Устройства, способы и наборы для иммунохроматографии
Группа изобретений относится к устройствам и способам анализа с использованием специфического связывания и предназначена для определения наличия или количества аналита в пробном образце. Иммунохроматографическое устройство содержит мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, и структуру с конъюгатами, соединенную по текучей среде с мембраной в проксимальном конце. Данная структура содержит детектирующее антитело, имеющее конъюгированный с ним репортерный фрагмент. Каждое из указанных захватывающего и детектирующего антител представляет собой моноклональное антитело, производимое гибридомными клетками, депонированными под номером доступа DSM АСС3092 (моноклональное антитело LG96) или DSM АСС3093 (моноклональное антитело MG97). Аналит представляет собой белок Z-ААТ, присутствующий в образце от носителя гена PiZ. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность определения наличия аналита, в частности белка Z-ААТ. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 33 ил., 1 табл., 5 пр.
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/386214, поданной 24 сентября 2010 г. и предварительной заявке США № 61/482867, поданной 5 мая 2011 г., обе они включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к устройствам и способам анализа с использованием специфического связывания, в частности иммунохроматографическим устройствам и способам анализа.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В способах проточного анализа для определения наличия и/или концентрации аналитов, которые могут присутствовать в пробном образце, обычно применяют различные аналитические методы и устройства. Тесты с латеральными потоками, также известные как иммунохроматографические способы анализа с латеральными потоками или способы анализа с латеральными потоками (LFA), обычно применяют, например, в устройствах для медицинской диагностики по месту лечения (POC). Отдельные схемы анализа приспосабливают к конкретному применению.
Дефицит альфа-1-антитрипсина (AATD) представляет собой наследственное заболевание, которые можно диагностировать посредством генетического обследования. При этом AATD гиподиагностируют и только 10-15% выявляют. У не выявленных пациентов иногда неверно диагностируют соответственно "обычное" хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) и астму.
Сохраняется необходимость в эффективном способе анализа с латеральными потоками для определения наличия аналита, в частности белка Z-AAT.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает иммунохроматографическое устройство, содержащее мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне. Данное захватывающее антитело способно к связыванию с аналитом. Аналит может представлять собой белок Z-AAT, присутствующий в образце от носителя гена PiZ.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает устройство для иммуноанализа, содержащее: мембрану, несущую область захвата белка Z-AAT, определяемую посредством захватывающего антитела, иммобилизованного в ней, причем данное захватывающее антитело представляет собой антитело к белку Z-AAT.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает устройство для иммуноанализа для определения наличия или количества белка Z-AAT в текучем образце. Данное устройство содержит:
область нанесения образца;
микропористую мембрану, несущую область захвата белка Z-AAT, определяемую посредством захватывающего антитела, иммобилизованного в ней, причем данное захватывающее антитело представляет собой LG96 или его антигенсвязывающий фрагмент;
путь потока от области нанесения образца до области захвата белка Z-AAT, причем наличие или количество белка Z-AAT в текучем образце можно определять по образованию комплекса между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в текучем образце; и
структуру с конъюгатами, расположенную в пути потока, причем данная структура с конъюгатами содержит детектирующий реагент, специфичный к белку Z-AAT, причем данный детектирующий реагент является подвижным или мобилизуемым, причем данный детектирующий реагент представляет собой конъюгированное с золотом LG96 или его конъюгированный с золотом антигенсвязывающий фрагмент.
В одном аспекте предлагается способ обнаружения белка Z-AAT у субъекта. Данный способ включает в себя:
нанесение биологического образца от данного субъекта на устройство для иммуноанализа настоящего изобретения; и
обнаружение комплекса, образованного между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в текучем образце, причем обнаружение данного комплекса указывает на наличие белка Z-AAT в данном образце.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ определения носителя гена PiZ. Данный способ включает в себя подвергание образца от субъекта иммунохроматографии с применением устройства в соответствии с настоящим изобретением; и определение связывания аналита с захватывающим антителом, причем связывание аналита с захватывающим антителом указывает на то, что данный субъект является носителем PiZ.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает способ диагностирования состояния или заболевания, связанного с дефицитом AAT. Данный способ включает в себя подвергание образца от субъекта иммунохроматографии с применением устройства в соответствии с настоящим изобретением; и определение связывания аналита с захватывающим антителом, причем связывание аналита с захватывающим антителом указывает на то, что данный субъект имеет данное состояние или заболевание.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает способ определения предрасположенности субъекта к развитию состояния или заболевания, связанного с дефицитом AAT. Данный способ включает в себя подвергание образца от субъекта иммунохроматографии с применением устройства в соответствии с настоящим изобретением; и определение связывания аналита с захватывающим антителом, причем связывание аналита с захватывающим антителом является признаком предрасположенности субъекта к развитию состояния или заболевания.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ определения наличия белка Z-AAT в биологическом образце. Данный способ включает в себя: помещение биологического образца и первого антитела в смешанном состоянии на мембрану, несущую второе антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, причем как первое, так и второе антитело способны к связыванию с белком Z-AAT; причем захват второго антитела в тестовой зоне указывает на наличие белка Z-AAT в данном образце.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает набор, содержащий устройство в соответствии с настоящим изобретением; и детектирующий реагент.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 показывает результаты тестирования совместимых пар, сэндвичный ELISA с моноклональными антителами LG96 и MG97. Частично очищенные моноклональное антитела LG96 и MG97 применяли или в качестве захватывающих антител, или в качестве детектирующих антител, меченых с помощью пероксидазы хрена (LG96HRP или MG97HRP соответственно). Смешанную сыворотку ZZ или MM последовательно разбавили буфером для образца и использовали в качестве раствора антигена. Совместимые пары LG96-LG96HRP, LG96-MG97HRP, MG97-LG96HRP и MG97-MG97HRP демонстрируют специфическое связывание с сывороткой PiZZ, но не с сывороткой PiMM.
Фиг.2 показывает результаты тестирования перекрестной реактивности моноклональных антител LG96 и MG97 с покрывающим AAT (M-форма). M-специфичные антитела F43.8.1 и 1AT играют роль положительного контроля и демонстрируют очень сильное специфическое связывание с покрывающим AAT (M-форма). Напротив, антитела LG96 и MG97 демонстрируют отсутствие связывания с покрывающей M-формой AAT.
Фиг.3 иллюстрирует схему устройства для анализа с латеральными потоками (LFA) для иммунохроматографии в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг.4 иллюстрирует схему с фиг.3, причем образец не содержит целевой аналит.
Фиг.5 представляет собой изображение устройства для LFA, причем иммунохроматографические компоненты изображены заключенными в корпус, изготовленный, например, из пластмассы. Тестовая линия или зона не показана, что указывает на то, что результаты теста на наличие аналита в образце отрицательны. Контрольная линия или зона положительна, что указывает на то, что устройство работает правильно.
Фиг.6 иллюстрирует схему с фиг.3, причем образец содержит целевой аналит.
Фиг.7 представляет собой изображение устройства для LFA, причем иммунохроматографический компоненты изображены заключенными в корпус, как на фиг.5. Тестовая линия или зона показана присутствующей, что указывает на то, что результаты теста на наличие аналита в образце положительны. Контрольная линия или зона также положительна, что указывает на то, что устройство работает правильно.
Фиг.8 иллюстрирует принцип LFA в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, причем образец представляет собой кровь от индивидуума типа ZZ. Захватывающее антитело LG96; детектирующее антитело MG97, конъюгированное с HRP; контрольное антитело: Ig.
Фиг.9 иллюстрирует принцип LFA в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, причем образец представляет собой кровь от индивидуума типа MM. Захватывающее антитело LG96; детектирующее антитело MG97, конъюгированное с HRP; контрольное антитело: Ig.
Фиг.10 иллюстрирует принцип LFA в соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения, причем образец представляет собой кровь от индивидуума типа MZ. Захватывающее антитело LG96; детектирующее антитело MG97, конъюгированное с FIRP; контрольное антитело: Ig.
Фиг.11 показывает кривые результатов связывания LG96-MG97HRP с сывороткой ZZ и MM.
Фиг.12 показывает результаты специфического связывания LG96-MG97HRP с сывороткой ZZ. Связывание с сывороткой MM отсутствует.
Фиг.13 показывает результаты скрининга реальных образцов (разведение 1:20) в контрольных тестах.
Фиг.14 показывает определение концентрации Z-AAT в различных коммерчески доступных и собственных образцах сыворотки/плазмы с применением PiZZ-ELISA.
Фиг.15A-15D показывают тестирование образцов сыворотки #1-6 со всеми возможными комбинациями антител, причем антитело, указанное первым, является захватывающим антителом, иммобилизованным на нитроцеллюлозе, а антитело, указанное после косой черты, является детектирующим антителом, соединенным с частицами золота.
Фиг.16 показывает вид сбоку одного варианта осуществления устройства настоящего изобретения.
Фиг.17 представляет собой продольное сечение устройства, показанного на фиг.16.
Фиг.18 представляет собой увеличенное изображение загрузочной области устройства, показанного на фиг.16.
Фиг.19 представляет собой увеличенное представление реакционной области: (A) устройства, показанного на фиг.16; и (B) другого варианта осуществления устройства, в котором устройство содержит отдельный картридж.
Фиг.20 показывает вид сбоку колпачка и режущей части устройства, показанного на фиг.16.
Фиг.21 представляет собой продольное сечение одного варианта осуществления устройства настоящего изобретения.
Фиг.22 представляет собой другой вариант осуществления устройства настоящего изобретения.
Фиг.23 представляет собой устройство настоящего изобретения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.
Фиг.24 представляет собой устройство настоящего изобретения в соответствии с другими вариантами осуществления.
Фиг.25 представляет собой устройство настоящего изобретения в соответствии с некоторыми другими вариантами осуществления.
Фиг.26 показывает результаты трех отдельных скринингов ZZ(+) образцов сыворотки с применением одного варианта осуществления устройства настоящего изобретения.
Фиг.27 показывает тестирование капиллярной крови в сравнении с образцами сыворотки (сравнение 20 мкл капиллярной крови и образца сыворотки от одного и того же донора). Тестовые сигналы измеряли через 15 минут с применением оптического считывателя (QuickSens Omega 100 reader). Количества в мг/дл указывают на уровень AAT в сыворотке, определяемый нефелометрически.
Фиг.28 показывает воздействие различных антикоагулянтов на результаты теста. Контроль: сыворотка ММ. Тестируемые образцы: плазма ZZ-ЭДТА, плазма ZZ-цитрат и ZZ-гепарин плазма. Тестовые сигналы измеряли оптическим считывателем через 15 минут после начала теста. Количества в мг/дл указывают на уровень AAT в сыворотке, определяемый нефелометрически.
Фиг.29 показывает тестируемые образцы сыворотки от: (A) MM донора; (B) ZZ донора; и (C) SZ донора (использовали образцы сыворотки по 20 мкл, и результаты показаны после различных промежутков времени). "Vol." представляет собой интенсивность сигнала тестовой линии (T), измеренную посредством оптического считывателя. Контрольная линия обозначена "C".
Фиг.30 показывает сводку тестирования по n-65 тестам с сывороткой и цельной кровью. 0=образцы PiMM; 1=образцы PiMZ, PiSZ и PiZZ. Тестовые сигналы измеряли после 15-20 минут с применением оптического считывателя.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает иммунохроматографическое устройство, содержащее мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне. Данное захватывающее антитело способно к связыванию с аналитом. В предпочтительном варианте осуществления аналит представляет собой белок Z-AAT. Данное устройство можно применять, для того чтобы определять наличие аналита в образце.
Термин "белок Z-AAT", как применяется в настоящем описании, относится к полимеру(ам) из аминокислот Z-AAT и не предназначен для обозначения определенной длинны данного белка; следовательно, его фрагменты включены в определение "белка Z-AAT". Данный термин также включает формы, варианты и аналоги белка Z-AAT, включая мономеры, димеры, мультимеры и т.д., а также посттрансляционные модификации данного белка, например гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и тому подобные. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления термин "белок Z-AAT" может быть синонимом термина "полипептид Z-AAT" или может относиться к комплексу из двух или более Z-AAT полипептидов (например, димерному, мультимерному, агрегированному).
Образец
Образец, обычно, относится к материалу, который может содержать или не содержать аналит. Образец можно использовать непосредственно как он получен из источника или после предварительной обработки для модификации или изменения характеристик образца. Источником образца может быть любой биологический источник, такой как физиологическая жидкость, включая, но без ограничения, кровь, интерстициальную жидкость, слюну, внутриглазную жидкость, цереброспинальную жидкость, пот, мочу, молоко, асцитную жидкость, хрипы, синовиальную жидкость, перитонеальную жидкость, вагинальную жидкость, амниотическую жидкость или тому подобное. Предпочтительно, образец представляет собой водный образец.
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой неразбавленный образец, т.е. образец получают из биологического источника и наносят непосредственно на устройство без какого-либо предварительного разбавления образца. В других вариантах осуществления образец предварительно обрабатывают перед использованием, как например получают плазму из крови, разбавляют вязкие жидкости и тому подобное. Предварительная обработка образца может включать в себя фильтрацию, осаждение, разбавление, перегонку, концентрирование, инактивацию мешающих компонентов и добавление реагентов. В одном варианте осуществления в качестве источника образца можно применять твердый материал, исследуемый на содержание аналита, предпочтительно посредством модификации твердого материала в форму жидкой или полужидкой композиции.
В одном варианте осуществления образец представляет собой цельную кровь, плазму или сыворотку. В другом варианте осуществления образец представляет собой капиллярную кровь.
Мембрана
Устройство настоящего изобретения обеспечивает мембранный иммунохроматографический анализ для определения наличия или количества аналита в образце. В предпочтительных вариантах осуществления аналит представляет собой белок Z-AAT. Например, в одном варианте осуществления аналит представляет собой белок Z-AAT, причем наличие аналита в образце крови, полученном от млекопитающего (например, человека), указывает на то, что данное млекопитающее является носителем гена PiZ.
Мембрану можно изготавливать из любого из множества материалов, через которые образец способен проходить. Например, материалы, применяемые для того, чтобы сформировать мембрану, могут включать, но без ограничения, натуральные, синтетические или встречающиеся в природе материалы, которые подвергают синтетической модификации, такие как полисахариды (например, целлюлозные материалы, такие как бумага, и производные целлюлозы, такие как ацетат целлюлозы и нитроцеллюлоза); полиэфирсульфон; нейлоновые мембраны; кремнезем; неорганические материалы, такие как деактивированный оксид алюминия, диатомитовая земля, MgSO4 или другой неорганический мелкоизмельченный материал, равномерно распределенный в пористой полимерной матрице, с полимерами, такими как винилхлорид, сополимер винилхлорида и пропилена и сополимер винилхлорида и винилацетата; ткань, как натуральная (например, хлопок), так и синтетическая (например, нейлон или искусственный шелк); пористые гели, такие как силикагель, агароза, декстран и желатин; полимерные пленки, такие как полиакриламид; и тому подобное.
В одном варианте осуществления мембрану формируют из нитроцеллюлозных и/или полиэфирсульфоновых материалов. Нитроцеллюлоза может представлять собой азотнокислые эфиры целлюлозы, которые могут представлять собой одну нитроцеллюлозу или смешанные сложные эфиры азотной кислоты и других кислот, таких как алифатические карбоновые кислоты с одним или несколькими атомами углерода.
В некоторых вариантах осуществления мембрана содержит нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлоза может обладать способностью связывать белки без необходимости в предварительной сенсибилизации. Некоторые реагенты, такие как антитела, можно наносить непосредственно на нитроцеллюлозу и иммобилизовывать на ней. Химическая обработка, которая может помешать основной специфической связывающей активности реагента, требуется небольшая или не требуется. Неиспользованные участки связывания на нитроцеллюлозе можно затем блокировать с помощью простых материалов, таких как поливиниловый спирт. Кроме того, нитроцеллюлоза с различными размерами пор легко доступна, и это облегчает выбор материала мембраны, подходящего для конкретных требований, таких как скорость потока образца и т.д.
В одном варианте осуществления мембрана содержит одну тестовую зону, или линию, или участок, несущий захватывающее антитело, связанное с ним.
В других вариантах осуществления мембрана содержит несколько тестовых зон, расположенных, например, последовательно, на мембране, через которые водный образец может поступательно проходить. В одном варианте осуществления несколько тестовых зон можно применять для получения количественного измерения аналита, или, в другом варианте осуществления, можно нагружать индивидуально различными специфическими захватывающими антителами для получения теста на несколько аналитов.
В других вариантах осуществления мембрана содержит контрольную зону, для того чтобы обеспечивать определение того, что устройство работает. Предпочтительно, контрольная зона расположена по направлению потока от тестовой зоны (тестовых зон), в которых определяют искомый результат теста. Индикатор положительного контроля, следовательно, предоставляет информацию о том, что образец по меньшей мере прошел требуемое расстояние по мембране.
Например, контрольную зону можно нагружать антителом или другой молекулой/реагентом, который будет связываться с детектирующим реагентом, для того чтобы подтверждать, что образец продвинулся по мембране достаточно. Например, если детектирующий реагент представляет собой меченое антитело, полученное из мышиной гибридомы, то контрольная зона может содержать "антимышиное" антитело (например, антимышиный IgG). В другом варианте осуществления контрольная зона может содержать безводный реагент, который, при увлажнении, изменяет цвет или окрашивается, например безводный сульфат меди, который становится синим при увлажнении водным образцом. В качестве еще одного варианта осуществления контрольная зона может содержать иммобилизованный аналит (например, белок Z-AAT), который будет реагировать с избытком детектирующего реагента.
В одном варианте осуществления мембрана содержит контрольную зону, несущую контрольное антитело, связанное с ней, причем контрольное антитело способно к связыванию с детектирующим реагентом. В некоторых вариантах осуществления контрольное антитело представляет собой антимышиный IgG.
Захватывающее антитело
В предпочтительных вариантах осуществления захватывающее антитело, которое связано с мембраной в тестовой зоне, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфичны к белку Z-AAT.
Антитело в различных вариантах осуществления проявляет по существу малую перекрестную реактивность к сывороткам PiMM или очищенному AAT дикого типа или не проявляет ее.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Термины "поликлональное" и "моноклональное" относятся к степени гомогенности препарата антитела, и не предназначены для ограничения конкретных способов получения. Термин "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела", как применяется в настоящем описании, относится к популяции молекул антитела, которая содержит антигенсвязывающий участок только одного вида, способный к иммунной реакции с конкретным эпитопом.
Фрагменты антител включают, но без ограничения, одноцепочечные, химерные, гуманизированные, приматизированные или венированные антитела также рассматриваются. Например, фрагменты антитела, способные к специфическому связыванию с белком Z-AAT, могут включать, но без ограничения, Fab', Fab, F(ab')2, однодоменные антитела (DAB), Fv, scFv (одноцепочечные Fv), линейные антитела, диатела, камелизированные антитела и тому подобное. Способы получения и применения различных основанных на антителах конструкций и фрагментов хорошо известны в данной области техники. Такие фрагменты можно получать посредством ферментативного расщепления или посредством рекомбинантных методов. Например, расщепление папаином или пепсином может давать, соответственно, фрагменты Fab или F(ab')2. Другие протеазы с нужной субстратной специфичностью также можно применять для получения фрагментов Fab или F(ab')2. Антитела также можно получать во множестве процессированных форм с применением генов антител, в которые вводят один или несколько стоп-кодонов по направлению против хода транскрипции от естественного терминирующего участка. Например, можно разработать химерный ген, кодирующий часть тяжелой цепи F(ab')2, включающий последовательности ДНК, кодирующие домен CH1 и шарнирный участок тяжелой цепи.
Одноцепочечные антитела и химерные, гуманизированные, или приматизированные (с привитыми определяющими комплементарность областями (CDR-привитые)), или венированные антитела, а также химерные, CDR-привитые или венированные одноцепочечные антитела, содержащие участки, происходящие из различных видов, и тому подобные также охвачены настоящим изобретением. Различные участки данных антител можно объединять вместе химически посредством обычных методов или можно получать в виде непрерывного белка с применением методов генной инженерии.
В одном варианте осуществления захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, MG97 или их антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело MG97, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96. В одном варианте осуществления захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96.
Клетки типичного образца гибридомных клеточных линий, производящие моноклональное антитела LG96 и MG97, депонированы 14 сентября 2010 года в "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroder Weg 1b, 38124 Брауншвейг, Германия в соответствии с Будапештским договором под номерами доступа DSM ACC3092 и DSM ACC3093 соответственно.
Средний специалист в данной области техники может определить последовательности нуклеиновой кислоты моноклональных антител с применением ряда способов, известных в данной области техники. Нуклеиновые кислоты, кодирующие моноклональное антитело, можно клонировать, для того чтобы получить "рекомбинантное" моноклональное антитело. Можно использовать любой метод рекомбинантного клонирования, включая применение полимеразной цепной реакции (ПЦР), для того чтобы запустить синтез кодирующих антитело последовательностей нуклеиновой кислоты. Таким образом, способы получения моноклонального антитела включают способы, включающие в себя получение по меньшей мере первой подходящей молекулы или сегмента нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-Z-AAT антитело, от подходящей производящей анти-Z-AAT антитело клетки, предпочтительно гибридомы; и экспрессию молекулы или сегмента нуклеиновой кислоты в рекомбинантной клетке-хозяине, для того чтобы получить рекомбинантное анти-Z-AAT моноклональное антитело.
В данной области техники известны другие рекомбинантные методы, такие как, например, способы, основанные на фагмидных библиотеках. Например, способ может включать в себя: (a) иммунизирование животного посредством введения животному по меньшей мере одной дозы и, необязательно, более чем одной дозы композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество иммуногенного белка Z-AAT, предпочтительно композиции, содержащей активированные эндотелиальные клетки; (b) получение комбинаторной иммуноглобулиновой фагмидной библиотеки, экспрессирующей РНК, выделенную из производящих антитела клеток, предпочтительно из селезенки иммунизированного животного; (c) выбор из фагмидной библиотеки по меньшей мере первого клона, экспрессирующего по меньшей мере первое анти-Z-AAT антитело, необязательно такое, которое по существу перекрестно реагирует или конкурирует с моноклональным антителом LG96 или MG97; (d) получение нуклеиновых кислот, кодирующих анти-Z-AAT антитело, из по меньшей мере первого выбранного клона и экспрессирование нуклеиновых кислот в рекомбинантной клетке-хозяине, для того чтобы получить по меньшей мере первое анти-Z-AAT антитело; и (e) получение по меньшей мере первого анти-Z-AAT антитела, экспрессируемого нуклеиновыми кислотами, полученными из по меньшей мере первого выбранного клона.
В некоторых вариантах осуществления захватывающее антитело, которое связано с мембраной в тестовой зоне, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфичен к белку Z-AAT, причем антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) из моноклонального антитела LG96, MG97 или из обоих.
В другом варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент обладает такой же или схожей эпитопной специфичностью, что и моноклональное антитело LG96 или MG97. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты с эпитопной специфичностью такой же или схожей со специфичностью моноклонального антитела LG96 или MG97 можно идентифицировать с помощью множества способов, известных в данной области техники. Например, антитело с такой же или схожей эпитопной специфичностью можно идентифицировать исходя из способности конкурировать с моноклональным антителом за связывание с полипептидом Z-AAT. В другом примере связывание, например, LG96 mAb, и связывание антитела с такой же или схожей эпитопной специфичностью к полипептиду Z-AAT можно ингибировать одним пептидом (например, природным пептидом, синтетическим пептидом).
Не ограничивая себя одной конкретной теорией, можно полагать, что проблема с высокими концентрациями аналита в образце для тестирования может представлять собой так называемый "хук-эффект", который известен среднему специалисту в данной области техники как уменьшение детектируемого сигнала при очень высоких концентрациях аналита. Обычно при гетерогенной схеме сэндвичного анализа растворимое меченое антитело (например, детектирующий реагент) и антитело в твердой фазе (например, захватывающее антитело) присутствуют в избытке по отношению к определяемому аналиту, так что сэндвичные комплексы могут быть образованы, а также обнаружены, по существу полностью. Однако, при наличии высокой концентрации аналита, ограниченное количество антител встречается с очень большим количеством молекул аналита, который может присутствовать в образце. В крайнем случае имеет место дефицит антитела в твердой фазе, так что аналит связывается только частично и, кроме того, долю аналита, связанного с твердой фазой, нельзя полностью обнаружить, поскольку меченое антитело захвачено избытком аналита с образованием комплексов растворимое детектирующее антитело - аналит. Это может приводить к уменьшению измеренного сигнала, что может приводить к ложноотрицательному результату теста.
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой предварительно разбавленный образец, который затем подвергают иммунохроматографии.
В других вариантах осуществления мембрана содержит одну или несколько зон захвата, расположенных (например, последовательно) на мембране, каждая в проксимальном положении относительно тестовой зоны (тестовых зон), через которые водный образец может поступательно проходить до достижения тестовой зоны (тестовых зон). В некоторых вариантах осуществления одна или несколько зон захвата содержат иммобилизованное/связанное с ними моноклональное антитело LG96 или MG97. Одна или несколько зон захвата могут обеспечивать предупреждение, уменьшение или устранение хук-эффекта в способах анализа образцов, потенциально подверженных такому эффекту.
Структура с конъюгатами
В одном варианте осуществления устройство дополнительно содержит структуру с конъюгатами, несущую детектирующий реагент, такой как детектирующее антитело, меченое репортерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления структура с конъюгатами приведена в контакт с мембраной, причем, когда жидкость приходит в контакт со структурой с конъюгатами, детектирующий реагент регидратируется и переносится по мембране.
В других вариантах осуществления структура с конъюгатами соединена по текучей среде с мембраной в проксимальном конце мембраны.
В другом варианте осуществления структура с конъюгатами представляет собой подушку с конъюгатами, которая частично перекрывает мембрану в проксимальном конце мембраны.
Например, в некоторых вариантах осуществления структуру с конъюгатами изготавливают из впитывающего влагу пористого или волокнистого материала, способного быстро абсорбировать жидкость. Пористость материала может быть однонаправленной (например, с порами или волокнами, расположенными полностью или преимущественно параллельно оси структуры) или многонаправленной (например, всенаправленной, так что элемент обладает аморфной губкоподобной структурой). Можно использовать пористый полимерный материал, такой как полипропилен, полиэтилен, поливинилиденфторид, этиленвинилацетат, акрилонитрил и политетрафторэтилен. Полезно предварительно обработать данный материал поверхностно-активным веществом во время производства, поскольку это может уменьшить присущую материалу гидрофобность и, следовательно, усилить его способность принимать и доставлять влажный образец быстро и эффективно. Пористую структуру также можно изготавливать из бумаги или других целлюлозных материалов, таких как нитроцеллюлоза. В некоторых вариантах осуществления можно использовать материалы, которые в настоящее время применяют в наконечниках так называемых волоконных пишущих узлов, и таким материалам можно придавать форму или экструдировать с получением множества длин и поперечных сечений, соответствующих контексту настоящего изобретения. Предпочтительно, материал, содержащий пористую структуру с конъюгатами, выбирают так, чтобы данный пористый материал мог насыщаться водной жидкостью в течение секунд. Предпочтительно, материал остается прочным при увлажнении.
В других вариантах осуществления структура с конъюгатами представляет собой лак или глазурь, на которые нанесен слой детектирующего реагента. В одном варианте осуществления часть мембраны несет структуру с конъюгатами. Специалисту в данной области техники ясно, что, на практике, лак/глазурь не может образовывать настоящий поверхностный слой, и лакирующий/глазурующий материал может проникать до некоторой степени внутрь толщины мембраны. Нанесенный детектирующий реагент также может проникать внутрь мембраны. В соответствии с такими вариантами осуществления водный образец может течь вдоль длины мембраны и при этом растворять лак/глазурь и мобилизовать детектирующий реагент и переносить детектирующий реагент вдоль мембраны.
Детектирующий реагент
В предпочтительных вариантах осуществления детектирующий реагент представляет собой детектирующее антитело, меченое репортерным фрагментом.
В одном варианте осуществления детектирующее антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфичны к белку Z-AAT. Антитело в различных вариантах осуществления проявляет по существу малую перекрестную реактивность к сывороткам PiMM или очищенному AAT дикого типа или не проявляет ее.
В другом варианте осуществления детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, MG97 или его антигенсвязывающий фрагмент.
В других вариантах осуществления детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело MG97, причем захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96. В некоторых вариантах осуществления детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, причем захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело MG97. В некоторых вариантах осуществления захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96.
Репортерный фрагмент может быть любым из широкого диапазона материалов/репортерных систем, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления репортерный фрагмент содержит первый член пары лиганд-рецептор, включая, но без ограничения, фермент (например, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фрсфатазу, люциферазу, β-галактозидазу, глюкозооксидазу, лизоцим, малатдегидрогеназу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу); золь металла, золь селена, углеродный золь и тому подобное; окрашенные или способные окрашиваться частицы (например, окрашенные или способные окрашиваться частицы латекса); частицы коллоидного металла (например, коллоидное золото, коллоидное серебро, коллоидная платина, коллоидный селен). Примеры известных в данной области техники способов обнаружения репортера включают, но без ограничения, способы обнаружения посредством визуального осмотра, спектрофотометрии в ультрафиолетовом (УФ) и видимом диапазоне, флуорометрии и радиационных счетчиков.
Репортерный фрагмент может быть ковалентно или нековалентно связан/соединен с детектирующим антителом. Связывание/соединение можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники. Например, реагенты, применяемые при связывании/соединении, включают, но без ограничения, глутаральдегид, п-толуолдиизоцианат, различные карбодиимидные реагенты, п-бензохинон м-периодат, N,N1-o-фенилендималеимид, рекомбинантные способы и тому подобное.
Система разделения крови
В других вариантах осуществления устройство дополнительно содержит систему разделения крови для приема образца, причем данная система разделения крови соединена по текучей среде со структурой с конъюгатами. В одном варианте осуществления система разделения крови представляет собой система разделения крови, которая частично перекрывает подушку с конъюгатами.
В некоторых вариантах осуществления образец не следует наносить непосредственно на структуру с конъюгатами или мембранную часть устройства. В предпочтительном варианте осуществления образец наносят на систему разделения крови (например, абсорбирующий материал/подушку), которая соединена по текучей среде со структурой с конъюгатами. Например, система разделения крови может функционировать в качестве фильтра, например для удаления кровяных клеток из образца. Фильтрованный образец затем может достигать структуры с конъюгатами. В других вариантах осуществления в течение процесса фильтрации можно в то же время осуществлять добавление реагентов посредством их выделения из компонентов, присутствующих в системе разделения крови в сухом состоянии. С помощью таких компонентов можно удалять из раствора мешающие факторы. Таким образом, например, аскорбиновую кислоту, присутствующую в образце, которая может мешать при применении оксидаз и пероксидаз как средств мечения, можно делать неэффективной посредством подходящего окисляющего средства. Система разделения крови также может функционировать в качестве адсорбента, который удаляет мешающие факторы из образца посредством адсорбции.
Дистальная структура
Предпочтительно, детектирующий реагент (например, меченое антитело) перемещается с жидким образцом к тестовой зоне. Поток образца продолжается за пределами тестовой зоны, и на мембрану наносят достаточно образца, для того чтобы это было возможно. В некоторых вариантах осуществления устройство дополнительно содержит дистальную структуру, соединенную по текучей среде с мембраной, у дистального конца мембраны, причем данная дистальная структура выполнена с возможностью обеспечения достаточного потока от проксимального конца до дистального конца. Дистальная структура функционирует по меньшей мере в качестве поглощающего "приемника" на дистальном конце мембраны. Поглощающий приемник может содержать, например, ватманскую хроматографическую бумагу 3MM.
В одном варианте осуществления дистальная структура представляет собой подушку с адсорбентом, которая частично перекрывает мембрану в дистальном конце, причем данная подушка с адсорбентом выполнена с возможностью обеспечения достаточного потока от проксимального до дистального конца мембраны под действием капиллярных сил.
Способы
В некоторых вариантах осуществления при эксплуатации водный образец наносят на систему разделения крови в проксимальном конце устройства. Образец течет под действием капиллярных сил через структуру с конъюгатами и переносит детектирующий реагент от структуры с конъюгатами до тестовой зоны (тестовых зон), затем до контрольной зоны, для того чтобы вызвать, например, цветовой сигнал, видимый невооруженным глазом, независимо от того, содержит ли образец определяемый аналит. Определение аналита происходит в тестовой зоне (тестовых зонах). В некоторых вариантах осуществления пользователь устройства может определять, присутствует ли аналит в образце, сравнивая сигнал, получаемый из двух зон.
Например, в одном варианте осуществления, если тест используется для определения наличия белка Z-AAT в образце крови, полученном от млекопитающего, мембранный компонент устройства может содержать одну тестовую зону, несущую иммобилизованное в ней моноклональное антитело LG96; и одну контрольную зону, несущую иммобилизованный в ней антимышиный IgG. На мембрану в проксимальном конце мембраны может быть наложена подушка с конъюгатами, причем данная подушка с конъюгатами содержит моноклональное антитело MG97, меченое репортерным фрагментом, таким как, например, окрашенные частицы латекса. Обнаружение видимой полосы в тестовой зоне указывает на наличие белка Z-AAT в крови; и обнаружение видимой полосы в контрольной зоне подтверждает, что образец проник по мембране в достаточной степени.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает способ определения носителя гена PiZ. Данный способ включает в себя:
(a) подвергание образца иммунохроматографии с применением иммунохроматографического устройства, содержащего мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, причем данное захватывающее антитело способно к связыванию с аналитом, причем данный аналит представляет собой белок Z-AAT, присутствующий в образце от носителя гена PiZ, причем данное захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97; и
(b) определение сигнала в тестовой зоне, причем наличие сигнала в тестовой зоне указывает на то, что данный субъект является носителем PiZ.
В одном варианте осуществления детектирующий реагент представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97, причем данное антитело помечено репортерным фрагментом.
В других вариантах осуществления носитель PiZ обладает фенотипом, представляющим собой любую аллельную комбинацию с аллелем PiZ.
В некоторых вариантах осуществления фенотип представляет собой PiZZ, PiMZ, PiSZ или PiZ/Null.
В другом варианте осуществления циркуляция крови у субъекта имеет концентрацию белка Z-AAT, являющуюся детектируемой и тем самым указывающей на наличие аллеля PiZ.
В других вариантах осуществления носитель PiZ является гетерозиготным MZ носителем, имеющим сывороточный уровень AAT, равный по меньшей мере приблизительно 80 мг/дл.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает способ диагностирования состояния или заболевания, связанного с дефицитом AAT, причем данный способ включает в себя:
(a) подвергание образца иммунохроматографии с применением иммунохроматографического устройства, содержащего мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, причем данное захватывающее антитело способно к связыванию с аналитом, причем данный аналит представляет собой белок Z-AAT, присутствующий в образце от носителя гена PiZ, причем данное захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97; и
(b) определение сигнала в тестовой зоне причем наличие сигнала в тестовой зоне указывает на то, что субъект имеет данное состояние или заболевание.
Устройства
В других аспектах настоящее изобретение предлагает устройство для осуществления способов анализа со специфическим связыванием, в частности иммунохроматографических способов анализа. Устройства легко можно приспособить для использования антител и способов настоящего изобретения для обнаружения Z-AAT. Устройства для твердофазного анализа включают, но без ограничения, устройства для иммунохроматографического иммуноанализа, проточные аналитические устройства, титрационные микропланшеты, тест-полоски и иммуноанализ в капиллярах.
В предпочтительном варианте осуществления устройство, которое можно приспособить для использования с антителами и способами настоящего изобретения, описано в WO 2010/089102, которая включена в настоящее описание посредством ссылки благодаря идее устройства для жидкостей организма человека или животного.
В некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой одноразовую закрытую систему, имеющую ланцетный компонент и компонент для сбора крови, с использованием интегрированного интерфейса для капиллярного непосредственного определения дефицита альфа-1-антитрипсина.
В одном варианте осуществления устройство выполнено с возможностью осуществления сэндвичного иммуноанализа на антиген Z-AAT в соответствии с иммунохроматографическими способами и антителами настоящего изобретения. Вариант осуществления устройства 10, проиллюстрированный с помощью фиг.16 в качестве примера, имеет удлиненный цилиндрический корпус 11.
Колпачок 12 расположен на внутренней поверхности корпуса 11, будучи одной стороной обращен к держателю 13, который держит имеющий форму полоски элемент 45. Имеющий форму полоски элемент 45 вытянут в осевом направлении корпуса 11 и зафиксирован проксимальным концом в имеющей форму сопла входной трубке 44 имеющего форму чаши разделяющего элемента 41. Разделяющий элемент 41, который отделяет индикаторную область 40 от реакционной области 30, имеет открытое кверху поперечное сечение в форме чаши и герметично закреплен за счет неподвижной посадки в корпусе 11. Сквозное отверстие 42 в нижней части разделяющего элемента 41 открыто непосредственно в сторону имеющего форму полоски элемента 45. Разделяющий элемент 41 окружен сквозным отверстием 42 вставок 43 (фиг.17 и 19).
В некоторых вариантах осуществления имеющий форму полоски элемент 45 содержит мембрану (например, кусок микропористого абсорбирующего материала, такого как нитроцеллюлоза), который необязательно может быть нанесен на подложку (например, пластиковую подложку). В контакте с мембраной находятся: (a) структура с конъюгатами, несущая детектирующий реагент, такой как детектирующее антитело, меченое репортерным фрагментом; и (b) дистальная структура, например полоска второго абсорбирующего материала (например, ватманская хроматографическая бумага 3MM, стекловолокно), причем упомянутая дистальная структура находится в жидкостной связи с мембраной, для того чтобы способствовать прохождению анализируемых жидкостей по мембране от ее проксимального конца до дистального конца. Дистальная структура также функционирует в качестве абсорбента, который абсорбирует жидкости, прошедшие по мембране.
Мембрана содержит тестовую зону, несущую захватывающее антитело настоящего изобретения, иммобилизованное в ней. В одном варианте осуществления мембрана дополнительно содержит контрольную зону для обеспечения определения того, что устройство работает. Предпочтительно, контрольная зона расположена по направлению потока от тестовой зоны (тестовых зон), в которой определяют искомый результат теста. Индикатор положительного контроля, следовательно, предоставляет информацию о том, что образец по меньшей мере прошел требуемое расстояние по мембране. Например, контрольную зону можно нагружать антителом или другой молекулой/реагентом, который будет связываться с детектирующим реагентом, для того чтобы подтверждать, что образец продвинулся по мембране достаточно. Например, если детектирующий реагент представляет собой меченое антитело, полученное из мышиной гибридомы, то контрольная зона может содержать антимышиный IgG. В одном варианте осуществления захватывающее антитело в тестовой зоне представляет собой LG96 и/или MG97; детектирующий реагент представляет собой LG69, который помечен детектируемой меткой; и контрольная зона содержит антимышиный IgG, иммобилизованный в ней. В другом варианте осуществления, захватывающее антитело в тестовой зоне представляет собой LG96 и/или MG97; детектирующий реагент представляет собой MG97, который помечен детектируемой меткой; и контрольная зона содержит антимышиный IgG, иммобилизованный в ней.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько картриджей расположены непосредственно выше разделяющего элемента 41 в осевом направлении корпуса 11. В варианте осуществления, изображенном на фиг.19A, показано устройство, содержащее в реакционной области 30 три картриджа 31, 34 и 37; и в варианте осуществления, изображенном на фиг.19B, показано устройство с одним картриджем 37.
В качестве примера со ссылкой на фиг.19A в одном варианте осуществления каждый картридж 31, 34, 37 имеет цилиндрическую часть корпуса 31a, 34a, 37a, внешние размеры которой совпадают с внутренними размерами корпуса 11, и запечатан сверху и снизу герметизирующей пленкой 32/33, и 35/36, и 38/39. Картридж(и) может содержать буфер, реагент или другое химическое вещество, которое необходимо для анализа. Картридж(и) может быть изготовлен заводским способом и использоваться в заполненном и запечатанном состоянии при неподвижной посадке в корпусе 11, так что цилиндрические части корпуса лежат в осевом направлении одна на другой. В варианте осуществления, показанном на фиг.19A, участок имеющего форму полоски элемента 45, обращенный к картриджу 37, лежит своим нижним концом на верхнем крае разделяющего элемента 41. На противоположном верхнем конце картриджа 31 расположен фиксирующий элемент 15 в форме фиксирующей муфты, который может быть зафиксирован за счет эластичной деформации вплотную к внутренней стенке корпуса 11, так что один или несколько картриджей надежно расположены и/или держатся вплотную друг к другу.
Режущее устройство 19 расположено выше картриджей 31, 34 и 37, причем упомянутое режущее устройство содержит режущую часть 22. Режущая часть 22 содержит удерживающую основную часть 21 и цилиндрическое дополнение 21b, которое содержит в нижнем конце, обращенном к картриджу(ам) 31, 34, 37, режущий нож 23, например, нож, содержащий режущий зубец. Около нижнего конца цилиндрического выступа 21b расположен кольцевидный или цилиндрический герметизирующий элемент 16, который лежит на внутренней поверхности корпуса 11 и внешней части цилиндрического выступа 21b, и опирается в осевом направлении на верхнюю часть фиксирующей муфты 15.
Удерживающая основная часть 21 режущей части 22 имеет осевое центральное отверстие 21a, в которое вставлена капиллярная трубка 24. Цилиндрический колпачок 25 имеет внутреннее глухое отверстие 26, в котором установлена выступающая верхняя часть капиллярной трубки 24. На верхнем конце колпачка 25 находится рукоятка 28, которую пользователь может крутить и двигать колпачок 25 в осевом направлении. На нижнем конце напротив рукоятки 28 колпачка 25 находится направляющий элемент 27.
Как показано на фиг.20, удерживающая основная часть 21 режущей части 22 имеет радиально выступающий наружу направляющий штырь 17, который цепляет за направляющую, образованную в корпусе 11 в форме паза 14 в виде прорези (смотри также фиг.16). В соответствии с фиг.16 паз 14 имеет первый сегмент 14a в направлении по кругу корпуса 11, продолжающий первый сегмент 14a, второй сегмент 14b в продольном направлении корпуса 11, продолжающий второй сегмент 14b, третий сегмент 14c в направлении по кругу корпуса 11, продолжающий третий сегмент 14c, и четвертый сегмент 14d в продольном направлении корпуса 11, продолжающий четвертый сегмент 14d. В некоторых вариантах осуществления может быть предложен слегка сужающийся поперечный разрез у выступа 46 в переходном участке между третьим сегментом 14c и четвертым сегментом 14d, для того чтобы предупредить ошибочный переход направляющего штыря 17 из сегмента 14c в сегмент 14d. Зацепление направляющего штыря 17 в пазу 14 приводит к движению режущей части 22 относительно корпуса 11 и проходит сегменты 14a и 14c во вращательном движении и сегменты 14b и 14d в осевом движении.
Для того чтобы осуществлять анализ с помощью устройства 10, образец (например, цельную кровь) для исследования вводят в верхний участок 20. Например, колпачок 25 удаляют, для того чтобы открыть часть капиллярной трубки 24, которую затем приводят в контакт с каплей крови, например на кончике пальца субъекта. Образец входит в капиллярную трубку 24 под действием капиллярных сил. Затем колпачок 25 с глухим отверстием 26 помещают на капиллярную трубку 24 и сдвигают полностью так, чтобы уменьшить объем между нижней частью глухого отверстия 26 и верхним концом капиллярной трубки 24, что приводит к возрастанию давления, которое вынуждает образец выходить с нижнего конца капиллярной трубки 24 во внутреннюю часть 29 цилиндрического выступа 21b режущей части 22.
При помещении колпачка 25 назад на устройство сегмент 27a направляющего элемента 27 колпачка 25 зацепляется за отверстие 22a, так что осуществляется передача вращательного движения колпачка 25 на режущую часть 22. Пользователь вращает колпачок 25, и посредством этого режущая часть 22 также вращается, до тех пор пока направляющий штырь 17 может двигаться в сегменте 14a. Затем пользователь нажимает на колпачок 25, посредством этого также надавливая на режущую часть 22 в осевом направлении корпуса 11, до тех пор пока направляющий штырь 17 может двигаться в сегменте 14b - в результате этого осевого перемещения режущей части 22 режущее лезвие 23 приходит в контакт с верхней герметизирующей пленкой 32 картриджа 31, посредством этого разрушая/разрезая пленку 32. После разрушения пленки 32 образец, который присутствует во внутренней части 29 цилиндрического выступа 21b приходит в контакт с содержимым картриджа 31. Другие картриджи 34 и 37 все еще закрыты.
Для того чтобы начать следующую фазу тестирования, пользователь снова поворачивает колпачок 25, благодаря чему направляющий штырь 17 двигается вдоль сегмента 14c до переходного участка между сегментом 14c и сегментом 14d. В этом положении пользователь может продавить колпачок 25 дальше в корпус 11, так что режущая часть 23 сдвигается на достаточное расстояние внутри корпуса 11 для того, чтобы привести к разрушению как герметизирующую пленку 33 картриджа 31, так и герметизирующую пленку 35 картриджа 34. для того чтобы также разрушить/разрезать герметизирующие пленки 36, 38 и 39, колпачок 25 двигают дальше на соответствующее расстояние вдоль сегмента 14d. Таким образом, образец также успешно приходит в контакт с содержимым картриджей 34 и 37. Затем образец проходит в имеющий форму чаши сепаратор 41 и протекает через сквозное отверстие 42, приходя в контакт с лежащим непосредственно ниже имеющим форму полоски элементом 45, где он может вызывать изменение цвета, которое можно визуализировать через окно 18.
В других вариантах осуществления устройство дополнительно содержит ланцет 50 на дистальном конце корпуса 11 (см., например, фиг.21-25). Предпочтительно, ланцет представляет собой съемный ланцет.
Что касается фиг.21, то для того чтобы осуществлять анализ, в ткани тела делают отверстие в участке образца с применением ланцетного компонента устройства, для того чтобы получить образец. Затем колпачок 25 удаляют, для того чтобы открыть часть капиллярной трубки 24, которую затем приводят в контакт с образцом. Затем колпачок 25 помещают обратно на устройство 10 с глухим отверстием 26 на капиллярной трубке 24 и сдвигают полностью так, чтобы уменьшить объем между нижней частью глухого отверстия 26 и верхним концом капиллярной трубки 24. В одном варианте осуществления герметизирующая пленка 32 картриджа 31 разрушается, благодаря чему образец может вступить в контакт с буфером, содержащимся внутри картриджа 31, образуя композицию образец/буфер. Затем, после разрушения герметизирующей пленки 33, композиция образец/буфер приходит в контакт с имеющим форму полоски элементом 45, который в некоторых вариантах осуществления содержит мембрану; со структурой с конъюгатами, несущей детектирующий реагент, причем детектирующий реагент представляет собой детектирующее антитело, меченое репортерным фрагментом; и с дистальной структурой в жидкостном соединении с мембраной, причем композиция образец/буфер приходит в контакт со структурой с конъюгатами так, что композиция образец/буфер всасывается в нее посредством капиллярных сил (впитывания), таким образом приводя композицию образец/буфер в контакт с детектирующим реагентом. Смесь образец/буфер/детектирующий реагент непрерывно всасывается в мембранную часть имеющего форму полоски элемента 45, благодаря чему смесь приходит в контакт с захватывающим антителом, иммобилизованным на мембране в тестовой зоне, тем самым позволяя всем антигенам Z-AAT, которые могут присутствовать в смеси, связываться с захватывающим антителом. Необязательно, в устройство может впитываться раствор для промывания после достаточного количество времени после того, как смесь пришла в контакт с захватывающим антителом. Детектируемую метку детектирующего антитела затем визуализируют в области иммобилизованного захватывающего антитела. В предпочтительный вариант осуществления аналитического устройства включают положительный контроль на мембране поблизости, но отдельно от иммобилизованного захватывающего антитела, предпочтительно иммобилизованный на мембране в области, приходящей в контакт с перемещающейся жидкостью образца после того, как он вступает в контакт с областью иммобилизованного захватывающего антитела.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает устройство для иммуноанализа, содержащее: мембрану, несущую область захвата белка Z-AAT, определяемую посредством захватывающего антитела, иммобилизованного в ней, причем данное захватывающее антитело представляет собой антитело к белку Z-AAT.
В одном варианте осуществления захватывающее антитело представляет собой LG96 или его фрагмент.
В другом варианте осуществления захватывающее антитело представляет собой MG97 или его фрагмент.
В некотором варианте осуществления устройство дополнительно содержит область нанесения образца и путь потока от области нанесения образца до области захвата белка Z-AAT, причем наличие или количество белка Z-AAT в текучем образце можно определять по образованию комплекса между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в текучем образце.
В других вариантах осуществления устройство дополнительно содержит структуру с конъюгатами, расположенную в пути потока, причем данная структура с конъюгатами содержит детектирующий реагент, специфичный к белку Z-AAT, причем данный детектирующий реагент является подвижным или мобилизуемым.
В одном варианте осуществления детектирующий реагент представляет собой детектирующее антитело.
В некоторых вариантах осуществления детектирующее антитело представляет собой LG96 или его фрагмент.
В других вариантах осуществления детектирующее антитело представляет собой MG97 или его фрагмент.
В другом варианте осуществления детектирующее антитело помечено репортерным фрагментом.
В других вариантах осуществления детектирующее антитело представляет собой конъюгированное с золотом детектирующее антитело.
В некоторых других вариантах осуществления источником текучего образца является капиллярная кровь, сыворотка или плазма.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает устройство для иммуноанализа для определения наличия или количества белка Z-AAT в текучем образце. Данное устройство содержит:
область нанесения образца;
микропористую мембрану, несущую область захвата белка Z-AAT, определяемую посредством захватывающего антитела, иммобилизованного в ней, причем данное захватывающее антитело представляет собой LG96 или его антигенсвязывающий фрагмент;
путь потока от области нанесения образца до области захвата белка Z-AAT, причем наличие или количество белка Z-AAT в текучем образце можно определять по образованию комплекса между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в текучем образце; и
структуру с конъюгатами расположенную, в пути потока, причем данная структура с конъюгатами содержит детектирующий реагент, специфичный к белку Z-AAT, причем данный детектирующий реагент является подвижным или мобилизуемым, причем данный детектирующий реагент представляет собой конъюгированное с золотом LG96 или его конъюгированный с золотом антигенсвязывающий фрагмент.
В одном аспекте предлагается способ обнаружения белка Z-AAT у субъекта. Данный способ включает в себя:
нанесение биологического образца от данного субъекта на устройство для иммуноанализа настоящего изобретения; и
обнаружение комплекса, образованного между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в текучем образце, причем обнаружение данного комплекса указывает на наличие белка Z-AAT в данном образце.
Наборы
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ определения предрасположенности субъекта к развитию состояния или заболевания, связанного с дефицитом AAT, причем данный способ включает в себя:
(a) подвергание образца иммунохроматографии с применением иммунохроматографического устройства, содержащего мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, причем данное захватывающее антитело способно к связыванию с аналитом, причем данный аналит представляет собой белок Z-AAT, присутствующий в образце от носителя гена PiZ, причем данное захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97; и
(b) определение сигнала в тестовой зоне, причем наличие сигнала в тестовой зоне является признаком предрасположенности субъекта к развитию данного состояния или заболевания.
Настоящее изобретение в других аспектах предлагает набор, содержащий:
(a) иммунохроматографическое устройство в соответствии с настоящим изобретением, причем захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97; и
(b) детектирующий реагент.
В некоторых вариантах осуществления детектирующий реагент представляет собой детектирующее антитело, имеющее конъюгированный с ним репортерный фрагмент.
В одном варианте осуществления детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97, причем данное антитело помечено репортерным фрагментом.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает набор, содержащий моноклональное антитело LG96, MG97 или оба.
В других аспектах устройство и реагенты для осуществления иммуноанализа могут быть упакованы в форме набора. Например, такой набор может включать в себя соответствующее аналитическое устройство, антитела-реагенты и/или реагенты для развития данного анализа, такие как буферы и/или, при необходимости, реагенты для обнаружения выбранной метки.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает набор для определения наличия белка Z-AAT в биологическом образце субъекта, причем упомянутый набор содержит устройство, описанное в настоящем описании, необязательно с реагентами и/или инструкциями по применению.
В других вариантах осуществления набор необязательно может дополнительно включать в себя другие материалы/компоненты, нужные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая ланцеты, буферы (например, буфер для образца, CANDOR Bioscience GmbH, Wangen, Германия), разбавители, фильтры, капилляры (например, капилляр 20 мкл), иглы и/или шприцы, например для забора/получения биологического образца.
В некоторых других вариантах осуществления набор может также включать в себя систему, делающую возможным регистрацию результатов теста. Результаты могут быть зарегистрированы визуально или инструментально в зависимости от метки, присутствующей на комплексах. В предпочтительном варианте осуществления результаты регистрируют визуально.
Примеры
Пример 1
Моноклональные антитела
Гибридомы LG96 и MG97 получали посредством иммунизирования мышей BALB/c полимерным человеческим альфа-1-антитрипсином (AAT) в полном адъюванте Фрейнда. Мышей иммунизировали интраперитонеально; интервалы между иммунизациями составляли 7-8 дней. Клетки селезенки иммунизированных мышей объединяли с плазмацитомной клеточной линией NSW. Гибридомные супернатанты подвергали скринингу на наличие моноклональных антител с помщью ELISA с применением микротитрационных планшетов, покрытых полимерным hAAT или сывороткой от AAT-дефицитных пациентов PiZZ.
Отобранные гибридомы клонировали и снова подвергали скринингу, для того чтобы отобрать тех, которые производят антитело против полимерного AAT, но не нативного AAT. Оказалось, что моноклональные антитела гибридом LG96 и MG97 распознают полимерный AAT и специфически реагируют с сывороткой PiZ.
Гибридомы замораживали в специальной среде (DMEM с 20% FCS и 10% DMSO), клеточная концентрация в каждом флаконе составляла 2×106 клеток на мл. Клетки хранили в азоте. Клетки можно восстанавливать с применением среды DMEM-10 или 20% сыворотки.
Пример 2
Тестирование антител LG96 и MG97 по AAT типа PiZZ
Моноклональные антитела LG96 и MG97 тестировали на их способность свзывать нативный тип PiZZ в сэндвичном ELISA. Получали малые количества супернатантов клеточной культуры, содержащих антитела, и оба антитела частично очищали с помощью CANDOR Bioscience GmbH (Wangen, Германия).
Тестирование совместимых пар, сэндвичный ELISA
Все использованные буферы для иммунного анализа предложены CANDOR Bioscience. Микротитрационный планшет (MaxiSorp™, Nunc, Langenselbold, Германия) покрывали частично очищенными антителами LG96 или MG97, соответственно, посредством добавления 150 мкл соответствующего захватывающего антитела в концентрации 1 мкг/мл в покрывающем буфере pH 9,6 (номер продукта 121) в каждую лунку и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре в условиях встряхивания. После удаления покрывающего раствора планшеты блокировали посредством добавления 300 мкл блокирующего раствора (номер продукта 110) в каждую лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшет промывали три раза отмывочным буфером (номер продукта 140). После этого человеческие сыворотки (смешанную генотипированную ZZ-сыворотку или MM-сыворотку) разбавляли 1:20 и 1:80 (5% и 1,25% сыворотки) буфером для образца (номер продукта 105), содержащего 1 мкг/мл LG96HRP или MG97HRP соответственно. Буфер для образца без сыворотки играл роль отрицательного контроля (0%). 150 мкл данной смеси добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в условиях встряхивания. После стадии инкубирования планшет промывали три раза. Затем добавляли 150 мкл раствора TMB (Kem-En-Tec, Дания) в каждую лунку и инкубировали в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2н. H2SO4. Определяли поглощение при 450 нм с применением микропланшетного считывателя.
Тестирование на перекрестную реактивность
Микротитрационный планшет (MaxiSorp™, Nunc) покрывали очищенным AAT (M-форма, BA672, Acris GmBH, Германия) посредством добавления 150 мкл AAT в концентрации 1 мг/мл в покрывающем буфере pH 74 мг/мл (номер продукта 120) в каждую лунку и инкубировали в течение 6 часов при комнатной температуре в условиях встряхивания. После удаления покрывающего раствора планшеты блокировали посредством добавления 250 мкл блокирующего раствора (номер продукта 110) в каждую лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшет промывали четыре раза отмывочным буфером (номер продукта 140). После этого очищенные Z-специфические антитела LG96 и MG97 и коммерчески доступные антитела F43.8.1 (Monosan®, Uden, Нидерланды) и 1AT (Acris Antibodies GmbH, Herferd, Германия), и те, и другие направлены против M-формы, последовательно разбавили буфером для образца (номер продукта 105) для получения различных концентраций для анализа для каждого антитела (1000 нг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 5 нг/мл, 2,5 нг/мл, 1,25 нг/мл 0,625 нг/мл и 0 нг/мл). 150 мкл каждого последовательно разбавленного антитела добавляли в лунки и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в условиях встряхивания. После стадии инкубирования планшет промывали четыре раза. Для обнаружения применяли HRP-меченое вторичное антитело (Anti-Mouse-IgG-HRP 610-703-124, Biotrend, Германия), которое разбавляли буфером для образца до 0,5 мг/мл и добавляли в каждую лунку с последующей стадией инкубации приблизительно 2 часа при комнатной температуре в условиях встряхивания. После этого планшет промывали четыре раза. Затем добавляли 150 мкл раствора TMB (Kem-En-Tec, Дания) в каждую лунку и инкубировали в течение 26 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2н H2SO4. Определяли поглощение при 450 нм с применением микропланшетного считывателя.
Результаты показаны на фиг.1 и 2. Фиг.1 показывает сэндвичный ELISA (тестирование совместимых пар), где оба антитела использовали или в качестве захватывающих антител или в качестве детектирующих антител, последние метили пероксидазой хрена (HRP). Смешанные человеческие сыворотки 10 пациентов, несущие или PiZZ- или PiMM-тип AAT (генотипирование не показано) использовали в качестве раствора антигена. Используя частично очищенные антитела, наблюдали положительное специфическое связывание со смешанной сывороткой типа PiZZ и не наблюдали перекрестной реактивности со смешанной сывороткой типа PiMM.
Результаты дополнительного теста на перекрестную реактивность показаны на фиг.2. В данном случае очищенной M-формой AAT покрывали лунки для ELISA и определяли связывание нативных антител LG96 и MG97. В отличие от специфического связывания M-специфических контрольных антител 1AT и F43.8.1 с покрывающим M-типом AAT, антитела LG96 и MG97 не демонстрируют перекрестную реактивность к M-типу AAT.
Результаты показывают, что моноклональное антитела LG96 и MG97 можно успешно применять в сэндвичном ELISA против AAT типа PiZZ. Моноклональные антитела LG96 и MG97 можно применять в качестве антител анализа при сэндвичной схеме иммуноанализа, специфичных к AAT типа PiZZ без перекрестной реактивности к типу PiMM.
Пример 3
Разработка эталонного ELISA на Z-AAT
Десять образцов (контрольные тесты) различных субъектов (P1-P10) подвергали скринингу на наличие Z-AAT с долей совпадений 100% (фиг.13). Все образцы с Z давали сигнал, без Z (такие как MM) - нет.
Пример 4
Дополнительное тестирование с помощью ELISA
Использовали образцы сыворотки от ZZ-пациента (сыворотка #1 и 2), от MZ-пациента, замещенной Prolastin® (сыворотка #3 и 4), и от контрольного индивидуума (MM; сыворотка # 5+6). Образцы сыворотки 1-6 (описанные выше) подвергали измерениям. Сыворотку #1 с известной концентрацией, равной 36 мг/дл (определенной нефелометрически) использовали в качестве стандарта. Концентрацию образцов сыворотки #2-6 определяли в тестировании с помощью ELISA (таблица 1).
| Таблица 1 | ||||||
| Концентрация Z-белка в образцах сыворотки 1-6 | ||||||
| Сыворотка #1 (PiZZ) | Сыворотка #2 (PiZZ) | Сыворотка #3 (MZ) | Сыворотка #4 (MZ) | Сыворотка #5 (PiMM) | Сыворотка #6 (PiMM) | |
| Концентрация Z-белка [мг/дл] |
36,0 | 34,0 | 35,8 | 34,1 | 0,0 | 0,0 |
Подтвердили специфичность антител MG97 и LG96. Образцы сыворотки #5 и 6 были явно отрицательными, а образцы сыворотки #1-4 демонстрировали сильный положительный сигнал. Тесту на содержание в них Z-AAT подвергали различные сывороточные и плазменные препараты, коммерчески доступные или собственные препараты (фиг.14). Коммерчески доступные сывороточные/плазматические образцы, а также собственные образцы, можно применять в качестве отрицательных образцов.
Мечение антител
Антитело MG97, как и LG96, успешно связывали с частицами коллоидного золота 40 нм.
Комбинация антител
Антитела использовали в качестве захватывающего антитела, а также детектирующего антитела во всех возможных комбинациях. Для скрининга антител использовали образцы сыворотки #1-6 (фиг.15A-15D).
Вывод
Комбинации MG97/LG96 и LG96/LG96 (захватывающее антитело/детектирующее антитело) идентифицировали как наилучшие с точки зрения дифференциации между положительными образцами (#1-4) и отрицательными образцами (#5 и 6). Комбинация LG96/LG96 может быть предпочтительной, поскольку результаты от #1+2, 3+4 и 5+6 были ближе друг к другу.
Пример 5
Тестирование устройства
Сыворотку ZZ(+) тестировали в трех различных устройствах, как показано на фиг.26. Все 3 теста оказались положительными.
1. Иммунохроматографическое устройство, содержащее мембрану, несущую захватывающее антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, и
структуру с конъюгатами, соединенную по текучей среде с мембраной в проксимальном конце, причем данная структура с конъюгатами содержит детектирующее антитело, имеющее конъюгированный с ним репортерный фрагмент,
причем каждое из указанных захватывающего антитела и детектирующего антитела представляет собой моноклональное антитело, производимое гибридомными клетками, депонированными под номером доступа DSM АСС3092 (моноклональное антитело LG96) или DSM АСС3093 (моноклональное антитело MG97), способное к связыванию с аналитом, причем аналит представляет собой белок Z-ААТ, присутствующий в образце от носителя гена PiZ.
2. Устройство по п. 1, в котором захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело MG97, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96.
3. Устройство по п. 1, в котором захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96.
4. Устройство по п. 1, в котором структура с конъюгатами представляет собой подушку с конъюгатами, которая частично перекрывает мембрану в проксимальном конце мембраны.
5. Устройство по п. 1, дополнительно содержащее систему разделения крови для приема образца, причем данная система разделения крови соединена по текучей среде со структурой с конъюгатами.
6. Устройство по п. 5, в котором структура с конъюгатами представляет собой подушку с конъюгатами, которая частично перекрывает мембрану в проксимальном конце мембраны, и система разделения крови частично перекрывает подушку с конъюгатами.
7. Устройство по п. 5, дополнительно содержащее дистальную структуру, соединенную по текучей среде с мембраной у дистального конца мембраны, причем данная дистальная структура выполнена так, что обеспечивается достаточный поток образца от проксимального до дистального конца данной мембраны.
8. Устройство по п. 7, в котором дистальная структура представляет собой подушку с адсорбентом, выполненную так, что обеспечивается достаточный поток образца от проксимального конца мембраны до, по меньшей мере, контрольной зоны под действием капиллярных сил.
9. Устройство по п. 1, в котором мембрана дополнительно содержит контрольную зону, несущую контрольное антитело, связанное с ней, причем данное контрольное антитело способно к связыванию с детектирующим реагентом.
10. Устройство по п. 9, в котором контрольное антитело представляет собой антимышиный IgG.
11. Способ определения носителя гена PiZ, причем способ включает:
подвергание образца от субъекта иммунохроматографии с применением устройства по п. 1; и
определение связывания аналита с захватывающим антителом, причем связывание аналита с захватывающим антителом указывает на то, что данный субъект является носителем PiZ.
12. Способ по п. 11, в котором носитель PiZ обладает фенотипом, представляющим собой любую аллельную комбинацию с аллелем PiZ.
13. Способ по п. 11, в котором захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело MG97, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96.
14. Способ по п. 11, в котором захватывающее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96, и детектирующее антитело представляет собой моноклональное антитело LG96.
15. Способ по п. 12, в котором фенотип представляет собой PiZZ, PiMZ, PiSZ, или PiZ/Null.
16. Способ диагностирования состояния или заболевания, связанных с дефицитом ААТ, причем способ включает:
подвергание образца от субъекта иммунохроматографии с применением устройства по п. 1; и
определение связывания аналита с захватывающим антителом, причем связывание аналита с захватывающим антителом указывает на то, что данный субъект имеет указанное состояние или заболевание.
17. Способ определения предрасположенности субъекта к развитию состояния или заболевания, связанных с дефицитом ААТ, причем способ включает:
подвергание образца от субъекта иммунохроматографии с применением устройства по п. 1; и
определение связывания аналита с захватывающим антителом, причем связывание аналита с захватывающим антителом является признаком предрасположенности субъекта к развитию указанного состояния или заболевания.
18. Устройство для иммуноанализа для определения наличия или количества белка Z-AAT в текучем образце, причем данное устройство содержит:
область нанесения образца;
микропористую мембрану, несущую область захвата белка Z-ААТ, определяемую посредством захватывающего антитела, иммобилизованного на ней, причем данное захватывающее антитело представляет собой LG96 или его антигенсвязывающий фрагмент;
путь потока от области нанесения образца до области захвата белка Z-AAT, причем наличие или количество белка Z-AAT в текучем образце можно определять по образованию комплекса между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в данном текучем образце; и
структуру с конъюгатами, расположенную в пути потока, причем данная структура с конъюгатами содержит детектирующий реагент, специфичный к белку Z-AAT, причем данный детектирующий реагент является подвижным или мобилизуемым, причем данный детектирующий реагент представляет собой конъюгированное с золотом LG96 или его конъюгированный с золотом антигенсвязывающий фрагмент.
19. Способ обнаружения белка Z-AAT у субъекта, причем способ включает:
нанесение биологического образца от данного субъекта на устройство для иммуноанализа по п. 18; и
обнаружение комплекса, образованного между захватывающим антителом и белком Z-AAT, который может присутствовать в текучем образце, причем обнаружение данного комплекса указывает на наличие белка Z-AAT в данном образце.
20. Способ определения наличия белка Z-AAT в биологическом образце, причем способ включает:
помещение биологического образца и первого антитела в смешанном состоянии на мембрану, несущую второе антитело, связанное с ней, в тестовой зоне, причем каждое из первого и второго антитела представляет собой моноклональное антитело LG96 или MG97; причем захват второго антитела в тестовой зоне указывает на наличие белка Z-AAT в данном образце.
21. Способ по п. 20, в котором первое антитело представляет собой LG96.
22. Способ по п. 20, в котором первое антитело представляет собой MG97.
23. Способ по п. 20, в котором второе антитело представляет собой LG96.
24. Способ по п. 20, в котором второе антитело представляет собой MG97.
25. Набор для определения наличия белка Z-AAT в биологическом образце субъекта, содержащий:
(a) устройство по п. 1; и
(b) реагенты и/или инструкции по применению.
