Продуцент ингибитора микоплазмы (mycoplasma hominis)


 


Владельцы патента RU 2569150:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Штамм Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 применяется в качестве продуцента ингибитора Mycoplasma hominis и может быть использован при лечении микоплазменных инфекций. Изобретение позволяет ингибировать рост Mycoplasma hominis. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, биохимии, фармакологии и может найти применение в биотехнологии, микробиологии.

Mycoplasma hominis является условно-патогенным микроорганизмом, обитает в урогенитальном тракте (УГТ) человека, причастна, по данным ряда авторов, к развитию хориоамнионита, внутриутробной патологии плода, развитию бактериального вагиноза и других патологических состояний УГТ. Описаны случаи выделения этой микоплазмы из абсцесса головного мозга, при пневмонии, при перикардите, эндокардите, раневой инфекции (Раковская И.В. Микоплазмы - возбудители микоплазменных инфекций человека. В кн. Руководство по медицинской микробиологии / Под ред. А.С. Лабинской и др. М.: БИНОМ, 2010, с. 964-993).

Для лечения микоплазменных инфекций используют антибиотики широкого спектра действия: чаще всего антибиотики тетрациклинового ряда (диоксициклин, миноциклин) и макролиды (джозамицин, клиндомицин, мидекамицин, рокситромицин). Однако известно, что многие штаммы микоплазм, обитающие в урогенитальном тракте, резистентны к тетрациклинам и макролидам. В таких случаях рекомендуется использовать хинолоны: левофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксанцин. Но в настоящее время от пациентов выделяют штаммы, устойчивые и к хинолонам. Показано также, что эффективность антибиотиков зависит от состояния иммунной системы. Для пациентов с иммунодефицитом рекомендуют вводить антибиотики внутривенно и обязательно после определения чувствительности к ним выделенной микоплазмы. Часто требуется продолжительная терапия. В связи с этим ведущие микоплазмологи считают, что радикальных средств для лечения микоплазменных инфекций в настоящее время нет (Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: Sophisticated, Reemerging, and Burdened by Their Notoriety. Emerging Infect. Diseases. 1997, Vol 3, №1, P. 21-32.).

Известен штамм Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 (патент RU 2493247). Сведения о применении штамма в качестве продуцента ингибитора роста Mycoplasma hominis отсутствуют.

Техническим результатом изобретения является подавление роста Mycoplasma hominis.

Технический результат достигается тем, что в качестве продуцента ингибитора роста Mycoplasma hominis применяют штамм Trichoderma harzianum Rifai. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д. 1 Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Морфолого-биохимическая характеристика штамма.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто- или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агар. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28-+29°C. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при pH 4-6, однако, может расти и при pH от 1,5 до 9.

Trichoderma harzianum Rifai в одинаковой степени усваивает как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты - метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин-α-оксидазной активностью. Активность L-лизин-α-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту H2O2, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции H2O2 с О-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг О-дианизидингидрохлорида и 0.1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°C пробы охлаждали до +4°C. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Активность L-лизин-α-оксидазы рассчитывали по приросту H2O2 и выражали на 1 мл культуральной жидкости.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пущино).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г. Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и pH.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение pH 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t°+125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°C, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину pH в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения pH от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин в течение часа при температуре +(2-4)°C. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Активность полученного концентрата культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai составляла 0,54 Ед/мл.

В работе использовали вид микроорганизма класса Mollicutes:

Mycoplasma hominis (Mh). Штамм M.hominis H-34 был получен в 1967 г. из коллекции доктора Lemke R.M. (Lister Inst. Preventive medicine, London S.W.I.). Штамм хранится и поддерживается в лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ФГБУ НИИЭМ имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи.

Для выращивания штамма Mycoplasma hominis использовали бульон (Difco PPLOBroth, Becton, Dickinson, USA) с 20% сыворотки крови лошади, 2% свежего дрожжевого экстракта, 1% аргинина или 1% глюкозы (в зависимости от пищевых потребностей вида микоплазм) и 0,005% индикатора фенолово-красного. Для титрования культур делали серийные десятикратные разведения пробы в физиологическом растворе с высевом материала из всех разведений на 0,3% агар (BBL Mycoplasma Agar Base, Becton, Dickinson, USA) с такими же добавками, как в бульоне. Спустя трое суток подсчитывали число колоний в двух последних пробирках из ряда разведений и высчитывали средний показатель числа колоний. Титр культур выражали средним числом выросших колоний, помноженным на разведение культуры. В опыт брали культуры с установленным ранее титром.

Опыты по определению чувствительности микоплазм к концентрату культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai проводили по следующей схеме. В пробирки вносили 1 мл бульонной культуры микоплазм с известным титром, затем соединяли с 1 мл культуральной жидкости с активностью L-лизин-α-оксидазы 0,54 Ед/мл в разведениях 1:10 и 1:100 и 0,1 мл культуры микоплазмы с известным титром. Смеси выдерживали в течение 45 мин при комнатной температуре, затем заливали жидкой питательной средой и культивировали в течении 3 суток, наблюдая за скоростью и интенсивностью роста по изменению цвета культуральной среды. Титр клеток микоплазмы в опытной и контрольной пробирке определяли описанным выше способом.

Из данных таблицы видно, что в присутствии культуральной жидкости продуцента L-лизин-α-оксидазы скорость роста Mycoplasma hominis, регистрируемая по изменению цвета среды, была снижена, особенно при низкой посевной дозе. При определении титра КОЕ/мл наблюдали полное подавление роста при контакте клеток микоплазмы с неразведенной культуральной жидкостью триходермы с активностью L-лизин-α-оксидазы 0,54-0,56 Ед/мл даже при высокой посевной дозе. Десятикратное разведение исходной культуральной жидкости триходермы также подавляло рост микоплазм, но в меньшей степени - на 3 Lg. При использовании меньшей посевной дозы микоплазм рост также был подавлен полностью при контакте с культуральной жидкостью продуцента

фермента. Использование десятикратного разведения ее в опытных пробирках приводило к росту лишь единичных колоний.

Титр КОЕ/мл культур Mh был ниже в сравнении с контролем на 3 Lg и 1 Lg (соответственно) при высокой посевной дозе культуры и разных концентрациях культуральной жидкости продуцента L-лизин-α-оксидазы. При более низкой посевной дозе и разных концентрациях культуральной жидкости исследуемого штамма -продуцента фермента титр КОЕ выросшей культуры различался на 3 и 2 Lg соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований, полученные данные свидетельствуют о том, что культуральная жидкость Trichoderma harzianum Rifai F-180 способна ингибировать рост Mycoplasma hominis, которая наглядно проявляется после предварительного контакта микоплазм и культуральной жидкости триходермы. Степень подавления роста зависит от посевной дозы микоплазм и используемой концентрации культуральной жидкости триходермы.

Применение штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 в качестве продуцента ингибитора микоплазмы Mycoplasma hominis.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает последовательное осуществление стадий культивирования биомассы микроводорослей на питательной среде в течение 8 суток и создания стрессовых условий в течение 3 суток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Komagataeibacter xylinus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12068.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Предложен штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D для изготовления бактериального удобрения под сою.

Изобретение относится к промышленной микробиологии. Биопрепарат содержит гидролизат, содержащий продукт анаэробной ферментации смеси листьев растений, свекольной или тростниковой мелассы и воды, взятых в заданных соотношениях, и культуральную жидкость, образованную в процессе получения микробной массы аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Staphylococcus aureus 113, обладающий антилизоцимной активностью, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptococcus salivarius М-11, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11174 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает приготовление питательной среды на основе осветленной творожной сыворотки, стерилизацию и охлаждение.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ получения пищевого продукта из очищенных от лузги семян подсолнечника.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов. Штамм Тrichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 является продуцентом мембраноактивных антибиотиков-пептаиболов, обладающих антигрибковой и антибактериальной активностью.

Группа изобретений относится к микробиологии, микологии, в частности к выращиванию съедобных грибов. Предложены штамм гриба шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 (учетный номер: KCCM11135P) и плодовое тело, продуцируемое при культивировании указанного штамма.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа производств вакцины для профилактики и терапии трихофитоза крупного рогатого скота. Охарактеризованное решение включает засев матрасов культурой гриба Trichopyton verrucosum штамма ТФ-130 Л ВГНКИ на твердую питательную среду.

Изобретение относится к способу получения состава ферментационного бульона. Способ предусматривает инкубацию смеси, содержащей один или несколько ферментационных бульонов, первый компонент органической кислоты, второй компонент органической кислоты, при pH от 3,5 до 5, температуре от 20°C до 50°C в течение 8-36 ч.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и представляет собой штамм Colephoma empetri, депонированный в CGMCC с учетным номером CGMCC 4129, продуцирующий антибиотики с высоким выходом.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma hamatum обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus niger В-6 является продуцентом лимонной кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae 12-84, обладающий высоким уровнем синтеза комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы, маннаназы и α-амилазы, депонирован в ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под регистрационным номером Aspergillus oryzae RCAM01134.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения экстракта зверобоя продырявленного. Способ получения экстракта зверобоя продырявленного путем экстрагирования травы этиловым спиртом при температуре 60-120°C и давлении 80-100 атм в течение 30-50 минут.
Наверх