Гуманизированные антитела к cdcp1



Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1
Гуманизированные антитела к cdcp1

 


Владельцы патента RU 2571207:

РОШЕ ГЛИКАРТ АГ (CH)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и раскрывает группу гуманизированных рекомбинантных антител, специфически связывающихся с человеческим CDCP1. Настоящее изобретение также раскрывает нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту и прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, предназначенную для получения указанных антител. Предусмотрен способ получения указанных антител с применением указанной клетки-хозяина. Использованием в качестве активного указанного антитела получают фармацевтическую композицию для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией CDCP1. Настоящее изобретение позволяет получить гуманизированные антитела с улучшенными CDCP1 связывающими свойствами. 10 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 6 пр.

 

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к человеческому CDCP1 (антитело к CDCP1), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к вариантам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Человеческий CDCP1 ((содержащий CUB-домен белок 1, В345, CD318, SIMA135, TRASK; SEQ ID NO: 29 и варианты с мутацией R525Q (т.е. замена аргинина (R) на глутамин (Q) в положении 525 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29) и/или с мутацией G709D (т.е. замена глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D) в положении 709 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29)) представляет собой трансмембранный белок, содержащий три внеклеточных CUB-домена. Обнаружена сверхэкспрессия этого белка при раке молочной железы, ободочной кишки и легкого. Уровни его экспрессии коррелируют с метастатической способностью клеток карцином (Uekita Т. и др.. Am. J. Pathol. 172, 2008, сс. 1729-1739). Установлено, что в линии раковых клеток он несет фосфорилированный тирозин (WO 2002/004508; Scherl-Mostageer М. и др., Oncogene 20, 2001, сс. 4402-4408; Hooper J. D. и др., Oncogene 22, 2003, сс. 1783-1794; Perry S.E. и др., FEBS Lett. 581, 2007, со. 1137-1142; Brown Т.А. и др., J. Biol. Chem. 279, 2004, сс. 14772-14783; Ota Т. и др., Nat. Genet. 36, 2004, сс. 40-45). Описаны образованные в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы.

CDCP1 описан в WO 2002/004508 в качестве ассоциированного с опухолями антигена В345.

CDCP1 описан в WO 2004/074481 в качестве гликопротеинового антигена SIMA135, который экспрессируется в метастатических опухолевых клетках. CDCP1 описан в WO 2005/042102 в качестве белка, ассоциированного с раком яичника. В WO 2007/005502 описаны методы и композиции, предназначенные для лечения заболеваний, которые обеспечивают направленное воздействие на CDCP1.

В US 2004/0053343 (и у Conze Т. и др., Ann. N. Y. Acad. Sci. 996, 2003, сс. 222-226 и Buehring H.J. и др., Stem Cells 22, 2004, сс. 334-343) описаны антитела к CDCP1, предназначенные для идентификации определенных популяций стволовых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно а) является гуманизированным и б) содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно а) является гуманизированным и б) содержит в VL последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) и триптофан (W) в положении 47 (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно а) является гуманизированным и б) содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) и триптофан (W) в положении 47 (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что относится к человеческим антителам IgGI-подкласса.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антитело является гликозилированным с помощью сахарной цепи на Asn297, при этом на долю фукозы в указанной сахарной цепи приходится 65% или менее.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении.

Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, предназначенная для лечения рака.

Изобретение относится также к гуманизированному антителу, предлагаемому в изобретении, которое предназначено для лечения рака.

Изобретение относится также к применению гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, которая кодирует гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении. Изобретение относится также к экспрессионным векторам, которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которые обладают способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и к клеткам-хозяевам, которые содержат указанные векторы, предназначенные для рекомбинантного производства антитела, предлагаемого в изобретении.

Изобретение относится также к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, которая содержит вектор, предлагаемый в изобретении.

Изобретение относится также к способу получения рекомбинантного гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, отличающемуся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют антитело из клетки или супернатанта клеточной культуры. Изобретение относится также к антителу, полученному с помощью указанного способа рекомбинации.

Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего раком, заключающемуся в том, что вводят пациенту, у которого диагностировано наличие указанного заболевания (и который поэтому нуждается в такой терапии) в эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении. Антитело вводят предпочтительно в составе фармацевтической композиции.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что конкретные гуманизированные версии антитела к CDCP1 CUB4, предлагаемые в изобретении, отличаются улучшенными CDCP1-связывающими свойствами по сравнению с другими гуманизированными версиями, полученными в результате гуманизации, которые известны из существующего уровня техники. Это обусловлено конкретными аминокислотными заменами в CDRH2 и/или в CDRL1 и в каркасном участке легкой цепи. При создании изобретения неожиданно было установлено, что гуманизированные версии антитела к CDCP1 CUB4, предлагаемые в изобретении, отличаются повышенной способностью ингибировать рост опухолей in vivo по сравнению с химерными или мышиными антителами CUB4.

Подробное описание изобретения

Антитело CUB4 представляет собой антитело, депонированное под №DSM АСС2551 (DSMZ), описанное в DE 10242146 (ЕР 1396501, US 7541030), вариабельная область тяжелой цепи (VH) которого имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи (VL) которого имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Антитело CUB4 специфически связывается с человеческим CDCP1 (депонирование под номером DSM ACC2551 (DSMZ) осуществлено. Университетом Эберхарда-Карла г.Тюбингена, Университетской клиникой г.Тюбингена (Eberhard-Karls-University Tubingen, UniversitatskUnikum Tubingen, Geissweg 3 72076, Тюбинген)).

Понятие «является гуманизированным» в контексте настоящего описания означает антитело на основе мышиного антитела CUB4, в котором VH имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и VL имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, в котором (после химеризации с использованием человеческой константной области) указанные VH и VL гуманизируют путем трансплантации мышиных CDR в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L., и др. Nature 332, 1988, сс. 323-327; nNeubergerM. S. и др.. Nature 314, 1985, сс. 268-270; Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 10029-10033; US 5530101; US 5585089; US 5693761; WO 90/07861; и US 5225539). Каркасные участки вариабельных областей тяжелой и легкой цепей можно выводить из последовательностей одного и того же человеческого антитела или из различных человеческих антител. Последовательности человеческих антител могут представлять собой последовательности, которые встречаются в естественных условиях в человеческих антителах. Человеческие каркасные участки вариабельных областей тяжелой и легкой цепей перечислены, например, у Lefranc M.P., Current Protocols in Immunology, приложение IP A.I P.I-A. IP.37, 2000, и их можно получать через IMGT, международную информационную систему ImMunoGeneTics® (http://imgt.cines.fr) или на сайте http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk.

Гуманизированные антитела, предлагаемые в изобретении, имеют также

а) конкретные мутации в CDRH2 VH (мутации Т57К. и P60V) и/или

б) конкретные мутации в CDRL1 VL (мутация V33L) и в каркасном участке VL (обратная мутация, приводящая к замене в положении 47 человеческой аминокислоты в каркасном участке VL на мышиную аминокислоту W).

При создании изобретения неожиданно было установлено, что указанные мутации в гуманизированных антителах CUB4 приводят к улучшенным способностям к связыванию (по сравнению с гуманизированными антителами CUB4 без указанных модификаций). Кроме того, такие модификации в CDR и/или каркасном участке приводят к получению гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, обладающих повышенной способностью ингибировать рост опухолей in vivo (по сравнению с химерными и мышиными родительскими антителами).

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности: лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2) (нумерация всех положений дана по Кэботу). Это означает, что SEQ ID NO: 1 несет мутации Т57К и P60V в CDRH2 VH.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL) (нумерация всех положений дана по Кэботу). Это означает, что SEQ ID NO: 2 несет мутацию V33L в CDRL1 и обратную мутацию, приводящую к замене человеческой аминокислоты на мышиную аминокислоту W в положении 47 в каркасном участке VL.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (нумерация всех положений дана по Кэботу). Это означает, что SEQ ID NO: 1 несет мутации Т57К и P60V в CDRH2 VH и SEQ ID NO: 2 несет мутацию V33L в CDRL1 и обратную мутацию, приводящую к замене человеческой аминокислоты на мышиную аминокислоту W в положении 47 в каркасном участке VL.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL); глицин (G) или аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRL1) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL), глицин (G) или аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRH) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRL1) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRL1) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO: 18.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что относится к человеческим антителам IgGI-подкласса.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антитело является гликозилированным с помощью сахарной цепи на Asn297, при этом на долю фукозы в указанной сахарной цепи приходится 65% или менсс.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается наличием одной из следующих комбинаций гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL, которые представлены в таблице 1 (см. приведенные ниже номера примеров антител.).

Таблица 1:
Предпочтительные комбинации гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL
Гуманизированное антитело CUB4, пример антитела № VL (SEQ ID NO:) VL (SEQ ID NO:)
80 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-M (SEQ ID NO: 14)
69 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-L2 (SEQ ID NO: 15)
47 hHC4.H (SEQ ID NO: 3) hLC-K (SEQ ID NO: 16)
58 hHC4.H(SEQ ID NO: 3) hLC-L (SEQ ID NO: 17)
36 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC.J (SEQ ID NO: 18)
102 hHC4.H (SEQ ID NO: 3) hLC-b (SEQ ID NO: 19)
113 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-c (SEQ ID NO: 20)
91 hHC4.H (SEQ ID NO: 3) hLC-a (SEQIDNO:21)
124 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-d (SEQ ID NO: 22)
135 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-e (SEQ ID NO: 23)
146 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-f (SEQIDNO:24)

Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 15.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 16.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 17.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 18.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 19.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 20.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 21.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 22.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 23.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 24.

Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается наличием одной из следующих комбинаций гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL, которые представлены в таблице 2. Указанные комбинации содержат человеческие последовательности, представленные в таблице 2 в примерах под соответствующими номерами.

Таблица 2:
Дополнительные предпочтительные комбинации гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL
Гуманизированное антитело CUB4, пример № VL(SEQIDNO:) VL (SEQ ID NO:)
80 hHC4-H (SEQIDNO: 3) hLC-M (SEQ ID NO: 14)
69 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-L2 (SEQ ID NO: 15)
47 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-K (SEQ ID NO: 16)
58 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-L (SEQ ID NO: 17)
36 hHC4-H (SEQ ID NO: 3) hLC-J (SEQ ID NO: 18)

Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

и

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Понятие «нумерация по Кэботу» или «нумерация согласно Кэботу» или «EU-нумерация», если не указано иное, относится к нумерации остатков, например, в IgG, с помощью EU-нумерации, предложенной Kabat и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый аминокислотный состав.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из мышиного антитела и по меньшей мере часть константной области, выведенную из другого источника или видов, которое, как правило, получают методами рекомбинантной ДНК. Наиболее предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессируемых генов иммуноглобулина, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют мышиные вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, которые кодируют человеческие константные области иммуноглобулина. Другими формами «химерных антител», подпадающими под объем настоящего изобретения, являются антитела, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела называют также «антителами переключенного класса». Методы получения химерных антител основаны на общепринятых методиках рекомбинантной ДНК и методиках генной трансфекции, и в настоящее время являются хорошо известными в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Ргос.Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Человеческий CDCP1 ((содержащий CUB-домен белок 1, В345, CD318, SIMA135, TRASK; SEQ ID NO: 29 и варианты с мутацией R525Q (т.е. замена аргинина (R) на глутамин (Q) в положении 525 аминокислотной последовательности SEQ ID N0:29) и/или с мутацией G709D (т.е. замена глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D) в положении 709 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29)) представляет собой трансмембранный белок, содержащий три внеклеточных CUB-домена. Обнаружена сверхэкспрессия этого белка при раке молочной железы, ободочной кишки и легкого. Уровни его экспрессии коррелируют с метастатической способностью клеток карцином (Uekita Т. и др.. Am. J. Pathol. 172, 2008, сс. 1729-1739). Установлено, что в линии раковых клеток он несет фосфорилированный тирозин (WO 2002/004508; Scherl-Mostageer М. и др., Oncogene 20, 2001, сс. 4402-4408; Hooper J. D. и др., Oncogene 22, 2003, сс. 1783-1794; Perry S.E. и др FEBS Lett. 581, 2007, сс. 1137-1142; Brown T.A. и др., J. Biol. Chem. 279, 2004, сс. 14772-14783; Ota Т. и др., Nat. Genet. 36, 2004, сс. 40-45). Описаны образовавшиеся в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы.

В контексте настоящего описания понятие «специфически связывающееся с человеческим CDCP1» относится к антителу, которое специфически связывается с человеческим антигеном CDCP1. Аффинность связывания характеризуется значением KD, составляющим 1,0 х 10 молей/л или ниже (например, от 1,0×10-8 до 1,0×10-8 молей/л), предпочтительно значение KD составляет 5,0×10-9 молей/л или ниже (например, от 5,0×10-9 до 1,0×10-13 молей/л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом, таким как метод поверхностного плазмонного резонанса (Biacore®).

Понятие «эпитоп» относится к белковой детерминанте человеческого CDCP1, которая обладает способностью специфически связываться с антителом.

Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и, как правило, эпитопы обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационнные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, в отличие от последних, элиминируется в присутствии денатурирующих растворителей.

Понятия «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания обозначают области каждой из пар легких и тяжелых цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждая область содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых в значительной степени являются консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адаптированы к Р-складчатой конформации, и CDR могут образовывать петли, соединяющие Р-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживают свою трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют наиболее важную роль в специфичности/аффинности связывания антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому они представляют собой еще один объект изобретения.

«Каркасные участки» или «РР»-участки представляют собой участки вариабельных областей, отличные от остатков гипервариабельных участков, как они определены в настоящем описании. Таким образом, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу следующие участки: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR- и FR-участки определяют согласно стандартной номенклатуре, предложенной Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) и/или как участки из «гипервариабельной петли».

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающий центр антитела» обозначает аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание антигена. Антигенсвязывающий центр антитела содержит аминокислоты из гипервариабельных участков или «CDR». «Антигенсвязывающий центр» антитела, предлагаемого в изобретении, содержит шесть гипервариабельных участков (CDR), которые вносят различный вклад в аффинность сайта связывания с антигеном. В вариабельной области тяжелой цепи присутствуют три CDR (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и в вариабельной области легкой цепи присутствуют три CDR (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Понятие «CDRH1» обозначает CDR1-участок вариабельной области тяжелой цепи, определенной согласно Кэботу. CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 обозначают соответствующие участки из тяжелой (Н) или легкой (L) цепи. Размер CDR и каркасных участков (FR) определяют путем сравнения с компилированной базой данных аминокислотных последовательностей, в которых такие участки были определены на основе вариабельности последовательностей согласно Кэботу с соавторами, см. выше.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятия «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относятся к молекуле ДНК и молекуле РНК. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

В контексте настоящего описания понятие «аминокислота» обозначает группу встречающихся в естественных условиях аминокислот, в которых карбоксильная группа находится в а-положении относительно аминогруппы, включающую аланин (трехбуквенный код: а1а, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys. С), глутамин (gin, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys. К), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr. Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что константная область выведена из человеческого антитела и предпочтительно человеческого антитела подкласса IgG. Константная область включает константную область тяжелой цепи и легкой цепи антитела. Константная область тяжелой цепи содержит в направлении от N-конца к С-концу антитела домен 1 константной области антитела (СН1), шарнирную область антитела (HR), домен 2 константной области тяжелой цепи антитела (СН2) и домен 3 константной области тяжелой цепи антитела (СИЗ) и необязательно домен 4 константной области тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Константная область легкой цепи содержит константный домен легкой цепи антитела (CL). Константная область легкой цепи антитела (CL) может относиться к к-(каппа)-типу или Х-(лямбда)-типу. Такие константные цепи хорошо известны в данной области, и они описаны, например, у Kabat E.A. (см., например, Johnson, G. и Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, сс. 214-218). Например, пригодная для применения человеческая константная область тяжелой цепи подкласса IgGI содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. Например, пригодная для применения человеческая константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи SEQ ID NO: 27; другая пригодная для применения человеческая константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой лямбда-цепи SEQ ID NO: 28.

«Fc-область (Fc-фрагмент)» антитела не принимает непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но с ней связаны различные эффекторные функции. Понятие «Fc-область антитела» хорошо известно специалистам в данной области и определяется на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотой последовательности константой области тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины подразделяют на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, и IgG4, IgAl и IgA2. В зависимости от константных областей тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов обозначают как α, β, ε, γ и µ соответственно.

Fc-область антитела принимает непосредственное участие в ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность), основой которых является активации комплемента, связывание Clq и связывание Fc-рецептора. Активация комплемента (CDC) инициируется в результате связывания фактора Clq системы комплемента с Fc-областью большинства антител из подклассов IgG. Хотя воздействие антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с Clq происходит опосредуется определенными сайтами связывания в Fc-области. Такие сайты связывания известны в данной области, и они описаны, например, у Boackle R.J. и др., Nature 282, 1979, сс. 742-743; Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс. 2555-2560; Bunkhouse R. и Cobra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс. 907-917; Burton D.R. и др.. Nature 288, 1980, сс. 338-344; Thomason J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, сс. 995-1004; Idiocies E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184; Hearer М. и др., J. Virol. 75, 2001, сс. 12161-12168; Morgan А. и др.. Immunology 86, 1995, сс. 319-324; и в ЕР 0307434. Такими сайтами связывания являются, например, сайты, L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-нумерации по Кэботу, см. ниже). Для антител подкласса IgGI, IgG2 и IgG3, как правило, характерна способность активировать комплемент и связываться с Clq и СЗ, в то время как антитела подкласса IgG4 не активируют систему комплемента и не связываются cClqHC3.

Антитело, предлагаемое в изобретении, содержит Fc-область, имеющую человеческое происхождение, и предпочтительно все другие фрагменты человеческих константных областей. В контексте настоящего описания понятие «Fc-область, имеющая человеческое происхождение» относится к Fc-области, которая либо представляет собой Fc-область человеческого антитела подкласса IgGI, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно Fc-область человеческого подкласса IgG, несущую мутации Fc-область человеческого подкласса IgGI (предпочтительно несущую мутацию L234A+L235A), Fc-область человеческого подкласса IgG4 или несущую мутации Fc-область человеческого подкласса IgG4 (предпочтительно несущую мутацию S228P). Наиболее предпочтительными являются константные области тяжелых цепей человеческого подкласса IgGI, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 26 или 31, человеческого подкласса IgGI с мутациями L234A и L235A, человеческого подкласса IgG4, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO:32, или человеческого подкласса IgG4 с мутаций S228P.

Понятие «антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC)» относится к лизису человеческих клеток-мишеней, опосредованному антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии эффекторных клеток.

Уровень ADCC оценивают предпочтительно путем обработки препарата экспрессирующих CDCP1 клеток антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или очищенные эффекторные клетки из лейкоцитарных пленок, типа моноцитов или естественных клеток-киллеров (NK) или постоянно выращиваемой линии NK-клеток.

Понятие «комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» обозначает процесс, инициируемый связыванием фактора Clq системы комплемента с Fc-областью антител большинства подклассов IgG. Связывание Clq с антителом происходит в результате определенных белок-белковых взаимодействий в так называемом сайте связывания. Такие сайты связывания Fc-области известны в данной области (см. выше). Такие сайты связывания Fc-фрагмента представляют собой сайты, в которых присутствуют аминокислоты L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-нумерации по Кэботу). Антитела подклассов IgGI, IgG2 и IgG3, как правило, обладают способностью к активации комплемента, включая связывание с Clq и СЗ, в то время как антитело подкласса IgG4 не активирует систему комплемента и не связывается с СЦи/илиСЗ.

Клеточно-опосредованные эффекторные функции моноклональных антител можно усиливать путем конструирования их олигосахаридного компонента, как это описано у Umana Р. и др. Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180 и в US 6602684. Антитела IgGI-типа, которые являются наиболее широко применяемыми терапевтическими антителами, представляют собой гликопротеины, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, которые присоединены к Asn297, размещаются между СН2-доменами, образуя обширные контакты с каркасом полипептида, и их наличие является существенным для способности антитела опосредовать эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, сс. 813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, сс. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, сс. 26-32). В статье Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180 и в WO 99/54342 продемонстрировано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III («GnTIII»), которая представляет собой гликозилтрансферазу, катализирующую образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает ADCC-активность антител т vitro, Изменения состава присоединенного к Asn297 углевода или его элиминация оказывает влияние также на связывание с FcγR и Clq (Umana P. и др.. Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng. 74, 2001, сс. 288-294; Mimura Y. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 45539-45547; Radaev S. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 16478-16483; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, сс. 26733-26740; Simmons L.C. и др., J. Immunol. Methods 263, 2002, сс. 133-147).

Методы усиления клеточно-опосредуемых эффекторных функций моноклональных антител описаны, например, в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, у Umana Р. и др.. Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180, в WO 99/154342. WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 и WO 2000/061739 или, например, у Niwa R. и др., J. Immunol. Methods 306, 2005, сс. 151-160; ShinkawaT. и др., J. Biol. Chem. 278, 2003, сс. 3466-3473; в WO 03/055993 и US 2005/0249722.

Таким образом, в одном из вариантов рсуществления антитело, предлагаемое в изобретении, является гликозилированным (если оно содержит Fc-область антитела подкласса IgGI или IgG3) с помощью сахарной цепи на Asn297, при этом на долю фукозы в указанной сахарной цепи приходится 65% или менее (нумерация согласно Кэботу). В другом варианте осуществления изобретения на долю фукозы в указанной сахарной цепи приходится от 5 до 65%, предпочтительно от 20 до 40%. В альтернативном варианте осуществления изобретения на долю фукозы приходится 0% от количества олигасахаридов в положении Asn297 Fc-области. В контексте настоящего описания «Asn297» обозначает аминокислоту аспарагин, присутствующую примерно в положении 297 в Fc-области. Вследствие минорных вариаций последовательности антител Asn297 может располагаться также на несколько аминокислот (как правило, не более чем на ±3 аминокислоты) дальше или ближе в направлении к С-концу по отношению к положению 297, т.е. между положениями 294 и 300. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагаемое в изобретении гликозилированное антитело подкласса IgG представляет собой человеческое антитело подкласса IgGI или антитело подкласса IgG3. В другом варианте осуществления изобретения количество остатков N-гликолилнейраминовой кислоты (NGNA) составляет 1% или менее и/или количество остатков N-концевой альфа-1,3-галактозы составляет 1% или менее в указанной сахарной цепи. Предпочтительно сахарная цепь обладает характеристиками N-связанных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое рекомбинантно экспрессируется в СНО-клетке.

Выражение «сахарная цепь обладает характеристиками N-связанных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое рекомбинантно экспрессируется в СНО-клетке» означает, что сахарная цепь на Asn297 антитела, предлагаемого в изобретении, имеет такую же структуру и последовательность сахарных остатков за исключением фукозного остатка, что и антитело, экспрессируемое в немодифицированных СНО-клетках, например, как описано в WO 2006/103100.

В контексте настоящего описания понятие «NGNA» обозначает сахарный остаток N-гликолилнейраминовой кислоты.

Гликозилирование человеческого IgGI или IgG3 имеет место на Asn297 в виде гликозилирования, осуществляемого с помощью сложного биантенного олигосахарида с коровым фукозилированием, на концах которого располагаются вплоть до 2 остатков Gal. Константные области человеческих тяжелых цепей подклассов IgGI или IgG3 подробно описаны у Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins oflmmunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, а также у Bruggemann M. и др., J. Exp.Med. 166, 1987, сс. 1351-1361; Love T.W. и др.. Methods Enzymol. 178, 1989, сс. 515-527. Эти структуры обозначают как гликановые остатки G0, G1 (α1,б или α1,3) или G2 в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int. 1, 2003, сс. 44-53). СНО-тип гликозилирования Fc-областей антитела описан, например, у Routier F.H., Glycoconjugate J. 14, 1997, сс. 201-207. Антитела, которые рекомбинантно экспрессируются в СНО-клетках-хозяевах с немодифицированной схемой гликозилирования, как правило, являются фукозилированными на Asn297 по меньшей мере на 85%. Модифицированные олигосахариды в антителе могут быть гибридными или сложными. Предпочтительно бисекционные восстановленные/нефукозилированные олигосахариды являются гибридными. В другом варианте осуществления изобретения бисекционные восстановленные/нефукозилированные олигосахариды являются комплексными. В контексте изобретения понятие «количество фукозы, доля фукозы» означает количество указанного сахара в сахарной цепи на Asn297, взятое по отношению к сумме всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии и рассчитывают в виде среднего значения (см. например, WO 2008/077546). Относительное количество фукозы выражают в виде процента содержащих фукозу структур относительно всех гликоструктур, идентифицированных с помощью MALDI-TOF, в обработанном N-гликозидазой F образце (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы соответственно).

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. Такие методы хорошо известны в данной области, и они включают осуществление экспрессии белка в прокариотических и эукариотических клетках и последующее выделение полипептида антитела и, как правило, очистку до достижения фармацевтически приемлемой степени чистоты. Для осуществления экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как СНО-клетки, NSO-клетки, SP2/0-клетки, НЕК293-клетки, COS-клетки, клетки дрожжей или клетки E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса).

Методы рекомбинантного получения антител хорошо известны из существующего уровня техники, и они описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.C„ Protein Expr. Purif. 17, 1999, сс. 183-202; Geisse S. и др.. Protein Expr. Purif. 8, 1996, сс. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, сс. 151-161; Werner R.G„ Drug Res. 48, 1998, сс. 870-880.

Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или находиться в частично очищенной или практически чистой форме. Очистку для удаления других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, осуществляют с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).

Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с.Е9. Клонирование вариабельных областей описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 3833-3837; Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс. 4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, сс. 77-87. Предпочтительная система для кратковременной экспрессии (НЕК293) описана Schlaeger E.-J. и Christensen К. в Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83 и у Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996,сс.191-199.

Контролирующие последовательности, которые можно применять для прокариотических организмов, представляют собой, например, промотор, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что для эукариотических клеток применяют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие «функционально овязаны» означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидерной секреторной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако для энхансеров не является необходимым, чтобы они были смежными. Связывание осуществляют путем лигирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

Моноклональные антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как, хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, которые кодируют моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Клетки гибридом могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как НЕК293-клетки, СНО-клетки или клетки миеломы, которые в ином случае не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для обеспечения синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

В контексте настоящего описания понятия «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все определения, в которые входят эти понятия, включают потомство. Так, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные рассматриваемые клетки, а также культуры, выведенные из них, независимо от количества переносов. Следует также иметь в виду, что все потомство может не быть строго идентичным касательно содержания ДНК вследствие случайных или неумышленных мутаций. Эти понятия включают варианты потомства, которые обладают такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга исходная трансформированная клетка. В тех случаях, когда следует применять другие обозначения, это должно быть очевидно из контекста.

В контексте настоящего описания понятие «трансформация» относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если в качестве клеток-хозяев применяют клетки, оболочки которых не представляют собой труднопреодолимые барьеры, то трансфекцию осуществляют, например, методом, основанным на осаждении фосфатом кальция, описанным у Graham и Van der Eh, Virology 52, 1978, с.546 и далее. Однако можно применять также и другие методы интродукции ДНК в клетки, такие как инъекция в ядра или слияние протопластов. Если используют прокариотические клетки или клетки, имеющие значительные клеточные оболочки, то в качестве метода трансфекции можно применять обработку кальцием с использованием хлорида кальция, описанную у Cohen F.N. и др., PNAS 69, 1972, с. 2110-2114.

В контексте настоящего описания понятие «экспрессия» относится к процессу, посредством которого осуществляется транскрипция нуклеиновой кислоты в мРНК, и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК (которую называют также транскриптом) впоследствии транслируется с образованием пептидов, полипептидов или белков. Транскрипты и кодируемые полипептиды в целом называют генным продуктом. Если полинуклеотид выводят из геномной ДНК, то экспрессия в эукариотической клетке может включать сплайсинг мРНК.

«Вектор» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в частности самореплицирующуюся, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между клетками-хозяевами. Понятие включает векторы, функция которых состоит, прежде всего, во встраивании ДНК или РНК в клетку (например, хромосомная интеграция), репликационные векторы, функция которых состоит, прежде всего, в репликации ДНК или РНК, и в экспрессионные векторы, функция которых состоит, прежде всего, в транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Под понятие подпадают также векторы, которые обладают несколькими указанными функциями.

«Экспрессионный вектор» представляет собой полинуклеотид, который при интродукции в соответствующую клетку-хозяина может транскрибироваться и транслироваться в полипептид. Понятие «экспрессионная система» относится, как правило, к приемлемой клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, функцией которой может быть выход требуемого продукта экспрессии.

Одним из объектов изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении. Другим объектом изобретения является применение антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления фармацевтической композиции. Следующим объектом изобретения является способ приготовления фармацевтической композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении. Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, например, фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, включенное в состав препаративной формы в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, установлено, что указанные конкретные гуманизированные версии антитела к CDCP1 CUB4 являются более ценными для лечения рака по сравнению, например, с другими антителами к CDCP1.

Таким образом, одним из объектов изобретения является фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения рака.

Другим объектом изобретения является гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, предназначенное для лечения рака.

Другим объектом изобретения является применение гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Следующим объектом изобретения является способ лечения пациента, страдающего раком, который заключается в том, что вводят гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

В контексте настоящего описания понятие «фармацевтический носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, придающие изотоничность и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель можно применять для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии).

Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить с помощью различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или форму введения можно варьировать в зависимости от требуемых результатов. Для введения соединения, предлагаемого в изобретении, с помощью определенных путей введения может оказаться необходимым наносить на соединение покрытие из материала, препятствующего его инактивации, или осуществлять введение соединения совместно с таким материалом. Например, соединение можно вводить индивидууму в соответствующем носителе, например, в липосомах или в разбавителе. К фармацевтически приемлемым разбавителям относятся физиологический раствор и водные забуферивающие растворы. К фармацевтически приемлемым носителям относятся стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Применение таких сред и агентов для обладающих фармацевтической активностью субстанций известно в данной области.

В контексте настоящего описания понятия «парентеральное введение» и «введение парентеральным путем» означают пути введения, отличные от энтерального введения и местного применения, как правило, они относятся к введению путем инъекции и включают (но, не ограничиваясь только ими) внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

В контексте настоящего описания понятие «рак» относится к таким заболеваниям, как, например, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), альвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза, лимфома, лимфолейкоз, включая рефракторные варианты любого из указанных выше видов рака и комбинации одного или нескольких видов рака. Предпочтительно указанный рак представляет собой рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак легкого или рак предстательной железы и более предпочтительно рак легкого. Предпочтительные указанные виды рака отличаются также экспрессией или сверхэкпрессией CDCP1, более предпочтительно сверхэкспрессией CDCP1.

Указанные композиции могут содержать также адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Отсутствие микроорганизмов можно обеспечивать как с помощью процедур стерилизации (см. выше), так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких, например, как парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п. Может оказаться целесообразным включать в композиции агенты для придания изотоничности, такие как сахара, хлорид натрия и т.п.Кроме того, можно пролонгировать абсорбцию инъекционной фармацевтической формы путем включения веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Вне зависимости от выбранного пути введения соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, которые можно применять в пригодной гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых форм лекарственного средства с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.

Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, можно варьировать для получения количества действующего вещества, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, но которое не является токсичным для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, которые используют в сочетании с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни пациента, подлежащего лечению, и другие подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Композиция должна быть стерильной и текучей в той степени, чтобы композицию можно было вводить с помощью шприца. Помимо воды предпочтительным носителем является изотонический забуференный физиологический раствор.

Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию агенты для придания изотоничности, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит или сорбит, и хлорид натрия.

Следующие примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, полный объем которого представлен в приведенной ниже формуле изобретения. Очевидно, что в изложенных процедурах могут быть сделаны модификации без отклонения от сути изобретения.

Описание аминокислотных последовательностей из перечня последовательностей

SEO ID NO: 1 вариабельная область тяжелой цепи VH антитела CUB4 (депонировано под №DSM ACC2551);

SEO ID NO: 2 вариабельная область легкой цепи VL антитела CUB4 (депонировано под №DSM ACC2551);

SEO ID NO: 3 hHC4-H - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 4 hHC4-c - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 5 hHC4-a - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 6 hHC4-d - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 7 hHC4-04 - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 8 hHC4-K - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 9 hHC4-K2 - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 10 hHC4-I - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 11 hHC4-07 - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 12 hHC4-03 - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 13 hHC4-b - гуманизированная VH CUB4;

SEO ID NO: 14 hLC4-M - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 15 hLC4-L2 - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 16 hLC4-K - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 17 hLC4-L - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 18 hLC4-J - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 19 hLC4-b - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 20 hLC4-c - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 21 hLC4-a - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 22 hLC4-d - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 23 hLC4-e - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 24 hLC4-f - гуманизированная VL CUB4;

SEO ID NO: 25 hLC4-I - гуманизированная VL CUB4;

SEQ ID NO: 26 - константная область тяжелой цепи IgGI человеческого происхождения (кавказский аллотип);

SEQ ID NO: 27 - константная область легкой каппа-цепи человеческого происхождения;

SEO ID NO: 28 - константная область легкой лямбда-цепи человеческого происхождения;

SEO ID NO: 29 - человеческий CDCP1;

SEO ID NO: 30 - содержащий внеклеточный домен (ECD) фрагмент

человеческого CDCP1;

SEQ ID NO: 31 - константная область тяжелой цепи IgGI человеческого происхождения (афроамериканский аллотип).

SEO ID NO: 32 - константная область тяжелой цепи IgG4 человеческого происхождения.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - аминокислотная последовательность VH-области (CDRH1, CDRH2 и CDRH3 обозначены выделенными жирным шрифтом буквами) мышиного (mVH-CUB4) антитела и аминокислотные последовательности VH-области различных гуманизированных антител к CDCP1 CUB4 (конкретные модификации, предлагаемые в изобретении, обозначены выделенными жирным шрифтом буквами);

на фиг.2 - аминокислотная последовательность VL-области (CDRL1, CDRL2 и CDRL3 обозначены выделенными жирным шрифтом буквами) мышиного (mVL-CUB4) антитела и аминокислотные последовательности VL-области различных гуманизированных антител к CDCP1 CUB4 (конкретные модификации, предлагаемые в изобретении, обозначены выделенными жирным шрифтом буквами);

на фиг.3 - относительные уровни связывания различных гуманизированных антител к CDCP1 CUB4. Представлены уровни связывания комбинаций различных гуманизированных VH- и VL-областей в сравнении с химерным антителом CUB4 ((chHC4=мышиные VH и VL с константной областью человеческого IgGI);

на фиг.4 - данные, полученные in vitro, характеризующие ADCC созданного с помощью гликоинженерии (GE) гуманизированного антитела CUB4 №69 GE, в котором количество фукозы составляет 65% или менее, по сравнению с ADCC химерного созданного с помощью гликоинженерии (GE) CUB4 и антитела дикого типа (wt обозначает химерное антитело CUB4, при создании которого не применяли гликоинженерию) и применяемого в качестве отрицательного контроля человеческим IgG;

на фиг.5а и 5б - данные, полученные in vivo, характеризующие ингибирование роста ксенотранспланта опухолей человеческого рака легкого Н322М гуманизированными антителами CUB4 №69 и №135, химерным антителом CUB4 и мышиным антителом CUB4.

Пример 1

Специфический для антигена ELISA

Растворимый внеклеточный домен CDCP1 (CDCP1-ECD) (SEQ ID NO: 30), слитый со стрептавидинсвязывающим белком (SBP), иммобилизовывали на сенсибилизированном стрептавидином планшете. Для определения оптимального связывания антитела с SBP-CDCP1-ECD 384-луночные полистирольные планшеты (NUNC, сенсибилизированные стрептавидином), поставляемые фирмой MicroCoat, Бернрид, Германия (Ю-№1734776-001) сенсибилизировали чистым и серийно разведенным супернатантом НЕК293-клеток (в буфере BCA/IMDM:100 мг/мл БСА, фракция V, фирмы Roche, 10735078001, растворенный в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков). С помощью калибровочной кривой, полученной для мышиных антител CUB4, определяли оптимальный фактор разведения супернатанта НЕК.293-клеток касательно способности связываться со стрептавидином на титрационном микропланшете. В случае стандартной сенсибилизации содержащий SBP-CDCP1-ECD супернатант НЕК293 разводили (от 1:15 до 1: 40) и инкубировали в течение ночи при 2-8°С (25 мкл на лунку). Интенсивная отмывка титрационного планшета являлась обязательной для удаления оставшегося несвязанного комплекса SBP-CDCP1-ECD.

Гуманизированные антитела CUB4 и/или референс-антитело (химерное (chHC4) антитело CUB4, содержащее человеческую константную область и мышиные VH и VL, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: I и 2) оценивали либо в неразведенном виде, либо, используя 12-стадийное разведение. По 12,5 мкл каждого образца на лунку инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. После интенсивной отмывки с помощью ЗФР-Т (0,1% Твин 20 в ЗФР) добавляли к любым человеческим антителам по 25 мкл козьих антител к человеческому IgG, сшитых с HRP (фирма Jackson ImmunoResearch, код №109-036-098, разведение 1:10000) и инкубировали в течение 1 ч. После интенсивной отмывки связывание антител оценивали с помощью таблеток ABTS (фирма Roche Diagnostics GmbH, каталожный №1112422). Оценивали абсорбцию при 405 нм/492 нм с помощью стандартного фотометра.

На фиг.3 представлены данные об уровнях связывания различных комбинаций гуманизированных VH и VL относительно химерного (chHC4) антитела CUB4. Результаты демонстрируют, что модифицированные определенным образом гуманизированные антитела, несущие

а) конкретные мутации в CDRH2 VH-области (мутации Т57К и P60V). (см. VH-область: hHC4-H (SEQ ID NO: 3), и/или

б) конкретные мутации в CDRL1 VL-области (мутация V33L) и мутацию, приводящую к замене человеческой аминокислоты на мышиную аминокислоту W в положении 47 в каркасном участке VL-области; (см. VL-области: hLC4-M(SEQ ID NO: 14), hLC4-L2 (SEQ ID NO: 15), hLC4-K(SEQ ID NO: 16), hLC4-L(SEQ ID NO: 17), hLC4-J(SEQ ID NO: 18)), неожиданно обладают в значительной степени улучшенными способностями к связыванию по сравнению с гуманизированными антителами CUB4, в которых отсутствуют указанные конкретные модификации.

Пример 2

Характеристики связывания антител к CDCP1 с содержащим внеклеточный домен (ECD) фрагментом человеческого CDCP1. последовательность которого представлена в SEO ID NO: 30 (содержит внеклеточный домен ECD человеческого CDCP1)

Для измерения аффинности сшивали по 30 мкг/мл антител к мышиному Fey (козьи, фирма Jackson Immuno Research JIR115-005-071) с поверхностью сенсорного чипа СМ-5 с помощью стандартной химии аминового сочетания и блокады с использованием устройства для SPR (Biacore Т 100). После конъюгации различные антитела к CDCP1 инъецировали при 25°С со скоростью потока 5 мкл/мин с последующим введением серийных разведении (от 0 до 1000 нМ) ECD CDCP1 со скоростью 30 мкл/мин. В качестве подвижного буфера в экспериментах по связыванию применяли ЗФР/0,1% БСА. Затем чип регенерировали, осуществляя 60 импульсов раствора 10 мМ глицин-HCl, рН 2,0.

Для расчета термодинамических параметров (КD, константа связывания) и кинетических параметров (скорость kon, скорость koff) использовали модель Лэнгмюра для связывания в соотношении 1:1.

Таблица 3. Приведенные в качестве примера параметры связывания гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении

Гуманизированное
антитело к CDCP1
Ka
[1/Мс]
kd
[1/с]
t1/2 дисс.
мин]
KD
[нМ]
47 2,0Е+05 7.5Е-04 15,4 3,77
69 2,1Е+05 5,2Е-04 22,1 2.55
80 2,5Е+05 8,8Е-04 13,1 3,53
91 1,8Е+05 1,ОЕ-03 11.2 5,60
102 1.9Е+05 1,1Е-03 11,0 5,40
135 1.4Е+05 1.1Е-03 10,3 8,30

Пример 3

Получение созданного с помощью гликоинженерии гуманизированного антитела CUB4 (гуманизированное антитело CUB4 GE)

Последовательности ДНК тяжелых и легких цепей полноразмерного антитела, соответствующие аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 15 (антитело 69), субклонировали в экспрессионных векторах млекопитающих (один для легкой цепи и один для тяжелой цепи) под контролем промотора MPSV и против хода транскрипции относительно синтетического поли(А)-сайта, каждый вектор нес последовательность OriP EBV.

Антитела получали путем котрансфекции клеток линии HEK293-EBNA с использованием экспрессионных векторов, содержащих тяжелую и легкую цепи антител млекопитающих, с помощью подхода на основе трансфекции фосфатом кальция. Клетки HEK293-EBNA на экспоненциальной фазе роста трансфектировали фосфатом кальция. Для получения немодифицированного антитела клетки трансфектировали только экспрессионными векторами, содержащими тяжелую и легкую цепи, в соотношении 1:1. Для получения созданного с помощью гликоинженерии антитела клетки котрансфектировали четырьмя плазмидами, две из которых предназначались для экспрессии антитела, одна - для экспрессии слитого с GnTIII полипептида (экспрессионный вектор для GnT-III) и одна - для экспрессии маннозидазы II (экспрессионный вектор для маннозидазы II комплекса Гольджи) в соотношении 4:4:1:1 соответственно. Клетки выращивали в виде прикрепленных монослойных культур в Т-колбах, используя культуральную среду DMEM, дополненную 10% FCS, и их трансфектировали при достижении 50-80% конфлюэнтности. Для осуществления трансфекции в Т150-колбах высевали 15 миллионов клеток за 24 ч до трансфекции в 25 мл культуральной среды DMEM, дополненной FCS (конечная концентрация 10 об.%), и клетки выдерживали при 37°С в инкубаторе в содержащей 5% СO2 атмосфере в течение ночи. Для осуществления трансфекции каждой Т150-колбы приготавливали раствор, содержащий ДНК, СаСl2 и воду, путем смешения 94 мкг общей входящий в векторы плазмидной ДНК, которую отбирали поровну из экспрессионных векторов легкой и тяжелой цепей, воды до достижения конечного объема 469 мл и 469 мкл 1М раствора CaCl2. К этому раствору добавляли 938 мкл раствора, содержащего 50 мМ HEPES, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2НРO4, рН 7,05, немедленно перемешивали в течение 10 с и выстаивали при комнатной температуре в течение 20 с. Суспензию разводили в 10 мл среды DMEM, пополненной 2% FCS, и вносили в Т150-колбу вместо присутствующей в ней среды. Затем вносили дополнительно 13 мл среды для трансфекции. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение примерно 17-20 ч, после чего среду заменяли 25 мл DMEM, 10% FCS. Кондиционированную культуральную среду собирали через 7 дней после трансфекции путем центрифугирования в течение 15 мин при 210хg, раствор стерилизовали фильтрацией (фильтр с размером отверстий 0,22 мкм) и добавляли азид натрия в конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.

Секретируемые созданные с помощью гликоинженерии гуманизированные антитела CUB4 №69 (гуманизированные антитела CUB4 №69 GE) очищали с помощью аффинной хроматографии на белке А с последующей катионообменной хроматографией и, наконец, с помощью стадии гель-фильтрации на колонке Superdex 200 (фирма Amersham Pharmacia), осуществляя замену буфера на раствор, содержащий 25 мМ фосфат калия, 125 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, рН 6,7, и собирали чистые мономерные антитела в виде IgGl. Концентрацию антител определяли с помощью спектрофотометра при длине волны абсорбции 280 нм. Олигосахариды, присоединенные к Fc-области антител, анализировали с помощью MALDI/TOF-MC (согласно методу, описанному в WO 2008/077546). Олигосахариды высвобождали из антител путем ферментативного расщепления с помощью PNGaseF (пептид-К-гликозидаза F), причем антитела были либо иммобилизованы на ПВДФ-мембране, либо находились в растворе. Полученный в результате расщепления раствор, содержащий высвободившиеся Олигосахариды, либо использовали непосредственно для MALDI/TOF-MC-анализа, либо дополнительно расщепляли с помощью гликозидазы EndoH перед подготовкой образцов к MALDI/TOF-MC-анализу.

В другом эксперименте созданные с помощью гликоинженерии гуманизированные антитела CUB4 (гуманизированное антитело CUB4 GE), такие как антитела №69 и №135, получали путем контрансфекции четырьмя плазмидами, две из которых предназначались для экспрессии антитела, одна -для экспрессии слитого с GnTIII полипептида (экспрессионный вектор для GnT-III) и одна - для экспрессии маннозидазы П (экспрессионный вектор для маннозидазы II комплекса Гольджи) в соотношении 4:4:1:1 соответственно, используя СНО-клетки вместо НЕК293-ЕВМА-клеток. Проанализированное количество фукозы в сахарной цепи на Asn297 составляло 50-10%.

Пример 4

Анализ in vitro ADCC гуманизированных антител CUB4

Клетки-мишени линии PC-3 (DSMZ №АСС 465, клетки аденокарциномы предстательной железы, которые культивировали в питательной смеси Хэма F12+2 мМ L-аланил-L-глутамин+10% FCS) и линии Н322М (немелкоклеточная карцинома легких, которые культивировали в среде RPMI1640+2 мМ L-аланил-L-глутамин+10% PCS), собирали после обработки трипсином/ЭДТК (фирма Gibco, №25300-054) на экспоненциальной фазе роста. После стадии отмывки и проверки количества и жизнеспособности клеток, требуемые аликвоты метили в течение 30 мин при 37°С в инкубаторе для клеток кальцеином (фирма Invitrogen, №С3100МР; содержимое 1 флакона ресуспендировали в 50 мкл ДМСО с получением 5 млн. клеток на 5 мл среды). Затем клетки отмывали трижды средой AIM-V, проверяли количество и жизнеспособность клеток и количество клеток доводили до 0,3 млн/мл.

Параллельно подготавливали РВМС в качестве эффекторных клеток путем центрифугирования в градиенте плотности (Histopaque-1077, фирма Sigma, №Н8889) согласно протоколу производителя (стадии отмывки: 1х при 400g и 2х при 350g по 10 мин каждый раз). Проверяли количество и жизнеспособность клеток и количество клеток доводили до 15 млн/мл.

По 100 мкл окрашенных кальцеином клеток-мишеней высевали в круглодонные 96-луночные планшеты, добавляли по 50 мкл разведенного антитела и добавляли по 50 мкл эффекторных клеток. В некоторых экспериментах клетки-мишени смешивали с жидким Redimune® NF (иммуноглобулин здорового человека) (фирма ZLB Behring), используя Redimune в концентрации 10 мг/мл.

В качестве контроля служили образцы, в которых происходил спонтанный лизис, полученные путем совместного культивирования клеток-мишеней и эффекторных клеток без антитела, и образцы, для которых характерен максимальный лизис, для определения которого осуществляли лизис с помощью 1% Тритон Х-100 только клеток-мишеней. Планшет инкубировали в течение 4 ч при 37°С во влажной камере для клеток.

Уничтожение клеток-мишеней оценивали, измеряя высвобождение LDH (лактатдегидрогеназа) из поврежденных клеток с помощью набора для определения цитотоксичности (набор для определения LDH, фирма Roche, №1644793) согласно инструкции производителя. В целом, метод состоял в следующем: по 100 мкл супернатанта из каждой лунки смешивали с 100 мкл субстрата, входящего в набор, в прозрачном плоскодонном 96-луночном планшете. Значение Vmax, обнаруженное в цветной реакции в присутствии субстрата, определяли с помощью ридера для ELISA при 490 нм в течение по меньшей мере 10 мин. Процент опосредуемого конкретным антителом уничтожения рассчитывали следующим образом: ((А - SR)/(MR- SR)xlOO, где А обозначает среднюю величину Vmax при конкретной концентрации антитела, SR обозначает среднюю величину Vmax при спонтанной высвобождении и MR обозначает среднюю величину Vmax при максимальном высвобождении.

Дополнительные данные, касающиеся сохранения кальцеина интактными клетками-мишенями, получали путем лизиса оставшихся клеток-мишеней в боратном буфере (5 мМ борат натрия+0,1% Тритон) и количественно оценивали по флуоресценции кальцеина с помощью планшет-ридера для определения флуоресценции.

На фиг.4 представлены данные анализов in vitro ADCC созданного с помощью гликоинженерии (GE) гуманизированного антитела CUB4 №69 GE, в котором количество фукозы составляло 65% или менее, в сравнении с ADCC химерного созданного с помощью гликоинженерии (GE) антитела CUB4 и антитела дикого типа (wt обозначает химерное антитело CUB4, при создании которого не применяли гликоинженерию) и применяемого в качестве отрицательного контроля человеческого IgG.

Пример 5

Стимуляция фосфорилирования CDCP1 в клетках линии DU-145

По 2×105 клеток линии Du-145 на 6-луночный планшет культивировали в среде DMEM (фирма РАА, каталожный №Е15-0011), дополненной 2 мМ L-глутамином (фирма Sigma, каталожный №G7513, 2 мМ пируватом натрия, 10% FCS (фирма РАА, каталожный №Е 15-0011) в течение ночи. Клетки инкубировали с различными гуманизированными антителами CUB4 в концентрации 20 мкг/мл в течение 10 мин. Клетки лизировали с помощью свежеприготовленного охлажденного на льду буфера для лизиса (RlPA - буфер: 1% NP4О, 1% DOC (дезоксихолат), 0,1% ДСП, 150 мМ Nad, ЮмМ Трис/HCl, рН 7,4, 1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид) в этаноле, 10 мкг/мл апротинина, 0,4 мМ ортованадат). После выдерживания в течение 10 мин на льду клеточные лизаты центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин. Лизаты разделяли с помощью ДСН-ПААГ с использованием стандартного протокола и переносили на нитроцеллюлозу посредством вестерн-блоттинга. Полученные при бестерн-блоттинге блоты выявляли с помощью антитела к фосфотирозину (4G10) или антитела к фосфоСОСР. Уровень фосфорилирования CDCP1 определяли с помощью денситометрического сканирования (денситометр Biorad GS 800).

Таблица 4:
Процент (%) стимуляции гуманизированными антителами CUB4 (в сравнении с химерным CUB4)
Гуманизированное антитело CUB4, № Процент (%) стимуляции
химерное антитело CUB4 100
80 133
69 112
47 96
135 72

Все гуманизированные антитела CUB4 №80, №69, №47 и №135 обладали способностью стимулировать фосфорилирование CDCP1 в клетках линии DU-145.

Пример 6

In vivo ингибирование опухолей гуманизированными антителами CUB4

А) Название эксперимента: CDCP1 PZ H322M 007

Настоящее исследование in vivo осуществляли с целью сравнения эффективности химерного антитела к CDCP1 CUB4 и гуманизированных версий антитела CUB4 в отношении применяемой в качестве модели немелкоклеточного рака легкого линии NCI-H322M.

Клетки немелкоклеточного рака легкого линии H322M получали из коллекции NCI. Линию опухолевых клеток культивировали согласно общепринятым методам в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной водяным паром атмосфере при 5% СО2. Для трансплантации использовали пассаж 4.

Человеческую линию клеток немелкоклеточного рака легкого H322M подкожно инокулировали (5х10 клеток) в матригеле в правую боковую область мышей.

Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы, т.е. через 19 дней после трансплантации. Антитела вводили i.p.q7d в дни опыта 19, 26, 33, 40 и 47 в указанной дозе 25 мг/кг. Кроме того, в эти же дни вводили наполнитель. Вводимый объем составлял 10 мл/кг.

Основой гуманизированного антитела CUB4 №69 являлись VH и VL, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 15.

Основой гуманизированного антитела CUB4 №135 являлись VH и VL, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 23.

Группы:

Подвергнутая обработке группа 1: наполнитель.

Подвергнутая обработке группа 2: химерное антитело CUB4 (25 мг/кг i.p.).

Подвергнутая обработке группа 3: гуманизированное антитело CUB4 №69 (25 мг/кг i.p.).

Подвергнутая обработке группа 4: гуманизированное антитело CUB4 №135 (25 мг/кг i.p.).

На фиг.5а представлены полученные in vivo данные, демонстрирующие ингибирование роста ксенотранплантата опухолей человеческого рака легкого линии H322M гуманизированными антителами CUB4 №69 и №135 и химерным антителом CUB4, при этом четко продемонстрировано более выраженное ингибирование роста опухолей in vivo обоими гуманизированными антителами CUB4 №69 и №135 по сравнению с химерным антителом CUB4.

Б) Название эксперимента: CDCP1 PZ H322M 004

Настоящее исследование in vivo осуществляли с целью сравнения эффективности мышиного антитела к CDCP1 CUB4 и химерного антитела к CDCP1 CUB4 (мышиные VH и VL и константная область человеческого IgGI) в отношении применяемой в качестве модели немелкоклеточного рака легкого линии NCI-H322M.

Клетки немелкоклеточного рака легкого линии H322M получали из коллекции NCI. Линию опухолевых клеток культивировали согласно общепринятым методам в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной водяным паром атмосфере при 5% СО2. Для трансплантации использовали пассаж 4.

Человеческую линию клеток немелкоклеточного рака легкого H322M подкожно инокулировали (5х10 клеток) в матригеле в правую боковую область мышей.

Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы, т.е. через 17 дней после трансплантации. Антитела вводили i.p.q7d вплоть до прекращения опыта в день 59 в указанной дозе 10 мг/кг.Кроме того, в эти же дни вводили наполнитель. Вводимый объем составлял 10 мл/кг.

Группы:

Подвергнутая обработке группа 1: наполнитель.

Подвергнутая обработке группа 2: мышиное антитело CUB4 (10 мг/кг i.p).

Подвергнутая обработке группа 3: химерное антитело CUB4 (10 мг/кг i.p).

На фиг.5б представлены полученные in vivo данные, демонстрирующие ингибирование роста ксенотранплантата опухолей человеческого рака легкого линии H322M мышиным антителом CUB4 и химерным антителом CUB4, при этом продемонстрировано более выраженное ингибирование роста опухолей in vivo химерным антителом CUB4 по сравнению с мышиным антителом CUB4.

1. Антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, и домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4,
отличающееся тем, что оно
а) является гуманизированным и
б) содержит в VH-последовательности:
лизин (K) в положении 57 вместо треонина (Т) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р), где нумерация всех положений дана по Кэботу.

2. Антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, и домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4,
отличающееся тем, что оно
а) является гуманизированным и
б) содержит в VL-последовательности:
лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) и триптофан (W) в положении 47, где нумерация всех положений дана по Кэботу.

3. Антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, и домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4,
отличающееся тем, что оно
а) является гуманизированным и
б) содержит в VH-последовательности:
лизин (K) в положении 57 вместо треонина (Т) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р),и
в) содержит в VL-последовательности:
лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) и триптофан (W) в положении 47, где нумерация всех положений дана по Кэботу.

4. Антитело по п. 3, отличающееся тем, что содержит в VL-последовательности: метионин (М) в положении 21, где нумерация всех положений дана по Кэботу.

5. Антитело по пп. 2, 3 или 4, отличающееся тем, что содержит в VL-последовательности:
глицин (G) или аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V), где нумерация всех положений дана по Кэботу.

6. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что содержит в VL-последовательности:
аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V), где нумерация всех положений дана по Кэботу.

7. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что содержит в VL-последовательности:
глицин (G) в положении 24 вместо серина (S) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V), где нумерация всех положений дана по Кэботу.

8. Антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, отличающееся тем, что содержит домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3, и домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.

9. Антитело по п. 8, отличающееся тем, что содержит
домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3, и
домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 14.

10. Антитело по п. 8, отличающееся тем, что содержит домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3, и
домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 15.

11. Антитело по п. 8, отличающееся тем, что содержит
домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3, и
домен вариабельной области легкой цепи (VL), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23.

12. Антитело по пп. 8-11, отличающееся тем, что представляет собой человеческое антитело подкласса IgG1.

13. Антитело по пп. 8-11, отличающееся тем, что антитело гликозилировано с помощью сахарной цепи на Asn297, при этом на долю фукозы в сахарной цепи приходится 65% или менее.

14. Антитело по пп. 8-11, предназначенное для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией CDCP1.

15. Фармацевтическая композиция для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией CDCP1, содержащая гуманизированное антитело по пп. 1-13 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Применение антитела по пп. 1-13 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией CDCP1.

17. Нуклеиновая кислота, кодирующая гуманизированное антитело по пп. 1-13.

18. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 17, который обладает способностью экспрессировать нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.

19. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, предназначенная для получения антитела по пп. 1-13 и содержащая вектор по п. 18.

20. Способ получения рекомбинантного гуманизированного антитела по пп. 1-13, отличающийся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту по п. 17 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют антитело из клетки или супернатанта клеточной культуры.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) человека, в том числе в форме меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конструкции с константным доменом иммуноглобулина, конъюгата с терапевтическим или цитотоксическим средством и в кристаллизованной форме.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены: клещевой аллерген домашней пыли, представляющий собой полипептид, содержащий определенную аминокислотную последовательность, приведенную в описании в перечне списка последовательностей; кодирующая полипептид молекула ДНК; экспрессирующий вектор на её основе и трансформированная им рекомбинантная клетка для экспрессии полипептида.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделенному пептиду, который имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), а также к его применению. Предложенный пептид может использоваться в противораковой иммунотерапии, более конкретно, в противораковых вакцинах.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ повышения экспрессии полинуклеотида фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в клетках или тканях пациента in vivo, а также соответствующий олигонуклеотид и композиция.

Изобретение относится к области биотехнологии и раскрывает рекомбинантный экспрессионный вектор, включающий: либо последовательность, кодирующую фосфорилазу пуриновых нуклеозидов (ПНФазу из Sulfolobus solfataricus), либо последовательность, кодирующую уридинфосфорилазу (УФазу из Aeropyrum pernix), либо обе указанные последовательности.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело против фракталкина (ФКН, CX3CL1) и его фракталкин-связывающий фрагмент, охарактеризованные последовательностями вариабельных доменов.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенное антитело-антагонист против FGFR3 и его функциональный фрагмент, а также полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ получения антитела против FGFR3 или его функционального фрагмента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгатам Apo A с терапевтическими полипептидами, и может быть использовано в медицине. Получают конъюгат, содержащий молекулу Apo A-I или ее функционально-эквивалентный вариант, такой как Apo А-IV или Аро A-V, ковалентно связанную с представляющим терапевтический интерес полипептидом, выбранным из интерферона, ингибитора TGF-бета Р144 или Р17, IL-15, кардиотрофина-1, порфобилиногендеаминазы, инсулина и фактора VII.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложено гуманизированное антитело и его фрагмент, способные специфически связывать бета-амилоид, охарактеризованные фрагментами последовательностей на основе антитела мыши 8F5, и Fc-областью человеческого IgG1, содержащей аминокислотную замену D265A; а также кодирующая нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, продуцирующие антитело или его фрагмент клетки, способ продуцирования антитела или его фрагмента; композиция, применение антитела и его фрагмента для изготовления лекарственного средства, способ предупреждения, лечения или облегчения эффектов амилоидоза; способ диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний или состояний, способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек и тест-набор для выявления и диагностики амилоид-ассоциированных бляшек.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или фрагменту этого антитела, которое специфически связывается с TNFα человека, причем антитело или фрагмент антитела содержит последовательность каркасной области тяжелой цепи человека и последовательности CDR, происходящие из антитела кролика, а также к композиции для лечения заболеваний, опосредованных TNFα, содержащей вышеуказанное антитело или фрагмент.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Описана генетически модифицированная мышь, где мышь не способна к перегруппировке и экспрессии эндогенной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина мыши.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к лекарственному средству для лечения или профилактики рака, содержащему антитело в качестве активного ингредиента, которое обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pART27INT6, которая обеспечивает биосинтез внутриклеточного иммунного гамма-интерферона быка в трансгенных растениях.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант субтилизина Bacillus, где указанный вариант субтилизина является зрелой формой, обладающей активностью субтилизина и содержащий замену в положениях 118 и 213, где нумерация положений соответствует аминокислотной последовательности субтилизина BPN′ В.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению ингибиторов адгезии и/или агрегации тромбоцитов, и может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем с использованием матрицы кДНК слюнной железы Anopheles stephensi получают полипептид, который используют в составе фармацевтической композиции и в наборах для скрининга ингибиторов адгезии или агрегации тромбоцитов.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к белку, обладающему активностью в отношении стимуляции элонгации цепей жирных кислот, и полинуклеотиду, кодирующему этот белок.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Предложен экспрессионный плазмидный вектор для моноцистронной гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков в клетках яичника китайского хомячка (СНО), обладающий свойством высокочастотной интеграции экспрессионной кассеты в указанных клетках, в следующей последовательности содержащий область начала репликации плазмиды pUC с функциональным геном устойчивости к ампициллину; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; участок для клонирования открытой рамки считывания рекомбинантного белка (полилинкер); функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3′ нетранслируемой областью этого гена; промотор, функционирующий в клетках млекопитающих; ген устойчивости к антибиотику; и функциональный терминатор гена устойчивости к антибиотику.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании.

Представленные изобретения касаются модифицированного белка, нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок, вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, и носителя для связывания биотина, на котором иммобилизован такой белок.
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии. Предложен способ получения по меньшей мере одной трансфицированной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, включающий введение в клетку полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и полинуклеотида, кодирующего мутантный фермент дигидрофолатредуктазу по крайней мере одним вектором экспрессии, получение множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере чужеродный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и чужеродный полинуклеотид, кодирующий фермент дигидрофолатредуктазу (ДГФР), культивирование указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей метотрексат в концентрации 2,3-500 нМ и фолиевую кислоту в концентрации 12,5-50 нМ, и отбор по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.

Изобретение относится к области иммунологии. Представлены вариантные выделенные антитела 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9 и 2.14H9-opti и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывается с В7-Н1, где каждое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит набор из 6 CDR, последовательности которых представлены в описании.
Наверх