанного агента предпочтительно проводить в присутствии ингибитора пролиферации.

В качестве ингибитора пролиферации предпочтительно использовать по меньшей мере одну пептидную цепь глобина. Указанный ингибитор не только позволит быстрее "выздоравливать" стволовым клеткам в отношении канцерогенных полиморфизмов генов, но еще экспериментально было установлено, что он способствует регулированию всего цикла развития индуцированных стволовых клеток.

Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно проводить также в присутствии по меньшей мере одного ингибитора апоптоза. За счет белков bak и bax клеточная смерть проходит посредством апоптоза. Указанные белки также способствуют регуляции самого процесса апоптоза, при том как ингибитор апоптоза желателен для контроля его скорости.

В качестве ингибитора апоптоза предпочтительно использовать ингибитор FLIP. Указанное вещество является внутриклеточным ингибитором каспазы-8, блокирующим передачу сигнала апоптоза через рецепторы смерти. Несмотря на то что его роль является противоречивой, так как влияние его сверхэкспрессии на апоптоз неизвестно, при добавлении его в малом количестве он способен откорректировать механизм деления клеток и увеличить скорость переработки их отмирающего материала.

После культивации стволовых клеток следует провести последующую дифференцировку указанных клеток в присутствии по меньшей мере одного фактора роста, некоторые из которых, помимо самой дифференцировки клеток, способны стимулировать также их пролиферацию. В зависимости от того, какие дифференцированные клетки следует получить в конечном итоге, в качестве факторов роста можно использовать различные пептидные или стероидные гормоны.

Примеры осуществления.

Пример 1.

Из фиброцитов кончика хвоста мыши получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого фиброциты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду RPMI-1640 с глутамином. Изначальная плотность монослоя фиброцитов составляла 20%. Через 18,5 часов после рассева плотность монослоя достигла 40%.

По достижении заданной плотности в питательную среду были введены три фактора химического перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

вальпроевая кислота - 0,0001,

хлорид лития - 0,00007,

4-[4-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-5-(2-пиридинил)-1Н-имидазол-2-ил]бензамид(ингибитор SB-431542, чистота 99%) - 0,00009.

Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 0,8 мас.%.

Через 35 часов клетки были пересеяны в питательную среду RPMI-1640 с глутамином, в которую заранее были введены протеин Вах (марки 6А7), протеин Bak (марки (G-23)-G) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого был взят 5-аза-2′-дезоксицитидин, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

протеин Bax (марки 6А7) - 2,5,

протеин Bak (марки (G-23)-G) - 2,5,

5-аза-2′-дезоксицитидин - 0,00005.

В указанную среду в количестве 0,00003 г/л клеточной среды был также добавлен ингибитор пролиферации, представлявший собой композицию из дельта-глобиновой цепи гемоглобина и фармацевтически приемлемого носителя.

В описанных условиях клетки культивировали в течение 7 часов. После этого среда была заменена на питательную среду RPMI-1640 с глутамином. Последующее культивирование проводили уже в отсутствие 5-аза-2′-дезоксицитидина в течение 9 часов в атмосфере, содержащей монооксид азота.

Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен фактор роста нервов - Mouse Nerve Growth Factor (mNGF), в количестве 4 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 32 часов.

Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,04. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было. Данные показатели свидетельствуют о высокой степени созревания клеток и неактивном состоянии «стволовых» генов, работа которых в зрелых клетках чревата возникновением злокачественной опухоли.

40-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.

Пример 2.

Из среднедифференцированных миобластов задней лапы лягушки получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого указанные миобласты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина. Изначальная плотность монослоя миобластов составляла 15%. Через 15,2 часа после рассева плотность монослоя достигла 30%.

По достижении заданной плотности в питательную среду были введены два фактора химического перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

транилципромин (ингибитор моноаминоксидазы) - 0,00008,

PD-0325901 (синтетический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы МЕК) - 0,0001.

Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 0,6 мас.%.

Через 26 часов клетки были пересеяны в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую заранее были введены протеин Вах (марки В-9), протеин Bak (марки Ab-2) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого служила смесь белиностата (PXD101) и 5-азацитидина, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

протеин Bax (марки В-9) - 4,

протеин Bak (марки Ab-2) - 2,

белиностат (PXD101) - 0,00003,

5-азацитидин - 0,00004.

В описанных условиях клетки культивировали в течение 6,5 часов. После этого среда была заменена на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина. Последующее культивирование проводили уже в отсутствие агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, в течение 8 часов (без монооксида азота).

Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен фактор роста нервов - Mouse Nerve Growth Factor (mNGF), в количестве 3,5 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 30 часов.

Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,035. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было.

40-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.

Пример 3.

Из меланоцитов человеческой кожи получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого меланоциты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду RPMI-1640 с аланил-глутамином. Изначальная плотность монослоя меланоцитов составляла 12%. Через 26 часов после рассева плотность монослоя достигла 60%.

По достижении заданной плотности в питательную среду были введены факторы Яманаки (Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус) в количестве 0,00015 г/л клеточной среды.

Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 1,6 мас.%.

Через 37 часов клетки были пересеяны в питательную среду RPMI-1640 с аланил-глутамином, в которую заранее были введены протеин Вах (марки 6А7), протеин Bak (марки (G-23)-G), ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого был взят вальпроат, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

протеин Bax (марки 6А7) - 5,

протеин Bak (марки (G-23)-G) - 4,

FLIP (FLICE-inhibitory protein) - 0,00003,

вальпроат - 0,0002.

В указанную среду в количестве 0,00003 г/л клеточной среды был также добавлен ингибитор пролиферации, представлявший собой композицию из дельта-глобиновой цепи гемоглобина и фармацевтически приемлемого носителя.

В атмосферу клеточного инкубатора был впрыснут монооксид азота.

В описанных условиях клетки культивировали в течение 9,5 часов. После этого среда была заменена на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein) в количестве 0,00002 г/л клеточной среды.

Последующее культивирование проводили уже в отсутствие вальпроата в течение 10 часов в атмосфере, по-прежнему содержащей монооксид азота.

Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду RPMI-1640 с аланил-глутамином, в которую был добавлен фактор роста гепатоцитов (HGF) в количестве 6 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 40 часов.

Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,04. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было.

50-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.

Пример 4.

Из хондроцитов задней лапы крысы получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого хондроциты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина. Изначальная плотность монослоя хондроцитов составляла 25%. Через 30 часов после рассева плотность монослоя достигла 67%.

По достижении заданной плотности в питательную среду были введены три фактора химического перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

GSK3 (ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3) - 0,00002,

транилципромин 0,0001,

3-деазанепланоцин 0,00001.

Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 2 мас.%.

Через 33 часа клетки были пересеяны в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую заранее были введены протеин Вах (марки 2D2), протеин Bak (марки Fl-211), ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein), ингибитор апоптоза Bcl-w (марки G-21) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого была взята смесь Е-616452 (ингибитора трансформирующего ростового фактора бета TGF-[бета]) и вальпроата, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:

протеин Bax (марки 2D2) - 2,5,

протеин Bak (марки (G-21) - 5,

FLIP (FLICE-inhibitory protein) - 0,00001,

Bcl-w (марки G-21) - 0,00002,

Е-616452 (ингибитор трансформирующего ростового фактора бета TGF-[бета]) - 0,00008,

вальпроат - 0,00015.

В атмосферу клеточного инкубатора был впрыснут монооксид азота.

В описанных условиях клетки культивировали в течение 7 часов. После этого среда была заменена на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую были добавлены ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein) в количестве 0,00001 г/л объема клеточной среды и ингибитор апоптоза Bcl-w (марки G-21) в количестве 0,00002 г/л объема клеточной среды.

Последующее культивирование проводили уже в отсутствие Е-616452 и вальпроата в течение 10 часов в атмосфере, по-прежнему содержащей монооксид азота.

Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен фактор роста фибробластов 19 (FGF19) в количестве 10 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 36 часов.

Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,037. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было.

40-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.

Таким образом, предложенный способ позволяет за относительно короткий промежуток времени получить зрелые дифференцированные клетки, не склонные к образованию злокачественной опухоли.

Предложенный способ может найти применение в биоинженерии при получении и культивировании стволовых клеток и преобразования их в дифференцированные клетки, в частности при печати и выращивании искусственных живых тканей и органов.

В завершение можно отметить, что дальнейшее изучение вопроса перепрограммирования и дифференцировки клеток сделает возможным улучшение качества всего человека - начиная с его здоровья и заканчивая его личностью. Человек полностью состоит из клеток, жизненный цикл каждой из которых определяется ее потентностью и факторами роста, и, следовательно, жизненный цикл и развитие характеристик каждого человека также зависят от этих же условий.

1. Способ получения плюрипотентных стволовых клеток, включающий процесс дедифференцировки соматических клеток, культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, и культивирование стволовых клеток в отсутствие указанного агента, отличающийся тем, что процесс дедифференцировки соматических клеток проводят посредством их модификации с помощью факторов перепрограммирования в среде, содержащей ингибитор метилтрансферазы GSK126, а культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, проводят в среде, содержащей белки Вах и Bak.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что плотность монослоя индуцируемых клеток непосредственно перед процессом дедифференцировки составляет 30-60%.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что концентрация ингибитора метилтрансферазы GSK126 в среде составляет 0,8-2 мас.%.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток проводят также в присутствии ингибитора пролиферации.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве ингибитора пролиферации используют по меньшей мере одну пептидную цепь глобина.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование стволовых клеток проводят в присутствии монооксида азота.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток проводят в присутствии по меньшей мере одного ингибитора апоптоза.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что в качестве ингибитора апоптоза используют ингибитор FLIP.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимулированных дендритных клеток (ДК), и может быть использовано в медицине для иммунотерапии рака.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения дезинфицированного препарата клеток из ткани млекопитающего.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения композиций, содержащих стволовые плацентарные клетки. Способ включает: (a) получение адгезивных плацентарных клеток в растворе, включающем от 2% до 10% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, (b) фильтрацию полученного раствора через 70 мкм - 100 мкм фильтр; (c) разбавление указанных клеток до содержания не более 10±3·106 клеток на миллилитр раствором, включающим от 2% до 5% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, и (d) криоконсервацию раствора, содержащего клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1-клеток, направленных против коллагена типа II, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеток и их применению для получения полипептидов. Способ получения рекомбинантного посттрансляционно модифицированного полипептида предусматривает стадию продукции.

Изобретения относятся к области клеточной биологии, фармакологии и медицины. Описан способ культивирования стволовых клеток, исключающий их спонтанную дифференцировку.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен выделенный пептид, представляющий собой фрагмент белка CDC45L и обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты в форме комплекса с молекулой HLA-A*2402 или HLA-A*0201.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к изолированной амниотической адгезивной клетке человека, к популяции и композиции, которые содержат такие клетки, а также к способам получения таких клеток и способам использования этих клеток в лечении индивидуумов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен In vitro способ получения нейральных стволовых клеток (НСК), включающий получение соматических клеток, выбранных из группы фибробластов, кератиноцитов или адипоцитов, и репрограммирование указанных соматических клеток в НСК с помощью введения в указанные соматические клетки по меньшей мере двух генов, Bmi1 и Sox2; и культивирования указанных соматических клеток в питательной среде, содержащей ростовые факторы, выбранные из группы FGF2, EGF и BDNF и малой молекулы ингибитора ROCK.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ введения целевых молекул в клетки.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения дезинфицированного препарата клеток из ткани млекопитающего.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеток и их применению для получения полипептидов. Способ получения рекомбинантного посттрансляционно модифицированного полипептида предусматривает стадию продукции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к изолированной амниотической адгезивной клетке человека, к популяции и композиции, которые содержат такие клетки, а также к способам получения таких клеток и способам использования этих клеток в лечении индивидуумов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток, в частности суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток фиброзированных легких в фибробластные клетки, характеризующийся тем, что из правой доли фиброзированных легких выделяют клетки с фенотипом мезенхимальных стволовых клеток (CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45-), способные самообновляться in vitro в течение 60 дней, затем при добавлении в культуру мезенхимальных стволовых клеток фактора роста фибробластов 2 мкг/мл получают фибробластные клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ дифференцировки популяции полипотентных стволовых клеток, полученных из установленных линий полипотентных стволовых клеток, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выращенную прикрепленной к субстрату клетку из плаценты. Данная клетка культивирована в трехмерных (3D) условиях культивирования, которые обеспечивают возможность размножения клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им.

Изобретение относится к области клеточной биологии, клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани в тканях и органах включает выделение стромальных клеток жировой ткани, культивирование выделенных клеток в присутствии фактора некроза опухолей-альфа в количествах 5 или 100 нг/мл в течение 24-72 часов с последующим трансплантированием в ткани или органы.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточным технологиям и тканевой хирургии. Способ получения культуры гладкомышечных клеток заключается в том, что вырезают фрагмент кровеносного сосуда, измельчают его на кусочки до размеров не более 2 мм в любом измерении и инкубируют кусочки в культуральном флаконе с предварительно нанесенными на дно флакона царапинами, содержащем среду для культивирования, содержащую 10% эмбриональной фетальной сыворотки, в течение по меньшей мере 10 дней, но не более 24 дней, при температуре 37°С в условиях СО2-инкубатора, отличающийся тем, что упомянутым фрагментом кровеносного сосуда является фрагмент восходящего отдела грудной аорты, вырезаемый в ходе процедуры аортокоронарного шунтирования, а упомянутые кусочки фрагмента восходящего отдела грудной аорты перед инкубированием выдерживают в среде для культивирования, содержащей 0,1% коллагеназы, в течение по меньшей мере 30 минут, но не более 60 минут, при температуре 37°С, после чего промывают средой для культивирования клеток.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ выделения ганглиозида GM1 предусматривает получение тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1; выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1; экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры, который может быть использован для лечения болезни Паркинсона и других неврологических заболеваний. Получение ганглиозида данным способом позволяет избежать возникновения прионных заболеваний при его дальнейшем использовании. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 4 пр.
Наверх