Способ очистки пегилированного эритропоэтина



Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина
Способ очистки пегилированного эритропоэтина

 


Владельцы патента RU 2566267:

Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки белка, содержащего эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, от побочных продуктов реакции или от исходного материала, не вступившего в реакцию, с помощью катионообменной хроматографии. Используется хроматографический материал SP Sephacryl S 500 HR, уравновешенный раствором с электропроводностью 21 мСм/см и элюция линейным градиентом. Изобретение обеспечивает очистку белка за одну стадию с высокими чистотой и выходом. 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 табл., 4 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу очистки пегилированного эритропоэтина с помощью способа элюции линейным градиентом с использованием колонки SP Sephacryl S 500 HR.

Предшествующий уровень техники

Белки играют важную роль в современной медицине. Каждый белок, который используется в терапевтических целях для лечения человека, должен отвечать определенным критериям. Чтобы обеспечить безопасность биофармацевтических агентов для человека, все побочные продукты, которые накапливаются во время производственного процесса, должны быть тщательным образом удалены. Для выполнения нормативных требований за производственным процессом должны следовать один или более этапов очистки. Среди других критериев, важную роль в определении подходящего процесса очистки играет чистота, производительность и выход.

Конъюгаты терапевтических белков были описаны, например, для полиэтиленгликоля (ПЭГ) и интерлейкина-6 (ЕР 0442724), для ПЭГ и эритропоэтина (WO 01/02017), для химерных молекул, включая эндостатин и иммуноглобулины (US 2005/008649), для секретируемых антител на основе гибридных белков (US 2002/147311), для гибридных полипептидов, включая альбумин (US 2005/0100991; сывороточный альбумин человека US 5,876,969), для пегилированных полипептидов (US 2005/0114037), и для гибридных соединений эритропоэтина.

Necina, R., et al. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) описали получение моноклональных антител человека непосредственно из супернатантов клеточных культур с помощью ионообменного сорбента, обладающего большой плотностью заряда. В заявке WO 89/05157 описан способ очистки иммуноглобулинов, при котором культуральная среда напрямую подвергается катионообменной обработке. Одноступенчатый способ очистки моноклональных антител IgG из мышиных асцитов описан в работе Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988) 79-88. Способ очистки полипептидов с помощью ионообменной хроматографии описан в заявке WO 2004/024866, в котором для разделения целевого полипептида и одной или более примесей используют градиентную промывку. В заявке ЕР 0530447 описан процесс очистки моноклональных антител IgG с помощью комбинации трех этапов хроматографии. Быстрая очистка монопегилированного антагониста рецептора интерлейкина-1 описана в работе Yu, G., et al., Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977. В работе Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218; описана очистка белка hTFF3, который экспрессируется в E.coli, с помощью двухступенчатой катионообменной хроматографии. Очистка пегилированного rhG-CSF с помощью двух последовательных этапов ионообменной хроматографии описана в работе Yun, Q., et al. (Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74).

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении описан способ очистки конъюгата белка, содержащего эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, от побочных продуктов реакции или исходного материла, не вступившего в реакцию, с помощью метода катионообменной хроматографии. Было обнаружено, что использование катионообменного хроматографического материала SP Sephacryl S 500 HR, a также элюции линейным градиентом, который создают в колонке с помощью буферного раствора с определенной электропроводностью, позволяет получить с высокой степенью чистоты и высоким выходом заранее конъюгированный белок, содержащий эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля.

Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является способ получения гибридного белка, содержащего эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, который включает следующие стадии:

a) уравновешивание хроматографической колонки, содержащей хроматографический материал SP Sephacryl S 500 MR, раствором с электропроводностью около 21 мСм/см,

b) нанесение на колонку по п. а) раствора, содержащего смесь свободного эритропоэтина, а также гибридных белков эритропоэтина и полиэтиленгликоля, содержащих один или более остаток полиэтиленгликоля на одну молекулу эритропоэтина,

c) промывка колонки раствором с электропроводностью около 21 мСм/см, в ходе которой с колонки удаляются гибридные белки, содержащие два или более остатков полиэтиленгликоля,

d) пропускание через колонку раствора с непрерывно и линейно возрастающей электропроводностью, максимальное значение которой равно по меньшей мере 60 мСм/см, в результате чего с колонки высвобождается в индивидуальном виде гибридный белок, содержащий эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, и свободный эритропоэтин, при этом гибридный белок, содержащий эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, выходит в первую очередь.

В одном из вариантов реализации раствором с электропроводностью около 21 мСм/см является раствор, значение рН которого варьирует от 2.5 до 3.5. В другом варианте реализации раствором с электропроводностью около 21 мСм/см является фосфатный буферный раствор, значение рН которого варьирует от 2.5 до 3.5.

В одном из вариантов реализации раствор, используемый на этапе d), имеет рН, значение которого составляет 2.5-3.5. В другом варианте реализации у раствора с непрерывно и линейно возрастающей электропроводностью максимальное значение электропроводности составляет около 70.0 мСм/см.

В одном из вариантов реализации раствором с непрерывно и линейно возрастающей электропроводностью является раствор с непрерывно и линейно возрастающей концентрацией хлорида натрия.

В одном из вариантов реализации эритропоэтин представляет собой эритропоэтин человека. В другом варианте реализации эритропоэтин человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:01 или SEQ ID NO:02.

В одном из вариантов реализации один остаток полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу от 20 кДа до 40 kDa.

В одном из вариантов реализации раствор, состоящий из смеси свободного эритропоэтина и гибридных белков эритропоэтина и полиэтиленгликоля, содержащих один или более остаток полиэтиленгликоля на одну молекулу эритропоэтина, наносят на хроматографический материал таким образом, чтобы на 1 мл хроматографического материала приходилось от 1 мг до 4 мг гибридного белка.

Описание изобретения

В настоящем изобретении описан способ очистки белка, содержащего одну молекулу эритропоэтина и один остаток полиэтиленгликоля, с помощью способа градиентной элюции, при этом градиент представляет собой линейный градиент электропроводности, создаваемой в хроматографической колонке SP Sephacryl S 500 HR, которую уравновешивают раствором с определенной электропроводностью перед нанесением раствора, содержащего белок.

Обычные хроматографические способы и их применение широко известны специалистам в данной области техники. См., например, Heftmann, E., (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z., (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag (1982); Sambrook, J., et al., (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); or Ausubel, F.M., et at., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1994).

Термин "нанесение на" обозначает промежуточный этап (стадию) способа очистки, при котором раствор приводится в контакт с хроматографическим материалом. Этот термин описывает два случая: а) раствор добавляют в хроматографический прибор, в котором содержится хроматографический материал, или b) хроматографический материал добавляют в раствор. В случае а) раствор пропускают через прибор, при этом происходит взаимодействие между хроматографическим материалом и веществами, содержащимися в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, рН, электропроводность, концентрация соли, температура, и/или скорость потока, некоторые соединения раствора связываются с хроматографическим материалом и, таким образом, могут быть удалены с хроматографического материала на последующем этапе. Вещества, перешедшие в раствор, можно обнаружить элюате. "Элюат" обозначает раствор, полученный после прохождения прибора, который может быть раствором нанесения или буферным раствором, который используют для промывки колонки или для элюции соединений, связанных с хроматографическим материалом. В одном из вариантов реализации прибором является колонка или кассета. В случае b) хроматографический материал может быть добавлен, например, в виде твердого вещества, в раствор, например, содержащий целевое соединение, которое необходимо очистить, для того, чтобы привести во взаимодействие хроматографический материал и вещество в растворе. После взаимодействия хроматографический материал отделяют от раствора, например, с помощью фильтрации, а вещество, связанное с хроматографическим материалом, также извлекается вместе с ним из раствора, в то время как соединения, не связавшиеся с хроматографическим материалом, остаются в растворе.

Термин "режим связывания и элюции" обозначает один из режимов работы в ходе проведения хроматографии, при котором раствор, содержащий целевое соединение, которое необходимо очистить, наносят на хроматографический материал, в результате чего соединение интереса связывается с хроматографическим материалом. Таким образом, целевое соединение удерживается на хроматографическом материале, в то время как соединения, не представляющие интерес, удаляются вместе с элюатом или супернатантом. Целевое соединение впоследствии высвобождается с хроматографического материала на втором этапе очистки с помощью элюирующего раствора. В одном из вариантов реализации способ, описанный в настоящем изобретении, осуществляется в "режиме связывания и элюции".

Растворы, которые используют в способе, описанном в настоящем изобретении, представляют собой неочищенные или буферные растворы. Термин "буферный раствор" обозначает раствор, в котором изменения рН в результате добавления или высвобождения кислых или щелочных соединений уравновешиваются с помощью растворенного буферного соединения. Любые буферные соединения с подобными свойствами могут быть использованы. Обычно используются фармацевтически приемлемые буферные соединения. В одном из вариантов реализации буферный раствор выбирают из фосфатного буферного раствора, состоящего из фосфорной кислоты и/или ее солей, или ацетатного буферного раствора, состоящего из уксусной кислоты и ее солей, или цитратного буферного раствора, состоящего из лимонной кислоты или ее солей, или морфолинового буферного раствора, или 2-(N-морфолин)этансульфонового буферного раствора, или гистидинового буферного раствора, или глицеринового буферного раствора, или трис(гидроксиметил)аминометанового (TRIS) буферного раствора. В одном из вариантов реализации буферный раствор выбирают из фосфорной кислоты, или ацетатного буферного раствора, или цитратного буферного раствора, или гистидинового буферного раствора. Возможно буферный раствор может содержать дополнительные соли, такие, например, как хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия, или цитрат калия.

Термины "непрерывная элюция" и "способ непрерывной элюции", которые используются как взаимозаменяемые в рамках данной заявки, обозначают способ, в котором электропроводность раствора, вызывающего элюцию, т.е. высвобождение соединения, связанного с хроматографическим материалом, изменяют, т.е. повышают или понижают, непрерывно, т.е. концентрацию изменяют постепенно в несколько этапов, каждый из которых состоит в изменении концентрации соединения, вызывающего элюцию, не более чем на 2%, или 1%. В ходе этой "непрерывной элюции" одно или более условий, например рН, ионную силу, концентрацию соли, и/или скорость хроматографии, можно менять линейно, или экспоненциально, или асимптотически. В одном из вариантов реализации изменение является линейным.

Термин "материал для ионообменной хроматографии" обозначает неподвижную матрицу с большой молекулярной массой, которая несет ковалентно связанные заряженные заместители и используется в ионообменной хроматографии в качестве стационарной фазы. Для того чтобы суммарный заряд был равен нулю, матрица содержит противоионы, не связанные с ней ковалентно. "Материал для ионообменной хроматографии" обладает способностью обменивать не ковалентно связанные противоионы на ионы, имеющие заряд с тем же знаком и содержащиеся в окружающем растворе. В зависимости от заряда противоионов, которые могут замещаться, "ионообменная смола" бывает катионообменной смолой или анионообменной смолой. В зависимости от природы заряженной группы (заместителя) среди "ионообменных смол" выделяют, например, в случае катионообменной смолы смолу с остатком сульфокислоты (S), или с сульфопропиловым остатком (SP), или с карбоксиметиловым остатком (СМ).

Специалисту в данной области техники широко известны протоколы и методики, позволяющие переводить аминокислотную последовательность, например полипептид, в соответствующую последовательность нуклеиновых кислот, кодирующих эту аминокислотную последовательность. Следовательно, нуклеиновая кислота представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, состоящую из индивидуальных нуклеотидов, а также несет информацию об аминокислотной последовательности полипептида, которую она кодирует.

Термин "полиэтиленгликоль" или "остаток полиэтиленгликоля" обозначает небелковый остаток, содержащий полиэтиленгликоль в качестве основного компонента. Такой остаток полиэтиленгликоля может содержать дополнительные химические группы, которые необходимы для реакций связывания и которые образуются в результате химического синтеза молекулы, или являются спейсерами для создания оптимальных расстояний между различными частями молекулы. Эти дополнительные химические группы не учитываются при вычислении молекулярной массы остатка полиэтиленгликоля. Кроме того, такой остаток полиэтиленгликоля может состоять из одной или более цепей полиэтиленгликоля, которые ковалентно связаны друг с другом. Остатки полиэтиленгликоля, содержащие более одной цепи ПЭГ, называются многорукими или разветвленными остатками полиэтиленгликоля. Разветвленные остатки полиэтиленгликоля могут быть приготовлены, например, путем добавления оксида полиэтилена к различным полиолам, включая глицерин, пентаэритрит, и сорбит. Разветвленные остатки полиэтиленгликоля описаны, например, в заявке ЕР 0473084, US 5,932,462. В одном из вариантов реализации остаток полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу от 20 кДа до 35 кДа и является линейным остатком полиэтиленгликоля. В другом варианте реализации остаток полиэтиленгликоля является разветвленным остатком полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 35 кДа до 40 кДа.

Термин "гибрид эритропоэтина с остатком полиэтиленгликоля" означает соединение, содержащее ковалентную сшивку, введенную с помощью химической реакции между остатком полиэтиленгликоля и N-концом эритропоэтина или внутренним остатком лизина эритропоэтина. Слияние приводит к получению конъюгата белка, который содержит одну молекулу эритропоэтина и один или более остаток/остатков полиэтиленгликоля. Такой процесс слияния называют пегилированием, а продукт, который получается в результате этого процесса, - пегилированный эритропоэтин. Слияние/конъюгирование полипептидов с остатками полиэтиленгликоля широко известны в данной области техники и обобщены, например, в работе Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. Остаток полиэтиленгликоля может быть присоединен с помощью различных функциональных групп. Для этого могут быть использованы полиэтиленгликоли с разной молекулярной массой, разной формой, а также разными сшивающими группами (см. также Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, С., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304). Слияние эритропоэтина и остатка полиэтиленгликоля может быть проведена в водном растворе с использованием реагентов для присоединения остатка полиэтиленгликоля, как описано, например, в заявке WO 00/44785. Слияние также может быть выполнено в твердой фазе согласно протоколу, описанному в работе Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. Не случайно N-терминальное слияние может быть также выполнена согласно протоколу, описанному в заявке WO 94/01451.

Термины "слияние эритропоэтина и полиэтиленгликоля" и "пегилирование" означают образование ковалентной сшивки между остатком полиэтиленгликоля и N-концом эритропоэтина и/или внутренним остатком лизина с тем, чтобы получить конъюгат белка, который содержит одну молекулу эритропоэтина и один остаток полиэтиленгликоля. В одном из вариантов реализации пегилирование эритропоэтина осуществляют в водном растворе с использованием NHS-активированных линейных или разветвленных молекул ПЭГ с молекулярной массой между 5 кДа и 40 кДа.

Термин "в условиях, приемлемых для связывания" и его грамматические эквиваленты, употребляемые в данной заявке, означает, что целевое соединение, например пегилированный эритропоэтин, связывается со стационарной фазой, когда приводится во взаимодействие, например, с ионообменным материалом. Это не обязательно означает, что 100% целевого соединения связывается, но в основном связывается 100% целевого соединения, т.е. связывается по меньшей мере 50% целевого соединения, связывается по меньшей мере 75% целевого соединения, связывается по меньшей мере 85% целевого соединения, или более чем 95% целевого соединения связывается со стационарной фазой.

Химическое слияние или конъюгирование эритропоэтина и полиэтиленгликоля, как правило, приводит к смеси разных соединений, таких как полипегилированный эритропоэтин, монопегилированный эритропоэтин, непегилированный эритропоэтин, продукты гидролиза активированного эфира ПЭГ, а также продукты гидролиза самого эритропоэтина. Чтобы получить монопегилированный эритропоэтин с высокой степенью гомогенности, эти соединения должны быть удалены.

Поэтому, одним из аспектов настоящего изобретения является способ получения конъюгата белка, который содержит одну молекулу эритропоэтина и один остаток полиэтиленгликоля, с высокой степенью гомогенности, при этом способ включает следующие стадии:

a) конъюгирование эритропоэтина и полиэтиленгликоля с использованием активированных эфиров полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа,

b) нанесение конъюгатов, полученных на стадии а), на хроматографический материал SP Sephacryl S 500 HR, уравновешенный раствором с электропроводностью около 21 мСм/см,

c) высвобождение белка, который содержит одну молекулу зритропоэтина и один остаток полиэтиленгликоля (монопегилированный эритропоэтин), с высокой степенью гомогенности с помощью элюции линейным градиентом электропроводности, и, таким образом, получение конъюгата белка, который содержит эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля.

В одном из вариантов реализации хроматографический материал SP Sephacryl S 500 MR представляет собой хроматографическую колонку. Этот способ лучше всего подходит для очистки пегилированного рекомбинантного эритропоэтина, который гликозилирован, т.е. который получают с помощью клеток млекопитающих, в одном из вариантов реализации с помощью линии клеток СНО, или линии клеток HEK293, или линии клеток ВНК, или линии клеток На Per.C6®, или линии клеток HeLa, после чего проводят химическое пегилирование.

На первой стадии способа по настоящему изобретению проводят пегилирование эритропоэтина. Молекула полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ), использованная в рекации пегилирования, имеет молекулярную массу около 20 кДа-40 кДа (термин "молекулярная масса", который используется в настоящей заявке, означает среднюю молекулярную массу ПЭГ, поскольку молекула ПЭГ является полимерным соединением и не может быть получена с определенной молекулярной массой, а на самом деле имеет распределение молекулярных масс; термин "около" означает, что в препарате ПЭГ некоторые молекулы весят больше, а некоторые весят меньше указанной молекулярной массы, т.е. термин "около" означает распределение молекулярных масс, в котором 95% молекул ПЭГ имеют молекулярную массу в пределах указанной молекулярной массы +/- 10%. Например, молекулярная масса 30 кДа означает диапазон молекулярных масс от 27 кДа до 33 кДа).

Термин "эритропоэтин" и его аббревиатура "ЕРО" относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или к белку или полипептиду, имеющему высокую степень гомологии с эритропоэтином, который обладает биологическими свойствами стимулировать продукцию красных кровяных клеток, а также деление и дифференцировку коммиттированных эритроидных предшественников в костном мозге. Рекомбинантный эритропоэтин может быть получен путем экспрессии в эукариотических клетках, например, в клетках СНО, или в клетках ВНК, или в клетках HeLa с помощью технологии рекомбинантной ДНК или с помощью активации эндогенных генов, т.е. гликопротеин эритропоэтина экспрессируется с помощью активации эндогенных генов, см. например US 5,733,761, US 5,641,670, US5.733.746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667, и WO 91/09955. В одном из вариантов реализации эритропоэтин представляет собой ЕРО человека. В одном из вариантов реализации эритропоэтин человека имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. В одном из вариантов реализации эритропоэтин человека имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1. Термин "эритропоэтин" также означает изоформы белка SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, в которых один или более аминокислотных остатков заменены, удалены или вставлены и которые обладают биологической активностью, сравнимой с биологической активностью немодифицированного белка, эти примеры отражены в заявках ЕР 1064951 или US 6,583,272. Изоформа белка может иметь аминокислотную последовательность эритропоэтина человека, которая несет от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования. Специфическая активность пегилированного эритропоэтина может быть определена с помощью различных анализов, известных в данной области техники. Биологическая активность очищенного пегилированного эритропоэтина проявляется в том, что введение пациентам этого белка с помощью инъекции приводит к увеличению продукции клеток костного мозга, включая ретикулоциты и красные кровяные клетки, по сравнению с контрольной группой или с пациентами, которым ничего не вводили. Биологическая активность пегилированного эритропоэтина, полученного и очищенного согласно способу, описанному в настоящем изобретении, может быть проверена с помощью методов, описанных в работе Bristow, A., Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48.

Варианты аминокислотной последовательности эритропоэтина могут быть получены с помощью введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую эритропоэтин, или с помощью синтеза пептидов. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены аминокислотных остатков в пределах аминокислотной последовательности эритропоэтина. Любая комбинация делеции, вставок и замен может быть использована для получения конструкта, кодирующего конечный белок, при условии, что конечный белок обладает биологической активностью, сравнимой с биологической активностью эритропоэтина человека.

Консервативные аминокислотные замены представлены в таблице 1 под заголовком "предпочтительные замены". Более существенные изменения приведены в таблице 1 под заголовком "типичные замены" со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены могут быть введены в эритропоэтин человека и продукты скрининга на сохранение биологической активности эритропоэтина человека.

ТАБЛИЦА 1
Исходный остаток Типичные замены Предпочтительные замены
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (С) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu

Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут за собой замену члена одного из этих классов на другой класс.

Химическое пегилирование эритропоэтина обычно приводит к получению препарата белка, содержащего эритропоэтин, который пегилирован по одной или более ε-аминогруппам остатков лизина и/или по N-концевой аминогруппе. Избирательное пегилирование по N-терминальной аминокислоте может быть выполнено согласно протоколу, описанному в работе Felix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly(ethylene glycol)) (1997) 218-238. Избирательное N-терминальное пегилирование может быть достигнуто в ходе твердофазного синтеза с помощью реакции присоединения Nα-пегилированного аминокислотного производного к N-1 терминальной аминокислоте пептидной цепи. Пегилирование боковой цепи может быть выполнено в ходе твердофазного синтеза с помощью реакции присоединения N-пегилированных производных лизина к растущей цепи. Комбинированное N-концевое пегилирование и пегилирование боковой цепи осуществляют, как описано выше, с помощью твердофазного синтеза или с помощью синтеза в растворе, действуя активированными реагентами ПЭГ на пептид, незащищенный по определенной аминогруппе.

Подходящие производные ПЭГ представляют собой молекулы активированного ПЭГ, средняя молекулярная масса которых составляет в одном из вариантов реализации около 5 кДа - 40 кДа, в другом варианте реализации около 20 кДа - 40 кДа, и в еще одном варианте реализации около 30 кДа - 35 кДа. Производные ПЭГ могут быть линейными или разветвленными ПЭГ. Доступно большое разнообразие производных ПЭГ, подходящих для применения с целью приготовления конъюгатов ПЭГ-белок и ПЭГ-пептид.

Активированные производные ПЭГ широко известны в данной области техники и описаны, например, в работе Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, для ПЭГ-винилсульфонов. Типы ПЭГ с линейными и разветвленными цепями являются предпочтительными для получения пегилированных фрагментов. Примерами реактивных реагентов ПЭГ являются йодацетилметокси-ПЭГ, или метокси-ПЭГ-винилсульфон (в одном из вариантов реализации m - это целое число примерно от 450 до 900, a R - это низший алкил, линейный или разветвленный, содержащий от одного до шести углеродных атомов, такой как метил, этил, изопропил, и др. при этом метил является предпочтительным):

, или ,

Применение этих йод-активированных соединений широко известно в данной области техники и описано, например, в работе Hermanson, G. Т., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) pp.147-148.

В одном из вариантов реализации типы ПЭГ представляют собой активированные эфиры ПЭГ, например, N-гидроксисукцинимида пропионат, или М-гидроксисукцинимида бутират, или N-гидроксисукцинимид, такой как ПЭГ-NHS (Monfardini, С., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). В одном из вариантов реализации ПЭГ активируют с помощью эфира N-гидроксисукцинимида

или

с использованием алкокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимида, такого как метокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимид (MW 30000), в котором Рит определены выше. В одном из вариантов реализации типы ПЭГ являются эфирами метоксиполиэтиленгликольбутановой кислоты с N-гидроксисукцинимидом. Термин "алкокси" означает алкильную группу простого эфира, в котором термин 'алкил' означает алкильную группу с линейной цепью или разветвленной цепью, содержащую максимум четыре углеродных атома, такую как метокси, этокси, н-пропиокси и т.п., предпочтительно метокси.

Термин "с высокой степенью гомогенности" означает, что гибрид белка эритропоэтина или конъюгат, полученный, содержащийся, или используемый, содержит определенное количество остатков ПЭГ, связанных с эритропоэтином. В одном из вариантов реализации пегилированный эритропоэтин является монопегилированным эритропоэтином. Препарат может содержать не вступивший в реакцию эритропоэтин (т.е. не содержащий группы ПЭГ), полипегилированный эритропоэтин, а также фрагменты полипептида, которые образуются в ходе реакции пегилирования. Термин "с высокой степенью гомогенности" означает, что препарат монопегилированного эритропоэтина содержит по меньшей мере 50% (мас./мас.) монопегилированного эритропоэтина, или по меньшей мере 75% монопегилированного эритропоэтина, или по меньшей мере 90% монопегилированного эритропоэтина, или более чем 95% монопегилированного эритропоэтина. Значения концентрации в процентах получены на основе площади под кривой на хроматограмме в соответствии с хроматографическим способом, с помощью которого получен монопегилированный эритропоэтин.

Настоящее изобретение относится к способу очистки пегилированного эритропоэтина, который позволяет получить монопегилированный эритропоэтин с высокой степенью гомогенности. Было обнаружено, что хроматографический материал необходимо уравновесить с помощью раствора, электропроводность которого составляет около 21 мСм/см, перед тем, как наносить препарат пегилированного эритропоэтина. В случае, когда хроматографический материал уравновешен раствором с более низкой электропроводностью, разделение разных типов пегилированного эритропоэтина менее эффективно. Также не является предпочтительным регулировать электропроводность раствора, содержащего препарат пегилированного эритропоэтина, перед нанесением на хроматографический материал. Более того, применение ступенчатого градиента менее эффективно, поскольку непегилированный эритропоэтин не может быть восстановлен количественно с хроматографического материала. Восстановление исходного материала, не вступившего в реакцию, является предпочтительным, поскольку он может быть повторно использован в реакции пегилирования.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения монопегилированного эритропоэтина с использованием хроматографического материала SP Sephacryl S 500 HR в один этаппосредством первоначального уравновешивания хроматографического материала раствором с электропроводностью около 21 мСм/см и последующего нанесения на хроматографический материал раствора, содержащего препарат пегилированного эритропоэтина. Было обнаружено, что электропроводность первого раствора нужно тщательно контролировать, чтобы обеспечить разделение индивидуальных компонентов неочищенного препарата белка.

Таким образом, способ получения конъюгата белка, содержащего эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, который описан в данной заявке, состоит из следующих этапов:

a) уравновешивание хроматографической колонки, содержащей хроматографический материал SP Sephacryl S 500 HR, раствором с электропроводностью около 21 мСм/см,

b) нанесение на колонку по п. а) раствора, содержащего смесь свободного эритропоэтина и конъюгатов белка эритропоэтина и полиэтиленгликоля, содержащих один или более остаток полиэтиленгликоля на одну молекулу эритропоэтина,

с) промывка колонки раствором с электропроводностью около 21 мСм/см, в ходе которой с колонки высвобождаются гибридные белки, содержащие два или более остатков полиэтиленгликоля,

d) пропускание через колонку раствора с непрерывно и линейно возрастающей электропроводностью, максимальное значение которой равно по меньшей мере 62.5 мСм/см, в результате чего с колонки высвобождается в индивидуальном виде гибридный белок, содержащий эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, и свободный эритропоэтин, при этом гибридный белок, содержащий эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, выходит в первую очередь.

Было обнаружено, что для разделения индивидуальных компонентов препарата необходимо сначала уравновесить хроматографический материал раствором с электропроводностью около 21 мСм/см.

В одном из вариантов реализации способ по настоящему изобретению основан на применении колоночной хроматографии.

В одном из вариантов реализации перед нанесением раствора, содержащего препарат пегилированного эритропоэтина, хроматографический материал уравновешивают, пропуская через колонку 8-кратный объем раствора с электропроводностью около 21 мСм/см. В одном из вариантов реализации раствором с электропроводностью около 21 мСм/см является раствор с рН, значение которого составляет 2.5-3.5. В одном из вариантов реализации раствором с электропроводностью около 21 мСм/см является фосфатный буферный раствор с рН, значение которого составляет 2.5-3.5.

После нанесения раствора, содержащего препарат пегилированного эритропоэтина, колонку промывают раствором с электропроводностью около 21 мСм/см, в результате чего свободный полиэтиленгликоль и гибридные белки (т.е. белковые конъюгаты), содержащие два или более остатков полиэтиленгликоля, удаляются с хроматографического материала. В одном из вариантов реализации через хроматографический материал пропускают до 8 объемов колонки раствора с электропроводностью около 21 мСм/см.

После того, как полипегилированный эритропоэтин удаляется с хроматографического материала, начинают непрерывную элюцию линейным градиентом электропроводности. Электропроводность подвижной фазы, которую пропускают через хроматографический материал, повышают непрерывно и линейно до значения, которое составляет по меньшей мере 62.5 мСм/см. Линейный градиент позволяет элюировать с колонки в первую очередь монопегилированный эритропоэтин, а потом выходит непегилированный эритропоэтин с высокой степенью гомогенности. Увеличение электропроводности в одном из вариантов реализации осуществляют, увеличивая концентрацию раствора хлорида натрия. В одном из вариантов реализации раствор, который используют для увеличения электропроводности, имеет рН, значение которого составляет 2.5-3.5. В одном из вариантов реализации увеличение электропроводности находится в диапазоне, минимальное значение которого равно около 21 мСм/см, а максимальное значение составляет по меньшей мере 62.5 мСм/см, при этом объем подвижной фазы составляет 10 объемов колонки.

В одном из вариантов реализации раствор с электропроводностью около 21 мСм/см является буферным раствором на основе фосфатов натрия или калия с концентрацией около 100 мМ, с рН, значение которого составляет около 3.0, и содержащим хлорид натрия, концентрация которого составляет примерно120 мМ.

В одном из вариантов реализации линейный градиент является градиентом концентрации хлорида натрия, которую увеличивают от 120 мМ до 1000 мМ, при этом используют буферный раствор на основе фосфатов натрия или калия с концентрацией около 100 мМ и с рН, значение которого составляет около 3.0.

В одном из вариантов реализации раствор, содержащий смесь свободного эритропоэтина и свободного полиэтиленгликоля, а также гибридные белки (т.е. белковый конъюгат) эритропоэтина и полиэтиленгликоля, в которых один или более остаток полиэтиленгликоля приходится на одну молекулу эритропоэтина, наносят на хроматографический материал, при этом на 1 мл хроматографического материала приходится от 1 мг/мл до 4 мг/мл белка.

Термин "хроматографический материал SP Sephacryl S 500 MR" обозначает катионообменный хроматографический материал, а также обозначается как MacroCap SP (оба материала поставляет GE Healthcare). Хроматографический материал SP Sephacryl S 500 HR в одном из вариантов реализации представляет собой сополимер с поперечными сшивками, который получен из аллилдекстрана и N,N-метиленбисакриламида, содержит сульфокислоту в качестве хроматографической функциональной группы и поэтому является сильным катионообменным хроматографическим материалом.

Следующие примеры, перечень последовательностей и рисунки приведены, чтобы облегчить понимание сути настоящего изобретения, которое представлено в полном объеме в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что в изложенные процедуры могут быть внесены изменения в пределах объема настоящего изобретения.

Описание перечня последовательностей

SEQ ID NO:01 Аминокислотная последовательность эритропоэтина человека.

SEQ ID NO:02 Аминокислотная последовательность эритропоэтина человека.

Описание графических материалов

Фиг.1 - Хроматограмма элюции, описывающая очистку препарата пегилированного эритропоэтина согласно способу по настоящему изобретению.

Фиг.2 - SEC аналитические хроматограммы пиковых фракций 1, 2 и 3, представленных на Фиг.1.

Фиг.3 - SEC аналитические хроматограммы пиковых фракций 1, 2 и 3, полученных в ходе разделения на хроматографической колонке, которая была уравновешена раствором с более высокой электропроводностью.

Фиг.4 - Хроматограмма элюции, описывающая очистку препарата пегилированного эритропоэтина с помощью способа ступенчатой элюции.

Фиг.5 - SEC аналитические хроматограммы пиковых фракций 1, 2 и 3 (пик регенерации), представленных на Фиг.4.

Фиг.6 - Хроматограмма элюции, описывающая очистку препарата пегилированного эритропоэтина с помощью способа по настоящему изобретению, при котором для образца предварительно готовят раствор с электропроводностью 20 мСм/см.

Фиг.7 - SEC аналитические хроматограммы пиковых фракций 1, 2 и 3, представленных на Фиг.6.

Примеры

Материалы и Методы

Аналитическая эксклюзионная хроматография:

смола TSK 3000 (Tosohaas)
колонка 300×7.8 мМ
скорость потока 0.5 мл/мин
элюирующий раствор 200 мМ фосфата калия, содержащего
250 мМ хлорида калия, рН 7.0
длина волны 220 нм

Хроматография пегилированного эритропоэтина:

смола SP Sephacryl S 500 HR
объем колонки 2.5 мл
количество образца мг/мл смолы - может различаться
(см. примеры ниже)
скорость потока 0.5 мл/мин
растворы А: 100 мМ фосфата калия, рН 3.0
В: 100 мМ фосфата калия,
1000 мМ хлорида калия, рН 3.0
раствор для уравновешивания 88% А и 12% В
раствор для промывки 88% А и 12% В
объем раствора для промывки 20 мл (8 объемов колонки (CV))
элюирующий раствор
для линейного градиента 100% В
линейный градиент в пределах 25 мл (10 объемов колонки)
до 100% В
длина волны 254 нм, 280 нм

Пример 1

Хроматография препарата пегилированного эритропоэтина на хроматографическом материале SP-Sephacryl, уравновешенном раствором с электропроводностью около 21 мСм/см

Хроматографию пегилированного эритропоэтина выполняли в соответствии сданными, приведенными в разделе Материалы и Методы,

Хроматограмма элюции, иллюстрирующая данный пример, представлена на Фиг.1. Аналитические эксклюзионные хроматограммы пиковой фракции 1, содержащей олигопегилированный эритропоэтин, пиковой фракции 2, содержащей монопегилированный эритропоэтин, и пиковой фракции 3, содержащей непегилированный эритропоэтин, представлены на Фиг.2 А-С.

ТАБЛИЦА 2
типы эритропоэтина линейный пик (пиковая фракция 1) [%] пик градиента 1 (пиковая фракция 2) [%] пик градиента 2 (пиковая фракция 3) [%]
олигопегилированный 92.2 12.1 0.1
монопегилированный 7.8 87.7 7.3
непегилированный - 0.2 92.6

Пример 2

Хроматография препарата пегилированного эритропоэтина на хроматографическом материале SP-Sephacryl, уравновешенном раствором с электропроводностью около 29 мСм/см

Хроматографию пегилированного эритропоэтина выполняли в соответствии с разделом Материалы и Методы, внеся изменения в следующие параметры:

раствор для уравновешивания 80% А и 20% В
раствор для промывки 80% А и 20% В
объем раствора для промывки 20 мл (8 объемов колонки (CV))
элюирующий буфер
для линейного градиента 100% В
линейный градиент в пределах 25 мл (10 объемов колонки)
до 50% В

Аналитические эксклюзионные хроматограммы пиковой фракции 1, содержащей олигопегилированный эритропоэтин, пиковой фракции 2, содержащей монопегилированный эритропоэтин, и пиковой фракции 3, содержащей непегилированный эритропоэтин, представлены на Фиг.3 А-С.

Таблица 3
типы эритропоэтина линейный пик (пиковая фракция 1) [%] пик градиента 1 (пиковая фракция 2) [%] пик градиента 2 (пиковая фракция 3) [%]
олигопегилированный 98.0 18.5 -
монопегилированный 2.0 81.5 7.0
непегилированный - - 93.0

Пример 3

Хроматография препарата пегилированного эритропоэтина на хроматографическом материале SP-Sephacryl, уравновешенном раствором с электропроводностью около 21 мСм/см, с использованием ступенчатой элюции раствором с электропроводностью 37 мСм/см

Хроматографию пегилированного эритропоэтина выполняли в соответствии с разделом Материалы и Методы.

Хроматограмма элюции, иллюстрирующая данный пример, представлена на рисунке 4. Аналитические эксклюзионные хроматограммы пиковой фракции 1, содержащей олигопегилированный эритропоэтин, пиковой фракции 2, содержащей монопегилированный эритропоэтин, и пиковой фракции 3, содержащей непегилированный эритропоэтин, представлены на Фиг.5 А-С. Было отмечено, что непегилированный эритропоэтин может высвобождаться с колонки только в процессе ее регенерации, и не удаляется с колонки с помощью метода ступенчатой элюции.

ТАБЛИЦА 4
типы эритропоэтина исходный материал [%] линейный пик (пиковая фракция 1) [%] Пик ступенчатой элюции 1 (пиковая фракция 2) [%] пик регенерации колонки (пиковая фракция 3) [%]
олигопегилированный 34.8 92.1 2.7 -
монопегилированный 45.3 7.7 96.1 1.4
непегилированный 19.9 0.2 1.2 98.6

Пример 4

Хроматография препарата пегилированного эритропоэтина на хроматографическом материале SP-Sephacryl, уравновешенном раствором с электропроводностью около 21 мСм/см, с использованием раствора для образца с электропроводностью 20 мСм/см

Хроматографию пегилированного эритропоэтина выполняли в соответствии с разделом Материалы и Методы.

Хроматограмма элюции, иллюстрирующая данный пример, представлена на Фиг.6. Аналитические эксклюзионные хроматограммы пиковой фракции 1, содержащей олигопегилированный эритропоэтин, пиковой фракции 2, содержащей монопегилированный эритропоэтин, и пиковой фракции 3, содержащей непегилированный эритропоэтин, представлены на Фиг.7 А-С.

ТАБЛИЦА 5
типы эритропоэтина линейный пик (пиковая фракция 1) [%] пик градиента 1 (пиковая фракция 2) [%] пик градиента 2 (пиковая фракция 3) [%]
олигопегилированный 100 14.5 -
монопегилированный - 85.3 3.9
непегилированный - 0.1 96.1

1. Способ получения белка, который содержит эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, включающий следующие стадии:
a) нанесение раствора, содержащего смесь свободного эритропоэтина и конъюгатов эритропоэтина и полиэтиленгликоля, содержащих один или более остатков полиэтиленгликоля на молекулу эритропоэтина, на колонку, содержащую хроматографический материал SP Sephacryl S 500 HR, уравновешенный раствором с электропроводностью около 21 мСм/см,
b) промывка колонки раствором с электропроводностью около 21 мСм/см и, таким образом, удаление свободного полиэтиленгликоля и белков, содержащих два или более остатков полиэтиленгликоля,
c) промывка колонки раствором с линейно возрастающей электропроводностью до конечного значения около 62.5 мСм/см и, таким образом, раздельное высвобождение с колонки белка, содержащего эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, и эритропоэтина, при этом белок, содержащий эритропоэтин и один остаток полиэтиленгликоля, высвобождается первым.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор с электропроводностью около 21 мСм/см представляет собой раствор с рН, значение которого составляет 2.5-3.5.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор с электропроводностью около 21 мСм/см представляет собой фосфатный буферный раствор с рН, значение которого составляет 2.5-3.5.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что электропроводность раствора, содержащего смесь эритропоэтина и конъюгатов эритропоэтина и полиэтиленгликоля, содержащих один или более остатков полиэтиленгликоля на молекулу эритропоэтина, не доводят до значения около 21 мСм/см.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствором с линейно возрастающей электропроводностью является раствор с линейно возрастающей концентрацией хлорида натрия.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор с линейно возрастающей электропроводностью имеет рН, значение которого составляет 2.3-3.5.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что эритропоэтин представляет собой эритропоэтин человека.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что эритропоэтин человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:01 или SEQ ID NO:02.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что один остаток полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 кДа до 40 кДа.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к никелевому комплексу 5,10,15,20-тетракис [3′,5′-ди-(2″-метилбутилокси)фенил]-порфина формулы: Изобретение позволяет получить никелевый комплекс, проявляющий свойство стационарной фазы для газовой хроматографии.

Изобретение относится к газохроматографическим методам анализа и может быть использовано для идентификации летучих компонентов различных лекарственных растений и фитопрепаратов в медицине, фармакологии, здравоохранении, пищевой, парфюмерной и др.

Изобретение относится к области аналитической химии и может найти применение в области экологии и охраны окружающей среды при контроле загрязнения атмосферы для определения акролеина в атмосферном воздухе на уровне референтной концентрации.

Изобретение относится к хроматографии и может применяться в аналитических лабораториях для анализа многокомпонентной углеводородной смеси, в частности нефтепродуктов, с различными температурами начала и конца кипения.

Изобретение относится к области аналитической химии применительно к анализу природных, поверхностных, подземных, сточных и технологических вод. Способ включает разделение с последующей идентификацией ацетона и метанола на капиллярной хроматографической колонке в потоке газа-носителя, представляющем собой азот; образование и регистрацию пламенно-ионизационным детектором исследуемых ионов, образующихся в пламени, при этом готовят основной раствор, хорошо сохраняющийся 2 месяца, при температуре от -2°C до -5°C, готовят промежуточный раствор с концентрацией 6,32 мг/дм3 разведением основного раствора очищенной водой, готовят градуировочные растворы для диапазона концентраций: ацетон 0,025-6,32 мг/дм3, метанол 0,025-6,32 мг/дм3 разведением водой промежуточного раствора, градуируют хроматограф, вводя в него предварительно отобранную паровую фазу градуировочных растворов, строят градуировочный график, после термостатирования исследуемого раствора отбирают паровую фазу парофазным шприцем и вводят в испаритель хроматографа, данные обрабатывают компьютерной программой ChemStation, которой комплектуется хроматографический комплекс МАЭСТРО 7820А.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения гидроксибензола и его монометильных замещенных в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий.
Изобретение относится к контролю содержания веществ в промышленных сточных водах методом жидкостной хроматографии. Для определения концентрации пентаэритрита в водных растворах используют раствор с содержанием пентаэритрита от 1 до 100 мг/дм3.
Изобретение относится к диагностическим методам в области медицины и описывает способ лабораторной диагностики болезни Альцгеймера посредством применения модифицированных по металл-связывающему домену 1-16 форм бета-амилоида человека в качестве биомаркеров патогенеза болезни Альцгеймера.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий.

Изобретение относится к медицине и токсикологической химии, а именно к способам определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для персонализированной интраоперационной контактной локальной гипертермии при лечении местнораспространенных злокачественных опухолей.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтическую аэрозольную композицию, содержащую по меньшей мере один газ-вытеснитель на основе гидрофторалкана; по меньшей мере одно активное вещество, образовавшее комплекс с адъювантом; и, необязательно, один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, где адъювант представляет собой поливинилпирролидон в количестве от 0,5% до 100% по массе активного вещества, где активное вещество выбирают из тиотропия, ипратропия, аклидиния, атропина или окситропия, и где активное вещество подвергают комплексообразованию с адъювантом с помощью способа, включающего растворение активного вещества и адъюванта в массовом соотношении активный компонент:поливинилпирролидон, равном 2:1, в растворителе с получением раствора и удаления растворителя из раствора под вакуумом с получением по меньшей мере одного активного вещества, образовавшего комплекс с адъювантом.

Изобретение относится к области наномедицинских технологий, а именно к созданию нанотранспортеров лекарственных препаратов, и описывает способ получения наночастиц нитрида бора для доставки противоопухолевого препарата в опухолевые клетки.

Настоящее изобретение относится к способу получения пэгилированного олигонуклеотида, который может быть использован для получения биологически активных веществ.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой безводную гелеобразную композицию мупироцина или его фармацевтически приемлемой соли для местного применения для лечения бактериальных инфекций кожи, содержащую липофильную основу, выбранную из группы, состоящей из вазелина, среднецепочечных триглицеридов, изопропилмиристата и их смесей, биоадгезив, выбранный из группы, состоящей из поливинилпирролидона и полиметакрилатов, и растворитель, выбранный из группы, состоящей из этанола, пропанола и изопропанола.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии, иммунологии и медицины и предназначена для идентификации популяций аутореактивных Т-клеток у индивидуумов с аутоиммунными заболеваниями.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены модифицированный капсулярный сахарид для вызова гуморального иммунного ответа, способ его получения и применение для профилактики или лечения бактериального менингита, конъюгат сахарид-белок и способы его получения, фармацевтическая композиция на основе модифицированного капсулярного сахарида и способ индуцирования гуморального иммунного ответа у млекопитающих.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для лечения и/или местного предупреждения заболеваний заднего сегмента глаза. Местная глазная композиция, выбранная из группы глазных капель и мазей, содержащая терапевтически эффективное количество соматостатина или аналога соматостатина, выбранного из группы, состоящей из соматостатина-28, соматостатина-14, соматостатина-13, просоматостатина, октреотида, ланреотида, вапреотида, пасиреотида, сеглитида, кортистатина и их фармацевтически приемлемых солей, применяется для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения заболевания заднего сегмента глаза.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой офтальмологическую композицию в виде капель для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний глаз, устойчивых к антибиотикам, состоящую из антисептика, выбранного из группы: полигексанид бигуанид, хлоргексидин, борная кислота, рекомбинантного интерферона, выбранного из группы: рекомбинантный интерферон-альфа, рекомбинантный интерферон-бета, рекомбинантный интерферон-гамма, и декспантенола, где в качестве консистентнообразующей основы содержит компонент, выбранный из группы: макрогол 400, макрогол 4000, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоли, декстран и гипромелозу, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении в мас.%.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой офтальмологическую композицию в виде капель для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний глаз, устойчивых к антибиотикам, состоящую из антисептика, выбранного из группы: полигексанид бигуанид, хлоргексидин, борная кислота, и декспантенола, а в качестве консистентнообразующей основы содержит компонент, выбранный из группы: макрогол 400, макрогол 4000, карбополполивинилпирролидон, полиэтиленгликоли, декстран и гипромелозу, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении, в мас.%.

Изобретение относится к косметической и фармацевтической промышленности и представляет собой средство для ухода за кожей, обладающее антифунгальными свойствами и содержащее гидрохлорид метилового эфира 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты, салициловую кислоту, диметилсульфоксид и спирт этиловый, причем компоненты в средстве находятся в определенном соотношении в масс.%. Изобретение обеспечивает широкий спектр фунгицидного действия и позволяет снизить содержание салициловой кислоты для достижения кератолитического эффекта. 2 н. и 3 з.п ф-лы, 21 пр., 2 табл.
Наверх