Способ получения препарата интерлейкина-2, препарат интерлейкина-2 и фармацевтический иммуномодулирующий препарат


 

C07K1/14 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2565553:

Общество с ограниченной ответственностью "Стратегия" (RU)

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способу получения препарата интерлейкина-2, препарату интерлейкина-2, полученному указанным способом, и фармацевтическому препарату, содержащему указанный препарат интерлейкина-2. Культивируют штамм Saccharomyces cerevisiae - продуцент интерлейкина-2 в питательной среде в течение от 36 до 50 часов при аэрации от 0,2 до 0,8 литра воздуха в минуту на 100 литров среды. Получают осадок дрожжевых клеток центрифугированием или фильтрованием. Механически разрушают клетки в течение от 15 минут до 40 минут. Очищают осадок от примесных дрожжевых липидов и белков промывкой н-бутанолом. Экстрагируют целевой белок и проводят его хроматографическую очистку. Изобретения позволяют получать препарат интерлейкина-2 с высокими показателями чистоты, выхода и удельной активности и применять его в фармацевтических иммуномодулирующих композициях. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области медицины и фармакологии, касается получения иммуномодулирующих лекарственных средств биотехнологическими методами. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения препарата интерлейкина-2, который может быть использован для лечения заболеваний различной этиологии, сопровождающихся проявлениями вторичного иммунодефицита, в том числе, инфекционно-воспалительных, септических и онкологических заболеваний.

Предшествующий уровень техники

История открытия интерлейкина-2 (ИЛ-2) начинается с 1960-х годов, когда многочисленные исследования in vitro показали, что активированные лимфоциты выделяют медиатор, стимулирующий множество иммунных реакций in vitro и in vivo. Лишь в 1976 году этот медиатор идентифицировали как T-клеточный ростовой фактор, получивший в 1979 году название "интерлейкин-2". Разработанные технологии получения его в культуре активированных лимфоцитов человека и очистки позволили получить первые препараты ИЛ-2 для исследовательских и клинических целей. Эти препараты получили название "лимфоцитарный" или "натуральный" ИЛ-2. Однако эти препараты, содержащие компоненты крови человека, относятся к потенциально опасным. Кроме того, возможности масштабирования такого производства ограничены, что препятствовало его широкому использованию до 1983 года, когда были разработаны технологии получения рекомбинантных белков, в частности, ИЛ-2, с использованием генной инженерии и биотехнологии.

Известны также генно-инженерные способы получения ИЛ-2. Многочисленные фирмы (Cetus Corp., Amgen, Inc., Hoffman-La Roche, Inc.) использовали методы генной инженерии и биотехнологии для получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве лекарственного препарата для лечения разных типов онкологических заболеваний.

В одном из способов получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве продуцента используют E.coli (кишечную палочку). Кишечная палочка представляет собой условно-патогенную флору. Поэтому препараты ИЛ-2 из E.coli требуют тщательной очистки и могут быть токсичными. Дрожжевые клетки являются более привлекательными продуцентами гетерологичного ИЛ-2.

Известен (ЕР 0162898 A1, опубликован 04.12.1985) способ получения препарата ИЛ-2 с использованием дрожжевого продуцента. В этом способе ИЛ-2 секретируется в культуральную среду и затем должен быть выделен из культуральной среды с помощью хроматографии, фильтрации, экстракции и т.п. Недостатком указанного способа является то, что секретируемые дрожжами белки гликозилируются, то есть в их структуре в процессе секреции появляются дрожжевые углеводные остатки. Такие гликопротеины являются сильно иммуногенными для человека, что создает проблемы при дальнейшем применении их в терапии, например, накопление у человека антител к таким гликозилированным белкам.

Известен (RU 2304586, дата приоритета 27.03.2006, опубликован 20.08.2007) способ получения препарата ИЛ-2, который предусматривает разрушение клеток дрожжевого продуцента ИЛ-2, получение осадка разрушенных дрожжевых клеток, очистку осадка от водорастворимых и липидных составляющих, высушивание осадка с добавлением сухого додецилсульфата натрия. Для активации ИЛ-2 и приобретения биологической активности к такому препарату добавляют воду. Указанный способ получения препарата ИЛ-2 не предусматривает проведение экстракции ИЛ-2 из раствора. Препарат, полученный таким способом, характеризуется более низким содержанием ИЛ-2 (50% экстрагируемого ИЛ-2 и 50% экстрагируемых дрожжевых белков) и значительным количеством водонерастворимых компонентов разрушенных клеток.

Известен (ЕР 0152358, опубликован 21.08.1985) способ получения препарата ИЛ-2, при котором разрушают клетки дрожжевой культуры, в которой был осуществлен синтез ИЛ-2, получают осадок разрушенных дрожжевых клеток посредством центрифугирования, обрабатывают осадок раствором додецилсульфата натрия, для того, чтобы перевести ИЛ-2 в жидкую фазу, и экстрагируют ИЛ-2 из жидкой фазы. В данном способе экстракцию ИЛ-2 из жидкой фазы проводят без предварительной очистки осадка разрушенных дрожжевых клеток. Препарат ИЛ-2 получают с низким выходом и низкой чистотой целевого продукта (ИЛ-2).

Также известен (WO 87/00056, опубликован 15.01.1987) способ получения гидрофобных рекомбинантных белков, таких как, например, ИЛ-2, при котором осуществляют стадии разрушения клеток продуцентов, отделение осадка разрушенных дрожжевых клеток посредством центрифугирования, солюбилизации белка путем обработки раствором додецилсульфата натрия и последующей экстракции целевого белка. Препарат белка получают с низким выходом и низкой степенью чистоты. Для увеличения активности белка его окисляют с последующей дополнительной хроматографической очисткой для повышения чистоты препарата белка.

Таким образом, до сих пор остается потребность в простом способе получения препарата ИЛ-2, который обеспечивает высокий выход и чистоту целевого продукта, а также его высокую биологическую активность.

Краткое описание изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в разработке высокоэффективного технологичного способа получения препарата ИЛ-2, который характеризуется высокими показателями выхода целевого белка (ИЛ-2), его биологической активности и чистоты препарата.

Данная задача решается тем, что предложен способ получения препарата интерлейкина-2, включающий культивирование штамма дрожжей-продуцента интерлейкина-2 в питательной среде в течение 36-50 часов при аэрации от 0,2 до 0,8 литров воздуха в минуту на 100 литров среды, получение осадка дрожжевых клеток, механическое разрушение клеток с обеспечением сохранности целевого белка в течение от 15 минут до 40 минут, очистку осадка от примесных дрожжевых липидов и белков и экстракцию целевого продукта (ИЛ-2).

Совокупность указанных параметров при осуществлении способа по изобретению неожиданно обеспечивает высокий уровень выхода, чистоты и биологической активности целевого белка (ИЛ-2).

Настоящее изобретение также относится к препарату интерлейкина-2, который получают вышеуказанным способом. При использовании способа по изобретению получают препарат ИЛ-2 с высокими показателями чистоты, выхода и биологической активности целевого белка (ИЛ-2).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему препарат ИЛ-2, получаемый способом по изобретению.

Подробное описание изобретения

На современном этапе развития биотехнологии и генной инженерии наиболее распространенным дрожжевым продуцентом является Saccharomyces cerevisiae. Технология получения рекомбинантных плазмид, содержащих ген ИЛ-2, в частности, человеческого ИЛ-2, хорошо известна. Также хорошо известны технологии получения штаммов дрожжей, содержащих такие рекомбинантные плазмиды.

В частности, примером дрожжевого продуцента человеческого ИЛ-2, который можно использовать в способе по изобретению, является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791 (РФ, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) (патент SU №1770359). Этот штамм является продуцентом человеческого ИЛ-2. Конструкция вектора экспрессии, введенного в штамм дрожжей, такова, что клетки не секретируют целевой белок. Может быть использован также любой другой штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирующий гетерологичный ИЛ-2.

Для получения культуры штамма дрожжей, продуцирующего ИЛ-2, можно использовать культуральные среды на основе общеизвестных и широко используемых, которые можно модифицировать в соответствии с генотипом культивируемого штамма. Такие составы сред известны и находятся в пределах компетенции специалиста.

Так, в частности, для штамма Y-791 можно использовать минимальную питательную среду 1 (М1) и минимальную питательную среду 2 (М2). Культуру штамма Y-791 сначала выращивают в среде M1 для получения свежей культуры штамма, а затем эту культуру инокулируют в среду M2.

Состав питательной среды M1

Компонент среды Количество на 1 л
Гистидин-HCl 0,07 г
(NH4)2SO4 5,0 г
MgSO4×7H2O 1,02 г
NaCl 0,1 г
CaCl2×2H2O 0,2 г
KH2PO4 1,5 г
Глюкоза 20 г
H3BO3 0,5 мг
CuSO4×5H2O 0,063 мг
KI 0,1 мг
FeCl3×6H2O 0,335 мг
MnSO4 0,4 мг
NaMoO4×2H2O 0,25 мг
ZnSO4×7H2O 0,72 мг
Биотин 0,025 мг
Кальция пантотенат 2,5 мг
Фолиевая кислота 0,0025 мг
Инозит 12,5 мг
Никотиновая кислота 5 мг
П-аминобензойная кислота 0,25 мг
Пиридоксина гидрохлорид 0,625 мг
Рибофлавин 0,25 мг
Тиамина гидрохлорид 0,625 мг

Состав питательной среды М2

Компонент среды Количество на 1 л
Гистидин-HCl×H2O 0,07 г
(NH4)2-цитрат 7,6 г
MgSO4×7H2O 1,02 г
NaCl 0,1 г
CaCl2×2H2O 0,2 г
KCl 1,5 г
KH2PO4 0,007 г
Глюкоза 20 г
H3BO3 0,5 мг
CuSO4×5H2O 0,063 мг
KI 0,1 мг
FeCl3×GH2O 0,335 мг
MnSO4 0,4 мг
NaMoO4×2H2O 0,25 мг
ZnSO4×7H2O 0,72 мг
Биотин 0,025 мг
Кальция пантотенат 2,5 мг
Фолиевая кислота 0,025 мг
Инозит 12,5 мг
Никотиновая кислота 5,0 мг
П-аминобензойная кислота 0,25 мг
Пиридоксина гидрохлорид 0,625 мг
Рибофлавин 0,25 мг
Тиамина гидрохлорид 0,625 мг

Условия культивирования, такие как, например, температура и скорость вращения мешалки, также являются хорошо известными и обычно используемыми для получения культуры соответствующих штаммов дрожжей. Например, можно использовать температуру от 25°C до 34°C, предпочтительно от 28°C до 32°C, наиболее предпочтительно 30°. Скорость вращения мешалки может составлять от 100 до 400 об/мин, предпочтительно, 200 об/мин.

Синтез ИЛ-2 может быть конститутивным или требовать индукции или дерепрессии, что определяется генетической конструкцией, содержащейся в штамме-продуценте.

В общем, с учетом особенностей выбранного штамма-продуцента специалист способен подобрать среду и указанные выше общеизвестные условия культивирования штамма, которые приведут к получению культуры дрожжевых клеток, в которых синтезирован ИЛ-2.

В способе по изобретению культивирование штамма-продуцента ИЛ-2 необходимо проводить в течение от примерно 36 часов до примерно 50 часов, что означает любой промежуток времени, входящий в данный интервал (например, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 часов ровно или примерно). При этом уровень аэрации культуры должен составлять от примерно 0,2 до примерно 0,8 литров воздуха в минуту на 100 литров среды, что означает 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 и 0,8 литров воздуха в минуту на 100 литров среды. Такие условия культивирования (время и скорость аэрации культуры) неожиданно позволяют получить культуру дрожжей, из которой значительно легче получить препарат ИЛ-2 с высоким выходом, чистотой и высокой биологической активностью, что, помимо прочего, обусловлено снижением количества образующихся нежелательных сопутствующих дрожжевых белков.

Значение оптической плотности OD600 получаемой суспензии клеток дрожжей зависит, прежде всего, от конкретного используемого штамма. Для штамма Y-791 в среде М1 OD600 может составлять от 2,0 до 4,5, предпочтительно от 2,5 до 4,0, наиболее предпочтительно 3,0, а в среде М2 - от 6,0 до 10,0, предпочтительно от 4,0 до 9,0, наиболее предпочтительно 8,0. При культивировании штамма Y-791 получают, как правило, от 8 до 14 г клеток из 1 л питательной среды.

По окончании культивирования клетки отделяют от культуральной среды с помощью, например, центрифугирования или фильтрования, что является общеизвестными операциями при работе с культурами дрожжей. Так получают осадок дрожжевых клеток.

Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают. Полученную биомассу можно использовать сразу или подвергнуть заморозке для хранения с целью в дальнейшем использовать в способе по изобретению.

Разрушение дрожжевых клеток осуществляют любыми известными способами, представляющими собой механическое разрушение, в частности, с использованием высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками. Примером высокоскоростного измельчителя является дезинтегратор Dyno-Mill.

Механическое разрушение дрожжевых клеток проводят в течение от 6 до 40 минут, предпочтительно от 10 до 30 минут, более предпочтительно от 15 до 25 минут, более предпочтительно от 20 до 25 минут, наиболее предпочтительно 25 минут. Это время, используемое в способе по изобретению, позволяет эффективно разрушить дрожжевые клетки штамма-продуцента ИЛ-2 и обеспечить эффективный выход белка.

Разрушение предпочтительно проводить при температурах от 2 до 10°C, более предпочтительно от 3 до 8°C, более предпочтительно от 4 до 6°C, наиболее предпочтительно при 4°C; скорости вращения шнэка от 2000 до 6000 об/мин, предпочтительно от 3000 до 5000 об/мин, наиболее предпочтительно при 3000 об/мин. Размер используемых для механического разрушения стеклянных шариков может варьировать, например, от 0,4 до 0,6 мм.

Возможно, но необязательно, для обеспечения сохранности целевого белка добавлять к суспензии разрушаемых клеток ингибиторы протеаз. В качестве ингибитора дрожжевых протеаз традиционно используется фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), этилен-диамин-тетраацетат (ЭДТА), однако может быть использован любой другой ингибитор или смесь ингибиторов протеаз. Достаточно использовать ФМСФ в концентрации 1-3 мМ и ЭДТА в концентрации 2 мМ, однако может быть использовано иное подходящее количество ингибитора протеаз.

Очистку осадка и экстракцию ИЛ-2 из полученной суспензии проводят с помощью любых из общеизвестных способов (см., например, "Новое в клонировании ДНК. Методы" // под ред. Гловера Д., Москва, "Мир", 1989). Например, используют центрифугирование и отмывку, обработку додецилсульфатом натрия для перевода ИЛ-2 в жидкую фазу с последующей хроматографической очисткой обращено-фазовой ВЭЖХ и/или гель-фильтрацией.

Очистку от примесных дрожжевых липидов и белков начинают с центрифугирования суспензии, полученной после механического разрушения дрожжевых клеток, которое можно осуществлять при пониженных температурах, например, от 2 до 8°C, предпочтительно от 3 до 6°C, наиболее предпочтительно при 4°C, и скорости вращения ротора от 4000 до 12000 об/мин, предпочтительно от 6000 до 11000 об/мин, более предпочтительно от 8000 до 10000 об/мин. Осадок разрушенных клеток дрожжей освобождают от сопутствующих дрожжевых белков и липидов путем промывания его буферным раствором и н-бутанолом.

Из промытого осадка клеток ИЛ-2 переводят в жидкую фазу с помощью обработки указанного осадка раствором, содержащим додецилсульфат натрия в концентрации от 1 до 5 масс.%, предпочтительно от 2 до 3 масс.%, наиболее предпочтительно 2 масс.%. Раствор, содержащий солюбилизированный ИЛ-2, подвергают гель-фильтрации, в результате чего получают препарат ИЛ-2.

Согласно изобретению также предлагается препарат ИЛ-2, полученный вышеописанным способом в любом из его возможных вариантов.

Оценку биологической активности полученного препарата ИЛ-2 можно провести в международном стандартном тесте с культурой ИЛ-2-зависимых опухолеспецифических цитотоксических T-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Hammeriing U. et al. "Development and validation bioassay for interleukin-2" // J. Pharmaceut. & Biochem. Analysis, - 1992. - vol.10. - p.547. Gearing A.J.H. and Thorpe R. "The international standard for human interleukin-2. Calibration by international collaborative study" // J.Immunol. Methods. - 1984. - vol.74. - p.39). Биологически активный рекомбинантный ИЛ-2 должен стимулировать пролиферацию этих клеток. Определение биологической активности проводят с использованием колориметрического метода с тетразолиевым красителем MTT. Жизнеспособные клетки, стимулированные ИЛ-2, поглощают краситель и накапливают в цитоплазме нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана (восстановленный MTT). После удаления культуральной среды и полного растворения кристаллов в диметилсульфоксиде измеряют оптическую плотность полученного раствора на компьютеризованном фотометре при длине волны 530 и 690 нм. Темно-синее окрашивание раствора в пробах, содержащих ИЛ-2, должно быть зависимым от концентрации ИЛ-2, внесенного в культуральную среду. Сравнивая оптическую плотность пробы и стандарта активности ИЛ-2, определяют биологическую активность ИЛ-2 в инкубационной пробе.

Количество ИЛ-2 можно определить любым стандартным способом определения целевого белка, например методом электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli U. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". // Nature. - 1970. - 227. - p.680-685) или с применением иммуноферментного анализа (Gehman L.O. and Robb R.J. "An ELISA-based assay for quantitation of human interleukin-2." // J. Immunol. Methods. - 1984. - vol.74. - p.39), и др.

Полученный указанным способом препарат ИЛ-2 используется для включения в фармацевтические препараты, обладающие иммуномодулирующей активностью и предназначенные для лечения заболеваний различной этиологии, сопровождающихся проявлениями вторичного иммунодефицита, которые применяются для внутривенного и подкожного введения, а также в виде форм для перорального, ректального и/или вагинального введения: желатиновые капсулы (твердые и мягкие), суппозитории (с липофильной, или гидрофильной, или липофильно-гидрофильной основой), а также ректальные пипетки (ректиолы). Данные фармацевтические препараты также пригодны для лечения тяжелых состояний у млекопитающих, таких как онкологические, инфекционные и гнойно-воспалительные заболевания.

Вводимый с этими препаратами в организм ИЛ-2 обеспечивает адекватную и целенаправленную медикаментозную коррекцию иммунных дисфункций, восполняет дефицит эндогенных регуляторных молекул и полностью воспроизводит их эффекты. Высокая иммунокорригирующая эффективность, прогнозируемость и селективность действия препаратов на основе ИЛ-2 обусловлены наличием на клетках специфических рецепторов, и существованием природных механизмов его элиминации. Фармацевтические препараты на основе ИЛ-2 являются мощными средствами патогенетической иммуноориентированной терапии и обладают как прямым замещающим действием, так и оказывают различные индуктивные эффекты.

Помимо полученного способом по изобретению препарата интерлейкина-2 в качестве активного компонента, фармацевтический препарат содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как, в частности, стабилизатор, солюбилизатор, антиоксидантный агент, буфер, носитель, позволяющие реализовать его в требуемых лекарственных формах, которые конкретно известны для таких препаратов (например, RU 2140283).

Получение фармацевтических препаратов, содержащих ИЛ-2, хорошо известно в уровне техники (см. RU 2140283).

Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают данное изобретение.

Примеры

Пример 1. Получение препарата ИЛ-2 (по изобретению)

1.1. Получение биомассы дрожжевого штамма-продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2)

Вносят клетки штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-791, хранящиеся при -70°C в глицерине, в среду M1 таким образом, чтобы соотношение массы клеток к объему среды M1 приблизительно составило 0,6 г к 1 литру. Проводят культивирование в среде M1 и переносят полученный инокулят в десятикратно больший объем среды M2. Культивирование в среде М2 проводят при температуре 30°C, скорости вращения мешалки 200 об/мин при уровне аэрации из расчета 0,2 литра воздуха в минуту на 100 литров среды, в течение 36 часов.

По окончании культивирования в среде M2 клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием и получают 12 г клеток из 1 л питательной среды.

1.2. Разрушение клеток дрожжевого штамма-продуцента ИЛ-2

Из полученной биомассы готовят 50%-ную суспензию клеток в 5 мМ Трис-HCl буферном растворе с добавлением 2 мМ ЭДТА и 2 мМ ФМСФ, рН 7,2 (раствор А). Далее проводят механическое разрушение дрожжевых клеток при помощи стеклянных шариков размером от 0,4 до 0,6 мм в высокоскоростном дезинтеграторе Dyno Mill при температуре от 4°C и скорости вращения шнэка от 3000 об/мин в течение 16 минут. Суспензию разрушенных клеток собирают и центрифугируют.

1.3. Очистка и экстракция целевого белка

Суспензию, полученную на стадии 1.2, центрифугируют при температуре +4°C и скорости 10000 об/мин. Осадок многократно промывают для удаления дрожжевых белков раствором А, а для удаления липидов - н-бутанолом. После обработки осадка н-бутанолом проводят последнюю промывку осадка вышеуказанным раствором А.

Из обработанного осадка экстрагируют ИЛ-2 буфером, имеющим следующий состав: 0,1 М гидрокарбонат аммония, 2% додецилсульфат натрия, 2 мМ меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ФМСФ, рН 8,0 (раствор Б). Полученный экстракт наносят на колонку с Сефакрилом S-300, уравновешенную раствором Б. Проводят гель-фильтрацию и собирают белковые фракции, в которых измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм, и получают профиль элюции. Качество фракций с ИЛ-2 оценивают при помощи электрофореза в денатурирующих условиях, сравнивая со стандартным белком ИЛ-2. На основании полученных результатов делают вывод об отборе наиболее чистых белковых фракций, содержащих ИЛ-2. Объединяют фракции, содержащие ИЛ-2 с минимальным количеством примесных белков. Для иммуномодулирующих лекарственных средств из непатогенных источников минимальное количество примесных белков не должно превышать 5%. Определяют чистоту и количество ИЛ-2 в объединенном элюате при помощи электрофореза в денатурирующих условиях, а также биологическую активность тестом на культуре клеток CTLL-2.

Получают препарат с биологической активностью 1,3 млн. МЕ/мг и чистотой ИЛ-2 95%. Выход препарата составляет 78%.

Пример 2 (по изобретению)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время культивирования составляет 50 часов. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 61%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 95% и биологической активностью 1,2 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 80%.

Пример 3 (по изобретению)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что аэрация составляет 0,8 литра воздуха в минуту на 100 л среды. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 60%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 95% и биологической активностью 1,2 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 79%.

Пример 4 (по изобретению)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время разрушения дрожжевых клеток составляет 40 минут. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 59%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 95% и биологической активностью 1,1 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 60%.

Пример 5 (по изобретению)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время культивирования составляет 43 часа, аэрация составляет 0,4 литра воздуха в минуту на 100 л среды, время разрушения дрожжевых клеток составляет 25 минут. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 66%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 96,5% и биологической активностью 1,5 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 85%.

Пример 6 (сравнительный)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время культивирования составляет 30 часов. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 60%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 80% и биологической активностью 0,95 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 40%.

Пример 7 (сравнительный)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время культивирования составляет 60 часов. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 60%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 85% и биологической активностью 0,9 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 60%.

Пример 8 (сравнительный)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что аэрация составляет 0,1 литра воздуха в минуту на 100 л среды. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 61%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 80% и биологической активностью 0,95 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 61%.

Пример 9 (сравнительный)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что аэрация составляет 0,9 литров воздуха в минуту на 100 л среды. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 58%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 78% и биологической активностью 0,9 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 50%.

Пример 10 (сравнительный)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время разрушения дрожжевых клеток составляет 4 минуты. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 35%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 80% и биологической активностью 0,95 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 40%.

Пример 11 (сравнительный)

Осуществляют получение препарата ИЛ-2 согласно Примеру 1, за исключением того, что время разрушения дрожжевых клеток составляет 50 минут. Получают экстракт с содержанием ИЛ-2 34%. Из этого экстракта получают препарат ИЛ-2. Полученный препарат характеризуется чистотой ИЛ-2 75% и биологической активностью 0,8 млн. МЕ/мг. Выход препарата составляет 35%.

Пример 12. Получение препарата ИЛ-2 (по изобретению)

12.1. Получение биомассы дрожжевого штамма-продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2)

Вносят клетки штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-3079, хранящиеся при -70°C в глицерине, в среду М1, в которой вместо гистидина внесены лизин 30 мг/л и аргинин 30 мг/л. Соотношение массы клеток к объему среды М1 приблизительно должно составить 0,6 г к 1 литру. Проводят культивирование в указанной среде и переносят полученный инокулят в десятикратно больший объем среды М2, в которой вместо гистидина внесены лизин 30 мг/л и аргинин 30 мг/л. Культивирование в этой среде проводят при температуре 30°C, скорости вращения мешалки 200 об/мин при уровне аэрации из расчета 0,2 литра воздуха в минуту на 100 литров среды, в течение 36 часов.

По окончании культивирования клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием и получают 11 г клеток из 1 л питательной среды.

12.2. Разрушение клеток дрожжевого штамма-продуцента ИЛ-2

Из полученной биомассы готовят 50%-ную суспензию клеток в 5 мМ Трис-HCl буферном растворе с добавлением 2 мМ ЭДТА и 2 мМ ФМСФ, pH 7,2 (раствор А). Далее проводят механическое разрушение дрожжевых клеток при помощи стеклянных шариков размером от 0,4 до 0,6 мм в высокоскоростном дезинтеграторе Dyno Mill при температуре от 4°C и скорости вращения шнэка от 3000 об/мин в течение 16 минут. Суспензию разрушенных клеток собирают и центрифугируют.

2.3. Очистка и экстракция целевого белка

Суспензию, полученную на стадии 12.2, центрифугируют при температуре +4°C и скорости 10000 об/мин. Осадок многократно промывают для удаления дрожжевых белков раствором А, а для удаления липидов - н-бутанолом. После обработки осадка н-бутанолом проводят последнюю промывку осадка вышеуказанным раствором А.

Из обработанного осадка экстрагируют ИЛ-2 буфером, имеющим следующий состав: 0,1 М гидрокарбонат аммония, 2% додецилсульфат натрия, 2 мМ меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ФМСФ, pH 8,0 (раствор Б). Концентрация ИЛ-2 в полученном экстракте составляет 60%. Полученный экстракт наносят на колонку с Сефакрилом S-300, уравновешенную раствором Б. Проводят гель-фильтрацию и собирают белковые фракции, в которых измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм, и получают профиль элюции. Качество фракций с ИЛ-2 оценивают при помощи электрофореза в денатурирующих условиях, сравнивая со стандартным белком ИЛ-2. На основании полученных результатов делают вывод об отборе наиболее чистых белковых фракций, содержащих ИЛ-2. Объединяют фракции, содержащие ИЛ-2 с минимальным количеством примесных белков. Для иммуномодулирующих лекарственных средств из непатогенных источников минимальное количество

примесных белков не должно превышать 5%. Определяют чистоту и количество ИЛ-2 в объединенном элюате при помощи электрофореза в денатурирующих условиях, а также биологическую активность тестом на культуре клеток CTLL-2.

Получают препарат с биологической активностью 1,0 млн. МЕ/мг и чистотой ИЛ-2 95%. Выход препарата составляет 78%.

Таким образом, способ получения препарата ИЛ-2 по изобретению позволяет получить эффективный препарат ИЛ-2 с оптимальным сочетанием параметров чистоты, количества и биологической активности.

1. Способ получения препарата интерлейкина-2, включающий культивирование штамма Saccharomyces cerevisiae - продуцента интерлейкина-2 в питательной среде в течение от 36 до 50 часов при аэрации от 0,2 до 0,8 литра воздуха в минуту на 100 литров среды, получение осадка дрожжевых клеток, механическое разрушение клеток в течение от 15 минут до 40 минут, очистку осадка от примесных дрожжевых липидов и белков, включающую промывку н-бутанолом, экстракцию целевого белка и хроматографическую очистку экстракта.

2. Способ по п.1, где дрожжевым продуцентом человеческого интерлейкина-2 является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791.

3. Способ по п.1, где культивирование штамма дрожжей-продуцента интерлейкина-2 в питательной среде проводят в течение 43 часов.

4. Способ по п.1, где культивирование проводят при аэрации 0,4 литра воздуха в минуту на 100 литров среды.

5. Способ по п.1, где механическое разрушение клеток проводят в течение 25 минут.

6. Способ по п.1, где осадок дрожжевых клеток получают центрифугированием или фильтрованием.

7. Способ по п.1, где клетки разрушают в присутствии ингибиторов дрожжевых протеаз.

8. Способ по п.1, где механическое разрушение клеток выполняют с помощью высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками.

9. Препарат интерлейкина-2, полученный способом по любому из пп.1-8.

10. Фармацевтический иммуномодулирующий препарат, содержащий препарат интерлейкина-2 по п.9 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

11. Фармацевтический препарат по п.10, выполненный в форме суппозитория.

12. Фармацевтический препарат по п.10, выполненный в форме ректиолы.

13. Фармацевтический препарат по п.10, выполненный в форме капсулы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биопрепарат для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов. Штамм Тrichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 является продуцентом мембраноактивных антибиотиков-пептаиболов, обладающих антигрибковой и антибактериальной активностью.

Предложены штамм Lactobacillus plantarum DSM 23755, штамм Lactobacillus plantarum DSM 23756, штамм Lactobacillus fermentum DSM 23757 и штамм Lactobacillus fermentum DSM 23758, используемые для приготовления продукта на основе ферментированной сои, включающего изофлавон-агликоны, эквол и луназин.

Способ получения по существу чистого гепаросана из E.coli K5 предусматривает культивирование клеток E.coli K5 в среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, осуществление связывания гепаросана с твердофазным носителем с последующим элюированием и осаждение гепаросана из элюата.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Exiguobacterium sp.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения белка Bgl2p - гомолога антигена-маркера возбудителей микозов человека и животных.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2102/Забайкальский/2010.
Изобретение относится к области микробиологии. Вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю объектов. Способ культивирования листериозного микроба предусматривает приготовление питательной среды, содержащей маточный раствор сока листового салата, агар и фосфатный буфер в заданном соотношении.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения хитин-глюканового комплекса и полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения белка Bgl2p - гомолога антигена-маркера возбудителей микозов человека и животных.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой гибридный белок на основе мутантной рекомбинантной L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes с пониженной глутаминазной активностью и повышенной устойчивостью к действию трипсина, слитой с N-концевой аминокислотной последовательностью гепарин-связывающего пептида.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Конструируют плазмиду для экспрессии в клетках СНО рекомбинантного ФСГ человека, включающую область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональные элементы гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, последовательность Козак; открытые рамки считывания альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека с блоками стоп-кодонов; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса EMCV; открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе трицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным вакцинам против Candida albicans, и может быть использовано в медицине. Вакцина для лечения или предупреждения кандидозной инфекции содержит выделенный полипептид с SEQ ID NO: 2 в эффективном количестве, который может быть слит с партнером слияния.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана лиофилизированная лекарственная форма гликопротеина дезоксирибонуклеазы I человека для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты, отличающаяся тем, что указанный гликопротеин представляет собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека с аминокислотной последовательностью, представленной в описании, получаемую в микроорганизме Е.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к интернализации терапевтических молекул внутрь клетки, и может быть использовано в медицине. Получают композицию для доставки молекул нуклеиновых кислот в клетки, содержащую по меньшей мере один пептид с по меньшей мере 92% идентичностью к GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); или YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), присоединенный к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу разделения лактоферринов человека и козы. Способ включает иммуноафинную хроматографию с использованием мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4, аминокислотные последовательности которых представлены как SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.

Представленные изобретения касаются модифицированного белка, нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок, вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, и носителя для связывания биотина, на котором иммобилизован такой белок.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения хитин-глюканового комплекса и полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу.
Наверх