Способ донозологической оценки нарушений белково-синтетической функции печени у детей по активности фермента холинэстеразы

Авторы патента:

G01N33/68 - с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

Владельцы патента RU 2566718:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Пензенский институт усовершенствования врачей" Минздрава России (ГБОУ ДПО ПИУВ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики нарушений белково-синтетической функции печени на основании снижения активности фермента холинэстеразы. Способ включает взятие крови из вены, получение сыворотки и определение в сыворотке крови уровня альбумина, общего белка и активности фермента холинэстеразы на биохимическом анализаторе. При обнаружении снижения активности фермента холинэстеразы на фоне нормального уровня общего белка и альбумина в сыворотке крови диагностируют нарушение белково-синтетической функции печени у детей. Способ обеспечивает повышение точности диагностики донозологических нарушений здоровья у детей, проживающих в условиях избытка в окружающей среде вредных веществ. 1 пр., 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу донозологической оценки нарушений белково-синтетической функции печени у детей на основании снижения активности фермента холинэстеразы в сыворотке крови. В тканях человека существуют два различных фермента: ацетилхолинэстераза (или "истинная" холинэстераза), локализующаяся в нервной ткани, скелетных мышцах, незначительное количество в эритроцитах, и сывороточная холинэстераза (ее называют псевдохолинэстеразой), которая секретируется печенью в кровь. Сывороточная холинэстераза катализирует гидролитическое расщепление ацетилхолина.

Согласно данным литературы (Chatonnet A., Lockrige О., 1989), фермент холинэстераза является тонким индикатором оценки состояния белково-синтетической функции печени, осуществляет контроль проницаемости мембран клеток и стенок сосудов (Bajgar., Bartosova L., Kuca К. et al., 2007), Gorelick D.A. (1997), Lenz D.E.

Yemg D., Smith J.R. et al. (2007) сообщают, что фермент способен осуществлять гидролиз многих отравляющих фосфорорганических веществ, карбоматов, наркотических и алкогольных продуктов при поступлении их в организм и, тем самым, оказывать влияние на функцию гепатоцитов.

По результатам наших исследований (профилактические осмотры и диспансеризация детей школьного возраста Пензенского района) активность фермента холинэстеразы в крови у здоровых детей (девочек и мальчиков) колебалась в пределах от 2909 Е/л до 7051 Е/л; среднее значение составило 4100,24 Е/л (норма 5300-12900 Е/л). На основании этого предположили о снижении белково-синтетической функции гепатоцитов у детей района. В первую очередь в сыворотке должны снизиться уровни альбумина и протромбина (плазменный фактор свертывания крови), так как они синтезируются в печени. В нашем случае не было достоверных изменений количества альбумина и общего белка (табл.1).

На основании повышения активности фермента аспартатаминотрансфераза (ACT), которая колебалась в пределах "серой зоны", установили реактивные изменения в гепатоцитах. Активность фермента ACT в сыворотке крови была повышена у всех обследуемых детей района, КФК (креатинфосфокиназа) только у мальчиков, а активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и Y-глутамилтранспептидазы (ГГТП) соответствовали нормальным значениям.

Ферменты КФК, ЛДГ, ACT принимают участие в энергетических процессах: ЛДГ локализована в цитозоле, а фермент ACT в цитозоле и митохондриях. ACT в высоких концентрациях присутствуют в клетках сердечной, скелетных мышц, печени, почках и эритроцитах. При сохранении нормальной активности ферментов АЛТ, КФК, ЛДГ и ГГТП отметили некоторую дисфункцию энергопродуцирующей функции митохондрий гепатоцитов у здоровых детей (Патент на изобретение Курашвили Л.В., Булавкин Ю.В., 2012).

Поражение любого из этих органов и тканей могло привести к существенному повышению активности ACT в сыворотке. Так как измерение активности фермента ACT проведено в комплексе с ферментами АЛТ, КФК, ЛДГ, ГГТП, то увеличение только активности ACT позволило утверждать о "напряжении", но не о нарушении функции митохондрий.

Работами Хазанова В.А. (1992, 2003, 2004) установлена возможность наступления стадии истощения адаптивной реакции системы энергопродукции, если компенсаторные механизмы клетки не справляются с нарастающим расходом макроэргов или перегружаются сервисные системы поставки субстратов и удаления продуктов реакций. Повышение активности только фермента ACT у обследуемых детей свидетельствует об активации процесса переаминирования на уровне митохондрий и дает возможность предполагать об использовании ими в качестве энергетического субстрата аминокислот.

Обеспечивая клетку энергией, митохондрии интегрируют процессы катаболизма и анаболизма, поддерживая динамическую взаимосвязь обмена веществ. Длительное воздействие неблагоприятных факторов на растущий организм могло привести к истощению энергопродуцирующей функции митохондрий гепатоцитов у детей.

Снижение активности фермента холинэстеразы обусловлено снижением белково-синтетической функции печени, что бывает при действии различных токсических факторов инфекционной или онкологической природы за счет депрессии функции гепатоцитов, сопровождающейся грубыми поломками. Альбумин относится к низкомолекулярным белкам (молекулярная масса около 65 кДа), синтезируется в гепатоцитах, поддерживает онкотическое давление в сосудистом русле. В норме отрицательно заряженные молекулы альбумина практически не фильтруются в клубочках почек и не попадают в мочу. Отсюда концентрация альбумина в сыворотке крови зависит от состояния функции печени и почек, а также от содержания воды в клетках и внеклеточном пространстве.

Метод определения альбумина был взят за прототип, так как альбумин синтезируется только в гепатоцитах. Основная функция альбумина - участие в поддержании коллоидно-осмотического давления плазмы крови, а также в транспорте (непрямой билирубин, медь, НЭЖК, гормоны, кальций). При заболевании почек идет потеря уровня альбумина с мочой, снижается количество его в плазме, снижается белково-связанный кальций, появляются отеки и другие клинические проявления, при этом общий белок и белковые фракции крови могут оставаться в пределах нормы.

Средняя величина активности фермента ХЭ составила 4100,24 Е/л (общая для девочек и мальчиков), медиана [LQ-UQ] указана в табл.2. Снижение активности фермента в сыворотке крови ниже допустимой величины было у 15% девочек и у 15% мальчиков (у 6 девочек и 6 мальчиков). Сравнительная оценка результатов исследования по району показала, что у 80% детей активность фермента ХЭ находится на нижней границе нормы и у 15-36% за пределами нижней границы. Полученные результаты исследований согласуются с данными (Дегтева С.А., Старостина В.К., 2008). Колебания количества общего белка и альбумина в сыворотке крови у здоровых обследованных нами детей было равномерным и не выходило за допустимые пределы ни у девочек, ни у мальчиков.

Таблица 2

Онищенко Г.Г. и соавт. (2002) указывают, что постоянное поступление в организм детей солей тяжелых металлов, даже в малых количествах, увеличивает риск развития отдельных видов заболеваний, при этом девочки в два раза больше находятся в состоянии предболезни.

Анализируя результаты лабораторных исследований установили снижение активности фермента ХЭ в сыворотке крови, сохранение общего белка и количества альбумина в нормальных пределах. Полученные результаты обследования здоровых детей в возрасте 10-15 лет дают основание утверждать о подавлении белково-синтетической функции гепатоцитов по снижению активности ХЭ, самому тонкому индикатору нарушений функции печени.

Загрязнение окружающей среды может оказывать неблагоприятные эффекты после продолжительного периода воздействия, особенно соли тяжелых металлов, находящиеся в воде и почве, они накапливаются в организме и оказывают последующее токсическое действие (Онищенко Г.Г., Новиков С.М., Рахманин У.А., 2002; Дегтева С.А., Старостина В.К. 2008).

В водоемах Пензенского района в питьевой воде уровень железа превышает нормальные значения от 2,4 до 9,5 раз, уровень марганца превышает норму от 1,3 до 3,3 раз (Пантелеев Г.В. 2006). Химические вещества оказывают на организм неблагоприятные эффекты, которые могут быть обратимыми и необратимыми, в зависимости от возможностей механизмов адаптации (Анохин П.К., 1978, 1980). Необратимые изменения в организме сохраняются длительное время, прогрессируют, даже когда действие неблагоприятного фактора заканчивается (Паранько Н.М., Белицкая Э.Н., Карнаух Н.Г. и др. 2002; Басова О.М., Хамитова Р.Я., 2008).

Таким образом, активность фермента холинэстеразы - это индикатор оценки состояния здоровья детей и критерий токсичности ряда лекарственных препаратов, угнетающих энергопродуцирующую функцию митохондрий.

Источники информации

1. Басова О.М., Хамитова Р.Я. Риск здоровью детей малых городов от перорального поступления тяжелых металлов // Казанский медицинский журнал, 2008, №2, T. LXXXIX. - С. 203-206.

2. Дегтева С.А., Старостина В.К. Холинэстераза: методы анализа и диагностическое значение // Новости "ВЕКТОР-БЕСТ" 2008. - 1(47). - С. 9-14.

3. Комплексная санитарно-экологическая оценка населенных пунктов (территорий) в районе расположения объектов, опасных риском воздействия на людей биологически высокоактивных вредных химических веществ (1997): Метод. рек. / Госкомсанэпиднадзор РФ, утв. 30.07.97., N 2510/5717-97-32. - М., 18 с.

4. Курашвили Л.В., Булавкин Ю.В. (2012) Патент на изобретение №2465599 «Способ диагностики нарушений энергообразования в митохондриях».

5. Онищенко Г.Г., Новиков СМ., Рахманин У.А. Основы оценки риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду. М., 2002.

6. Паранько Н.М., Белицкая Э.Н., Карнаух Н.Г. и др. Тяжелые металлы внешней среды и их влияние на иммунный статус населения // Днепропетровск, 2002.

7. Пантелеев Г.В. Данные лабораторных исследований по факторам внешней среды. Пенза, 2006.

Способ диагностики нарушений белково-синтетической функции печени на основании снижения активности фермента холинэстеразы в гепатоцитах, включающий взятие крови из вены, получение сыворотки и определение в сыворотке крови уровня альбумина, общего белка и активности фермента холинэстеразы на биохимическом анализаторе, и при обнаружении снижения активности фермента холинэстеразы на фоне нормального уровня общего белка и альбумина в сыворотке крови диагностируют нарушение белково-синтетической функции печени у детей.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни. Из периферической венозной крови пациентов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ, выделяют ДНК и определяют генотипы полиморфизма -308G/A гена TNFα.

Способ прогнозирования уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения с использованием генетического полиморфизма 4a/4b enos // 2565405

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования уровня артериального давления на сроке родоразрешения. У женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, из периферической венозной крови выделяют ДНК.

Способ определения наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами // 2564914

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами. Осуществляют забор венозной крови, выделение ДНК, проведение ПЦР со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности генов ФНОα, ИЛ 4 и ИЛ 10.

Способы диагностики, контроля и профилактики воспаления и смягчения воспалительных состояний у псовых // 2564089

Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для лечения остеоартрита у псовых. Способ по изобретению включает введение псовым диеты, содержащей в перерасчете на сухую массу: DHA+ЕРА 0,5-2,5%, витамин C 75-1000 мг/кг, витамин E 250-1000 мг/кг, L-карнитин 100-1000 мг/кг.

Биомаркер для болезни альцгеймера или умеренного когнитивного расстройства // 2563987

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного расстройства. Сущность способа состоит в том, что способ включает измерение в крови десмостерола, бета-амилоида, гельсолина.

Способ специфической детекции trichophyton mentagrophytes в клиническом материале при различных клинических формах заболевания // 2563619

Изобретение относится к области медицины и предназначено для детекции гриба Trichophyton mentagrophytes. Осуществляют выделение тотальной нативной ДНК из образца кожи и волос, проводят полимеразную цепную реакцию и амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton mentagrophytes с использованием специфических праймеров.

Способ комплексной диагностики воспалительного процесса вульвы и влагалища бактериальной этиологии у девочек в возрасте от 0 до 8 лет // 2563182

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для диагностики воспалительного процесса вульвы и влагалища бактериальной этиологии у девочек в возрасте от 0 до 8 лет.

Способ определения аллельного полиморфизма ccr5 delta 32 // 2563172

Изобретение относится к области медицинской генетики и предназначено для определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32. Осуществляют выделение ДНК из криоконсервированной пуповинной крови.

Способ прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения // 2562559

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Сущность способа состоит в том, что определяют оптическую плотность экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF) в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению экстракорпорального оплодотворения, и дополнительно определяют содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции фолликулов, систолодиастолическое отношение (S/D) и индекс резистентности (IR) спиральных артерий в день введения триггера овуляции, а затем рассчитывают значение регрессионной функции (Z) по формуле.

Мультиплексный анализ стопочного трансгенного белка // 2561458

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выявления присутствия двух или более представляющих интерес белков с известными аминокислотными последовательностями в образце растительного происхождения (варианты) и способу сохранения генотипа сорта трансгенного растения.

Способ прогнозирования риска невынашивания первой половины беременности // 2566728

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для прогнозирования риска невынашивания первой половины беременности. Осуществляют выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентки и проводят генотипирование. При выявлении аллеля А rs-4680 гена катехол-О-метилтрансферазы СОМТ прогнозируют повышенный риск невынашивания беременности. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование риска невынашивания первой половины беременности при помощи специфичности генетических маркеров. 1 ил., 4 пр.

Способ прогнозирования отслойки хориона в первом триместре беременности // 2566729

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для прогнозирования отслойки хориона на ранних сроках беременности. Осуществляют выделение ДНК с последующей амплификацией полиморфных вариантов Arg353Gln (G10976A) гена коагуляционного фактора VII и Ile22Met (A66G) гена метионинсинтазы редуктазы (MTRR) при помощи метода ПЦР. При выявлении сочетания гетерозиготы GA полиморфного варианта Arg353Gln (G10976A) гена коагуляционного фактора VII с гомозиготой GG полиморфного варианта Ile22Met (A66G) гена MTRR прогнозируют риск развития отслойки хориона в первом триместре беременности. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование отслойки хориона в первом триместре беременности на основании определения сочетания генотипов генов тромбофилии и фолатного цикла. 4 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца с ишемической и/или постинфарктной дисфункцией миокарда на фоне хронической сердечной недостаточности // 2568577

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца с ишемической и/или постинфарктной дисфункцией миокарда на фоне хронической сердечной недостаточности. Сущность способа состоит в том, что при выявлении уровня тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 более 242,8 нг/мл и сердечно-сосудистого сопряжения более 1,29 риск развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий оценивается как высокий. Использование заявленного способа позволяет точно осуществить прогноз риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца с ишемической и/или постинфарктной дисфункцией миокарда на фоне хронической сердечной недостаточности. 2 ил., 3 табл., 2 пр.

Устройства, способы и наборы для иммунохроматографии // 2568875

Группа изобретений относится к устройствам и способам анализа с использованием специфического связывания и предназначена для определения наличия или количества аналита в пробном образце. Иммунохроматографическое устройство содержит мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, и структуру с конъюгатами, соединенную по текучей среде с мембраной в проксимальном конце. Данная структура содержит детектирующее антитело, имеющее конъюгированный с ним репортерный фрагмент. Каждое из указанных захватывающего и детектирующего антител представляет собой моноклональное антитело, производимое гибридомными клетками, депонированными под номером доступа DSM АСС3092 (моноклональное антитело LG96) или DSM АСС3093 (моноклональное антитело MG97). Аналит представляет собой белок Z-ААТ, присутствующий в образце от носителя гена PiZ. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность определения наличия аналита, в частности белка Z-ААТ. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 33 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ прогнозирования полиорганных нарушений с целью определения оптимального времени проведения остеосинтеза при сочетанной и множественной травме у детей // 2569727

Изобретение относится к медицине, а именно к детской травматологии, и может быть использовано для лечения переломов у детей с политравмой. Для определения оптимального времени проведения остеосинтеза в первые часы после травмы в сыворотке крови определяют концентрации маркеров белка S100 и цистатина С: исходные концентрации белка S100 312,2-587,8 нг/л и цистатина С 832,8-1062 нг/мл с последующим двукратным и более увеличением их в течение 1-4 суток расценивают как проявления тяжелых нарушений метаболизма мозга и почек, оптимизируют общее лечение, проводят отсроченный остеосинтез не ранее 5-7 суток; исходные концентрации белка S100 103,8-292,0 нг/л и цистатина С 541-967 нг/мл с последующим увеличением их менее чем в два раза или снижением в 1-е и последующие сутки расценивают как нарушения метаболизма мозга и почек обратимого функционального характера и оптимальным временем для остеосинтеза считают 1-4 сутки с момента травмы. Использование способа позволяет выявить скрытые органные нарушения, оценить степень их тяжести и провести остеосинтез в оптимальные сроки, что повысит эффективность лечения сочетанной и множественной травмы у детей. 4 табл., 8 ил., 3 пр.

Способ прогнозирования затяжного течения внебольничной пневмонии // 2569746

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, и предназначено для прогнозирования медленно разрешающегося (затяжного) течения внебольничной пневмонии. У пациента определяют наличие хронической обструктивной болезни легких, мультилобарного поражения легких и осложненного течения заболевания, а также наличие полиморфизма G-308A гена фактора некроза опухоли-α (ФНОα). Полученные данные включают в функцию логистического распределения и вероятность развития затяжного течения внебольничной пневмонии определяют по формуле 1-LOGIT(u). Изобретение обеспечивает раннее выявление больных с высоким риском развития затяжного течения внебольничной пневмонии, требующих более агрессивного медикаментозного лечения, что позволит сократить длительность пребывания пациентов в стационаре и сроки их временной нетрудоспособности. 1 ил., 5 табл., 2 пр.

Способ ранней диагностики заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца // 2569763

Изобретение относится к области медицины, в частности к области медицинской диагностики, и описывает способ ранней диагностики заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца. Способ характеризуется тем, что проводят корреляционный анализ зависимости: доза марганца из питьевой воды - содержание марганца в крови ребенка, дополнительно проводят корреляционный анализ между уровнем гамма-аминомасляной кислоты и/или глутамата в сыворотке крови и уровнем марганца в крови и при определении в цельной крови пациентов уровня марганца выше референтного уровня, который составляет 0,011 мг/дм3, одновременно с определением в сыворотке крови пациентов уровня глутамата выше референтного уровня, который составляет 83,24 мкмоль/дм3, и/или с определением в сыворотке крови пациентов уровня гамма-аминомасляной кислоты ниже референтного уровня, который составляет 0,077 мкмоль/дм3, диагностируют донозологическую стадию, предшествующую развитию заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца. Изобретение может использоваться для планирования санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению воздействия вредных веществ, в частности марганца, на нервно-психическое развитие детей. 2 табл.

Биологический способ анализа для контроля качества нутрицевтиков и лекарственных средств // 2570626

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ обнаружения вещества, которое опосредует положительную регуляцию транскрипции гена биологического маркера, или определения, опосредует ли вещество положительную регуляцию транскрипции гена биологического маркера, состоит из следующих этапов: обеспечение первой системы анализа, включающей последовательность мРНК, которая содержит область, кодирующую первый репортерный белок, функционально связанную с промотором первого биологического маркера; обеспечение второй системы анализа, включающей вторую последовательность мРНК, которая содержит область, кодирующую второй репортерный белок, функционально связанную с промотором второго биологического маркера; осуществление контакта указанной второй системы анализа с веществом; осуществления контакта указанной первой системы анализа со стандартным веществом или контрольным веществом и определение уровней транскрипции указанных первой и второй последовательностей мРНК. При этом уровень транскрипции второй последовательности мРНК выше, чем уровень транскрипции первой последовательности мРНК, если указанное вещество опосредует положительную регуляцию транскрипции гена биологического маркера. Гены первого биологического маркера и второго биологического маркера выбраны из группы, состоящей из проапоптотического белка, гомологичного С/ЕВР (CHOP), связывающего шаперонного белка эндоплазматического ретикулума (BiP), фактора активации транскрипции 4 (ATF-4), белка 1, связывающего X-box (Xbp-1) и синтетазы аминокислот. 13 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

Средне-региональный предшественник предсердного натрийуретического пептида (pro-anp) для идентификации пациентов с фибрилляцией предсердий, начавшейся меньше чем 48 часов тому назад // 2570755

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для определения времени от начала фибрилляции предсердий до поступления пациента в клинику. Для этого у пациента берут образец биологической жидкости, определяют уровень proANP (SEQ ID NO: 1) или его фрагментов в указанном образце, причем указанные фрагменты имеют длину по меньшей мере 6 аминокислотных остатков. Способ позволяет определить корреляцию между уровнем proANP или его фрагментов и временем от начала фибрилляции предсердий до поступления указанного пациента в клинику. 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

Способ оценки неспецифической резистентности организма при дисплазии тазобедренного сустава у детей // 2571500

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки неспецифической резистентности организма при дисплазии тазобедренного сустава у детей. Сущность способа состоит в том, что после клинического обследования и верификации диагноза больного осуществляют забор биологического материала - венозной крови. Готовят образцы проб сыворотки крови. Исследуют методом твердофазного иммуноферментного анализа с определением количественного значения олигомерного матриксного хрящевого белка и спектрофотометрически при длине волны 254 нм уровня среднемолекулярных пептидов. При количественном значении олигомерного матриксного хрящевого белка более 1785 нг/л и уровне среднемолекулярных пептидов более 0,38 ед. опт. пл. судят о снижении неспецифической резистентности организма. Изобретение позволяет повысить точность оценки неспецифической резистентности организма за счет использования в качестве критерия оценки показателей, более объективно отражающих способность детского организма к ответной реакции на внешние факторы воздействия и наличие патологии, а именно дисплазии тазобедренного сустава. 1 пр.