Эмульсионная вакцина, полученная из обработанного нагреванием бактерина



Эмульсионная вакцина, полученная из обработанного нагреванием бактерина
Эмульсионная вакцина, полученная из обработанного нагреванием бактерина
Эмульсионная вакцина, полученная из обработанного нагреванием бактерина
Эмульсионная вакцина, полученная из обработанного нагреванием бактерина

 


Владельцы патента RU 2569457:

Зоитис Пи ЭлЭлСи (US)

Изобретение касается вакцины для предупреждения инфекции, вызванной по меньшей мере одним из Leptospira, герпес-вируса коров, вируса парагриппа и коровьего респираторного синцитиального вируса. Представленная вакцина содержит обработанный нагреванием бактерин Leptospira, имеющий липазную активность 50% или менее по сравнению с липазной активностью бактерина до обработки нагреванием и сохраняющий антигенную активность, и 1-3 живых вируса, выбранных из группы, состоящей из герпес-вируса коров, вируса парагриппа и коровьего респираторного синцитиального вируса. Указанная обработка нагреванием включает нагревание бактерина Leptospira до температуры от 60°C до 70°C в течение времени от 5 до 10 часов. Изобретение позволяет получать стабильные вакцины с сохранением вирусной инфекционности вирусов. 6 з.п. ф-лы, 5 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области вакцин и к способам стабилизации эмульсионных вакцин. В частности, это изобретение относится к обработанным нагреванием бактеринам, способу получения обработанных нагреванием бактеринов и эмульсионным вакцинам, получаемым из таких обработанных нагреванием бактеринов.

Предшествующий уровень техники

Вакцинацию все шире используют для контроля инфекционных заболеваний у животных. В вакцинах часто используют адъюванты, потому что они способны увеличивать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ на антиген. Вакцины часто приготавливают в виде эмульсий, потому что эмульсия может действовать в качестве адъюванта и имеет свойство удерживать антиген в качестве депо в месте инъекции. В эмульсионных вакцинах обычно используют эмульгаторы. Кроме использования эмульгаторов, стабильность эмульсионных вакцин может достигаться за счет снижения размера капель эмульсии механическим способом.

Патент США №5084269 относится к адъювантному препарату, содержащему лецитин в комбинации с минеральным маслом, который вызывает меньшее раздражение у животного-хозяина и одновременно индуцирует повышенный системный иммунитет. Композиции в соответствии с Патентом США 5084269 имеются в продаже под торговым названием AMPHIGEN®, торговая марка Pfizer, Inc.

Обычно бактериальные антигены являются нестабильными при нагревании, и даже краткое экспонирование при повышенной температуре может снижать активность антигенов. Например, существующие в настоящее время вакцины против сибирской язвы могут терять всю биологическую активность за 48 часов при 37°C (S.Sing, N.Ahuja, V.Chauhan, E.Rajasekaran, W.S.Mohsin, R.Bhat, and R.Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295(5): 1058-62).

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к обработанным нагреванием бактеринам, способу получения обработанных нагреванием бактеринов и эмульсионным вакцинам, получаемым из таких обработанных нагреванием бактеринов. Способ включает нагревание бактерина до температуры от примерно 35 до примерно 80°C с образованием обработанного нагреванием бактерина.

Подробное описание

Определения

Приемлемая антигенная активность - Термин "приемлемая антигенная активность" означает способность индуцировать защитный иммунный ответ у вакцинированных животных после контрольного заражения или при прохождении кодифицированного теста на действенность с гомологичным живым организмом.

Бактерин - Термин "бактерин" означает суспензию убитых бактерий, которую можно использовать в качестве компонента вакцины.

Эмульгатор - Термин "эмульгатор" означает субстанцию, используемую для придания эмульсии большей стабильности.

Эмульсия - Термин "эмульсия" означает композицию двух несмешивающихся жидкостей, в которой мелкие капельки одной жидкости суспендированы в непрерывной фазе другой жидкости.

Обработанный нагреванием бактерин - Термин "обработанный нагреванием бактерин" означает бактерин, который был обработан нагреванием и который имеет липазную активность 50% или менее по сравнению с липазной активностью до обработки нагреванием и имеет приемлемую антигенную активность.

Обратная эмульсия - Термин "обратная эмульсия" означает эмульсию воды в масле.

Липаза - Термин "липаза" означает ферменты, эстеразы, липазы и фосфолипазы, которые могут вызывать распад эмульгатора в эмульсионной вакцине.

Нормальная эмульсия - Термин "нормальная эмульсия" означает эмульсию масла в воде.

Эмульсия масла в воде - Термин "эмульсия масла в воде" означает эмульсию, в которой мелкие капельки масла суспендированы в непрерывной водной фазе.

Комнатная температура - Термин "комнатная температура" означает температуру от 18 до 25°C.

Эмульсия воды в масле - Термин "эмульсия воды в масле" означает эмульсию, в которой капельки воды суспендированы в непрерывной масляной фазе.

Описание

Это изобретение относится к бактеринам со сниженной липазной активностью, вакцинам, получаемым из таких бактеринов, и способу снижения липазной активности бактеринов. Кроме антигенных компонентов, некоторые бактерины обладают липазной активностью. Когда бактерины с липазной активностью включены в состав эмульсии, липаза может разлагать эмульгаторы, использованные для создания эмульсии. Эмульсионные вакцины, которые содержат бактерины, имеющие высокую липазную активность, имеют тенденцию к нестабильности, а те, которые содержат бактерины, имеющие низкие уровни липазы, имеют тенденцию к стабильности. Примеры бактерий, которые могут, когда они убиты, продуцировать бактерины, имеющие липазную активность, включают Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxella sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas tragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaligenes eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirulina platensis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Synechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium и разновидности Leptospira, такие как известные патогены Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae и Leptospira pomona.

Липаза, которая может разрушать эмульгаторы, используемые для создания эмульсии, и таким образом вызывать нестабильность и распад эмульсии, может включать один или более чем один фермент, разрушающий эмульсии, такой как эстеразы, липазы и фосфолипазы. Все вместе эти ферменты, эстеразы, липазы и фосфолипазы называют липаза. Липазную активность бактерина можно измерять при использовании синтетического субстрата, называемого O-пивалоилоксиметилумбеллиферон (C-POM). Скорость гидролиза, вызываемого липазой, представляет собой меру липазной активности. Скорость реакции гидролиза, вызываемого липазой в этом взаимодействии, отслеживают по увеличению интенсивности флуоресценции продукта липазной активности. Эта скорость реакции зависит от точных условий выбранного гидролитического теста, так что сравнения уровней липазной активности при измерении скоростей гидролиза надо делать при использовании данных, полученных в тесте в одних и тех же условиях. Описанные в литературе способы раскрыты в нескольких статьях, в том числе Kurioka S. and Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281-289, De Silva NS and Quinn PA. (1987) J. Clin. Microbiol. 25: 729-731 и Grau, A. and Ortiz, A. (1998) Chem. Phys. of Lipids 91: 109-118.

В эмульсионной вакцине разрушение эмульсии вызывает фазовое разделение компонентов. Это является нежелательным, потому что при разделении фаз индивидуальные дозы, извлеченные из контейнера, могут не содержать один и тот же уровень вакцинных компонентов. Вдобавок, потеря эмульсии может приводить к потере адъювантной активности эмульгатора и приводить к снижению антигенного эффекта вакцины.

В вакцины часто наряду с бактеринами включают ослабленные живые вирусы. Такие вакцины являются полезными, потому что одну вакцину можно использовать для создания иммунитета к разным заболеваниям. Если в бактерине присутствует липазная активность, она будет вызывать высвобождение эмульгатора из эмульсии. Этот свободный эмульгатор может разрушать и инактивировать вирусы живой вакцины и тем самым приводить к потере вирусной инфекционности.

Бактерин, полезный в вакцинах, можно получать путем культивирования бактерии, представляющей интерес, а затем киллинга бактерий с тем, чтобы получить бактерин, содержащий множество разных бактериальных компонентов, в том числе компоненты клеточной стенки. Бактерин можно убивать множеством разных способов, в том числе экспонированием их таким соединениям, как мертиолат, формалин, формальдегид, диэтиламин, бинарный этиленамин (BEI), бета-пропиолактон (BPL) и глутаральдегид. Можно использовать комбинации этих соединений. Кроме того, бактерин можно убивать стерилизующей радиацией.

Обнаружено, что липазную активность бактерина, имеющего такую липазную активность, можно снизить обработкой нагреванием. Конкретно, липазную активность бактерина можно снизить нагреванием бактерина до температуры от примерно 35 до примерно 80°C с получением обработанного нагреванием бактерина, который имеет приемлемую антигенную активность. Обработку нагреванием осуществляют в течение достаточного времени, так что липазная активность обработанного нагреванием бактерина представляет собой 50% или менее чем 50% той, что находят в бактерине до обработки нагреванием. Для хорошей стабильности эмульсионной вакцины снижение липазной активности до нуля не является необходимым. Авторы обнаружили, что вакцины, имеющие хороший срок хранения, можно получать из обработанных нагреванием бактеринов, имеющих уровень липазной активности, который представляет собой 50% или менее чем 50% уровня липазной активности до обработки нагреванием.

Если в качестве меры липазной активности бактерина используют скорость гидролиза тестового субстрата, то скорость гидролиза тестового субстрат до обработки нагреванием сравнивают со скоростью гидролиза после обработки нагреванием. Обработку нагреванием осуществляют так, что снижают скорость гидролиза до 50% или менее чем 50% скорости гидролиза, которую наблюдали у свежего бактерина.

Точный способ измерения уровня липазной активность не является критическим, так как один и тот же способ используют для измерения активности до обработки нагреванием и активности после обработки нагреванием. Например, если скорость гидролиза тестового субстрата измеряют при использовании одного субстрата, другой субстрат может давать другую скорость. Однако, если один и тот же субстрат используют для определения исходной активности и определения активности после обработки, относительные скорости все равно должны показывать эффект обработки нагреванием.

Для бактеринов, содержащих одно или более чем одно из следующего, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona, имеется кодифицированный тест на антигенную активность (9CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104 и §113.105). Для этих видов приемлемую антигенную активность определяют как способность индуцировать такой защитный иммунный ответ у вакцинированных хомячков, что, когда хомячков подвергают действию гомологичных живых бактерий, по меньшей мере 75% вакцинированных хомячков выживают в модели, где по меньшей мере 80% невакцинированных хомячков не выживают. В случае антигена Leptospira hardjo приемлемую антигенную активность определяют как способность вакцины индуцировать геометрическое среднее титра серологической агглютинации против Leptospira hardjo не меньше чем у 40 телят, которые были вакцинированы вакциной, содержащей бактериальный антиген Leptospira hardjo. Для других бактеринов приемлемую антигенную активность определяют как способность индуцировать защитный иммунный ответ у вакцинированных животных после действия или прохождения кодифицированного теста на действенность с гомологичным живым организмом.

Обработку нагреванием можно осуществлять в диапазоне температур и в течение изменяющегося периода времени. Обычно нагревание можно осуществлять при температуре от примерно 35 до примерно 80°C в течение времени от примерно 20 минут до примерно 24 часов. Когда бактерин нагревают до более высокой температуры, такой как от примерно 75 до примерно 80°C, время нагревания находится в пределах начала диапазона времени. Когда нагревание осуществляют при более низкой температуре, нагревание осуществляют в течение более длительного периода времени. Другая комбинация температуры и времени представляет собой нагревание при температуре от примерно 60 до примерно 70°C в течение времени от примерно 9 до примерно 10 часов. Другая комбинация температуры и времени представляет собой нагревание при температуре от примерно 65 до примерно 70°C в течение времени от примерно 5 до примерно 8 часов. Другая комбинация температуры и времени представляет собой нагревание при температуре от примерно 65 до примерно 70°C в течение времени примерно один час. Другая комбинация температуры и времени представляет собой нагревание при температуре от примерно 55 до примерно 65°C в течение времени от примерно 5 до примерно 8 часов.

Бактерины после обработки нагреванием имеют более низкую липазную активность, чем только что полученные бактерины, но в других отношениях могут быть приготовлены так же, как и только что полученные бактерины. Соответственно, обработанные нагреванием бактерины можно включать в состав вакцин обычными способами получения вакцин. Эти способы хорошо известны в данной области.

Эмульсионные вакцины можно получать комбинированием желаемого бактерина с масляной фазой и эмульгатором или эмульгаторами. Эту комбинацию затем подвергают интенсивному перемешиванию с образованием эмульсии. Подходящие способы перемешивания включают гомогенизацию и затем микрофлюидизацию. В комбинацию до эмульгирования можно также включать консерванты и эксципиенты.

Вакцины могут включать как бактерины, так и вирусные антигены. При получении вакцины, которая включает бактерины и вирусные антигены, бактерины, любые вирусные антигены для введения в состав вакцины, эмульгатор или эмульгаторы и возможно консерванты и эксципиенты объединяют с масляной фазой и эмульгируют. После образования эмульсии можно доводить рН препаратов до надлежащего значения рН с помощью растворов NaOH или HCl. При применении вакцин обычно желательно, чтобы значение pH находилось близко к нейтральному для избежания раздражения в месте инъекции. Обычным является рН от около 7,0 до около 7,3.

Подходящие масляные фазы для получения эмульсионной вакцины включают неметаболизируемые масла и метаболизируемые масла. Неметаболизируемые масла включают минеральные масла, такие как белое минеральное масло и светлое минеральное масло. Метаболизируемые масла включают растительные масла, рыбий жир и синтетические глицериды жирных кислот.

Примерами эмульгаторов, которые можно использовать в получении эмульсионных вакцин по этому изобретению, являются фосфолипиды, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры полиэтоксилированного сорбитана и производные маннита, которые являются обычными эмульгаторами для вакцины. Фосфолипидные эмульгаторы включают лецитин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и лецитин (например, такой как AMPHIGEN®). Эмульгаторы, представляющие собой сложные эфиры сорбитана, включают монолаурат сорбитана (например, Span® 20 и Arlacel® 20), моноолеат сорбитана (например, Span® 80 и Arlacel® 80), монопальмитат сорбитана (например, Span® 40 и Arlacel® 40) и моностеарат сорбитана (например, Span® 60 и Arlacel® 60). Сложные эфиры полиэтоксилированного сорбитана включают монолаурат полиэтоксисорбитана (например, Tween® 20 и Tween® 21), моноолеат полиэтоксисорбитана (например, Tween® 80), монопальмитат полиэтоксисорбитана (например, Tween® 40) и моностеарат полиэтоксисорбитана (например, Tween 60). Эмульгаторы, представляющие собой производное маннита, включают октадекановые эфиры маннита. Span®, Arlacel® и Tween® представляют собой торговые марки ICI Americas. AMPHIGEN® представляет собой торговую марку Pfizer, Inc. Обычно вакцины готовят в виде нормальных эмульсий масла в воде, хотя возможно получение обратных эмульсий воды в масле.

В вакцинах можно использовать множество разных адъювантов, таких как Quil A, холестерин, фосфат алюминия и гидроксид алюминия, и консервантов, таких как мертиолат. Quil A представляет собой очищенную смесь сапонинов килайи, экстрагированных из коры южноамериканского дерева Quillaja Saponaria Molina. Quil A действует прямо на иммунную систему так, что активирует обобщенный статус чувствительности. При этом он индуцирует как гуморальные, так и опосредованные клетками ответы. Липофильная цепь делает возможным взаимодействие антигена и адъюванта для доставки в цитозоль для процессинга эндогенным путем. Quil A часто используют с холестерином, потому что холестерин устраняет менее желательные побочные эффекты при добавлении в надлежащих пропорциях. Холестерин формирует нерастворимые комплексы с Quil A, которые образуют спиралевидные структуры при связывании холестерина с Quil A так, что экспонируют сахарные блоки молекул, которые помогают стимулировать иммунный ответ.

Обычно к вакцинам, содержащим бактерины, добавляют вирусные антигены. Одним из преимуществ этого подхода является то, что одну вакцину можно использовать для создания иммунитета к нескольким заболеваниям вместо необходимости в дозах нескольких разных вакцин для получения того же результата. В вакцинах можно использовать как убитые вирусы, так и ослабленные живые вирусы. Вирусы, которые можно использовать, представляют собой герпес-вирус птиц, герпес-вирусы коров, герпес-вирусы собак, герпес-вирусы лошадей, вирус вирусного ринотрахеита кошек, вирус болезни Марека, герпес-вирус овец, герпес-вирус свиней, вирус псевдобешенства, птичьи парамиксовирусы, коровий респираторный синцитиальный вирус, вирус собачьей чумы, вирус собачьего парагриппа, коровьего парагриппа 3, овечьего парагриппа 3, вирус чумы рогатого скота, вирус пограничной болезни, вирус вирусной диареи коров (BVD), вирус классической лихорадки свиней, вирус птичьего лейкоза, вирус иммунодефицита коров, вирус лейкемии коров, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек, вирус лейкемии кошек, вирус прогрессирующей пневмонии овец, вирус аденокарциномы легких овец, коронавирус собак, коронавирус коров, коронавирус кошачьего энтерита, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус эпидемической диареи свиней, вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, свиной парвовирус, вирус инфекционного гастроэнтерита, индюшачий коронавирус, вирус однодневной лихорадки коров, вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита, птичьего гриппа, лошадиного гриппа, вирус гриппа свиней, вирус гриппа собак, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕ), вирус венесуэльского энцефалита лошадей и вирус западного энцефалита лошадей.

Если в бактерине присутствует липазная активность, она может вызвать высвобождение эмульгатора из эмульсии. Этот свободный эмульгатор может разрушить оболочку живого вируса и инактивировать вирусы живой вакцины, что приводит к потере вирусной инфекционности. Соответственно, обработка бактерина нагреванием служит стабилизации эмульсии, сохраняет ее адъювантный эффект, а также сохраняет вирусную инфекционность вирусов.

Нижеследующие примеры даны с целью дополнительной иллюстрации и не предназначены ограничивать объем заявленного изобретения.

Способы

Способ 1

Определение мутности

Мутность определяют в нефелометрических единицах (HE) способом светорассеяния. Интенсивность света, рассеянного пробой в определенных условиях, сравнивают с интенсивностью света, рассеянного стандартной референтной суспензией. Чем выше интенсивность рассеянного света, тем выше мутность пробы. Источник свет направляют на пробу и рассеяние света измеряют под 90° к направлению источника света. Прибор калибруют измерением рассеяния света суспензией формазина.

Калибровка прибора нефелометра

Ультрафильтрованную воду получают фильтрацией дистиллированной воды через мембранный фильтр, имеющий размер пор 0,2 мкм. Первый раствор получают растворением 1,00 г сульфата гидразина, (NH2)H2SO4, в ультрафильтрованной воде и разбавлением ультрафильтрованной водой до 100 мл в мерной колбе. Второй раствор получают растворением 10,00 г гексаметилентетрамина в ультрафильтрованной воде и разбавлением ультрафильтрованной водой до 100 мл в мерной колбе. Суспензию формазина получают перемешиванием 5,0 мл первого раствора с 5,0 мл второго раствора. Смеси дают стоять в течение 24 часов при приблизительно 24°C. Смесь разбавляют до 100 мл ультрафильтрованной водой с образованием маточной мутной суспензии, имеющей мутность 400 HE. Суспензию формазина с мутностью 40 HE получают разбавлением 10,00 мл маточной мутной суспензии до 100 мл ультрафильтрованной водой. Дополнительные калибровочные растворы получают разбавлением маточного раствора.

Измерение мутности

Пробы для измерения разбавляют ультрафильтрованной водой так, что мутность попадает в пределы калиброванного диапазона нефелометра. Мутность измеряют и исходную мутность вычисляют при использовании нижеследующего уравнения:

Исходная мутность в H E = M × ( D + O ) O

где M представляет собой мутность разбавленной пробы, в HE;

D представляет собой объем воды при разведении, в мл;

O представляет собой исходный объем пробы, в мл.

Способ 2

Анализ липазы

Липазную активность определяли при использовании O-пивалоксиметилумбеллиферона в качестве флуорогенного субстрата. При катализируемом липазой гидролизе этого нефлуоресцентного субстрата получают гидроксиметиловый эфир, который является нестабильным в водных условиях. При разложении нестабильного гидроксиметилового эфира образуется формальдегид и флуоресцентный продукт умбеллиферон. Отслеживание интенсивности флуоресценции продуцируемого умбеллиферона как функции времени дает чувствительный кинетический показатель липазной ферментативной активности.

Растворы O-пивалоксиметилумбеллиферона (Molecular Probes, продукт №P35901) получали в неразбавленном ДМСО при маточной концентрации 5 мМ; неиспользованный раствор хранили при -20° в защищенном от света месте. 5-мМ раствор О-пивалоксиметилумбеллиферона разбавляли до 750 мкМ с использованием буфера 58 мМ ТРИС-HCl (pH 8,0) и получившийся раствор предварительно нагревали до 37°C. Пробу Leptospira или контроль буфер/среда центрифугировали в течение 10 минут при комнатной температуре при 6500 g с образованием осадка и супернатанта. Взаимодействия осуществляли при комнатной температуре объединением 15 мкл буфера 100 мМ ТРИС-HCl (рН 8,0) с 15 мкл супернатанта из пробы Leptospira или контроля буфер/среда в аналитических лунках малообъемных 96-луночных планшетов (Corning 3393, несвязывающая поверхность из черного полистирола, половина площади); предварительным инкубированием в течение 10 минут при 37°C; затем инициированием взаимодействия добавлением 20 мкл 750 мкМ О-пивалоксиметилумбеллиферона или контроля буфер/среда. Получившиеся реакционные смеси содержали буфер 53 мМ ТРИС-HCl (рН 8,0) и 0 или 300 мкМ О-пивалоксиметилумбеллиферона. Интенсивность флуоресценции измеряли через интервалы в 30-45 секунд в течение одного часа (Spectramax Gemini XS, 37°C, λex=360 нм, λem=460 нм, установка чувствительности РМТ на средний уровень, 6 считываний с лунки). Скорость взаимодействия определяли по наклону получившийся кривой хода процесса.

Примеры

Пример 1. Снижение липазной активности путем обработки нагреванием

Для получения бактерина получали пул убитых мертиолатом лептоспир, содержащий следующие виды: Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo и Leptospira pomona. Шесть проб бактерина хранили в течение ночи (приблизительно 12 часов) при 4°C, 37°C, 45°C, 56°C, 65°C и 80°C. Проба, которую хранили при 4°C, служила необработанным контролем. Пробы, которые хранили в течение 12 часов при 4°C, 37°C, 45°C, 56°C, 65°C и 80°C, представляли собой обработанные нагреванием пробы. После хранения скорость, при которой тестовый субстрат гидролизовали в присутствии каждого бактерина, измеряли в соответствии со Способом 2. Скорость гидролиза для пробы, деленная на скорость гидролиза для пробы, которую хранили при 4°C, и помноженная на 100, представляет собой процент исходной липазной активности каждого бактерина, который остается после хранения. В следующей таблице показаны температура хранения и процент исходной липазной активности, который остается после хранения.

Температура хранение (12 часов) 4°C 37°C 45°C 56°C 65°C 80°C
Процент исходной липазной активности 100% 55,4% 32,5% 15,7% 10,8% 8,4%

Пример 2. Получение экспериментальных вакцинных препаратов

Выращивали культуры Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo и Leptospira pomona. Мутность каждой культуры измеряли в нефелометрических единицах (HE). Бактерин убивали при использовании мертиолата с образованием бактеринов. Каждый бактерин обрабатывали нагреванием при 65°C в течение 8 часов для снижения липазной активности. Бактерины объединяли и затем смешивали при использовании AMPHIGEN®, адъювантов, консервантов и буферов для разведения так, что каждая 5-мл доза вакцины содержала компоненты, указанные в таблице ниже.

Концентрации антигенов

Компонент Концентрация компонента / доза
L.canicola 1200 HE/5-мл доза
L.icterohaemorrhagiae 1200 HE/5-мл доза
L.grippotyphosa 1200 HE/5-мл доза
L.hardjo 2400 HE/5-мл доза
L.pomona 1200 HE/5-мл доза

Препарат гомогенизировали при использовании гомогенизатора Silverson и подвергали микрофлюидизации при использовании микрофлюидизатора от Microfluidics. После гомогенизации и микрофлюидизации доводили pH препарата до рН 7,0-7,3.

Пример 3. Тестирование действенности на хомячках и коровах

Вакцину Примера 2 вводили хомячкам и коровам для тестирования действенности при использовании стандартных лабораторных моделей и моделей животного-хозяина. Тестовых хомячков подвергали действию дозы Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa или Leptospira pomona для тестирования действенности вакцин. Количества выживших определяли в качестве показателей эффективности. У коров определяли титры микроскопический агглютинации против Leptospira hardjo для демонстрации действенности этой фракции вакцины у коров. Таблица ниже показывает, что вакцины, полученные из обработанных нагреванием бактеринов Leptospira, способны вызывать антигенный ответ, который соответствует критериям эффективности.

Термальное кондиционирование Leptospira Выжившие хомячки Серология у коров
Canicola Icteero Grippо Pomona Hardjo
65°C (8 часов) 10/10 10/10 10/10 10/10 Соответствует
Без обработки 10/10 10/10 10/10 10/10 Соответствует

Пример 4. Физико-химическое тестирование вакцин

Вакцину получали из обработанных нагреванием бактеринов Leptospira в соответствии со способом Примера 2. Такую же вакцину получали из не обработанных нагреванием бактеринов Leptospira в соответствии со способом Примера 2. Оба вакцинных препарата хранили при 4°C в течение 60 суток. Анализ размера частиц при использовании лазерного дифрактометра делали для каждой только что полученной вакцины в день 0 и снова через 60 суток.

Графики, приведенные ниже, показывают распределения размеров частиц для каждой вакцины в день 0 до хранения и после хранения в течение 60 суток.

Анализ размеров частиц только что полученной вакцины, содержащей не обработанные нагреванием бактерины Leptospira, в день 0.

Анализ размеров частиц только что полученной вакцины, содержащей не обработанные нагреванием бактерины Leptospira, на 60-е сутки.

Анализ размеров частиц только что полученной вакцины, содержащей обработанные нагреванием бактерины Leptospira, в день 0

Анализ размеров частиц только что полученной вакцины, содержащей обработанные нагреванием бактерины Leptospira, на 60-е сутки.

Вакцина, полученная из обработанных нагреванием бактеринов Leptospira, показывает сохранение размеров частиц, что указывает на стабильность эмульсии. Вакцина, полученная из не обработанных нагреванием бактеринов Leptospira, показывает увеличение размеров частиц, что указывает на распад эмульсии.

Пример 5. Анализ вирулицидности

Следуя способу Примера 2, получали вакцины из не обработанных нагреванием бактеринов Leptospira и обработанных нагреванием бактеринов Leptospira. После 5-6 месяцев старения тестировали вакцины на вирулицидную активность против вируса BHY-1, вируса PI3 и вируса BRSV. Тест на вирулицидную активность осуществляли регидратацией моновалентных контролей для анализа вирулицидности (VAC) адъювантным разбавителем, подлежащим тестированию. Два моновалентного контроля для анализа вирулицидности регидратировали при каждом объеме дозы. Два регидратированных моновалентных VAC объединяли в пул и инкубировали при 20-25°C в течение двух часов перед титрованием и инокуляцией на клетки для определения титра живых вирусов по TCID50 (доза, инфицирующая 50% культуры ткани). Неудовлетворительной является потеря вирусного титра больше чем 0,7 TCID50/мл.

Результаты анализов вирулицидности, показывающие потерю вирусного титра, приведены в таблице ниже.

Термальное кондиционирование Leptospira Потеря вирусного титра (TCID50)
BHY-1 PI3 BRSV
8 часов при 65°C 0,1 0,0 0,4
Без обработки 1,0 ≥1,2 ≥1,3

Вакцина, полученная с не обработанными нагреванием бактеринами Leptospira, показывает высокие уровни вирулицидной активности. Вакцина, полученная с обработанными нагреванием бактеринами Leptospira, была не вирулицидной.

1. Вакцина для предупреждения инфекции, вызванной по меньшей мере одним из Leptospira, герпес-вируса коров, вируса парагриппа и коровьего респираторного синцитиального вируса, содержащая эмульсию, включающую
а) обработанный нагреванием бактерин Leptospira, имеющий липазную активность 50% или менее по сравнению с липазной активностью бактерина до обработки нагреванием и сохраняющий антигенную активность, и
б) 1-3 живых вируса, выбранных из группы, состоящей из герпес-вируса коров, вируса парагриппа и коровьего респираторного синцитиального вируса,
где указанная обработка нагреванием включает нагревание бактерина Leptospira до температуры от 60°C до 70°C в течение времени от 5 до 10 часов.

2. Вакцина по п. 1, дополнительно содержащая убитые вирусы.

3. Вакцина по п. 2, где убитые вирусы содержат по меньшей мере один вирус из BVDV-1 (вирус вирусной диареи коров типа 1) и BVDV-2 (вирус вирусной диареи коров типа 2).

4. Вакцина по п. 1, содержащая эмульсию лецитина в масле, Quil А и холестерин.

5. Вакцина по п. 1, представляющая собой эмульсию масло в воде.

6. Вакцина по п. 3, представляющая собой эмульсию масло в воде.

7. Вакцина по п. 4, представляющая собой эмульсию масло в воде.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для защиты птиц от болезни Ньюкастла. Способ включает введение in ovo во время последней четверти периода инкубации эффективной иммунизирующей дозы иммуногенной композиции непосредственно в эмбрион.

Изобретение касается способа изготовления вакцины, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Охарактеризованный способ включает отбор пораженных органов от павших кроликов в период их заболевания из местного эпизоотического очага, выделение чистых культур возбудителей болезней, для чего проводят раздельное выращивание культур Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и биотехнологии. Иммуногенные композиции, которые содержат вирус собачьего гриппа и собачий респираторный коронавирус, а также они могут дополнительно содержать Bordetella bronchiseptica, пертактин, вирус собачьего парагриппа и собачий аденовирус серотипа 2 являются эффективными для лечения или предупреждения комплекса инфекционных респираторных заболеваний собак.
Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии. Предложена вакцина против чумы, аденовирусных инфекций, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, лептоспироза и бешенства собак, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит в 1 дозе вакцины смесь суспензии аттенуированного штамма вируса чумы плотоядных ГКВ №2313, семейства Paramyxoviridae, рода Morbillivirus с титром не менее 103,5 ТЦД50; суспензии аттенуированного штамма аденовируса собак 2-го типа ГКВ №2311, семейства Adenoviridae, рода Mastadenovirus с титром не менее 103,0 ТЦД50; суспензии аттенуированного штамма парвовируса собак 2-го типа ГКВ №2312, семейства Parvoviridae, рода Parvovirus с титром не менее 103,0 ГАЕ; суспензии аттенуированного штамма коронавируса собак ГКВ №2314, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus с титром не менее 103,0 ТЦД50; инактивированной суспензии штамма вируса бешенства Ера - СВ-М20, семейства Rhabdoviridae, рода Lyssavirus в количестве 1 ME, инактивированных суспензий лептоспир серогрупп Icterohaemorrhagiae и Canicola, взятых в смеси в равном соотношении с конечной концентрацией каждого штамма не менее 3×108 инактивированных микробных клеток в 1 дозе вакцины.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения конъюгата капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b (Hib) с антигенами. Представленный способ включает получение смеси столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси или фосфата алюминия, которую используют в качестве антигена.
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии. Способ иммунопрофилактики массовых вирусных болезней телят заключается в следующем: клинически здоровых телят 20-30-дневного возраста иммунизируют трехкратно с интервалом в 10-12 дней подкожными инъекциями гипериммунной сыворотки животных-доноров, содержащей антигемагглютинины к вирусу парагриппа-3 (в титре не ниже 1:1280), к вирусу инфекционного ринотрахеита (в титре 1:256), к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых (в титре 1:1024), к респираторно-синтициальному вирусу (в титре 1:128), к ротавирусу и коронавирусу (в титре 1:128), в дозе 1 мл/кг живой массы, а через 15 дней после последней инъекции иммунизируют инъекциями инактивированной комбинированной вакцины «Комбовак» против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистых, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусных болезней, а перед пассивной (с применением гипериммунной сыворотки) и перед активной (с применением вакцины «Комбовак») иммунизациями однократно в течение 15 дней применяют внутрь комплексный фитопрепарат, представляющий собой спиртовую настойку из измельченной растительной смеси равных количеств травы и соцветий эхинацеи пурпурной, мать-и-мачехи, тимьяна ползучего и корней солодки голой, в виде 7% водного раствора в дозе 2,0 мл/кг живой массы животного.
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии. Способ вакцинопрофилактики респираторных болезней телят включает иммунизацию клинически здоровых телят 20-30-дневного возраста трехкратно с интервалом в 10-12 дней подкожными инъекциями гипериммунной сыворотки животных-доноров, содержащей антигемагглютинины к вирусу парагриппа-3 в титре не ниже 1:1280, к вирусу инфекционного ринотрахеита в титре 1:256, к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых в титре 1:1024, к респираторно-синцитиальному вирусу в титре 1:128, к ротавирусу и коронавирусу в титре 1:128, в дозе 1 мл/кг живой массы, а через 15 дней после последней инъекции вакцинируют двукратным введением инактивированной комбинированной вакцины «Комбовак» против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистых, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусных болезней согласно наставлению.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается вакцины против гриппа, вызываемого известными штаммами вирусов гриппа А и В, а также возможными реассортантами.
Группа изобретений относится к ветеринарии и медицине, в частности к получению и использованию биопрепаратов для иммунотерапии экопатологий. Группа изобретений включает получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E.
Изобретение относится к области пищевой промышленности, биотехнологии и касается композиции антибактериальной и штамма бактериофага Escherichia coli, используемого для получения такой композиции.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются штамма Francisella tularensis 15/23-1ΔrecA и способа его получения. Охарактеризованный штамм является генетически маркированным: имеет только одну копию гена iglC и делетированный ген recA.

Изобретение относится к медицине, а именно для использования в области иммунологии, и касается индуктора гамма интерферона. Для этого применяют экзополисахарид бактерий P.nigrifaciens штамма КММ 156 в качестве индуктора IFN-γ.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины. Создана рекомбинантная псевдоаденовирусная частица, на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессирующую кассету со вставкой гена модифицированного химерного наноантитела, связывающегося с микоплазмой M.

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и иммунологии. Описан полисахарид клеточной стенки энтерококков.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой α1,6-глюкан-содержащее соединение Helicobacter pylori. Настоящее изобретение также раскрывает конъюгат для индукции иммунного ответа против H.pylori, содержащий указанное соединение, конъюгированное с белком-носителем.
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике риккетсиозов, и может быть использовано для выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в сыворотке крови людей, а также при изучении иммунологической структуры населения и проверке эффективности вакцинации.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются cпособа предотвращения или лечения заболевания у субъекта, вызванного патогенным организмом, путем введения вакцинной композиции, вакцинной композиции и ее применения.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и представляет собой иммуногенную композицию для активации иммунного ответа в отношении пневмококков и/или менингококков, содержащую: (i) смесь конъюгированных пневмококковых капсульных сахарид; и (ii) два различных полипептида фактор H-связующего белкового антигена (fHBP), но не содержащая везикулы внешней мембраны менингококка.
Предложенная группа изобретений относится к области ветеринарии. Предложены вакцина, направленная против актинобациллезной плевропневмонии, включающая липополисахарид в комплексе с одним или более повторов токсинов ApxI, ApxII и ApxIII, выделенный из бактериальной культуры, и полимиксин для уменьшения симптомов эндотоксического шока, вызываемого липополисахаридом, способ получения такой вакцины, применение полимиксина для снижения симптомов эндотоксического шока и способ снижения симптомов эндотоксического шока при введении вакцины, в котором полимиксин добавляют в вакцину в дозе от 2,6 до 60 мкг/мл.

Изобретение касается способа изготовления вакцины, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Охарактеризованный способ включает отбор пораженных органов от павших кроликов в период их заболевания из местного эпизоотического очага, выделение чистых культур возбудителей болезней, для чего проводят раздельное выращивание культур Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и эндокринологии, и касается лечения заболеваний, связанных с нарушениями эндоканнабиноидной системы. Для этого предложено лекарственное средство на основе антител к каннабиноидному рецептору человека, полученное в процессе многократного последовательного разведения этих антител и промежуточного внешнего механического воздействия.
Наверх