Способ получения пероксидазы

Авторы патента:

Сальникова Светлана Александровна (RU)

C12N9/02 - оксидоредуктазы (1.), например люцифераза

C07K1/14 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2570631:

Иванов Владимир Николаевич (RU)
Серкова Анастасия Никитична (RU)
Сальникова Светлана Александровна (RU)
Глазова Наталья Владимировна (RU)

Изобретение относится к способу получения пероксидазы. Способ заключается в экстракции предварительно измельченных корнеплодов редьки черной 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием. Полученный экстракт подвергают сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н⁺-форме со скоростью 240 мл/см² ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды. Осуществляют элюцию с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см² ч для получения элюата. Доводят значения рН в элюате до 6, обессоливают элюат и лиофильно высушивают с получением указанного фермента. Способ позволяет сократить потери целевого продукта, увеличить выход фермента на 30%. 2 пр.

Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу оксидаз (пероксидаз) и гидролитического фермента (лизоцима) из растительного сырья.

Известные способы получения ферментов из растительного сырья с использованием экстракционных, сорбционных и других методов выделения предусматривают получение отдельных ферментов или нескольких ферментов в комплексе, в основном для препаративных целей.

Из RU 2388819 C2 известен способ получения пероксидазы из корневищ хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония, осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях рН и рК буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, затем лиофилизуют.

Из RU 2342431 C1 известен способ получения авидина и лизоцима из яичного белка посредством хроматографии яичного белка, проводимой на силохроме C-80 при нейтральном значении pH (7,0-7,5), балластные белки удаляют в 0,2 М глицин-NaOH буфере в присутствии 0,3 М NaCl при pH 9,39,5, целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером с 0,5-0,8 М NaCl, при pH 10,8-11,0 с последующим разделением белков гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является описанный выше способ получения пероксидазы из корневищ хрена, раскрытый в RU 2388819. Недостатками указанного способа являются многостадийность процесса, использование агрессивного и экологически небезопасного высаливающего агента, использование для очистки от балластных белков двух гелевых сорбентов.

Задача настоящего изобретения заключалась в разработке нового сорбционного способа получения ферментов из растительного сырья, при котором процесс их получения упрощен с возможностью получения пероксидазы и лизоцима в одном цикле работы сорбционной колонны. Преимуществом такого способа также является повышение выхода и чистоты получаемой пероксидазы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения ферментов из растительного сырья, выбранных из пероксидаз и лизоцима, при котором предварительно измельченное растительное сырье подвергают водно-солевой экстракции 5 % раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5-3 ч при комнатной температуре. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию и сепарированию для удаления остатков сырья и балластных веществ, сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме со скоростью 50-240 мл/см² ч с последующей промывкой колонны 3-15 объемами дистиллированной воды или цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 4,0, элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 9,0-10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 25-160 мл/см² ч для получения элюата, содержащего пероксидазу, и последующей возможной элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 11 с 1 н. раствором (NH4)₂SO₄ со скоростью 25-160 мл/см² ч для получения элюата, содержащего лизоцим, и доводят значение рН в элюате(ах) до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного(ых) фермента(ов).

Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корнеплоды редьки черной.

Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корневища хрена.

Отличие предложенного способа от прототипа заключается в осуществлении процесса по гибкой технологии с использованием одного и того же сорбционного оборудования независимо от свойств целевого продукта с последующей очисткой индивидуально для каждого фермента.

Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:

- возможность выделения и очистки белков различной структуры на одних и тех же производственных мощностях в зависимости от потребности;

- сокращаются потери целевых продуктов и увеличивается съем ферментов с единицы сырья в среднем на 30%;

- улучшается качество готовых препаратов и условия труда.

Способ иллюстрируется следующими примерами

ПРИМЕР 1

Измельченные, обезжиренные и высушенные корнеплоды редьки черной подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см² ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см² ч при комнатной температуре, pH элюента 10,7. На выходе из колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу. Фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют, доводят рН элюата до 6,0, производят обессоливание и лиофильную сушку фермента пероксидазы.

ПРИМЕР 2

Измельченные, обезжиренные и высушенные корневища хрена подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см² ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см² ч при комнатной температуре, рН элюента 10,7. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л и определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. После десорбции пероксидазы колонну промывают 3 объемами цитратно-фосфатного буферного раствора с pH 4,0, после чего ведут десорбцию лизоцима раствором аммиака с рН 11,0-12,0 с 1 н. раствором (NH₄)₂SO₄ со скоростью 160 мл/см² ч. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность лизоцима; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. В полученных элюатах перокисдазы и лизоцима сдвигают рН до 6,0, после чего их подвергают обессоливанию и лиофилизации.

Способ получения пероксидазы из корнеплодов редьки черной, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием, сорбции полученного экстракта на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н⁺-форме со скоростью 240 мл/см² ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды, элюции с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см² ч для получения элюата, доведения значения рН в элюате до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного фермента.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий дельта-9-элонгазной активностью, а также к очищенному полипептиду, обладающему дельта-9-элонгазной активностью, кодируемому вышеуказанной изолированной молекулой нуклеиновой кислоты.

Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы. // 2557318

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой очищенную рекомбинантную уратоксидазу (уриказу), характеризующуюся содержанием тетрамеров и октамеров 95% и более от общего количества её молекул.

Белок, обладающий активностью в отношении стимуляции элонгации цепей жирных кислот, кодирующий его ген и их применение // 2556375

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к белку, обладающему активностью в отношении стимуляции элонгации цепей жирных кислот, и полинуклеотиду, кодирующему этот белок.

Способ получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов методом дериватизации // 2546672

Изобретение относится к новому способу получения флуоресцирующих катехоламинов, выбранных из допамина и адреналина, и их метаболитов, выбранных из гомованилиновой и ванилилминдальной кислот, методом дериватизации.

Клетка мицелиального гриба penicillium canescens - продуцент ксиланазы и лакказы, способ получения комбинированного ферментного препарата ксиланазы и лакказы // 2538149

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена клетка мицелиального гриба Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией, продуцирующая ксиланазу и лакказу.

Ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля // 2527899

Изобретение относится к области биохимии и касается применения концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Способ определения активности пероксидаз и субстратная смесь для определения активности пероксидаз // 2525137

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использовано при создании аналитических наборов с использованием пероксидаз. Способ предусматривает приготовление субстратной смеси, введение в субстратную смесь пероксидаз с последующей регистрацией интенсивности образующегося свечения.

Гены дельта-8-десатуразы, ферменты, кодируемые ими, и их применение // 2517615

Изобретение относится к биохимии и представляет собой выделенные полинуклеотиды, кодирующие Δ8-десатуразу. Изобретение также относится к самим Δ8-десатуразам, кодируемым выделенными полинуклеотидами, векторам экспрессии, содержащим выделенные полинуклеотиды, клеткам-хозяевам, содержащим векторы экспрессии, и к способам получения Δ8-десатураз и полиненасыщенных жирных кислот, выбранных из группы, состоящей из дигомо-гамма-линоленовой кислоты (DGLA), ω3-эйкозатетраеновой кислоты (ω3-ЕТА) и любых их сочетаний.

Трансгенные растения // 2515927

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетической конструкции для экспрессии нечувствительной к треонину аспартаткиназы в растении, где конструкция содержит специфический для фазы старения промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, которая кодирует полипептид, обладающий активностью нечувствительной к треонину аспартаткиназы, и в которой специфический к старению промотор выбран из группы, состоящей из SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 и SAG18, или их функциональных вариантов, или фрагментов.

Укороченная мутантная люцифераза из metridia longa для применения в качестве биолюминесцентного репортера в живых клетках // 2495929

Изобретение относится к биохимии и представляет собой укороченную мутантную люциферазу MLM4 из Metridia longa размером ~16 кДа с улучшенными свойствами для использования в качестве генетически-кодируемого биолюминесцентного репортера для визуализации молекулярных процессов в живых клетках.

Выделение нерастворимых искомых белков // 2570625

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения рекомбинантного нерастворимого искомого белка шелка из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев.

Способ очистки фактора свертывания крови viii // 2567811

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очищения или обогащения фактора свертывания крови FVIII с использованием хроматографии. Способ включает обеспечение фракции, содержащей рекомбинантный FVIII, в водном растворе с высокой ионной силой, где водный раствор содержит рекомбинантный FVIII в растворе с большой концентрацией соли, соответствующей проводимости в диапазоне от приблизительно 25 до приблизительно 200 мС/см при 25°C, приведение фракции, содержащей рекомбинантный FVIII, в контакт с многомодальной смолой, которая представляет собой Capto Adhere или Capto ММС.

Способ получения препарата интерлейкина-2, препарат интерлейкина-2 и фармацевтический иммуномодулирующий препарат // 2565553

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способу получения препарата интерлейкина-2, препарату интерлейкина-2, полученному указанным способом, и фармацевтическому препарату, содержащему указанный препарат интерлейкина-2.

Промывочный раствор и способ промывки для аффинной хроматографии // 2564569

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения очищенных антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc или слитый с Fc белок, с использованием матрикса аффинной хроматографии, с которым связаны указанные антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc или слитый с Fc белок.

Способ получения рекомбинантного белка sav-rgd, специфически узнающего клетки меланомы // 2563540

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения рекомбинантного белка SAV-RGD, специфически узнающего клетки меланомы человека, предусматривает культивирование в питательной среде штамма Escherichia coli MG1655/pSAV-RGD, получение периплазматической фракции клеток указанного штамма, очистку рекомбинантного белка ионообменной хроматографией с последующей ультрафильтрацией и лиофилизацией.

Конъюгаты меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами // 2562862

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению меченых антител, и может быть использовано для диагностики. Антитела конструируют с заменой одной или нескольких аминокислот исходного антитела на не являющиеся перекрестно связанными, высокореакционноспособные цистеиновые аминокислоты.

Способ получения ботулинического нейротоксина (варианты) // 2561459

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы получения биологически активного ботулинического нейротоксина с использованием хроматографии, по существу без использования продуктов животного происхождения.

Мультиплексный анализ стопочного трансгенного белка // 2561458

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выявления присутствия двух или более представляющих интерес белков с известными аминокислотными последовательностями в образце растительного происхождения (варианты) и способу сохранения генотипа сорта трансгенного растения.

Способ очистки полипептидных растворов // 2558367

Изобретение относится к способу получения иммуноглобулинов подкласса IG1 и IG4 из супернатантов культивированных клеток. За счет подведения значения рН в кислую сторону и последующего инкубирования закисленного раствора нуклеиновые кислоты и белки клетки хозяина могут преципитировать, но искомый полипептид остается в растворе.

Пептиды горохового белка с анти-helicobacter pylori активностью // 2558304

Изобретение касается применения композиции, включающей гидролизат горохового белка и/или пептид для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции Helicobacter pylori (варианты), а также таких композиций (варианты).

Способ очистки белка фактора роста // 2571926

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очистки G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) в последовательности очистки, применяющей хроматографию. Способ включает осуществление по меньшей мере одной хроматографии с использованием многомодальной смолы с отрицательно заряженным лигандом в виде 2-(бензоиламино)бутановой кислоты. G-CSF связывают с многомодальной смолой при pH в интервале 4-6,2. G-CSF элюируют при pH выше 6,3 или элюирующим агентом в элюирующем буфере, где указанный агент включает аминокислоту, имеющую основную боковую цепь и/или высокую ионную силу в элюирующем буфере, выбранную из группы, состоящей из аргинина, лизина и/или гистидина. Концентрация элюирующего агента находится в интервале от примерно 0,1 М до примерно 2,0 М. Предложенное изобретение позволяет получить очищенный G-CSF с высоким выходом. 13 з.п. ф-лы, 14 ил., 10 табл., 11 пр.