Препарат для биодеградации нефтепродуктов "биоионит" и способ его получения

Предложены препарат для биодеградации нефтепродуктов и способ его получения. Препарат включает ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida BKM В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269, иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в количестве 10⁸-10¹⁰ клеток/г. Способ получения препарата предусматривает раздельное культивирование вышеуказанных штаммов до содержания 10¹¹-10¹² мкл/мл. Готовят микробную ассоциацию смешиванием в одной емкости культуральных жидкостей штаммов при соотношении Bacillus megaterium ВКМ В-396 - 15%, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328 - 15%, Pseudomonas putida BKM В-1301 - 20%, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624 - 20%, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269 - 30% до содержания бактерий 10¹² мкл/мл. Осуществляют напыление ассоциации в виде аэрозоля на глауконитсодержащий сорбент. Содержание глауконита в сорбенте составляет не менее 60%. Дальнейшее обезвоживание смеси проводят путем подачи подогретого до 40°C воздуха со скоростью 3-5 м/с до достижения влажности в конечном биопрепарате 5% и содержания клеток 10⁹ мкл/мл препарата. Изобретение обеспечивает высокую степень очистки от нефтепродуктов и уменьшение времени культивирования при получении препарата. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды, в частности к биотехнологии и экологии, а именно к композициям для биодеградации загрязнений окружающей среды (почвы, грунтов, морских, пресных и минерализованных вод), а также технологических конструкций углеводородами нефти и нефтепродуктов с одновременным восстановлением физико-химических свойств и естественного биоценоза почв и акваторий.

До настоящего времени нефть остается одним из самых востребованных источников энергии как в России, так и во всем мире, однако в то же время она является и основным загрязнителем окружающей среды. Аварийные разливы нефти происходят при разведке, добыче, транспортировке и ее переработке достаточно часто, поэтому серьезный ущерб, наносимый при этом окружающей среде, требует принятия экстренных мер по устранению подобных загрязнений. При этом наряду с ликвидацией последствий аварийных разливов достаточно остро стоит проблема очистки емкостей для хранения и перевозки нефтепродуктов от нефтяных остатков и ликвидации нефтешламов в амбарах при бурении и добыче нефти и в шламонакопителях на нефтеперерабатывающих заводах.

Следует отметить, что традиционные физико-химические методы очистки природной среды являются, как правило, недостаточно эффективными, в частности их применение не позволяет полностью очистить загрязненные участки от следов нефтепродуктов и восстановить их биоценоз, поэтому они все чаще дополняются или заменяются (в зависимости от степени загрязнения) биологическими методами.

К биодеградации нефтепродуктов способны многие микроорганизмы (бактерии, дрожжи, микроскопические грибы). Так, известно использование для биодеградации нефтепродуктов и токсических органических соединений таких микроорганизмов, как Aspergillus niger, Candida Tropical, Pseudomonas pulida и т.д. (Карасевич Ю.А. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. с. 46; J. Bacterid., 1976, v. 125, 3, p. 818; Agr. Biol. Chem., 1968, v. 32, 8, p. 1033-1039).

Следует отметить, что сложный химический состав нефти и нефтепродуктов, имеющих многочисленные вариации структуры углеводородов, обуславливают неодинаковую степень их доступности воздействию микроорганизмов. При этом основными агентами биодеградации нефти и нефтепродуктов являются бактерии. Объясняется это тем, что использование углеводородов (особенно с длинной углеродной цепью) в качестве источника углерода для роста и развития микроорганизмов среди бактерий распространено достаточно широко. Установлено, в частности, что алканы, нафтены и ароматические компоненты достаточно активно метаболизируются микроорганизмами, причем более легкие фракции указанных соединений могут полностью расщепляться. Более тяжелые, более конденсированные циклические углеводороды достаточно устойчивы к бактериальному воздействию. Так, адаптированные углеводородокисляющие бактерии в жидкой среде за 30 дней расщепляют до 83% суммарных углеводородов нефти. Фракционный анализ показал, что бактерии деградировали 69,7% нормальных углеводородов, 23,6% ароматических соединений с моно- и дициклической структурой, 53,2% углеводородов с трициклической и полициклической структурой (Atlas R.M. Bacteria and bioremediation of marine oil spills//Oceanus.- 1993 - 36, - 2. - C. 71).

Известны разнообразные коммерческие биопрепараты, разработанные для очистки почв от нефтяных загрязнений, в частности такие, как Авалон, Бациспецин, Валентис, Деворойл, Достроил, Нафтокс, Никаойл, Петролан, Путидойл, Родер, Универсал и другие (WO 01/98435; RU 2077397, RU 20532054, RU 2023686, WO 93/00045, RU 2053205, SU 1428809, RU 2174496). Самым известным из них и давно применяющимся на практике является биопрепарат Путидойл (RU 2023686), представляющий собой смесь культуральной жидкости (КЖ), содержащую штаммы Pseudomonas putida 36 в высушенном состоянии. Препарат получают глубинным культивированием бактерии в питательной среде при 30°C, в аэробных условиях, с последующей распылительной сушкой либо лиофилизацией полученной культуральной жидкости (SU 1428809). Однако указанный препарат обладает не очень высокой эффективностью, в частности, в отношении мазутов и асфальтеновых соединений нефти, а при наличии в составе среды тяжелых металлов (Cu⁺⁺, Pb⁺⁺, Cd⁺⁺) в концентрации 50 до 100 мг/литр данный препарат не функционирует.

Препарат "Бациспецин", полученный на основе природного штамма Bacillus sp. 729 (RU 2077397), также показал низкую эффективность по рекультивации земли, загрязненной нефтепродуктами, основную часть которых составляют смолистые вещества и полициклические соединения.

Больший потенциал и более широкий спектр действия на углеводороды имеют препараты, содержащие два и более штамма микроорганизмов. Так, в состав препарата Деворойл входят штаммы Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus maris, Rhodococcus sp., Yarrowia lipolytica (ранее Candida sp.) (RU 2023686, WO 93/00045). Деворойл получают глубинным культивированием входящих в его состав микроорганизмов с последующим высушиванием полученной биомассы.

Известен препарат, содержащий смесь бактерий Pseudomonas putida, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas acruginasa и Arihrodacier cristallopoietes (Hazardous Waste & Hazardous Mater, 1989, v. 6, 2, p. 145-154), способный утилизировать дизельное топливо.

Недостатком препаратов является низкая степень деградации ароматических углеводородов, нестабильность препарата при применении в практике, например в полевых условиях, и отсутствие резистентности к тяжелым металлам.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является препарат Авалон (Foght J.M., Westlake W.S. Bioremidiation of oil spills //Spill Technol. Nenslet. - 1992. - 17, N 3. - C. 1-10), который содержит клетки Ps. fluorescens и Serratia marcescens, либо Serratia marcescens и Acidovorax delafieldii, выращенных на вспененном стеклообразном метафосфатном носителе при 20°C в течение 72-96 ч.

Недостатком препаратов является низкая эффективность при деградации тяжелых фракций нефти, особенно загрязненных тяжелыми металлами, а также неэффективность при использовании при загрязнении нефтепродуктами водоемов.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание более универсального и более эффективного биопрепарата - нефтедеструктора.

Технической задачей являлось создание композиции микроорганизмов, способных не только перерабатывать нефтепродукты, но и одновременно облагораживать обработанную среду.

Технический результат достигался созданием ассоциации культур бактерий Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269 с титром 10⁹ мкл/г иммобилизованных на природном сорбенте-ионообменнике, универсальном калийном удобрении с титром 10⁹ мкл/г.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы, воды и технологических конструкций хранения и переработки нефтепродуктов с одновременным восстановлением физико-химических свойств и естественного биоценоза почв и акваторий. Биопрепарат-нефтедеструктор состоит из ассоциации культур нефтеокисляющих и ростостимулирующих бактерий Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269, иммобилизованных на природном сорбенте-ионообменнике, универсальном калийном удобрении с титром живых клеток 10⁹ мкл/г.

В настоящее время известно большое число биопрепаратов-нефтедеструкторов, в месте с тем ни один из этих препаратов не обладает одновременно способностью сорбировать (купировать) и утилизировать загрязнение широкого диапазона, использоваться как для очистки почв и воды, так и различных конструкций хранения и переработки углеводородов, и, что самое важное, способностью эффективно стимулировать рост зеленной массы на обрабатываемом участке и тем самым усиливать воздействие аборигенной микрофлоры в широком диапазоне температур от 4°C до 40°C и с загрязненностью до 40%.

Известен штамм Bacillus megaterium ВКМ В-396 (RU №2147181, A01N 63/00, C05F 11/08, 10.04.2000), входящий в состав биопрепарата «Альбит», повышающего урожай растений и защищающего их от болезней, однако он представлен в виде гидролизата бактериальных клеток.

Bacillus subtilis ВКПМ В-5328 в доступных для анализа патентах не представлен и ранее не применялся.

Штаммы бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-1301 и Pseudomonas putida ВКПМ В-5624 в доступных для анализа патентах не представлены и ранее не применялись, вместе с тем в (RU 2122980, кл. c02f 3/34, 12.04.94 г.) штаммы Pseudomonas putida характеризуются как продуценты поверхностно-активных веществ для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти.

Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269 в доступных для анализа патентах не представлен и ранее не применялся, однако бактерии Rhodococcus erythropolis способны активно деструктировать углеводороды нефтепродуктов, что может найти широкое применение в технологиях биоремедиации окружающей среды (Костина Е.Г., Атыкян Н.А., Ревин В.В. Изучение возможности использования Rhodococcus erythropolis для деградации дизельного топлива // Современные наукоемкие технологии. - 2008. - №2 - С. 91-91).

Например, известен биопрепарат-нефтедеструктор, используемый для очистки грунтов и почвы от нефти и нефтепродуктов, содержащий биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, биомассу аэробных азотфиксирующих микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассу аэробных спорообразующих микроорганизмов Bacillus species 739 в массовом соотношении, равном 1:1:0,5÷1 (см. патент РФ на изобретение №2323970, МПК C12N 1/26, В09С 01/10, опубл. 10.05.2008 г.). Недостатком известного биопрепарата-нефтедеструктора является неполное разложение нефти из-за его избирательного действия на определенные фракции нефтепродуктов. Кроме того, обеспечивается эффективность только при поверхностном загрязнении почвы, не более 20%. При этом происходит разрушение только верхних слоев загрязнения (0-20 см), что не обеспечивает рекультивацию почв.

Тем самым защищаемая ассоциация бактерий нефтедеструкторов и стимуляторов роста уникальна, имеет новизну.

Известен способ (RU 2410170 С2, В09С 1/10, C12N /26 10.07.2010), включающий внесение в грунт сорбента, активных по отношению к имеющемуся в грунте органическому загрязнителю микроорганизмов и азотного минерального удобрения с последующим увлажнением. Причем в качестве сорбента используют термически обработанную при температуре 200-300°C глауконитовую породу с содержанием глауконита 40-90%, а в качестве микроорганизмов используют бактериальный препарат в виде лиофильно высушенного сухого порошка с активностью, равной численности углеводородокисляющих клеток 1-100 млрд в 1 г препарата, при этом сорбент и бактериальный препарат перемешивают при соотношении 500-1000 г бактериального препарата на 1 т сорбента.

Недостатками данного способа являются низкая выживаемость микроорганизмов на поверхности азотных удобрений и, как следствие, завышенная начальная концентрация клеток, а также непродолжительный срок хранения биопрепарата.

Известен способ получения сухой формы биопрепарата на основе микроорганизма-нефтедеструктора рода Pseudomonas или Rhodococcus для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. При этом бактерии рода Pseudomonas или Rhodococcus культивируют в жидкой питательной среде. Затем суспензию бактерий смешивают с защитной средой. При этом защитную среду готовят на основе 0,05 М натрий-калиевого фосфатного буфера pH 6,8 при следующем соотношении компонентов: 4% полиглюкина, 10% сахарозы, 4% тиомочевины, 2% аскорбиновой кислоты с последующим титрованием 45% раствором гидроксида натрия до pH 6,8-7,2. Полученную смесь добавляют к сорбенту - вспученному перлитовому песку. Затем проводят контактную сушку препарата при t=37°C до постоянной массы. Способ позволяет повысить выживаемость бактериальных клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus до 44% и 81% соответственно (RU №2434059, В09С, C02F C12N, 27.05.2010). Недостатками данного способа являются низкая сорбирующая способность перлитового песка, отсутствие ионообменных свойств, низкая рабочая концентрация клеток и нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов, недостаточная для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

Недостатками известных биологических способов очистки загрязненных грунтов являются: высокая стоимость; использование биологических способов очистки ограничено теплым временем года (весенне-летним периодом); требуется значительное время на переработку опасных отходов (2-4 месяца); необходимость создания специальных полигонов (система биоячеек), требующих больших площадей.

Наиболее близким к заявляемому препарату является композиция (RU2181701, 2000), которая содержит пористый носитель - вспененные стеклообразные метафосфаты и штаммы микроорганизмов-деструкторов Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II10-1, Acidovorax delafieldii 3-1 в концентрации 10¹² клеток/г, иммобилизованные в поры носител. Для получения посевного материала штаммы выращивали раздельно, в ферментере вели совместное культивирование микроорганизмов при Т=20°C, pH 6,5-7,0 в течение 24-36 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,02% сырую нефть. После этого проводят иммобилизацию микроорганизмов на носителе путем смешивания его с культуральной жидкостью, содержащей микроорганизмы с титром 2-5,10⁹ кл/мл. Недостатком препарата являлась его относительно невысокая активность.

Технической задачей, решаемой авторами изобретения, являлось расширение спектра нефтедеградирующих препаратов путем создания более эффективного комплексного препарата, способного наряду с переработкой нефтепродуктов улучшать плодородие обрабатываемой почвы, а также эффективного для обработки нефтяных загрязнений водной среды.

Техническая задача решалась путем создания ассоциации бактерий Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269, иммобилизованной на глауконитсодержащем носителе при концентрации микроорганизмов 10⁸-10¹⁰ клеток/г, и технологии получения нового биопрепарата.

Доля клеток отдельных бактерий в препарате составляет: Bacillus subtilis ВКПМ В-5328 - 15-25%, Pseudomonas putida ВКМ В-1301 - 15-25%, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624 - 15-25%, Rhodococcus eryth ropolis ВКПМ АС-1269 - 15-25%, Bacillus megaterium ВКМ В-396 - 15-25%.

Увеличение концентрации клеток (больше 10¹⁰ мкл/г) не приведет к значительному увеличению скорости деструкции загрязнителя, однако неоправданно увеличит стоимость работ по очистке, так как увеличение скорости биодеструкции будет незначительным по сравнению с увеличением стоимости препарата. При концентрации клеток микроорганизмов меньше 10⁸ КОЕ/г в биопрепарате технический результат не достигается вследствие снижения требуемой скорости биодеструкции загрязнителя.

Все штаммы биопрепарата выделены из почвы и не патогенны для теплокровных животных и гидробионтов, депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов (ВКМ) и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ).

Наиболее эффективным и экономически выгодным является препарат с одинаковой долей каждого микроорганизма и клеточным титром 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г препарата, получивший условное наименование «Биоионит».

Используемый в составе препарата глауконит является алюмосиликатом, в котором катионы находятся в легкоизвлекаемой форме. Катионы, входящие в состав глауконита, легко замещаются находящимися в избытке в окружаемой среде элементами. Слоистая структура минерала, его ионообменные свойства предопределяют его высокие сорбционные свойства по отношению к нефтепродуктам, радионуклидам и токсичным элементам. Способность глауконита депонировать воду и низкая десорбция (медленное высвобождение) позволяют эффективно иммобилизовать на его поверхности микроорганизмы и их метаболиты. При этом скорость химической реакции связывания такова, что глауконит способен в течение незначительного времени перевести загрязнители в связанное безопасное состояние, а микробное сообщество удобно может их утилизировать. Еще одно преимущество глауконита, то что он увеличивает диффузию кислорода и влаги в почве, что обеспечивает оптимальный водный, газовоздушный и тепловой режим для роста численности микроорганизмов, иммобилизованных на нем. При этом усиливается активность метаболитных ферментов и значительно увеличивается энергия всех биохимических процессов. Вместе с тем глауконит содержит значительное количество биогенных элементов - подвижного калия, фосфора и микроэлементов, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов и роста растений. Так как он в итоге представляет собой минеральное удобрение, то после применения биопрепарата отпадает необходимость его утилизации.

В качестве глауконитсодержащего носителя может использоваться как чистый глауконит, так и глауконитовая порода, содержащая от 30 до 80% глауконита.

Препарат получают следующим образом. Микроорганизмы биопрепарата Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269 выращиваются раздельно в биореакторе до содержания 10¹¹-10¹² мкл/мл, известными способами, затем готовят микробную ассоциацию смешиванием в одной емкости расчетных долей культуральных жидкостей до содержания 10¹² мкл/мл с последующим капиллярно-химическим обезвоживанием смеси путем ее напыления в виде аэрозоля в специальном смесителе на сорбент. При иммобилизации смесь постоянно фонтанирует в смесителе за счет подачи подогретого до 38°C воздуха, и при достижение влажности в конечном биопрепарате 5% процесс прекращается. Дополнительная термическая обработка глауконита не требуется, так как удаляемая внешняя влага только увеличивает гигроскопичность и осложняет условия проведения процесса.

Наиболее экономически оправдано проводить процесс при содержании глауконита в носителе не менее 60%, хотя иммобилизация возможна при его 30% содержании в породе, хотя при этом срок обработки существенно возрастает.

За счет реализации существенных признаков изобретения достигаются важные новые свойства объекта, позволяющие получить эффективный биопрепарат - нефтедеструктор с высокой нефтедеструктирующей активностью, для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы, воды и технологических конструкций хранения и переработки нефтепродуктов с одновременным восстановлением физико-химических свойств и естественного биоценоза почв и акваторий.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Препарат получают следующим образом. Микроорганизмы биопрепарата выращивают раздельно при условиях: Bacillus megaterium ВКМ В-396 (штамм-1) (культивирование на сусло-агаре при pH 7,0, 30°C, в течение 48 часов), Bacillus subtilis ВКПМ В-5328 (штамм-2) (культивирование на L-среде (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 15,0, вода до 1,0 л при pH 7,0, 36°C в течение 42 часов), Pseudomonas putida ВКМ В-1301 (штамм-3) (культивирование на мясопептонном агаре (г/л): пептон - 10,0, хлористый натрий - 5,0, мясной экстракт - 3,0, агар-агар - 20,0, вода до 1 л, при pH 7,0, 28°C в течение 48 часов), Pseudomonas putida ВКПМ В-5624 (штамм-4) (культивирование на среде (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 15,0, хлористый натрий - 5,0, агар 15,0, вода до 1 л при pH 7,0, 22-28°C в течение 48 часов), Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269 (штамм-5) (культивирование на МПА с глюкозой (г/л): мясная вода - 1,0, хлористый натрий - 5,0, пептон -10,0, глюкоза 1%, агар - 20,0 при pH 6,8-7,0, 30°C в течение 46 часов) до содержания 10¹¹-10¹² мкл/мл каждого штамма, затем в реакторе при 36°С смешивается определенное соотношение культуральных жидкостей (15, 15, 20, 20, 30 массовых частей), полученную микробную ассоциацию захолаживают в реакторе при температуре 14-16°C. Глауконит препарата измельчается на шаровой мельнице до 50% содержания частиц размером 10-50 мкм, просеивается через сита №50 и досушивается до остаточной влажности 2% при температуре 160°C в сушильных шкафах. Приготовление биопрепарата осуществляется методом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите, смешивание ассоциации с глауконитом осуществляется в специализированном смесителе, обеспечивающем смешивание в одном объеме расчетных долей культуральных жидкостей с глауконитом до содержания 10⁹ мкл/мл. Процесс в смесителе осуществляется напылением расчетного количества (10 л) микробного аэрозоля ассоциации микроорганизмов на фонтанирующий слой глауконита (50 кг) при температуре теплоносителя - воздуха (стерильного) 40°C и скорости 3-5 м/с. Иммобилизация завершается при достижении влажности в конечном биопрепарате 5% и содержания живых бактериальных клеток 10⁹ мкл/г. Биопрепарат расфасовывается в полимерные ведра по 5 кг.

Пример 2. По технологии примера 1 было получено 9 вариантов препарата с различным соотношением клеток Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269, с концентрацией клеток от 10⁸ до 10¹⁰ мкл/г, так как более высокое содержание неоправданно повышает стоимость препарата и незначительно влияет на его качество, а более низкий показатель не обеспечивает требуемой степени очистки.

Состав препаратов приведен в таблице 1.

Испытания проводились по следующей технологии. Колбы Эрленмейера (объемом 750 мл) заполняли 100 мл морской воды с концентрацией соли 21% и содержащей 0,53% нефти, затем к содержимому колбы добавили 20 мг выбранного сухого биопрепарата. Колбы инкубировали на качалке (100 об/мин) при 5°C, 18 и 30°C при pH 7,0. Через 48 ч наблюдался осадок загрязнителя на дне колб. Степень очистки приведена в таблице 1.

Лучшие результаты были получены для препаратов 4 и 5. Так как различие между ними несущественно, дальнейшие испытания проводили с препаратом 5.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности биопрепарата для очистки морской воды, сточных вод и других водных объектов от сырой нефти, в том числе и для очистки донных отложений.

Пример 3. В 10 колб Эрленмейера вносили по 100 мл дистиллированной воды с начальным значением pH 4-12. В каждую колбу добавляли 3% нефти и вносили по 1 г биопрепарата 6. Колбы инкубировали на качалке (120 об/мин) при 18-20°C. Через 4 сут в каждой колбе определяли содержание нефти. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 1, биопрепарат способен утилизировать нефть в широком интервале значений pH, что позволяет использовать его для очистки почв и воды различной кислотности без их предварительной нейтрализации.

Пример 4. Участок тундровой почвы был загрязнен сырой нефтью с начальным содержанием нефти 60 г на 1 кг почвы. Для очистки почвы на 1 м обрабатываемой площади вносится 1 л озерной воды, 1 г биопрепарата 6 и 6 г нитроаммофоски. Средняя температура в период обработки составляла 13°C. Через 1,5 месяца содержание нефти в почве составляло 5,8-6 г на 1 кг почвы, т.е. около 90% нефти было разрушено.

Пример 5. Обрабатывали амбар отстойника на нефтяной скважине объем 100 т, площадь 100 м² (Север России, тундра). Исходное содержание нефти в воде амбара составляло 14,5 мг/л. На поверхностью амбара нанесли биопрепарат 6 (0,5 кг/т) и нитроаммофоску в концентрации 1,4 г/л с таким расчетом, чтобы на 1 м² обрабатываемой поверхности расходовался 1 кг. Через 20 дней после однократной обработки содержание нефтепродуктов в воде снизилось до 0,07 мг/л.

Пример 6. Испытание биопрепарата проводили с использованием в качестве источника загрязнения моторного масла, содержащего флотский мазут в концентрации 0,5% и депарафинизат дизельного топлива в концентрации 10 об.%. К содержимому добавляли сухой порошок биопрепарата 6 (20,0 мг). Температура выращивания составляла 30°C, pH среды 7,0. В результате получили степень утилизации нефтепродуктов 98%. Это свойство биопрепарата позволяет рекомендовать его для очистки нефтешлама, почв, емкостей и др. объектов от нефтезагрязнений.

Пример 7. Дерново-подзолистую почву с содержанием мазута 10% помещали в кювету. К содержимому добавляли соли азота и фосфора в соотношении N:P=1:2,3 и сухой порошок биопрепарата. Температура культивирования 25°C, pH среды 7,0. Почву периодически рыхлили и поддерживали влажность на уровне 60-80%. В течение 30 дней степень очистки составила 99%, титр клеток биопрепарата составил 10⁸ мкл/г живых клеток. Это свойство биопрепарата позволяет рекомендовать его для очистки почв от нефтепродуктов.

По сравнению с аналогами заявляемый биопрепарат характеризуется высокой степенью очистки на уровне 99% и уменьшением времени культивирования, а также более высокой скоростью утилизации углеводородов и широкой областью применения для очистки от нефтепродуктов водной поверхности (морей, океанов), сточных вод нефтеперерабатывающей, нефтедобывающей, машиностроительной промышленности, пищевой промышленности (для очистки от масел), почвы и т.д.

Биопрепарат апробирован в природных условиях. Нормы расхода препарата приведены в таблице 3.

Приведенные данные показали, что при использовании изобретения удалось создать эффективный, простой и экономичный биопрепарат - нефтедеструктор с высокой нефтедеструктирующей активностью, свойствами минерального удобрения и ростостимулирующим эффектом, с простым и рентабельным режимом получения, перспективный для очистки нефтезагрязненных почв, шламов, донных илов, осадка сточных вод, водоемов и резервуаров, в районах с коротким тепловым периодом.

1. Способ получения препарата для биодеградации нефтепродуктов, включающий в себя раздельное культивирование штаммов Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida BKM В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269 до содержания 10¹¹-10¹² мкл/мл, приготовление микробной ассоциации смешиванием в одной емкости культуральных жидкостей штаммов при следующем соотношении: Bacillus megaterium ВКМ В-396 - 15%, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328 - 15%, Pseudomonas putida BKM В-1301 - 20%, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624 - 20%, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269 - 30%, до содержания бактерий 10¹² мкл/мл с последующим напылением в виде аэрозоля на глауконитсодержащий сорбент, в котором содержание глауконита составляет не менее 60%, дальнейшее обезвоживание смеси проводят путем подачи подогретого до 40°C воздуха со скоростью 3-5 м/с до достижения влажности в конечном биопрепарате 5% и содержания клеток 10⁹ мкл/мл препарата.

2. Препарат для биодеградации нефтепродуктов, полученный способом по п. 1, включающий ассоциацию бактерий, иммобилизованную на носителе, отличающийся тем, что он содержит микроорганизмы: Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida BKM В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269, иммобилизованные на природном сорбенте-ионообменнике - глауконитсодержащем носителе в количестве 10⁸-10¹⁰ клеток/г.