Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок (варианты)



Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок (варианты)
Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок (варианты)
Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок (варианты)
Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок (варианты)
Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок (варианты)

 


Владельцы патента RU 2571854:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЗД" Минздрава России) (RU)

Группа изобретений относится вариантам добавок к питательной среде для формирования бактериальных биопленок. Предложена добавка, состоящая из биополимера фибрина в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды и ингибитора протеиназ. Также предложена добавка, которая состоит из фибриногена в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды, плазмокоагулазы в соотношении к фибриногену от 1:128 до 1:10000 (масса:масса) и ингибитора протеиназ. Как вариант, предложена добавка, состоящая из фибриногена в концентрации от 0,01 г/л до 10 г/л, комплекса «тромбин-ионы Са2+», состоящего из тромбина в соотношении к фибриногену 1:10-1:500 и ионов Са2+ в количестве от 0,08 г до 0,2 г на 1 кг питательной среды, и ингибитора протеиназ. Ингибитор протеиназ используют в составе добавок в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды. Группа изобретений позволяет получить биопленки на основе штаммов бактерий, которые не способны формировать биопленки на известных питательных средах без предлагаемой добавки. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к процессам культивирования микроорганизмов в искусственных условиях с использованием питательных сред для формирования бактериальных биопленок. Изобретение может быть использовано в диагностических целях в клинической и общей микробиологии, а также в биотехнологическом производстве для накопления микробной биомассы.

Искусственные питательные среды являются субстанциями, на которых производится рост и размножение микроорганизмов в микробиологии и биотехнологических процессах. В настоящее время существует большое количество разнообразных питательных сред, которые классифицируются по исходным компонентам: натуральные и искусственные; консистенции: жидкие, плотные и полужидкие; по составу: простые и сложные; по назначению: основные и специальные: элективные, дифференциально-диагностические и консервирующие [Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. - Санкт-Петербург: НИЦФ. 2002, 80 с.].

Специальные питательные среды предназначаются для получения культур определенных микроорганизмов с проявлением нужных фенотипических свойств, например, бактериальных биопленок. Биопленки являются формой микробных сообществ, фиксированных на поверхностях и состоящих из двух обязательных элементов: микробных клеток и ассоциированного с ними внеклеточного матрикса [Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg Е.Р. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. - 1999. - Vol. 284. - P. 1318-1322]. Важной задачей современной микробиологии является воспроизведение микробных биопленок в искусственных условиях (in vitro). Моделирование биопленок необходимо для диагностики и исследования биопленочных инфекций, для реализации биотехнологических процессов и технологий.

Для воспроизведения микробных (бактериальных и грибковых) биопленок in vitro применяются различные питательные среды:

1. Среды без каких-либо модификаций, которые рекомендуются для моделирования биопленок конкретным видом микроорганизмов. Они выбраны для конкретного вида микроорганизма путем экспериментального перебора, в результате которого рекомендована среда, на которой для многих штаммов конкретного вида наблюдается наиболее интенсивное биопленкообразование.

Известная питательная среда Луриа-Бертани (Lysogeny broth или LB-medium) применялась для моделирования биопленок синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) [Martinez-Granero F, Navazo A, Barahona E, Redondo-Nieto M, Gonzalez de Heredia E, Baena I, Martin-Martin I, Rivilla R, Martin M. Identification of flgZ as a flagellar gene encoding a PilZ domain protein that regulates swimming motility and biofilm formation in Pseudomonas. PLoS One. 2014; 9(2): e87608]. LB-среда содержала стандартизованные по концентрации азота продукты естественного происхождения (триптон, дрожжевой экстракт), а также натрий хлористый.

2. Среды, содержащие специальные добавки (глюкозу, галактозу и др.), которые усиливают биопленкообразование [Møretrø Τ, Hermansen L, Holck AL, Sidhu MS, Rudi K, Langsrud S. Biofilm formation and the presence of the intercellular adhesion locus ica among staphylococci from food and food processing environments. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(9): 5648-55]. Эти добавки усиливают синтез микроорганизмами обязательного атрибута биопленок - внеклеточного матрикса, скрепляющего микробные клетки в единую систему биопленки.

Известна питательная среда «Сердечно-мозговой бульон» (Heart Infusion Broth) с добавлением глюкозы до конечной концентрации 1% применялась для моделирования биопленок ацинетобактериями (Acinetobacter baumannii) и синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa) [Gurung J, Khyriem AB, Banik A, Lyngdoh WV, Choudhury B, Bhattacharyya P. Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit. Indian J Crit Care Med. 2013; 17(4): 214-8].

Известна питательная среда «Основная дрожжевая азотистая» (Yeast nitrogen base medium или YNB medium) с добавлением 500 мМ галактозы или 50 мМ глюкозы применялась для моделирования биопленок микроскопических дрожжеподобных грибов Candida albicans [Hawser SP, Douglas LJ. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 1994; 62(3): 915-21.].

Недостатком перечисленных питательных сред является то, что не все штаммы каждого вида микроорганизмов могут формировать биопленки даже на средах, которые рекомендуются для моделирования биопленок микробами конкретного вида. Этот недостаток не позволяет воспроизводить в условиях in vitro биопленки на основе любого штамма, клетки которого необходимо получить в составе биопленки, что бывает необходимо, потому что в составе биопленок клетки микробов приобретают качественно новые свойства, отличающие их от небиопленочных планктонных клеток.

Известна питательная среда для усиления роста бифидобактерий на основе гидролизата молока, содержащая добавку, отличающаяся тем, что в качестве добавки она содержит аскорбиновую кислоту при следующем содержании компонентов, г/л: аскорбиновая кислота -0,01-0,1, гидролизат молока - остальное (патент РФ №2104014).

Широко применяется питательная среда на основе триптоно-соевого бульона (Tryptone Soya Broth), которая была модифицирована с целью усиления биопленкообразования путем добавления в нее глюкозы до концентрации 2,0%,. Питательная среда была использована для моделирования in vitro биопленок на основе разных видов рода Staphylococcus - S. epidermidis, S. aureus, S. saprophyticus, S. capitis, S. cohnii, S. intermedius, S. lentus и S. sciuri. [Møretrø T, Hermansen L, Holck AL, Sidhu MS, Rudi K, Langsrud S. Biofilm formation and the presence of the intercellular adhesion locus ica among staphylococci from food and food processing environments. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(9): 5648-55].

Состав триптоно-соевого бульона: пептон из казеина - 1,7%, пептон из сои - 0,3%, глюкоза - 2,0%, натрия хлорид - 0,5%, гидрофосфат калия (K2HPO4·3H2O) - 0,25%.

Задачей предлагаемого изобретения является создание новой эффективной добавки к питательным средам для формирования бактериальных биопленок в условиях in vitro.

Технический результат изобретения заключается в достижении эффекта биопленкообразования на средах с предлагаемой добавкой для штаммов бактерий, которые не способны формировать биопленки на питательных средах без предлагаемой добавки.

Задача решается тремя вариантами составов композиций добавок для формирования бактериальных биопленок.

1. Нерастворимый в водной среде биополимер фибрин в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды и ингибитор протеиназ в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды.

2. Фибриноген, как предшественник нерастворимого в водной среде биополимера фибрина, в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды, плазмокоагулаза в соотношении к фибриногену от 1:128 до 1:10000 (масса:масса), обеспечивающая трансформацию фибриногена в нерастворимый в водной среде биополимер фибрин, и ингибитор протеиназ в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды.

3. Фибриноген, как предшественник нерастворимого в водной среде биополимера, в концентрации от 0,01 г/л до 10 г/л, (2) комплекс «тромбинионы Са2+, содержащий тромбин в соотношении к фибриногену 1:10-1:500 и ионы Са2+ в количестве от 0,08 г до 0,2 г на 1 кг питательной среды, который обеспечивает трансформацию фибриногена в нерастворимый в водной среде биополимер фибрин, и ингибитор протеиназ в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды.

В качестве ингибитора протеиназ использовали следующие вещества, как по отдельности, так и в виде различных комбинаций смеси компонентов:

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ),

- апротинин (80 мкМ),

- бестатин (4 мМ), транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан (0,56 мМ),

- транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан (1,4 мМ),

- леупептин (2 мМ),

- пепстатин (1,5 мМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан (1,4 мМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + леупептин (2 мМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + пепстатин (1,5 мМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + апротинин (80 мкМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + бестатин (4 мМ)

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ)+апротинин (80 мкМ)+бестатин (4 мМ),

- транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан (1,4 мМ)+леупептин (2 мМ)+пепстатин (1,5 мМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + апротинин (80 мкМ) + бестатин (4 мМ) + транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан (1,4 мМ) + леупептин (2 мМ) + пепстатин (1,5 мМ),

- 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорид (104 мМ) + апротинин (80 мкМ) + бестатин (4 мМ) + транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан (1,4 мМ) + леупептин (2 мМ) + пепстатин (33,1 мМ).

Выбор ингибитора протеаз либо комбинации ингибиторов протеаз обусловлен тем, что перечисленные варианты ингибиторов протеиназ являются типовыми ингибиторами, способными подавлять активность подавляющего большинства протеиназ эукариотов, включая серинпротеиназы, цистеинпротеиназы, аспартатпротеиназы, металлопротеиназы и аминопептидазы [Berg J.М., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemistry New York // NY: WH Freeman. - 2002]. По одному из перечисленных вариантов добавки (в количестве 1 мл) было внесено в 99 г триптоно-соевого бульона, содержащего 2% глюкозы.

Все три варианта добавки используются для внесения в питательную среду в соотношении: добавка (масса):питательная среда (масса)=1:99.

В итоге бульоны содержали концентрацию ингибитора протеаз в диапазоне от 0,002 до 0,5 г на 1 кг.

Модифицированные таким образом варианты триптозо-соевого бульона использовались для получения биопленок, сформированных основными представителями различных групп микроорганизмов, включая грампозитивные кокки, энтеробактерии, неферментирующие грамнегативные палочки, а именно: золотистыми стафилококками (Staphylococcus aureus), эпидермальным стрептококком (Staphylococcus epidermidis), пневмококками (Streptococcus pneumoniae), кишечной палочкой (Escherichia coli), клебсиеллами (Klebsiella pneumoniae), синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa), ацинетобактериями (Acinetobacter baumannii).

Спектр бактерий был выбран исходя из того, что они являются типовыми видами, которые отражают общие свойства физиологии бактерий из разных таксономических групп [Ленгелер Й., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты. - М.: Мир, 2005. - Т. 1. - 667 с.]. Поэтому их свойства и особенности метаболизма, включая биопленкообразование, можно экстраполировать на представителей других видов бактерий.

В лунки 96-луночного планшета вносили по 0,35 мл приготовленной среды и 0,01 мл взвеси одной из перечисленных выше бактерий в изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизованной до 0,5 ед. оптической мутности по МакФарланду. В качестве среды сравнения использовали триптоно-соевый бульон, содержащий 2% глюкозы, без внесения добавки. Пробы инкубировали 48 часов при 37°C. Рост биопленок, сформированных каждым штаммом, исследовали в трех повторениях (лунках). После инкубации лунки с бактериями при помощи пипетки дважды ополаскивали изотоническим раствором хлорида натрия (по 0,4 мл), в течение 4 минут фиксировали 4%-ным раствором формальдегида, окрашивали 1%-ным раствором красителя кристаллического фиолетового (по 0,4 мл в лунку) в течение 5 мин. При помощи пипетки удаляли краситель, ополаскивали 96-луночный планшет в дистиллированной воде до исчезновения синих струек красителя. Высушивали при комнатной температуре. Высушивали при комнатной температуре. Оценивали интенсивность биопленкообразования по количеству остаточного красителя в лунках с бактериями при помощи известного метода, который включал смывание (элюирование) красителя из лунок этанолом (дважды по 0,4 мл, элюаты объединяли) с последующей оценкой интенсивности окраски элюата при помощи оценки светопоглощения (при длине волны 610 нм) с помощью плашечного фотометра Infinite 200М Tecan при длине волны

610 нм [Чеботарь И.В., Погорелов А.Г., Яшин В.А., Гурьев Е.Л., Ломинадзе Г.Г. Современные технологии исследования бактериальных биопленок. Современные технологии в медицине. - 2013. - Т. 5, №1. - с. 14-20].

Результаты, представленные в Таблице 2, демонстрируют интенсивность биопленкообразования и значительное увеличение объема биопленок при культивировании на среде, содержащей заявляемые добавки. Каждая из заявленных добавок способствует формированию биопленок любых бактерий.

Эффективность от использования предлагаемой добавки подтверждена следующими примерами.

Пример 1. Добавка, состоящая из: 0,5 г фибрина и 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего ингибитор протеаз, представляющий собой композицию 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорида (104 мМ), апротинина (80 мкМ), бестатина (4 мМ), транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутана (1,4 мМ), леупептина (2 мМ), пепстатина (1,5 мМ), была внесена в 99 г бульона Луриа-Бертани (Lysogeny broth или LB-medium) бульона, содержащего 1% глюкозы.

Модифицированный таким образом бульон Луриа-Бертани использовался для получения биопленок, сформированных синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa, штамм АТСС 27853): в лунки 96-луночного планшета вносили по 0,35 мл приготовленной среды и 0,01 мл взвеси синегнойной палочки в изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизованной до 0,5 ед. оптической мутности по МакФарланду. В качестве среды сравнения использовали бульон Луриа-Бертани, содержащий 1% глюкозы, без внесения добавки. Пробы инкубировали 24 часа при 37°C. Рост биопленок исследовали в трех повторениях (лунках). После инкубации лунки с бактериями при помощи пипетки дважды ополаскивали изотоническим раствором хлорида натрия (по 0,4 мл), в течение 4 минут фиксировали 4%-ным раствором формальдегида, окрашивали 1%-ным раствором красителя кристаллического фиолетового (по 0,4 мл в лунку) в течение 5 мин. При помощи пипетки удаляли краситель, ополаскивали 96-луночный планшет в дистиллированной воде до исчезновения синих струек красителя. Высушивали при комнатной температуре. Оценивали интенсивность биопленкообразования по количеству остаточного красителя в лунках с бактериями при помощи известного метода, который включал смывание (элюирование) красителя из лунок этанолом (дважды по 0,4 мл, элюаты объединяли) с последующей оценкой интенсивности окраски элюата при помощи колориметрии (светопоглощение при длине волны 610 нм) на плашечном фотометре Infinite 200М Tecan [Чеботарь И.В., Погорелов А.Г., Яшин В.А., Гурьев Е.Л., Ломинадзе Г.Г. Современные технологии исследования бактериальных биопленок. Современные технологии в медицине. - 2013. - Т. 5, № 1. - с. 14-20]. Результаты выражали в процентах относительно показателей, полученных на среде сравнения (бульон Луриа-Бертани, содержащий 1% глюкозы, предлагаемой без добавки) и обрабатывали, используя стандартные статистические методы.

Увеличение объема биопленок синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) при культивировании на среде, содержащей предлагаемую добавку, представлено в таблице 1.

В пробах сравнения, где использовалась питательная сред без добавки, интенсивность окраски элюатов составляла 100,0±5,2%. При использовании добавки интенсивность окраски элюатов составляла 158,1±8,3%, что в 1,5 раза превышало результаты, полученные на известной среде без добавки. Это говорит о том, что на питательной среде, содержащей заявляемую добавку, биопленки исследуемого штамма синегнойной палочки характеризовалась статистически достоверным увеличением биомассы по сравнению с биопленками, образованными тем же штаммом на известной питательной среде без добавки (p<0,001).

Пример 2. Добавка, состоящая из: 0,4 г фибриногена, 0,004 г плазмокоагулазы и 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего ингибитор протеаз, представляющий собой композицию 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорида (104 мМ), апротинина (80 мкМ), бестатина (4 мМ), транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутана (1,4 мМ), леупептина (2 мМ), пепстатина (1,5 мМ), была внесена в 99 г сердечно-мозгового бульона, содержащего 1% глюкозы.

Модифицированный таким образом сердечно-мозговой бульон использовался для получения биопленок, сформированных ацинетобактериями (Acinetobacter baumannii, штамм АТСС 19606): в лунки 96-луночного планшета вносили по 0,35 мл приготовленной среды и 0,01 мл взвеси ацинетобактерий в изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизованной до 0,5 ед. оптической мутности по МакФарланду. В качестве среды сравнения использовали сердечно-мозговой бульон, содержащий 1% глюкозы, без внесения добавки. Пробы инкубировали при 37°C. Рост биопленок исследовали на сроках 24 часа и 48 часов. Все эксперименты проводили в трех повторениях. На этих сроках инкубации лунки с бактериями при помощи пипетки дважды ополаскивали изотоническим раствором хлорида натрия (по 0,4 мл), в течение 4 минут фиксировали 4%-ным раствором формальдегида, окрашивали 1%-ным раствором красителя кристаллического фиолетового (по 0,4 мл в лунку) в течение 5 мин. При помощи пипетки удаляли краситель, ополаскивали 96-луночный планшет в дистиллированной воде до исчезновения синих струек красителя. Высушивали при комнатной температуре. Оценивали интенсивность биопленкообразования по количеству остаточного красителя в лунках с ацинетобактериями при помощи известного метода, который включал смывание (элюирование) красителя из лунок этанолом (дважды по 0,4 мл, элюаты объединяли) с последующей оценкой интенсивности окраски элюата при помощи оценки светопоглощения (при длине волны 610 нм) на плашечном фотометре Infinite 200М Tecan [Чеботарь И.В., Погорелов А.Г., Яшин В.А., Гурьев Е.Л., Ломинадзе Г.Г. Современные технологии исследования бактериальных биопленок. Современные технологии в медицине. - 2013. - Т. 5, №1, - с. 14-20]. Результаты выражали в единицах оптической плотности элюатов, рассчитанных плашечным ридером Infinite 200М Tecan на основе встроенного программного обеспечения и прямо коррелирующих с объемом биопленок. Результаты обрабатывали, используя стандартные статистические методы. Результаты представлены на Фиг. 1 графиком зависимости «Скорость формирования биопленок ацинетобактериями (Acinetobacter baumannii, штамм АТСС 19606) на среде без добавок и среде, содержащей предлагаемую добавку». В пробах сравнения, где использовалась питательная сред без добавки, интенсивность окраски элюатов составляла 1,36±0,30 через 24 часа инкубации и 3,07±0,41 через 48 часов инкубации. При использовании добавки интенсивность окраски элюатов составляла 4,06±0,35 через 24 часа инкубации и 4,83±0,31 через 48 часов инкубации. Таким образом, на сроках культивирования 24 часа и 48 часов наблюдалась статистически значимые различия между показателями биопленкообразования на среде с предлагаемой добавкой и среде без добавки (в обоих случаях p<0,05). Эти данные говорят об ускорении процесса формирования бактериальных биопленок на питательных средах, содержащих предлагаемую добавку по сравнению с известными средами без добавки.

Для экспериментов использовалась добавка, которая включала в свой состав 0,3 г фибриногена, 0,003 г тромбина, 0,03 г кальция хлорида (CaCl2) и 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего ингибитор протеаз.

Пример 3. Добавка, состоящая из: 0,3 г фибриногена, 0,003 г тромбина, 0,03 г кальция хлорида (CaCl2) - в 1 литре среды содержится 0,107 г ионов Са2+ и 0,190 г ионов хлора, что вместе составляет 0,297 г - и 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего ингибитор протеаз, представляющий собой композицию 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил-фторид-гидрохлорида (104 мМ), апротинина (80 мкМ), бестатина (4 мМ), транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутана (1,4 мМ), леупептина (2 мМ), пепстатина (1,5 мМ), была внесена в 99 г триптоно-соевого бульона, содержащего 2% глюкозы.

Модифицированный таким образом триптозо-соевый бульон использовался для получения биопленок, сформированных золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus): в лунки 96-луночного планшета вносили по 0,35 мл приготовленной среды и 0,01 мл взвеси золотистого стафилококка в изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизованной до 0,5 ед. оптической мутности по МакФарланду. В качестве среды сравнения использовали триптоно-соевый бульон, содержащего 2% глюкозы, без внесения добавки. Пробы инкубировали 48 часов при 37°C. В эксперименте были использованы 10 штаммов золотистого стафилококка, в том числе 2 штамма известных музейных культур (АТСС 29213 и V2A) и 8 штаммов, изолированных из клинических источников (штаммы 5983, 41-1764, 42-1610, 43-833, 45-380, 47-165, 49-182, 49-466). Рост биопленок, сформированных каждым штаммом, исследовали в трех повторениях (лунках). После инкубации лунки со стафилококками при помощи пипетки дважды ополаскивали изотоническим раствором хлорида натрия (по 0,4 мл), в течение 4 минут фиксировали 4%-ным раствором формальдегида, окрашивали 1%-ным раствором красителя кристаллического фиолетового (по 0,4 мл в лунку) в течение 5 мин. При помощи пипетки удаляли краситель, ополаскивали 96-луночный планшет в дистиллированной воде до исчезновения синих струек красителя. Высушивали при комнатной температуре. Биопленкообразование оценивали визуально по интенсивности окраски бактериального слоя стафилококков в лунках планшета.

Результаты в виде фотографии окрашенных биопленок показаны на Фиг. 2. Лунки, находящиеся по горизонтали в рядах А, В, С и по вертикали под номерами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 содержат питательную среду - триптоно-соевый бульон, содержащий 2% глюкозы и предлагаемую добавку, включающую в свой состав 0,3 г фибриногена, 0,003 г тромбина, 0,03 г кальция хлорида (CaCl2) и ингибитор протеаз. Лунки, находящиеся по горизонтали в рядах Е, F, G и по вертикали под номерами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, содержат питательную среду - триптоно-соевый бульон, содержащий 2% глюкозы без предлагаемой добавки. В лунках под номером 1 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм АТСС 29213. В лунках под номером 2 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм V2A. В лунках под номером 3 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 5983. В лунках под номером 4 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 41-1764. В лунках под номером 5 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 42-1610. В лунках под номером 6 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 43-833. В лунках под номером 7 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 45-380. В лунках под номером 8 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 47-165. В лунках под номером 9 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 49-182. В лунках под номером 10 культивировался золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), штамм 49-466. При использовании добавки интенсивная окраска, которая свидетельствует о наличии биопленки, была выявлена для всех штаммов золотистого стафилококка: АТСС 29213, V2A, 5983, 41-1764, 42-1610, 43-833, 45-380, 47-165, 49-182, 49-466. Все перечисленные штаммы золотистого стафилококка формировали биопленки на питательной среде, содержащей заявляемую добавку. В пробах сравнения, где использовалась питательная среда без добавки, интенсивная окраска, которая свидетельствует о наличии биопленки, была выявлена для 6 штаммов золотистого стафилококка: АТСС 29213, V2A, 5983, 47-165, 49-182, 49-466. Лунки, в которых культивировались штаммы 41-1764, 42-1610, 43-833, 45-380 не были окрашены. Это говорит о том, что лишь 60% штаммов формировали биопленку на известной питательной среде без предлагаемой добавки.

В качестве добавки к питательной среде по п. 3. формулы изобретения использовали следующие концентрации кальция хлорида в 1 кг питательной среды:

- 0,22 г на 1 кг питательной среды (соответствует количеству ионов Са2+, равному 0,08 г на 1 кг питательной среды);

- 0,42 г на 1 кг питательной среды (соответствует количеству ионов Са2+, равному 0,15 г на 1 кг питательной среды);

- 0,55 г на 1 кг питательной среды (соответствует количеству ионов Са2+, равному 0,2 г на 1 кг питательной среды).

Интервал концентрации ионов Са2+ составлял от 0,08 до 0,2 г на 1 кг питательной среды. Результаты, представленные в Таблице 3, продемонстрировали значительное увеличение объема биопленок при культивировании на среде, содержащей предлагаемую добавку с разными концентрациями ионов кальция.

Таким образом, при использовании добавки достигнут качественно иной эффект, который заключался в том, что в присутствии предлагаемой добавки наблюдалось биопленкообразование штаммами стафилококка, которые не были способны формировать биопленки на питательных средах без предлагаемой добавки.

Предлагаемые добавки универсальны, их можно вводить в состав разных питательных сред, предназначенных для культивирования различных видов бактерий с целью моделирования биопленок. Использование предлагаемой добавки позволяет получить биопленки на основе штаммов бактерий, которые не способны формировать биопленки на известных питательных средах без предлагаемой добавки.

Предлагаемые добавки ускоряют процесс формирования бактериальных биопленок на питательных средах по сравнению с известными средами без добавки.

Приготовление добавки технически достижимо при массовом производстве.

Среды, содержащие ее в своем составе, могут быть стерилизованы общепринятыми методами, например фильтрацией, имеют достаточный срок хранения без потери полезных свойств и не требуют особых условий утилизации после использования.

1. Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок, состоящая из биополимера фибрина в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды и ингибитора протеиназ в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды.

2. Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок, состоящая из фибриногена в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды, плазмокоагулазы в соотношении к фибриногену от 1:128 до 1:10000 (масса:масса) и ингибитора протеиназ в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды.

3. Добавка к питательной среде для формирования бактериальных биопленок, состоящая из фибриногена в концентрации от 0,01 г/л до 10 г/л, комплекса «тромбин-ионы Са2+», состоящего из тромбина в соотношении к фибриногену 1:10-1:500 и ионов Са2+ в количестве от 0,08 г до 0,2 г на 1 кг питательной среды, и ингибитора протеиназ в количестве от 0,002 г до 0,5 г на 1 кг питательной среды.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к молекулярной биологии, фармацевтике и медицинской химии, в частности к разработке и созданию тест-систем. Тест-система М.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотидную молекулу с SEQ ID №4 или 6, кодирующую легкую цепь энтерокиназы. Изобретение относится также к дрожжевому экспрессионному конструкту, содержащему указанную последовательность, а также к дрожжевой клетке, трансформированной конструктом.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающийся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC c аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.

Настоящее изобретение относится к способу предоставления вариантов протеазы или амилазы со значением эффективности, по меньшей мере, в одном интересующем тесте, превышающим показатель эффективности для указанного фермента дикого типа.

Изобретение относится к производному комплекса металл-сален. Комплекс представлен как А-В-С, где А: комплекс металл-сален; В: зона связи, включающая по меньшей мере одну дисульфидную связь; и С: функциональная молекула, состоящая из по меньшей мере одного из ферментов, антител, антигенов, пептидов, аминокислот, олигонуклеотидов, белков, нуклеиновых кислот и молекул лекарственного средства.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и представляет собой способ пивоварения, включающий добавление к суслу термостабильной протеазы после фильтрации сусла, но перед варкой сусла, причем термостабильность протеазы означает, что активность этой протеазы составляет по меньшей мере 70% ее активности, измеренной согласно следующему методу: протеазу разводят до концентрации 1 мг/мл в аналитическом буфере, содержащем 100 ммоль сукциновой кислоты, 100 ммоль HEPES, 100 ммоль CHES, 100 ммоль CABS, 1 ммоль СаСl2, 150 ммоль КСl, 0,01% Тритон Х-100, и с рН, доведенным до 5,5 с помощью NaOH; после чего протеазу преинкубируют i) во льду и ii) 10 мин при 70°С; субстрат, к которому протеаза проявляет активность, суспендируют в 0,01% Тритоне Х-100: для начала реакции в пробирку добавляют 20 мкл протеазы и инкубируют в термомиксере Эппендорфа при 70°С, 1400 об/мин в течение 15 минут; реакцию останавливают помещением пробирок в лед; образцы центрифугируют холодными при 14000 g в течение 3 минут и измеряют оптическую плотность OD590 супернатанта; полученное значение OD590 образцов без протеазы вычитают из полученного значения OD590 образцов, обработанных протеазой; определяют термостабильность протеазы посредством расчета процентной активности протеазы в образцах, преинкубированных при 70°С, относительно активности протеазы в образцах, инкубированных во льду, как 100%-ной активности.

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки. Предложен способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений, в котором первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций гистоновые и негистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8, пропускают полученные белки с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности.

Группа изобретений относится к хлебопекарной промышленности. Способ улучшения легкости разжевывания хлебобулочных изделий включает добавление по меньшей мере одной средне-термостойкой или термостойкой сериновой протеазы или металлопротеазы в указанное хлебобулочное изделие, где измеряют параметры текстуры, представляющие собой силу (г) и полную работу (г·сек), необходимые для разрушения идентичного образца хлебобулочного изделия.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который обеспечивает повышение качества (гомогенности) и выхода целевого продукта в условиях, когда гибридный белок обнаруживает дополнительные (скрытые) сайты расщепления энтеропептидазой.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н.

Предложен способ определения антиоксидантной активности вещества, предусматривающий приготовление контрольных проб, содержащих буферный раствор и биолюминесцентный сенсор, определения исходной интенсивности биолюминесценции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к пероральной композиции для снижения холестерина в сыворотке у субъекта. Данная композиция содержит пробиотические бактерии Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 с высокой активностью гидролазы солей желчных кислот bsh, их изолят или супернатант и носитель.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотических препаратов. Защитная среда высушивания для получения симбиотического препарата содержит желатин, сахарозу, пищевой хитозан и калий фосфатный буфер в заданных соотношениях.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению бактериальных штаммов, обладающих фунгицидными и ростстимулирующими свойствами.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в фармакологии и медицине. Предложен штамм Lactobacillus rhamnosus, депонированный в ВКПМ под номером В-11816.

Представленная группа изобретений касается штаммов Bifidobacterium longum и их применений в качестве пробиотиков в виде различных составов и композиций. Изолированные штаммы Bifidobacterium longum BL1207 (PTA-9608), AH121A (NCIMB 41675), AH1714 (NCIMB 41676) экспрессируют экзополисахарид и индуцируют соотношение [IL10]:[IL12], равное, по меньшей мере, 10, по результатам анализа ко-инкубированием с мононуклеарными клетками периферической крови (РМВС), при концентрации бактерий 1×107 КОЕ/мл.

Изобретение относится к ветеринаринарной микробиологии. Питательная среда для выявления возбудителя некробактериоза содержит среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ный раствор глюкозы в заданных соотношениях компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Komagataeibacter xylinus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12068.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Предложен штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D для изготовления бактериального удобрения под сою.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения терминального алкена, в конкретном варианте - изобутелена, применение мевалонатдифосфат декарбоксилазы и микроорганизма, продуцирующего мевалонатдифосфат декарбоксилазу, для получения терминального алкена, а также композиция для получения терминального алкена. Способ включает превращение 3-гидроксиалканоата формулы с помощью мевалонатдифосфат декарбоксилазы в присутствии АТФ, рНТФ, дНТФ или смеси нескольких таких молекул, полифосфата или пирофосфата в терминальный алкен. R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из атома водорода и линейной или разветвленной алкильной группы, включающей 1-4 атома углерода. Для получения изобутилена осуществляют превращение 3-гидрокси-3-метилбутирата с помощью мевалонатдифосфат декарбоксилазы, включающей последовательность SEQ ID NO:6, или последовательность, обладающую по крайней мере 15%, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией последовательности. Композиция для получения терминального алкена включает микроорганизм, продуцирующий мевалонатдифосфат декарбоксилазу, культуральную среду с источником углерода и 3-гидроксиалканоатом. Изобретения обеспечивают новый путь синтеза терминального алкена на основе ферментативного превращения 3-гидроксиалканоатов, что позволяет устранить применение нефтепродуктов и снизить затраты на получение пластиков и топлива. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 15 ил., 13 пр.
Наверх