Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата



Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата
Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата
Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата
Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата

 


Владельцы патента RU 2565819:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский федеральный университет" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата. Способ включает культивирование штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой воде с глюкозой. В начале процесса ферментации используют лимитирующие концентрации соединений серы, также добавляют субстрат-предшественник - гексаноат калия, при концентрации 1 г/л и ингибитор реакций цикла бета-окисления - акрилат, при концентрации 0,5-1,0 г/л дробно 2-3-кратно в течение 1,5-2,5 ч. Общая продолжительность процесса не менее 45 ч. Преимуществом изобретения является высокий выход сополимера, снижение степени кристалличности сополимера и повышение эластичности сополимера. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способам получения биоразрушаемых высокомолекулярных биополимеров на основе гидроксиалкановых кислот (полигидроксиалканоатов, ПГА), в частности, сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот (3-гидроксибутират и 3-гидроксигексаноат, П3ГБ/3ГГ).

ПГА относятся к классу природных полимеров, синтезируемых микроорганизмами. Эти полимеры термопластичны, характеризуются высокой биологической совместимостью и разрушаемостью в биологических средах. Среди них - различные материалы, от высококристалличных термопластов до конструкционных эластомеров, что определяется химическим строением мономеров, образующих эти полимеры. Потенциально сферы применения ПГА широки и включают медицину, фармакологию, сельское и коммунальное хозяйство, радиоэлектронику. Особо перспективны ПГА для конструирования изделий и устройств медико-биологического назначения, включая возможность получение нетканых и одноразовых изделий, шовных и перевязочных материалов, элементов для восстановительной хирургии и трансплантологии [Plastics from bacteria. Natural functions and applications / Eds.: G.-Q. Chen, A. Steinbüchel. - Springer. - 2010. Sudesh, K. Practical Guide to Microbial Polyhydroxyalkanoates. "Smitthes" (UK), 2010. Volova, Shishatskaya, Sinskey. Degradable Polymers: Production, Properties and Applications. - Nova Sci. Publ. Inc. USA - 2013].

Базовые физико-химические свойства сополимерных ПГА, в т.ч. степень кристалличности и температурные характеристики, определяют условия переработки полимеров и характеристики получаемых изделий.

Известны процессы синтеза сополимеров на различных субстратах (сахарах, органических и жирных кислотах), которые служат основным источником углерода. В состав сред для синтеза сополимеров П(3ГБ/3ГГ) необходимо внесение дополнительного углеродного субстрата в виде гексановой кислоты или ее солей в качестве субстрата-предшественника, необходимого для образования мономеров 3-гидроксигексаноата.

Известны аналогичные способы получения сополимеров П(3ГБ/3ГГ), образованных коротко- и среднецепочечными мономерами, природным штаммом R. eutrophus В5786 [Волова Т.Г. Беляева О.Г., Гительзон И.И., и др. Синтез и исследование гетерополимерных полигидроксиалканоатов хемолитотрофными бактериями. - ДАН. 1996. - Т. 347. - С. 256-258; Волова Т.Г., Калачева Г.С., Плотников В.Ф. Биосинтез сополимерных полгидрокисалканоатов хемолитотрофными бактериями. - Микробиология. - 1998. - Т. 67. - С. 420-424]. П(3ГБ/3ГГ) синтезируют в культуре природного штамма R. eutrophus В5786 при автотрофном росте на CO2 с добавками гексаноата с содержанием мономеров 3ГГ до 10-16 мол.%.

Недостаток указанного способа получения сополимера П(3ГБ/3ГГ) - низкое содержание мономеров 3ГГ, что обусловливает достаточно высокие значения степени кристалличности образцов и их низкую эластичность.

Прототипом изобретения является способ получения сополимеров П(3ГБ/3ГГ) культуре природного штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, обладающего повышенной устойчивостью к субстратам-предшественникам ряда мономеров на среде, содержащей основной углеродный ростовой субстрат, а также добавку углеродного субстрата-предшественника - гексаноата калия, и добавку ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, при лимите азота [Патент РФ №2439143 «Штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - продуцент полигидроксиалканоатов и способ их получения», опубл. 10.01.2012 г.]. Способ представляет собой синтез сополимерных трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами 3-гидроксибутирата 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата, при котором фактором, стимулирующим синтез ПГА, является лимитирующая подача азота. Полученные характеристики сополимеров: содержание мономеров 3ГГ от 0,2 до 56 мол.%; невысокий общий выход сополимера П(3ГБ/3ГГ) - 18-37%, степень кристалличности образцов сополимеров - от 30 до 41%.

Недостаток прототипа - низкий общий выход сополимеров П(3ГБ/3ГГ), невысокое содержание в сополимере мономеров 3ГГ и достаточно высокие значения степени кристалличности.

Задача изобретения - повышение общего выхода сополимера, повышение содержания в составе сополимера мономера 3-гидроксигексаноата (3ГГ).

Задача решается тем, что в способе получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, включающем культивирование штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей глюкозу, при введении в культуру субстрата-предшественника - гексаноата калия, и ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, согласно изобретению,гексаноат калия при текущей концентрации 1 г/л и акрилат при концентрации 0,5-1,0 г/л вводят в культуру штамма продуцента дробно 2-3-кратно в течение 1,5-2,5 ч на первом этапе ферментации при общей продолжительности процесса не менее 45 ч. Кроме того, на первом этапе процесса ферментации в составе жидкой солевой среды используют лимитирующие концентрации соединений серы, при отсутствии серы в среде на втором этапе. В качестве соединения серы используют сульфат магния в концентрации не выше 0,1 г/л.

Способ осуществляют следующим образом. Процесс культивирования ведут в два этапа. На первом этапе получают биомассу бактерий. Используют штамм Cupriavidus eutrophus (депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), коллекционный номер ВКПМ В-10646). Штамм-продуцент выращивают в периодическом режиме на среде Шлегеля при избытке углеродного субстрата (глюкоза) на полной минеральной среде с лимитированным содержанием серы. На первом этапе процесса ферментации постепенно, в течение 1,5-2,5 ч в культуру дробно, например 2-3 раза, вносят углеродный субстрат-предшественник - гексаноат калия, в концентрации 1 г/л и ингибитор реакций цикла бета-окисления - акрилат, в концентрации 0,5-1,0 г/л. На втором этапе продолжают процесс при тех же условиях, но в среде, не содержащей источника серы. Общая продолжительность процесса синтеза сополимера П(3ГБ/3ГГ) составляет 45 ч. Полимер выделяют, концентрируют, очищают, сушат. Регистрируют физико-химические характеристики с применением рентгеноструктурного анализа, дифференциального термического анализа и жидкостной хроматографии. Получают биоразрушаемые изделия, например пленки для раневых покрытий, одним из известных способов.

Техническим результатом изобретения является увеличение выхода сополимера П(3ГБ/3ГГ) свыше 50% от веса сухого вещества клеток, с содержанием мономеров 3ГГ более 50 мол.%, со степенью кристалличности сополимера не более 30-40% и повышенной эластичностью, показателем которой служит величина удлинения образца пленки при разрыве. Указанный результат обусловлен дробным 2-3-кратным постепенным (в течение 1,5-2,5 ч) введением в культуру субстрата-предшественника - гексаноата калия, при концентрации 1 г/л и ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, 0,5-1,0 г/л на первом этапе при общей продолжительности процесса не менее 45 ч. В качестве фактора, стимулирующего и максимизирующего накопление сополимера в клетках, используется сера, что обеспечивает повышение общего выхода сополимера.

Использование штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в качестве продуцента, варьирование концентрации основного и дополнительного углеродных субстратов и лимитирующего рост бактерий элемента (серы), а также дозированный режим подачи субстрата-предшественника и акрилата позволяет получать с высокими выходами сополимер П(3ГБ/3ГГ), образованный мономерами 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, характеризующийся стабильными показателями молекулярной массы и термических характеристик, существенным снижением степени кристалличности на фоне возрастания эластичности пленки.

Получение сополимеров 3ГБ/3ГГ с использованием природного штамма Cupriavidus eutrophus В-10646 и их свойства иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Синтезируют П(3ГБ/3ГГ). Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, хранящуюся на агаризованной среде при 5°C, суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 20 г/л, Na2HPO4·H2O - 9.1, KH2PO4 - 1.5; MgSO4·H2O - 0.2, Fe3C6 Η5O7·7H2O - 0.25, CO(NH2)2 - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H3BO3 - 0.228, СоСе2×6H2O - 0.030, CuSO4×5H2O - 0.008, MnCe2×4H2O - 0.008, ZnSO4×7H2O - 0.176, NaMoO4×2H2O - 0.050, NiCe2 - 0.008 (г/л) и раствор железа лимоннокислого 5 г/л из расчета 5 мл раствора на 1 л среды. Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.5 с использованием термостатируемого шейкера-инкубатора «Incubator Shaker Innova® серии 44» «New Brunswick Scientific)) (США). Культивирование проводят в течение 15-18 ч при 30°C и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в периодическом режиме синтеза полимеров в двустадийной культуре, при котором на первом этапе синтез полимеров стимулируется лимирующей концентрацией серы, которую подают в виде сульфата магния MgSO4 в концентрации не выше 0.1 г/л, в отличие от прототипа, в котором синтез полимера стимулируется дефицитом азота; на втором - в среде, не содержащей источника серы. Коэффициент заполнения стеклянных колб объемом 1-2 л составляет от 0,3 до 0,5. Выращивание бактерий проводят при 30°C и pH 7.0 при текущей концентрации глюкозы в культуре не менее 5 г/л. Через 15 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру дважды в течение 2 ч подают гексаноат калия в концентрации 1 г/л и акрилат в концентрации 1,0 г/л. Продолжают культивирование еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи сульфата магния культивирование продолжают 20 ч при подаче в культуру раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре не менее 5 г/л) и азота (50-100 мг/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 45 ч. Выделение полимера из биомассы проводят известным способом в среде дихлорметана. Полученный экстракт концентрируют на роторном испарителе Rotavapor R-210, осаждают изопропанолом. Процедуру перерастворения и осаждения проводят многократно - не менее 3-х раз. Полимер сушат при комнатной температуре в боксе-ламинаре.

Физико-химические свойства П(3ГБ/3ГГ) исследованы с применением рентгеноструктурного анализа, дифференциального термического анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Относительное разрывное удлинение образцов измеряют, например, с использованием универсальной испытательной машины Instron 5565, 5KN (Instron, Великобритания) при комнатной температуре. Базовая (начальная) длина образцов - от 20,0 до 50,0 мм; скорость растяжения 3 мм/мин. Результаты представлены в таблице 1.

Выход сополимера 58,0%; содержание 3-гидроксигексаноата 68,0 мол. %. Степень кристалличности 21%. Удлинение образца пленки при разрыве составило 477%.

Пример 2. Способ синтеза П(ЗГБ/3ГГ) аналогичен способу, указанному в примере 1. В качестве основного источника углерода используют глюкозу, которую вместе с источником азота подают в культуру в заданных концентрациях. На первом этапе лимитирующий элемент - сера; на втором подачу сульфата магния прекращают. Через 15 ч от начала культивирования с помощью насоса дозатора в культуру трижды в течение 1,5 ч подают гексаноат калия в концентрации 1 г/л и акрилат в концентрации 0,5 г/л. Продолжают культивирование в течение 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи сульфата магния культивирование продолжают 20 ч при подаче в культуру раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре не менее 5 г/л) и азота (50-100 мг/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 45 ч. Выделение полимера из биомассы и исследование образцов проводят аналогично примеру 1. Выход сополимера 64,3%, содержание 3-гидроксигексаноата 65,7 мол. %. Степень кристалличности 30%. Удлинение образца пленки при разрыве составило 290%. Результаты представлены в таблице 1.

Примечание: Тпл.°C - температура плавления; Тдегр.°C - температура термической деградации, Сх, % - степень кристалличности; Мв - средневесовая молекулярная масса, кДа; D - полидисперсность.

На фиг. 1 представлены структурная формула и 1H-ЯМР спектр сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот П(3ГБ/3ГГ) с содержанием мономеров 3ГГ 58,0 мол.%.

Фиг. 2 - представлена ионная хроматограмма сополимера П(3ГБ/3ГГ). Время удерживания 9,489 мин соответствует β-ОН-бутирату; 11,548 мин - β-ОН-гексаноату.

Фиг. 3. Масс-спектры мономеров 3-гидроксимасляной (3 ГБ) (а) и 3-гидроксигексановой (3ГГ) (б) кислот, входящих в состав сополимера П(3ГБ/3ГГ).

1. Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, включающий культивирование штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивание на жидкой солевой среде, содержащий глюкозу, при введении в культуру субстрата-предшественника - гексаноата калия, и ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, отличающийся тем, что на первом этапе процесса ферментации в составе жидкой солевой среды используют лимитирующие концентрации соединений серы, а гексаноат калия при концентрации 1 г/л и акрилат при концентрации 0,5-1,0 г/л вводят дробно 2-3-кратно в течение 1,5-2,5 ч при общей продолжительности процесса не менее 45 ч и отсутствии серы в среде на втором этапе.

2. Способ получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата по п. 1, отличающийся тем, что в качестве соединения серы используют сульфат магния в концентрации не выше 0,1 г/л.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения сополимера 3-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата и 4-гидроксибутирата.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения лизогликолипида, способ биоконверсии гликолипидов и способ получения пищевого продукта.

Изобретения относятся к биотехнологии. Предложены подпитываемые способы продуцирования высокомолекулярных полигидроксиалканоатов (PHA) в биомассе (варианты).

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ получения метакриловой кислоты или сложных эфиров метакриловой кислоты. .
Изобретение относится к способу получения сложных эфиров жирных кислот из жиров и может быть использовано при производстве жидкого топлива. .
Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения сополимера - 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот. .

Изобретение относится к порошкообразному препарату липазы, предназначенному для трансэтерификации. .
Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма-продуцента полимеров гидроксиалкановых кислот (ПГА) и способа их получения. .

Изобретение относится к способу получения сложных эфиров (мет)акриловой кислоты (F) на основе спиртов, имеющих, по меньшей мере, одну углерод-углеродную тройную связь, характеризующемуся тем, что, по меньшей мере, один спирт, имеющий, по меньшей мере, одну углерод-углеродную тройную связь, формулы (1) где R1 означает водород, алкил, имеющий от 1 до 18 атомов углерода; алкил, имеющий от 2 до 18 атомов углерода, арил, имеющий от 6 до 12 атомов углерода, циклоалкил, имеющий от 5 до 12 атомов углерода, прерванные, при необходимости, одним или несколькими атомами кислорода и/или серы и/или одним или несколькими замещенными или незамещенными иминогруппами, или пятичленный-шестичленный гетероцикл, имеющий атомы кислорода, азота и/или серы, при этом названные остатки могут быть замещены соответственно арилом, алкилом, арилокси, алкилокси, гетероатомами и/или гетероциклами, и R2 означает алкилен, имеющий от 1 до 20 атомов углерода, циклоалкилен, имеющий от 5 до 12 атомов углерода, арилен, имеющий от 6 до 12 атомов углерода, или алкилен, имеющий от 2 до 20 атомов углерода, прерванный одним или несколькими атомами кислорода и/или серы, и/или одной или несколькими замещенными или незамещенными иминогруппами, и/или одной или несколькими группами циклоалкила, -(СО)-, -O(CO)O-, -(NH)(CO)O-, -O(CO)(NH)-, -O(CO)- или -(CO)О-, при этом названные остатки могут быть замещены соответственно арилом, алкилом, арилокси, алкилокси, гетероатомами и/или гетероциклами, n означает целое число от 0 до 3, предпочтительно от 0 до 2 и особенно предпочтительно от 1 до 2 и Xi для каждого i=0 до n независимо друг от друга можно выбрать из группы -CH 2-СН2-O-, -CH2-CH(CH3)-O-, -CH(CH3)-CH2-O-, -CH2 -C(CH3)2-O-, -C(CH3)2 -CH2-O-, -CH2-CHVin-O-, -CHVin-CH2 -O-,-CH2-CHPh-O- и -CHPh-CH2 -O-, предпочтительно из группы -CH2-CH2 -O-,-CH2-CH(CH3)-O- и -CH(CH3)-CH2-O-, и особенно предпочтительно -CH2-CH2-O-, где Ph означает фенил и Vin означает винил, причем гидроксигруппы спирта являются первичными или вторичными, этерифицируют в присутствии, по меньшей мере, одного фермента (Е) с (мет)акриловой кислотой или переэтерифицируют с, по меньшей мере, одним сложным эфиром (мет)акриловой кислоты (D).
Изобретение относится к усовершенствованным способам получения сложных алкиловых эфиров, которые могут быть использованы в качестве дизельного топлива, реакцией переэтерификации или этерификации.

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к экологической биотехнологии, микробиологии. Предложен консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения сополимера 3-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата и 4-гидроксибутирата.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения биомассы активированных автохтонных микроорганизмов-деструкторов N-фосфонометилглицина (глифосата).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биопрепарат для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера.

Предложены штамм Lactobacillus plantarum DSM 23755, штамм Lactobacillus plantarum DSM 23756, штамм Lactobacillus fermentum DSM 23757 и штамм Lactobacillus fermentum DSM 23758, используемые для приготовления продукта на основе ферментированной сои, включающего изофлавон-агликоны, эквол и луназин.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает культивирование штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 в статических условиях на послеспиртовой зерновой барде с последующим получением гель-пленки бактериальной целлюлозы.

Способ получения по существу чистого гепаросана из E.coli K5 предусматривает культивирование клеток E.coli K5 в среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, осуществление связывания гепаросана с твердофазным носителем с последующим элюированием и осаждение гепаросана из элюата.

Группа изобретений относится к способу скрининга и выделения клеток Bacillus subtilis, к композиции кормовой добавки к кормовому продукту для животного, содержащей указанные клетки, и способу кормления животного.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Exiguobacterium sp.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы Lactobacillus plantarum CECT 7484, Lactobacillus plantarum CECT 7485 и Pediococcus acidilactici CECT 7483, проявляющие противовоспалительную активность, иммуномодулирующую активность, активность в отношении IBS или активность в отношении вздутия живота.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложенный штамм Stenotrophomonas maltophilia депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером В-7520. Данный штамм может быть использован для получения антигена для определения антител к Stenotrophomonas maltophilia в биологических средах. 4 табл., 6 пр.
Наверх