Моноклональное тело против амилоида бета



Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета
Моноклональное тело против амилоида бета

 


Владельцы патента RU 2571856:

АЦ ИММУНЕ С.А. (CH)
ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента, специфичных в отношении бета-амилоидного пептида 1-40. Каждый из вариантов характеризуется тем, что включает области VH и VL, либо 6 CDR из лёгкой и тяжёлой цепи. Описаны: кодирующая НК; варианты депонированных линий клеток (гибридом) с коллекционными номерами DSM ACC2844, DSM ACC2845, DSM ACC2846 и линия клеток, включающая указанный полинуклеотид, для получения антитела. Предложены: терапевтическая композиция для лечения заболеваний или расстройств, вызванных или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками, и набор для обнаружения амилоидного белка в биологическом образце, - использующие антитело. Раскрыты варианты способа получения антитела: с использованием гибридом или кодирующей НК. Описаны: способ диагностирования предрасположенности к заболеванию или состоянию, связанному с амилоидозом; способ определения степени нагрузки амилоидогенными бляшками в ткани; способ мониторинга минимального остаточного заболевания, связанного с амилоидом; способ прогнозирования восприимчивости субъекта; способ лечения или облегчения заболеваний, связанных с амилоидозом; способ снижения количества бляшек или их нагрузки в мозге; способ снижения общего количества растворимого белка амилоида и способ сохранения или повышения когнитивного объема памяти субъекта - использующие антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент. Описаны варианты применения антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента для приготовления лекарственного средства. Предложенные изобретения обеспечивают новые антитела, что может найти применение в терапии и диагностике болезни Альцгеймера и других перечисленных амилоидозов. 28 н. и 26 з.п. ф-лы, 20 ил., 13 табл., 3 пр.

 

Перекрестные сведения на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основе предварительной заявки на патент США US 60/943543, поданной 12 июня 2007 г., предварительной заявки на патент США US 60/943541, поданной 12 июня 2007 г., и предварительной заявки на патент США US 60/943790, поданной 13 июня 2007 г., которые включены в настоящее изобретение в виде ссылок.

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для диагностики и лечения заболеваний и расстройств, которые связаны или вызваны амилоидом или амилоидоподобными белками, в том числе амилоидозов - группы заболеваний и нарушений, связанных с амилоидным белком, например болезни Альцгеймера.

Амилоидоз означает не единственное заболевание, а разнородную группу прогрессирующих заболеваний, отличающихся внеклеточными тканевыми отложениями восковидного крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. По мере накопления отложений амилоида они начинают мешать нормальному функционированию органа или системы организма. Имеется по меньшей мере 15 разных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз без известных предшествующих проявлений заболевания, вторичный амилоидоз, проявляющийся после некоторого другого болезненного состояния, и наследственный амилоидоз.

Вторичный амилоидоз отмечают у людей с хронической инфекцией или воспалительным заболеванием, например, туберкулезом, бактериальной инфекцией, называемой семейной средиземноморской лихорадкой, костными инфекциями (остеомиелитами), ревматоидным артритом, воспалением тонкой кишки (грануломатозным илеитом), болезнью Ходжкина и лепрой.

Амилоидные белковые фибриллы, которые составляют примерно до 90% амилоидного материала, представляют один из нескольких различных типов белков. Эти белки способны складываться в так называемые «бета-складчатые» плоские фибриллы - уникальную белковую конфигурацию, которая имеет сайты связывания для красителя Конго красного, и в результате возникает уникальное для амилоидного белка свойство - окрашивание. Кроме того, амилоидные отложения тесно связаны с пентагональным компонентом амилоида Р (amyloid pentagonal - АР), гликопротеином, близким к нормальному сывороточному амилоиду Р (serum amyloid Р - SAP), и сульфатированными глюкозаминогликанами (glycosaminoglycans - GAG), сложными углеводами соединительной ткани.

Многие возрастные заболевания основаны или связаны с белками амилоидного типа и в частности характеризуются накоплением внеклеточных отложений амилоида или амилоидо-подобного материала, который участвует в патогенезе, а также в прогрессировании заболевания. К таким заболеваниям относятся, но ими не ограничиваются, неврологические заболевания, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания и состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное поражение (mild cognitive impairment - MCI), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам. К другим заболеваниям, которые связаны с белками амилоидного типа, относятся прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна.

Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, свойственные для них отложения часто содержат много общих молекулярных составляющих. В значительной степени они могут быть следствием местного активирования провоспалительных метаболических путей, связанных с одновременным отложением активированных компонентов комплемента, веществами острой фазы, иммунными модуляторами и другими медиаторами воспаления (McGeer и др., 1994).

Болезнь Альцгеймера (БА) является нейрологическим расстройством, предположительно вызываемым амилоидными бляшками, накоплением нарушенного отложения белков в мозге. Наиболее часто тип амилоида, обнаруженного в мозге больных, преимущественно состоит из фибрилл Аβ. Научное подтверждение заключается в том, что повышение выработки и накопления бета-амилоидного белка в бляшках приводит к отмиранию нервных клеток, которое влияет на развитие и прогрессирование БА. Утрата нервных клеток в стратегически важных участках мозга в свою очередь вызывает снижение содержания нейротрансмитеров и ухудшает память. К белкам, играющим основную роль в формировании бляшек, относятся амилоидный белок-предшественник (amyloid precursor protein - АРР) и два презенилина (презенилин I и презенилин II). Последующее расщепление амилоидного белка-предшественника (АРР), который экспрессируется конститутивно и подвергается катаболизму в большинстве клеток, ферментами β и γ секретазами приводит к высвобождению пептида Аβ, включающего от 39 до 43 аминокислот. Разрушение белков АРР вероятно повышает их предрасположенность агрегировать в бляшки. Особенно это относится к фрагменту Аβ(1-42), который имеет высокую предрасположенность к связыванию агрегатов из-за двух в высокой степени гидрофобных аминокислотных остатков по С-концу. Поэтому предполагают, что фрагмент Aβ(1-42) преимущественно вовлечен и ответственен за инициацию формирования старческих бляшек у больных БА, и соответственно обладает высоким патологическим потенциалом. Таким образом, существует потребность в агентах для предупреждения формирования амилоидных бляшек и растворения имеющихся бляшек у больных БА.

Симптомы болезни Альцгеймера проявляются медленно, и первым симптомом может быть небольшая забывчатость. На этой стадии индивидуумы могут забывать недавние события, поступки, имена знакомых людей или названия предметов и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. По мере прогрессирования заболевания симптомы становятся более заметными и достаточно серьезными, чтобы больные БА или их родственники стали обращаться за медицинской помощью. На средней стадии БА к симптомам относятся утрата способности выполнять простые задачи, например, поддержание личной гигиены, и проблемы, связанные с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на последующей стадии БА могут пребывать в состоянии обеспокоенности или агрессии, могут уйти из дома, а также могут полностью нуждаться в уходе.

В настоящее время единственным точным способом диагностики БА является идентификация бляшек и сплетений в ткани мозга при аутопсии после смерти индивидуума. Следовательно, врачи могут диагностировать БА только «приблизительно» или «примерно» при жизни пациента. С помощью современных методов врачи могут с точностью диагностировать БА до 90% случаев, используя некоторые средства для диагностики «возможной» БА. Врачи проводят опрос об общем состоянии здоровья пациента, перенесенных заболеваниях, а также о появлении каких-либо осложнений в быту. Поведенческое тестирование памяти, решения задач, внимания, счета и речи дают информацию о когнитивном вырождении, а медицинские анализы, например, крови, мочи, спинномозговой жидкости и сканирование мозга, могут предоставить некоторую дополнительную информацию.

Поддержание состояния пациентов с БА заключается в медицинском и немедицинском уходе. Способы лечения, направленные на изменение течения болезни (откладывая или ревертируя ее прогрессирование) до настоящего времени почти совсем неэффективны. Было показано, что лекарственные средства, которые восстанавливают недостаточность (дефицит) или нарушенное действие химических посредников нервных клеток (нейротрансмиттеров), в частности ингибиторов холинэстеразы (cholinesterase inhibitor - ChEI), например, такрин и ривастигмин, проявляют улучшение симптомов. Ингибиторы ChEI препятствуют ферментативному разрушению нейротрансмитеров, тем самым, повышая содержание химических посредников, способных передавать нервный сигнал в мозг.

У некоторых людей на ранних и средних стадиях заболевания лекарственные средства такрин (продукт COGNEX®, Morris Plains, NJ), донепезил (продукт ARICEPT®, Токия, Япония), ривастигмин (продукт EXELON®, Восточный Гоновер, Нью-Джерси) или галантамин (продукт REMINYL®, Нью-Брунсвик, Нью-Джерси) могут помочь предупредить наихудшее проявление некоторых симптомов в течение ограниченного периода времени. Другое лекарственное средство, мемантин (продукт NAMENDA®, Нью-Йорк, Нью-Йорк), было одобрено для лечения БА, проявляющейся в формах от умеренных до тяжелых. Медикаментозные средства также применимы для лечения психиатрических проявлений БА. Кроме того, некоторые медикаментозные средства могут способствовать контролю поведенческих симптомов при БА, например, бессонницы, беспокойства, блуждания, состояния тревоги и депрессии. Лечение этих симптомов часто облегчает существование больных, делая его более комфортабельным, и облегчает уход за ними для персонала. К сожалению, несмотря на существенные преимущества лечения, показавшего, что агенты этого класса стабильно лучше плацебо, болезнь продолжает прогрессировать и обычное воздействие на ментальное функционирование проявляется умеренно. Многие лекарственные средства, используемые для лечения БА, например, ChEI, также обладают побочными эффектами, к которым относятся желудочно-кишечные расстройства, печеночная токсичность и потеря массы тела.

Другими заболеваниями, связанным или основанными на накоплении и отложении белка амилоидного типа, являются умеренное когнитивное нарушение (УКН), болезнь диффузных поражений телец Леви, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ) и дегенерацию желтого пятна, в частности возрастную дегенерацию желтого пятна.

Предполагают, что отложение β-амилоида в энторинальной области коры головного мозга играет ключевую роль в развитии умеренного расстройства с когнитивным нарушением (mild cognitive impairment - MCI) у престарелых. Это согласуется с наблюдением, заключающемся в том, что уровни СМЖ-А Aβ(1-42) существенно снижаются, когда клиническое проявление симптомов БА становится очевидным. В отличие от СМЖ- Aβ(1-42), уровни СМЖ-тау существенно повышены на стадии MCI, и позднее эти величины продолжают повышаться, свидетельствую о том, что повышенные уровни СМЖ-тау могут помочь выявить субъектов с MCI, у которых прогнозируют развитие БА.

Болезнь диффузных поражений телец Леви является нейродегенеративным расстройством, которое может быть у людей старше 65 лет, при котором обычно проявляются симптомы когнитивного (умственного) ухудшения и нарушенного поведения. К симптомам могут относиться когнитивное ухудшение, нейрологические признаки, расстройство сна и недостаточность вегетативной нервной системы. Когнитивное ухудшение представляет симптом LBD в большинстве случаев. У пациентов повторяются приступы помрачения сознания, которые постепенно ухудшаются. Флуктуация когнитивной способности часто связана с изменением степеней проявления внимания и живости поведения. Когнитивное ухудшение и флюктуации мыслительной способности могут меняться на протяжении минут, часов или суток.

Тельца Леви формируются из фосфорилированных и нефосфорилированных нейрофиламентных белков; они содержат синаптический белок альфа-синуклеин, а также убиквитин, которые участвуют в элиминации поврежденных или аномальных белков. Помимо телец Леви также могут присутствовать нейриты Леви, которые являются тельцами-включениями в клеточные процессы нервных клеток. Амилоидные бляшки могут формироваться в мозге пациентов с болезнью диффузных поражений телец Леви, однако проявляется тенденция к уменьшению их числа по сравнению с пациентами с болезнью Альцгеймера. Нейрофибриллярные сплетения и другие микропатологические признаки БА не являются основными симптомами болезни диффузных поражений телец Леви, но они часто присутствуют наряду с амилоидными бляшками.

Амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS) характеризуется дегенерацией нижних и верхних моторных нейронов. У некоторых пациентов с ALS может быть слабоумие или потеря речи (афазия) (ALS-D). Слабоумие в большинстве случаев является лобно-височным слабоумием (frontotemporal dementia - FTD), при этом у многих пациентов имеются убиквитин-положительные, тау-отрицательные включения в нейронах зубчатой извилины медиальной и нижней поверхности полушария большого мозга и поверхностные слои лобных и височных долей.

Миозит с включенными тельцами (МВТ) (Inclusion-body myositis - IBM) является травматическим заболеванием, обычно выявляемым у людей старше 50 лет, у которых в мышечных волокнах формируется воспаление и начинается атрофия, но у которых сохранен мозг и полностью сохранен интеллект. Установлено, что в большинстве случаев содержание двух ферментов, участвующих в выработке белка амилоида-В, повышено в мышечных клетках пациентов этого наиболее распространенного прогрессирующего мышечного заболевания пожилых людей, у которых содержание амилоида-В также повышено.

Другим заболеванием, основанным или связанным с накоплением и отложением белка типа амилоида, является дегенерация желтого пятна.

Дегенерация желтого пятна представляет распространенное заболевание, при котором происходит повреждение желтого пятна, являющегося центральной областью сетчатки (ткани, толщиной с лист бумаги в задней части глаза, из которой светочувствительные клетки посылают зрительные сигналы в мозг). Острое, четкое, «прямое» зрение перерабатывается желтым пятном. Повреждение желтого пятна приводит к развитию слепых пятен и расплывчатому или искаженному восприятию. Возрастная дегенерация желтого пятна (ВДЖП) представляет основную причину ухудшения зрения в США, а для людей старше 65 лет она представляет основную причину развития практической (гражданской) слепоты среди представителей европеоидной расы. Примерно 1,8 миллионов американцев в возрасте 40 лет и старше, имеющие продвинутую форму ВДЖП, и другие 7,3 миллионов американцев, имеющие промежуточную форму ВДЖП, подвержены значительному риску потери зрения. По оценке правительства к 2020 году у 2,9 миллионов людей будет продвинутая форма ВДЖП. Жертвы ВДЖП часто удивляются и расстраиваются, узнав, что о причинах слепоты и ее лечении известно слишком мало.

Имеется две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки желтого пятна начинают медленно разрушаться, диагностируют в 85% случаев дегенерации желтого пятна. Оба глаза обычно поражены сухой формой ВДЖП, хотя один глаз может потерять зрение при сохранности второго глаза. Старческие бляшки, которые представляют желтые отложения под сетчаткой, обычно представляют ранние симптомы сухой формы ВДЖП. Риск развития продвинутой сухой формы ВДЖП или влажной формы ВДЖП повышается по мере увеличения числа или размера старческих бляшек. Сухая форма ВДЖП может прогрессировать и вызвать потерю зрения без перехода к влажной форме заболевания, однако также возможен для ранней стадии сухой формы ВДЖП внезапный переход во влажную форму.

Влажная форма, хотя она встречается только в 15% случаев, в 90% приводит к слепоте, и рассматривается в виде продвинутой формы ВДЖП (нет ранней или промежуточной стадии у влажной формы ВДЖП). Влажной форме ВДЖП всегда предшествует сухая форма заболевания. По мере ухудшения сухой формы у некоторых людей начинается патологический рост кровеносных сосудов за желтым пятном. Эти сосуды очень хрупкие, и могут быть кровотечения (отсюда «влажная» дегенерация желтого пятна), вызывающие быстрое разрушение желтого пятна.

Сухая форма ВДЖП может в начальной стадии часто вызывать слегка расплывчатое зрение. Центр изображения в частности затем может стать расплывчатым, и эта область разрастается по мере прогрессирования заболевания. Симптомы могут остаться незамеченными, если поражен только один глаз. При влажной форме ВДЖП прямые линии могут казаться волнистыми, а утрата центрального зрения может происходить быстро.

Диагностика дегенерации желтого пятна обычно включает расширенный анализ глаз, используя метод, называемый фундоскопией, который способствует диагностике ВДЖП, и, если предполагается влажная форма ВДЖП, также могут проводить флуоресцентную ангиографию. Если сухая форма ВДЖП достигает продвинутых стадий, в настоящее время нет лечения для предупреждения потери зрения. Однако специфические высокие дозы формулы антиоксидантов и цинка могут отсрочить или предупредить промежуточную стадию ВДЖП от прогрессирования до продвинутой стадии. Продукт Macugen® (инъекция пегаптаниба натрия), коагуляция лазером и фотодинамическая терапия могут контролировать патологический рост кровеносных сосудов и кровотечение в желтом пятне, что полезно для некоторых людей с влажной формой ВДЖП, однако, такими способами утраченное зрение восстановить нельзя. Если зрение уже утрачено, существует мало средств, которые могут помочь улучшить качество жизни.

Одним из ранних признаков возрастной дегенерации желтого пятна (ВДЖП) является накопление внеклеточных отложений, известных под названием «старческих бляшек», между базальным слоем пигментированного эпителия сетчатки (retinal pigmented epithelium - RPE) и базальной пластинки, также называемой оболочкой Бруха (Bruch's membrane - ВМ). Предшествующие исследования, выполненные Anderson и др., подтвердили, что старческие бляшки содержат амилоид бета (Experimental Eye Research 78, 2004, cc.243-256).

Современные исследования продолжают исследовать факторы внешней среды, генетические факторы и факторы питания, которые могут содействовать ВДЖП. Также исследуются новые стратегии лечения, включая трансплантаты клеток сетчатки, лекарственные средства, которые могут предупредить или понизить прогрессирование заболевания, радиационную терапию, генную терапию, имплантацию компьютерного чипа в сетчатку, которые могут помочь стимулировать зрение, и агенты, которые могут предупредить рост новых кровеносных сосудов под желтым пятном.

Важным фактором, который рассматривают при разработке новых лекарственных средств, является легкость применения пациентами, для которых они предназначены. Средства доставки пероральных лекарственных средств, особенно таблетки, капсулы и мази, составляют до 70% от всех потребляемых лекарственных форм, поскольку они удобнее для пациентов. Разработчики лекарственных средств полагают, что пациенты предпочитают пероральное введение в большей степени, чем инъекции или другие более инвазивные формы медикаментозного введения. Также предпочтительны составы, с увеличенными интервалами дозирования (т.е. раз в сутки или составы устойчивого высвобождения). Простота введения антибиотиков в пероральной лекарственной форме приводит к повышению соблюдения пациентом режима и схемы лечения.

Необходимы эффективные способы и композиции для выработки высокоспецифических и высокоэффективных антител, если антитела предусмотрены в пероральной дозированной форме. Предпочтительно такие антитела могут распознавать специфические эпитопы на различных антигенах, например, на амилоидном белке.

Следовательно, необходимы эффективные способы и композиции для предупреждения или выявления осложнений, связанных с заболеваниями или расстройствами у субъектов, нуждающихся в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или белками типа амилоида, включая амилоидоз - группу заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна. В частности необходимы агенты, способные противодействовать физиологическим проявлениям заболевания, например, формированию бляшек, ассоциированных с агрегированием волокон амилоида или амилоидоподобного пептида.

Сообщалось, что антиамилоидные антитела, возникшие в результате инокуляции амилоидом Aβ1-42, смешанным с полным или неполным адъювантом Фройнда, снижают амилоидную нагрузку у трансгенных мышей, связанную с болезнью Альцгеймера человека (Schenk и др., 1999).

Внутрибрюшинное введение тетрапальмитоилированного Aβ1-16, помещенного в липосомы, трансгенным мышам NORBA, высвобождает существенные титры антиамилоидных антител, о которых сообщалось, что они растворяют амилоидные волокна и бляшки in vitro и in vivo (Nicolau и др., 2002).

Возможный механизм, с помощью которого происходит растворение амилоидных бляшек и волокон, впервые был предложен Bard и др. (2000), которые заключили, что опсонизированные антителами бляшки были последовательно разрушены макрофагами микроглии. De Mattos и др. (2001) установили, что моноклональное антитело (MAb), направленное против центрального домена β-амилоида, способно связывать и полностью изолировать амилоид плазмы. Они пришли к заключению, что наличие моноклональных антител в кровеносном русле смещает баланс Aβ между мозгом и плазмой, способствую периферическому очищению и катаболизму вместо отложения в мозге.

Настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции, включающие высоко специфичные и высоко эффективные антитела, способные специфически распознавать и связывать специфические β-амилоидные белки.

Антитела по настоящему изобретению особенно применимы для лечения заболеваний и расстройств у субъектов, нуждающихся в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или белками типа амилоида, в том числе амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания или состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, например, миозит с включенными тельцами (МВТ), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, а также многие другие.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции для удержания или повышения когнитивного объема памяти у млекопитающих со связанным с амилоидом заболеванием или состоянием, включающие введение субъекту, особенно млекопитающему, особенно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективное количество моноклонального антитела по настоящему изобретению.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к применению презентации антигена, которая приводит к повышенной экспозиции и стабилизации предпочтительной конформации антигена, которая в конечной счете приводит к антителам с уникальными свойствами.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело, в том числе какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, или, более предпочтительно, моноклональное антитело, в том числе какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которые возникают против надмолекулярной антигенной конструкции, включая антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, особенно его выбранного фрагмента, модифицированного гидрофильной частью молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), или, в другом случае, гидрофобной частью молекулы, например, пальмитиновой кислотой, причем указанная гидрофильная или гидрофобная часть молекулы ковалентно связана с каждым из концов антигенного пептида через, по меньшей мере, одну, по меньшей мере одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин, или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, которые способны быть связующим механизмом для соединения гидрофильного и гидрофобного фрагментов пептидного фрагмента.

При использовании гидрофильной части молекулы, например, ПЭГ, выбранный фрагмент β-амилоидного пептида может быть фрагментом, соответствующим аминокислотной последовательности Aβ22-35 и Аβ29-40, соответственно, и свободные от ПЭГ концы могут быть ковалентно связаны с фосфатидилэтаноломамином или каким-либо другим соединением, пригодным для действия в качестве элемента заякоривания, например, к погруженной антигенной конструкции в двухслойной липосомы.

При использовании гидрофобной части молекулы, например, пальмитиновой кислоты, выбранный фрагмент β-амилоидного пептида может быть фрагментом, соответствующим аминокислотной последовательности Aβ1-15, и такая гидрофобная часть может непосредственно действовать в качестве элемента заякоривания, например, к погруженной антигенной конструкции в двухслойной липосомы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, предпочтительно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело распознает и связывается с конформационным эпитопом и связывается с полимерным растворимым амилоидом, и с амилоидными фибриллами или волокнами, соответственно, особенно с полимерными растворимыми Aβ пептидами и амилоидными Aβ фибриллами или волокнами, соответственно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, предпочтительно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело распознает и связывается с конформационным эпитопом, предпочтительно представленным на полимерном растворимом амилоиде и олигомерных амилоидных пептидах, соответственно, на полимерных растворимых амилоидных Aβ пептидах и олигомерных амилоидных Aβ пептидах, включая множество мономерных Aβ 1-42 пептидов, соответственно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, предпочтительно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело распознает и связывается с конформационным эпитопом, предпочтительно представленным на полимерном растворимом амилоиде и олигомерных амилоидных пептидах, соответственно, а также на амилоидных волокнах или фибриллах, особенно на полимерных растворимых амилоидных Aβ пептидах и олигомерных амилоидных Аβ пептидах, включая множество мономерных Aβ 1-42 пептидов и амилоидные фибриллы и волокна, включая множество указанных олигомерных пептидов, соответственно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое распознает и связывается с конформационным эпитопом, предпочтительно представленным на полимерных растворимых амилоидных и олигомерных амилоидных пептидах, соответственно, но также на амилоидных фибриллах или волокнах, особенно на полимерных растворимых амилоидных Aβ пептидах и олигомерных амидоидных Aβ пептидах, включая множество мономерных Aβ 1-42 пептидов, и на амилоидных фибриллах и волокнах, включающих множество указанных олигомерных пептидов, соответственно.

Наследование аллеля ε4 белка аполипопротеина Е (ароЕ4) является важным генетическим фактором риска при БА. Этот белок способен связывать амилоид и известно, что он участвует и в клиренсе Aβ через гематоэнцефалитный барьер, и в индукции отложения Aβ. Напротив, связывание амилоидных участков в гидрофобной липопротеин-связывающей области ApoE и эта связь резко снижает среднюю связывающую липид способность ApoE.

Таким образом, еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения по получению антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, согласно описанному в настоящем изобретении, является антитело, способное ингибировать или в другом варианте уменьшать взаимодействие амилоида с ApoE4 в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека, особенно в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной концентрацией Aβ в мозге. Антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, таким образом, предпочтительно связывается с полимерными растворимыми амилоидными и олигомерными амилоидными пептидами, соответственно, особенно с растворимыми полимерными Aβ пептидами и олигомерными Aβ пептидами, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, соответственно. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Aβ мономерными пептидами, имеющими по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, но практически не связываются с Aβ мономерными пептидами, имеющими менее 30 остатков, предпочтительно пептидами, имеющими менее 20 остатков, более предпочтительно пептидами, имеющими менее 10 остатков, но особенно пептидов, имеющих 8 и менее остатков.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерными пептидами, имеющими по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, предпочтительно с мономерным Aβ пептидом 1-40 и растворимым полимерным и/или олигомерным пептидом, включающим множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но практически не проявляет связывания с Aβ мономерными пептидами 17-40.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но проявляет промежуточное связывание с Aβ мономерным пептидом 1-42.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и проявляет промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но проявляет промежуточное связывание с Aβ мономерным пептидом 1-42, и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ 1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, проявляет промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, при совместном инкубировании с Aβ мономерным пептидом в мономерной и/или олигомерной форме, имеющим по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, но особенно с Aβ1-42 мономерным пептидом и/или олигомерным пептидом, включающим множество указанных Aβ1-42 мономерных пептидов, особенно в соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 до 1:1000, но особенно в соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:100, ингибирует агрегирование Aβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.

Предпочтительно совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения совместное инкубирование с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 48 ч при температуре 37°С.

В частности антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, связывается предпочтительно с Aβ1-40 мономерным пептидом и при совместном инкубировании с Aβ1-40 мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается предпочтительно с Aβ1-40 мономерным пептидом, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40, и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов, но слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, промежуточно связывается с мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-40 мономерным пептидом, а также с Aβ1-42 олигомерными и/или полимерными пептидами, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связываются с мономерным пептидом 1-42 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40 и, при совместном инкубировании с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование Aβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85%-90% или более по сравнению с соответствующими мономерами амилоидного пептида, инкубированными в буфере (контроль).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-40 мономерным пептидом, а также с Aβ1-42 олигомерными и/или полимерными пептидами, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связывается с мономерным пептидом 1-42 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40 и, при совместном инкубировании с Aβ1-42 мономерными и/или олигомерными пептидами в течение 24 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Aβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85%-90% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100 и по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85%-90% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 по результатам флуоресцентного исследования с применением тиофлавина Т (Th-Т), особенно флуоресцентного исследования с применением тиофлавина Т (Th-Т) по описанию в приведенных ниже примерах 1.4 и 2.4.

Связывание антител по настоящему изобретению, согласно описанию в настоящем изобретении, амилоидогенными и мономерными и/или олигомерными пептидами, но особенно с амилоидной формой (1-42), приводит к подавлению агрегирования мономерных и/или олигомерных амилоидогенных пептидов в высокомолекулярные фибриллы или филаменты. За счет подавления агрегирования амилоидогенных мономерных и/или олигомерных пептидов антитела по настоящему изобретению могут предупреждать или снижать формирование амилоидных бляшек, особенно амилоидной формы (1-42), о которой известно, что она становится нерастворимой при изменении вторичной конформации и представляет основную часть бляшек в мозге больных животных или людей.

По настоящему изобретению потенциал агрегирования антитела может быть определен каким-либо соответствующим способом, известным в настоящей области, например, ультрацентрифугированием в градиенте плотности с последующим анализом осаждения SDS-PAGE полученного градиента и/или методом флуоресценции с применением тиофлавина Т (Th-T).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно к моноклональному антителу, описанному в настоящем изобретении, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело при совместном инкубировании, особенно при соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:1000, более предпочтительно в соотношении 1:100, с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, особенно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 60%, но особенно по меньшей мере на 70% или больше.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способность антитела подавлять агрегирование и дезагрегировать, соответственно, определяют ультрацентрифугированием в градиенте плотности с последующим анализом осаждения SDS-PAGE полученного градиента.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способность антитела подавлять агрегирование и дезагрегировать, соответственно, определяют флуоресцентным анализом с применением тиофлавина Т (Th-T).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению инкубируют совместно с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидным фибриллами или филаментами в течение 12-36 ч, особенно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, предпочтительно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.

В частности, совместное инкубирование с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение от 24 ч при температуре 37°С.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-40 мономерным пептидом, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связывается с мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40 и, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные амилоидные фибриллы или филаменты, особенно по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, преимущественно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 60%, и еще более предпочтительно на 70% или более.

В частности, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-40 мономерным пептидом, а также с Aβ1-42 олигомерными и/или полимерными пептидами, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связывается с мономерным пептидом 1-42 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40 и, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные амилоидные фибриллы или филаменты, особенно по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, преимущественно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-40 мономерным пептидом, а также с Aβ1-42, олигомерными и/или полимерными пептидами, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связывается с мономерным пептидом 1-42 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40 и, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ1-42 мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С, приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 55%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85-90% при соотношении мольной концентрации антитела к Aβ1-42 1:10 по данным флуоресцентного анализа с применением тиофлавина Т (Th-T), особенно анализа с применением тиофлавина Т (Th-T), описанного ниже в примерах 1.4 и 2.4.

Через ингибирование агрегирования амилоидного белка, а также через дезагрегирование амилоидогенных полимерных фибрилл или филаментов, антитела по настоящему изобретению могут предупреждать или понижать формирование амилоидных бляшек, в результате чего происходит облегчение проявления симптомов, связанных с заболеванием, и отсрочка или обращение его прогрессирования.

Таким образом, в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело способно снижать общее количество Аβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной концентрацией Аβ в мозге.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело способно разрушать бляшки, тем самым снижая нагрузку бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает нагрузку бляшек в мозге по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85-90%.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело способно растворять бляшки, связанные с уменьшением количества бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, предпочтительно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенным содержанием бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает количество бляшек в мозге по меньшей мере на 10%, особенно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85-90%.

Следует учитывать, что антитело по настоящему изобретению может проявлять одно, два или несколько специфических свойств, описанных в настоящем изобретении, в разных комбинациях.

Например, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела, особенно моноклональные антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанные антитела являются биспецифическими или биэффективными, поскольку проявляют и способность ингибировать агрегирование, и способность к дезагрегированию, описанные в настоящем изобретении, особенно в связи с высокой степенью конформационной чувствительности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, является биспецифическим или биэффективным, и при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом, имеющим по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом, ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы и, кроме того, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты.

В частности, совместное инкубирование с амилоидными и/или олигомерными пептидами и ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, происходит при соотношении мольных концентраций до 1:1000, но особенно при соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:100, особенно при соотношении мольных концентраций 1:100.

Совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами, проводят в течение 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С, причем совместное инкубирование с амилоидными ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение 12-36 ч, преимущественно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, согласно описанному в настоящем изобретении способно к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 55%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 75-80%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело ингибирует агрегирование Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85-90% или более по сравнению с соответствующими амилоидными пептидными мономерами, инкубированными в буфере (контроль).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело согласно описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело проявляет высокую специфичность к Aβ1-40 мономерным пептидам, особенно к Aβ мономерному пептиду 1-40 и к растворимому полимерному и/или олигомерному амилоидному пептиду, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов, но практически не проявляет или проявляет только от минимальной до умеренной степени перекрестную реактивность к мономеру амилоидному пептиду, выбранному из группы, состоящей из Aβ1-28, Aβ17-40, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-41 и/или Aβ1-42 мономерных пептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело до 1000 раз, особенно в 50-100 раз, более предпочтительно в 80-100 раз, но особенно в 100 раз более чувствительно к амилоидному пептиду Aβ1-40 по сравнению с Aβ1-28, Aβ17-40, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-41, Aβ1-42, и способно ингибировать in vitro и in vivo агрегирование амилоидогенных мономерных и/или олигомерных пептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-40 мономерным пептидом, а также с Aβ1-42 олигомерными и/или полимерными пептидами, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связывается с мономерным пептидом 1-42, и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 24 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Aβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 55%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, в соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100, и по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85%-90% в соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 и при совместном инкубировании с ранее сформулированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами, сформированными агрегированием Aβ1-42 мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 10% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100 и по меньшей мере на 20% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 по результату флуоресцентного анализа с применением тиофлавина Т (Th-T), особенно анализа с применением тиофлавина Т (Th-T), описанного ниже в примерах 1.4 и 2.4.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к описанному в нем антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело обладает высокой связывающей чувствительностью к амилоидному пептиду Aβ1-40 и способно выявить Aβ1-42 растворимые олигомерные и/или полимерные амилоидные пептиды в концентрации до 0,01 мкг, но особенно в диапазоне концентрации 0,5-0,01 мкг, более предпочтительно 0,1-0,01 мкг, но особенно в концентрации 0,01 мкг.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части, причем содержание указанного антитела повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Aβ1-15, модифицированного частями гидрофобной пальмитиновой кислоты, причем указанная гидрофобная часть ковалентно связана с каждым из концов через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, которые могут выступать в качестве молекулы-линкера.

Антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, распознает и связывается с конформационным эпитопом.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:7, или функциональной части этой последовательности, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три области CDR легкой цепи, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO:9-11, но особенно все три области CDR, погруженные в их естественные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, или функциональной части этой последовательности, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO:12-14, но особенно все три области CDR, погруженные в их естественные каркасные участки.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:7, или функциональной части этой последовательности, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три области CDR легкой цепи, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO:9-11, но особенно все три области CDR, погруженные в их естественные каркасные участки.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, или функциональной части этой последовательности, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO:12-14, но особенно все три области CDR, погруженные в их естественные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, или их функциональной части, включая часть или все области CDR тяжелой и легкой цепи, имеющими полипептидные последовательности SEQ ID NO:9-14.

Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое включает полипептидную последовательность SEQ ID NO:7 и/или- SEQ ID NO:8. Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:7-8.

К настоящему изобретению также относится антитело, последовательность которого была изменена путем внедрения по меньшей мере одного, особенно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех или более консервативных замещений в последовательностях SEQ ID NOs: 7-8, таким образом, что антитело существенным образом сохраняет свою полную функциональность.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к пептидному фрагменту, включающему область CDR1 легкой цепи SEQ ID NO:9, и/или CDR2 легкой цепи SEQ ID NO:10, и/или CDR3 легкой цепи SEQ ID NO:11.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к пептидному фрагменту, включающему область CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO:12, и/или CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO:13, и/или CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO:14.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к CDR1 легкой цепи SEQ ID NO:9.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к CDR2 легкой цепи SEQ ID NO:10.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к CDR3 легкой цепи SEQ ID NO:11.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO:12.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO:13.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO:14.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, выражающуюся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:7, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:9-11, но особенно все три области CDR, погруженные в их природные каркасные участки. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выражающуюся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:12-14, но особенно все три области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:7, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:9-11, но особенно все три области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:12-14, но особенно все три области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, или их функциональным частям, включающим области CDR легкой цепи и тяжелой цепи, имеющими полипептидные последовательности SEQ ID NO:9-14.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело по настоящему изобретению, но особенно нуклеотидную последовательность, кодирующую моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:7-8. Особенно это полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO:15-16.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:7-8. В частности предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:15-16.

В частности, в положении 52 в последовательности SEQ ID NO:8 может быть какая-либо аминокислота. В другом варианте осуществления настоящего изобретения в положении 52 может быть остаток тирозина, серина или цистеина. Более предпочтительно в положении 52 находится остаток цистеина.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает свойствами антитела, вырабатываемого линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2844.

В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, вырабатываемое линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2844.

В частности, настоящее изобретение также относится к эпитопу Aβ, который связывается с моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем количество указанного антитело повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Aβ1-15, модифицированный гидрофобными частями молекулы пальмитиновой кислоты, причем указанная гидрофобная часть молекулы ковалентно связана с каждым из концов через аминокислоту, например, лизин или другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, способный выступать в качестве молекулы-линкера. Настоящее изобретение также относится к эпитопу Aβ, который связывается с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерными пептидами, имеющими по меньшей мере 10, особенно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 30, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, и/или к растворимым полимерным амилоидным пептидам, включающим множество указанных амилоидных мономерных пептидов, и/или к амилоидным волокнам или фибриллам, включающим множество указанных полимерных пептидов, но особенно к Aβ1-42 мономерным пептидам и полимерным растворимым Aβ пептидам, включающим множество Aβ1-42 мономерных пептидов и Aβ фибрилл или волокон, включающих множество указанных полимерных пептидов, и практически не проявляет связывания с Aβ мономерными пептидами, имеющими 8 аминокислотных остатков или менее.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерными пептидами, имеющими по меньшей мере 30, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, и/или к растворимым полимерным амилоидным пептидам, включающим множество указанных амилоидных мономерных пептидов и/или к амилоидным волокнам или фибриллам, включающим множество указанных полимерных пептидов, но особенно к Aβ1-42 мономерному пептиду и полимерным растворимым Aβ пептидам, включающим множество β1-42 мономерных пептидов и Aβ фибрилл или волокон, включающих множество указанных полимерных пептидов, но практически не проявляет связывания с Aβ мономерным пептидом 17-40.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-42 и полимерными растворимыми Aβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов и Aβ фибрилл или волокон, включающих множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Aβ мономерным пептидом 1-42 и полимерными растворимыми Aβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов и Aβ фибрилл или волокон, включающих множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40.

В частности, антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, связывается с Aβ1-42 мономерными растворимыми Aβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов и Aβ фибрилл или волокон, включающих множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Aβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 80%-90% или более по сравнению с соответствующими мономерами амилоидного пептида, инкубированными в буфере (контроль).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Aβ1-42 мономерным пептидом, с полимерными растворимыми Aβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов, и Aβ фибриллами и волокнами, включающими множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40 и при совместном культивировании с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 24 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100 и по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 по результатам флуоресцентного исследования с применением тиофлавина Т (Th-T), особенно флуоресцентного исследования с применением тиофлавина Т (Th-T) по описанию в приведенных ниже примерах 1.4 и 2.4.

В частности, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-42 мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов, и Aβ фибриллами или волокнами, включающими множество указанных полимерных пептидов, но слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными агрегированием Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, может дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или волокна, предпочтительно по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 60% или более.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Aβ1-42 мономерным пептидом, а также с полимерными растворимыми Aβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов, и Aβ фибриллами и волокнами, включающими множество указанных полимерных пептидов, но намного слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном культивировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ1-42 мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С, приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или волокон, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100 и по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 по результатам флуоресцентного исследования с применением тиофлавина Т (Th-T), особенно флуоресцентного исследования с применением тиофлавина Т (Th-T) по описанию в приведенных ниже примерах 1.4 и 2.4.

За счет ингибирования агрегирования амилоидного белка и/или за счет дезагрегирования амилоидогенных полимерных фибрилл или филаментов, антитела по настоящему изобретению могут предупредить или понизить формирование амилоидных бляшек, что приводит к ослаблению проявления симптомов, связанных с заболеванием, и отсрочке рецидива или дальнейшего прогрессирования.

Таким образом, это еще один вариант настоящего изобретения, направленный на получение антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело может снижать общее содержание Aβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, предпочтительно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной концентрацией Aβ в мозге.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело может разрушать бляшки, тем самым, снижая нагрузку бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает нагрузку бляшек в мозге по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере более чем на 30%.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело может растворять бляшки, связанные с уменьшением количества бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает количество бляшек в мозге по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%.

Следует учитывать, что антитело по настоящему изобретению может проявлять одно, два или несколько специфических свойств, описанных в настоящем изобретении в разных комбинациях.

Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела, особенно моноклональные антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитела являются биспецифичными или биэффективными, что заключается в том, что они согласно настоящему изобретению проявляют и способность подавлять ингибирование бляшек, и способность дезагрегировать, особенно в сочетании с высокой степенью конформационной чувствительности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению является биспецифичным или биэффективным и при совместном инкубировании с Aβ мономерным и/или олигомерным пептидом, состоящим по меньшей мере из 30, предпочтительно по меньшей мере из 35, еще более предпочтительно по меньшей мере из 38, еще более предпочтительно по меньшей мере из 40 аминокислотных остатков, но особенно с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом, ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы, и, кроме того, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными агрегированием Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, но особенно Aβ1-42 мономерными и/или олигомерными пептидами, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты.

В частности, совместное инкубирование с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами и ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, соответственно, происходит при соотношении мольных концентраций до 1:1000, но особенно при соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:1000, особенно при соотношении мольных концентраций 1:100.

Совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28°С до 40°С, предпочтительно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С, причем совместное инкубирование с амилоидными ранее сформированными высокомолекуляными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение 12-36 ч, особенно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, предпочтительно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, способно дезагрегировать ранее сформированные фибриллы или филаменты по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, но особенно Aβ1-42 мономерных и/или олигомерных пептидов, по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, но особенно по меньшей мере на 80-90% или более по сравнению с соответствующими мономерами амилоидного пептида, инкубированными в буфере (контроль).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, способно проявлять высокую специфичность к Aβ1-42 мономерным пептидам, но практически не проявляет или проявляет минимальную перекрестную реактивность в отношении мономера амилоидного пептида, выбранного из группы, состоящей из Aβ1-28 и Aβ17-40 мономерных пептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело до 1000 раз, особенно в 50-1000 раз, более предпочтительно в 80-100 раз, но особенно в 100 раз более чувствительно к амилоидному пептиду Aβ1-42 по сравнению с Aβ1-28 и/или Aβ17-40, и способно ингибировать in vitro и in vivo агрегирование амилоидогенных мономерных и/или олигомерных пептидов, и/или дезагрегирование ранее сформированных полимерных фибрилл и филаментов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ1-42 мономерным пептидом и полимерными растворимыми Aβ пептидами, включающими множество Aβ1-42 мономерных пептидов, и Aβ фибриллами или волокнами, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточно связывается с мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Aβ1-42 мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 24 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Aβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 30%, при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100, и по меньшей мере на 65% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 и при совместном инкубировании с ранее сформулированными высокомолекулярными олигомерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными агрегированием Aβ1-42 мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 20% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:100 и по меньшей мере на 50% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ1-42 1:10 по результату флуоресцентного анализа с применением тиофлавина Т (Th-T), особенно анализа с применением тиофлавина Т (Th-T), описанного ниже в примерах 1.4 и 2.4.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к описанному в нем антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело обладает высокой связывающей чувствительностью к амилоидному пептиду Aβ1-42 и способно выявить волокна Aβ1-42 в концентрации до 0,01 мкг, но особенно в диапазоне концентрации 0,5-0,01 мкг, более предпочтительно 0,1-0,01 мкг, но особенно в концентрации 0,01 мкг.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части, причем содержание указанного антитела повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Aβ22-35 и Aβ29-40, соответственно, модифицированных гидрофильными частями молекулами, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанная гидрофильная часть молекулы ковалентно связана с каждым из концов через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, которые могут выступать в качестве молекулы-линкера.

Антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, распознают и связывают конформационный эпитоп.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи, выражающейся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19, соответственно, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи, выражающейся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

Кроме того, изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части по настоящему изобретению и описанное в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

Кроме того, изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части по настоящему изобретению и описанное в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению и описанное в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи, выражающиеся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20, или их функциональной части, включающей часть областей CDR или все области CDR легкой и тяжелой цепи.

Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело включает полипептидную последовательность SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20. Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 и антителу ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NOs: 19-20.

Настоящее изобретение также относится к антителу, последовательность которого была изменена путем внедрения по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех или нескольких консервативных замещений в последовательностях SEQ ID NO:17-18 и SEQ ID NO:19-20, соответственно, таким образом, что антитело в существенной степени сохраняет свою полную функциональность.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к фрагменту пептида, включающего область CDR1 легкой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:21, и/или область CDR2 легкой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:22, и/или область CDR3 легкой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:23.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к фрагменту пептида, включающего область CDR1 тяжелой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:24, и/или область CDR2 тяжелой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:25, и/или область CDR3 тяжелой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:26.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к области CDR1 легкой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:21.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к области CDR2 легкой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:22.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к области CDR3 легкой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:23.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к области CDR1 тяжелой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:24.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к области CDR2 тяжелой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:25.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к области CDR3 тяжелой цепи, приведенной в последовательности SEQ ID NO:26.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, выражающуюся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, приведенные в виде последовательностей SEQ ID NO:21-23, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выражающуюся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи, приведенные в виде последовательностей SEQ ID NO:24-26, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению и описанное в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, приведенные в виде последовательностей SEQ ID NO:21-23, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению и описанное в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи, приведенные в виде последовательностей SEQ ID NO:24-26, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению и описанное в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи, выражающийся в аминокислотной последовательности, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19 и последовательностям SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20, соответственно, или их функциональной части, включающей области CDR легкой цепи и тяжелой цепи, выраженные в последовательностях SEQ ID NO:21-26.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, но особенно нуклеотидную последовательность, кодирующую моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 или моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:19-20. В частности, полипептидами, кодирующими последовательности SEQ ID NO:17-18 и SEQ ID NO:19-20, являются последовательности SEQ ID NO:27-28 и SEQ ID NO:29-30, соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 или моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:19-20. В частности предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:27-28 или SEQ ID NO:29-30. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое имеет отличительные свойства антитела, образуемого линией гибридомных клеток FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года с коллекционным номером DSM АСС2845.

В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, образуемые линией гибридомных клеток FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года с коллекционным номером DSM АСС2845.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает отличительными свойствами антитела, образуемого линией гибридомных клеток FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года с коллекционным номером DSM АСС2846.

В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, образуемые линией гибридомных клеток FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года с коллекционным номером DSM АСС2846.

В частности, настоящее изобретение также относится к эпитопу Aβ, который связывается с моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем содержание антитела повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Aβ22-35 и Aβ29-40, соответственно, модифицированного гидрофильной частью молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанная гидрофильная часть молекулы ковалентно связана с каждым концом через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, которые могут выступать в качестве молекулы-линкера. Настоящее изобретение также относится к Aβ эпитопу, который связывается с моноклональным антителом ACI-11-Ab-9. Настоящее изобретение также относится к Aβ эпитопу, который связывается с моноклональным антителом ACI-12-Ab-11. Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое способно понизить общее количество растворимого Aβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого Aβ в мозге.

Согласно другому объекту настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению способно разрушать бляшки, тем самым, снижая нагрузку бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, предпочтительно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого Aβ в мозге.

Согласно другому объекту настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению способно растворять бляшки, тем самым, снижая количество бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, предпочтительно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого Aβ в мозге.

Согласно другому объекту настоящего изобретения предусмотрены способы и композиции, включающие антитело по настоящему изобретению для предупреждения, и/или терапевтического лечения, и/или облегчения проявлений заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ми не ограничиваясь, амилоидоз - группу заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное нарушение (УКН), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна, например, пассивной иммунизацией субъекта, включая млекопитающего или человека, антителом по настоящему изобретению, описанным выше.

В одном из объектов настоящего изобретения моноклональным антителом в указанных способах является антитело ACI-24-Ab-3, обладающее полипептидными последовательностями SEQ ID NO:7-8 или их функциональной частью, описанной в настоящем изобретении.

В другом специфическом объекте настоящего изобретения моноклональным антителом в указанных способах является антитело ACI-11-Ab-9, обладающее полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 или антитело ACI-12-Ab-11, обладающее полипептидными последовательностями SEQ ID NO:9-10, соответственно, или их функциональной частью, описанной в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также относится к терапевтической композиции, включающей описанное в настоящем изобретении антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части в терапевтически эффективном количестве.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция также включает фармацевтически приемлемый носитель, особенно в терапевтически эффективном количестве.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, описанная в настоящем изобретении, для применения в лечении заболеваний и расстройств, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, опухоли и дегенерацию желтого пятна.

Согласно одному из объектов таких вариантов осуществления настоящего изобретения используют моноклональное антитело ACI-24-Ab-3, обладающее полипептидными последовательностями SEQ ID NO:7-8, или его функциональную часть, описанную в настоящем изобретении.

Согласно другому специфическому объекту таких вариантов осуществления настоящего изобретения используют моноклональное антитело, выбранное из моноклонального антитела ACI-11-Ab-9, обладающего полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18, и моноклонального антитела ACI-12-Ab-11, обладающего полипептидными последовательностями SEQ ID NO:19-20 или их функциональной частью, описанной в настоящем изобретении.

Антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, может быть введено в комбинации с другими биологически действующими веществами или другими методами лечения заболеваний. Другие биологически действующие вещества могут составлять часть той же композиции, уже включающей антитело по настоящему изобретению, в форме смеси, в которой антитело и другое биологически действующее вещество перемешивают в том же или с тем же фармацевтически приемлемым растворителем и/или носителем, или антитело и другое биологически действующее вещество могут быть предусмотрены отдельно в качестве отдельной композиции, которая может быть предоставлена отдельно или вместе в форме набора частей.

Антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, может быть введено субъекту, нуждающемуся в этом, одновременно с другим или другими биологически действующими веществами или с перерывами или последовательно. Например, моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, может быть введено одновременно с первым дополнительным биологически действующим веществом или последовательно после или до введения антитела. Если выбрана схема, по которой вводят одно биологически действующее вещество вместе с по меньшей мере одним антителом по настоящему изобретению, соединения или вещества могут частично вводиться одновременно, частично последовательно в разных комбинациях.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции, включающей антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве, а также биологически действующее вещество или соединение, особенно соединение, применяемое в лечении заболеваний и расстройств, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна, и/или фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция по настоящему изобретению, включающая антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и дополнительно включающая по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей соединения против окислительного стресса, противоапоптические соединения, хелаторы металлов, ингибиторы репарации ДНК, например, пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновую кислоту, 1,3-пропандисульфонат, активаторы секретазы, ингибиторы β- и γ-секретазы, тау белки, нейротрансмиттеры, разрушители β-слоев, противовоспалительные молекулы или ингибиторы холинэстеразы, например, такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин и другие лекарственные средства, и пищевые добавки, и необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция по настоящему изобретению, включающая антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и дополнительно включающая по меньшей мере одно соединение, а именно ингибитор холинэстеразы (ChEIs).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, включающая антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и дополнительно включающая по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из такрина, ривастигмина, донепезила, галантамина, ниацина и мемантина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены композиции, включающие описанное в нем антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, также включающие по меньшей мере одно «атипичное антипсихотическое средство», например, клозапин, ципразидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин для лечения положительных и отрицательных психотических симптомов, включая галлюцинации, мании, нарушения мышления (проявляемые в выраженной бессвязности, отходе от реальности, поверхностности восприятия) и эксцентричное неорганизованное поведение, а также эмоциональную анестезию, однородную эмоциональную реакцию, апатию и асоциальное поведение, а также необязательно дополнительно включающие фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

К другим соединениям, которые могут быть применимы в композициях и комбинациях с антителом по настоящему изобретению, включающих антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, относятся, например, описанные в патентной заявке WO 2004/058258 (см. особенно cc.16 и 17) терапевтические лекарственные мишени (cc.36-39), алкансульфоновые кислоты и алкансерные кислоты (cc.39-51), ингибиторы холинэстеразы (cc.51-56), антагонисты рецептора NMDA (cc.56-58), эстрогены (cc.58-59), нестероидные противовоспалительные средства (cc.60-61), антиоксиданты (сс.61-62), агонисты рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом, (peroxisome proliferators-activated receptor - PPAR) (cc.63-67), холестерин-понижающие агенты (сс.68-75), ингибиторы амилоида (сс.75-77), ингибиторы формирования амилоида (сс.77-78), хелаторы металлов (сс.78-79), антипсихотические средства и антидепрессанты (сс.80-82), пищевые добавки (сс.83-89) и соединения, повышающие доступность биологически действующих веществ в мозге (см. сс.89-93), а также пролекарства (сс.93 и 94), причем указанная патентная заявка включена в настоящее изобретение в виде ссылки.

В частности, композиция по настоящему изобретению включает моноклональное антитело и/или биологически действующее вещество, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения антитела, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, который включает повышение содержания в организме соответствующего хозяина антитела против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида или его фрагмента, особенно β-амилоидного пептида Aβ1-15, модифицированного гидрофобными частями молекулы, особенно пальмитиновой кислотой, или в другом варианте β-амилоидного пептида Aβ22-35 и Aβ29-40, соответственно, модифицированного гидрофильными частями молекулы, особенно полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанная гидрофобная или гидрофильная часть молекулы ковалентно связана с каждым концом по меньшей мере через одну, особенно одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, которые могут выступать в качестве молекулы-линкера, и выделение антитела.

При использовании гидрофильной части молекулы, например, ПЭГ, выбранный фрагмент β-амилоидного пептида может быть фрагментом, соответствующим аминокислотной последовательности Аβ22-35 и Аβ29-40, соответственно, и свободный от ПЭГ конец может быть ковалентно связан с фосфатидилэтаноламином или каким-либо другим соединением, способным функционировать в качестве заякоривающего элемента, например, для погружения антигенной конструкции в двойной слой липосомы.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и/или к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, или к смеси по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения или облегчения симптомов заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но, не ограничиваясь ими, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции или смеси по настоящему изобретению, используя антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, для применения в лечении или облегчении заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но, не ограничиваясь ими, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения лекарственного средства с применением антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и/или к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, или к смеси по настоящему изобретению для предупреждения, лечения или облегчения симптомов заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но, не ограничиваясь ими, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, особенно с применением антитела по настоящему изобретению, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем способ включает переработку указанного антитела в фармацевтически приемлемую форму, особенно таким образом, что антитело включено в композицию в терапевтически эффективном количестве.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает способ понижения нагрузки бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции, или смеси по настоящему изобретению, описанных выше.

Один из объектов настоящего изобретения относится к моноклональному антителу ACI-24-Ab-3, используемому в указанных способах, имеющему полипептидные последовательности SEQ ID NO:7-8 или его функциональную часть, описанную в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2844.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения в способах используют моноклональное антитело, выбранное из группы антител, включающей антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 и ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:19-20 или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2846.

В частности, нагрузку бляшек снижают по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 30%.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ снижения количества бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению согласно описанию, приведенному выше.

Один из объектов настоящего изобретения относится к моноклональному антителу ACI-24-Ab-3, используемому в указанных способах, имеющему полипептидные последовательности SEQ ID NO:7-8, или его функциональной части, описанным в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2844.

В другом объекте настоящего изобретения в способах используют моноклональное антитело, выбранное из группы антител, включающей антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 и антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:19-20 или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2846.

В частности, количество бляшек в мозге снижается по меньшей мере на 10%, особенно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно по меньшей мере на 15%.

В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ снижения общего количества растворимого Aβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, предпочтительно человека с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого Aβ в мозге, включая введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению, описанных в настоящем изобретении.

Один из объектов настоящего изобретения относится к моноклональному антителу ACI-24-Ab-3, используемому в указанных способах, имеющему полипептидные последовательности SEQ ID NO:7-8, или его функциональной части, описанным в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2844.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения в способах используют моноклональное антитело, выбранное из группы антител, включающей антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:17-18 и ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO:19-20 или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2846.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает способ предупреждения, лечения или облегчения симптомов заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна, у животных, млекопитающих или человека с таким заболеванием, путем введения терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицию, или смесь по настоящему изобретению, описанные выше, субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает способ сохранения или повышения когнитивного объема памяти у млекопитающих со связанными с амилоидом заболеванием или состоянием, включающий введение животному, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функциональное антитело или его функциональные части, или композиции, или смеси по настоящему изобретению, согласно приведенному выше описанию.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к линии гибридомных клеток, отличающихся тем, что они вырабатывают моноклональное антитело по настоящему изобретению, описанному выше.

В частности, настоящее изобретение относится к линии гибридомных клеток, отличающихся тем, что они вырабатывают моноклональное антитело, свойства которого свойственны антителу, образуемому гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM АСС2844.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена линия гибридомных клеток EJ1A9, депонированная 25 мая 2007 года и получившая коллекционный номер DSM АСС2844.

В частности, настоящее изобретение относится к линии гибридомных клеток, отличающихся тем, что они вырабатывают моноклональное антитело, свойства которого свойственны антителу, образуемому гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года и получившей коллекционный номер DSM ACC2846.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена линия гибридомных клеток FG1F9E4, депонированная 25 мая 2007 года и получившая коллекционный номер DSM АСС2845.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена линия гибридомных клеток FK2A6A6, депонированная 25 мая 2007 года и получившая коллекционный номер DSM ACC2846.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение иммуноспецифического связывания антитела, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо эквивалентное антитело или его функциональные части, в эпитопе амилоидного белка в образце или in situ, который включает стадии:

(а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с моноклональным антителом по настоящему изобретению, причем антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,

(б) предоставления возможности для антитела связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса,

(в) выявления формирования иммунологического комплекса, особенно таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка, и

(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела субъекта.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция по стадии (а) включает комбинацию антител для лечения указанного субъекта.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани субъекта, нуждающегося в этом, включающий:

(а) получение образца, представляющего ткань исследуемого субъекта,

(б) исследование в указанном образце наличия амилоидных бляшек с помощью антитела по настоящему изобретению, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части,

(в) определение количества антитела, связанного с антигеном, особенно таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидных бляшек, и

(г) расчет нагрузки бляшек в ткани субъекта. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ диагностики предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию у субъекта, включающий определение специфического связывания описанного в настоящем описании антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, включающий следующие стадии:

(а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с моноклональным антителом, причем указанное антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,

(б) предоставления возможности для антитела связать амилоидный белок в образце для формирования иммунологического комплекса,

(в) выявления формирования иммунологического комплекса,

(г) выявления корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела субъекта, и

(д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной,

причем повышение количества указанного комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что у указанного субъекта велика вероятность развития заболевания или состояния, связанного с амилоидом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ мониторинга минимального остаточного заболевания у субъекта после лечения антителом или композицией по настоящему изобретению, причем указанный способ включает:

(а) приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом по настоящему изобретению, особенно моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части, причем антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,

(б) предоставление возможности для антитела связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса,

(в) выявление формирования иммунологического комплекса,

(г) выявление корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, и

(д) сравнение количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной,

причем повышение количества указанного комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что у указанного субъекта все еще сохранилось минимальное остаточное заболевание.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция на стадии (а) включает комбинацию антител для лечения указанного субъекта.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ прогнозирования восприимчивости субъекта, подвергаемого лечению антителом или композицией по настоящему изобретению, включающий:

(а) приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом по настоящему изобретению, особенно моноклональным антителом, включая какое-либо эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,

(б) предоставление возможности для антитела связать амилоидный антиген для формирования иммунологического комплекса,

(в) выявление формирования иммунологического комплекса,

(г) выявление корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, и

(д) сравнение количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения,

причем снижение количества указанного иммунологического комплекса показывает, что у указанного субъекта велика вероятность проявления восприимчивости к лечению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция на стадии (а) включает комбинацию антител для лечения указанного субъекта.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к диагностическому набору для выявления и диагностики ассоциированных с амилоидом заболеваний и состояний у субъекта, нуждающегося в этом, включающий антитело по настоящему изобретению и, согласно описанию в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально равноценное антитело или его функциональные части и инструкции для применения антитела для связывания амилоидного белка с формированием иммунологического комплекса и выявления формирования иммунологического комплекса таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

Эти и другие объекты, свойства и преимущества настоящего изобретения станут яснее после рассмотрения приводимого ниже подробного описания варианта осуществления настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание фигур и последовательностей

Фиг.1 показывает результаты картирования эпитопа моноклонального антитела мыши ACI-24-Ab-3, полученные методом ELISA, используя пептидную библиотеку перекрывающихся пептидов, покрывающих всю аминокислотную последовательность Aβ 1-42. Связывание с целой последовательностью Аβ 1-42 используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды длиной 8-10 аминокислот (аа). Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Aβ 1-42, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).

Фиг.2 показывает результаты картирования эпитопа моноклонального антитела мыши ACI-24-Ab-3, полученные методом ELISA, используя удлиненные пептиды, покрывающие Аβ 1-28, 17-40, 1-40, 1-42А (фирма Anaspec) или 1-42В (фирма Bachem). Результаты выражены в виде ОП после вычитания фоновых значений. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.3 представляет ACI-24-Ab-3-опосредованное подавление агрегирования Aβ1-42 в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.4 представляет ACI-24-Ab-3-опосредованное дезагрегирование предварительно агрегированных Aβ1-42 в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.5 представляет связывание антитела ACI-24-Ab-3 с препаратами, обогащенными высокомолекулярным протофибриллярным олигомером, и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Aβ 1-42.

Фиг.6 представляет связывание контрольного антитела 6Е10 с препаратами, обогащенными высокомолекулярным протофибриллярным олигомером, и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Aβ 1-42.

Фиг.7 представляет связывание антитела ACI-24-Ab-3 (А) и контрольного антитела 6Е10 (Б) с мономерами и олигомерами пептида Aβ 1-42. Результаты выражены в виде средней величины (±SEM) оптической плотности (ОП) в трех независимых экспериментах.

Фиг.8 представляет результаты исследования картирования эпитопа моноклонального антитела мыши ACI-11-Ab-9, полученные методом ELISA, используя пептидную библиотеку перекрывающихся пептидов, покрывающих всю аминокислотную последовательность Aβ 1-42. Связывание с целой последовательностью Aβ 1-42 используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды длиной 8-10 аминокислот (аа). Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Aβ 1-42, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).

Фиг.9 представляет результаты исследования картирования эпитопа моноклонального антитела мыши ACI-11-Ab-9, полученные методом ELISA, используя удлиненные пептиды, покрывающие Aβ 1-28, 17-40, 1-40, 1-42А (фирма Anaspec) или 1-42В (фирма Bachem) Результаты выражены в виде ОП после вычитания фоновых значений. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.10 представляет результаты исследования картирования эпитопа моноклонального антитела мыши ACI-12-Ab-11, полученные методом ELISA, используя пептидную библиотеку перекрывающихся пептидов, покрывающих всю аминокислотную последовательность Aβ 1-42. Связывание с целой последовательностью Aβ 1-42 используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды длиной 8-10 аминокислот (аа). Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Aβ 1-42, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).

Фиг.11 представляет результаты исследования картирования эпитопа моноклонального антитела мыши ACI-11-Ab-9, полученные методом ELISA, используя удлиненные пептиды, покрывающие Аβ 1-28, 17-40, 1-40, 1-42А (фирма Anaspec) или 1-42В (фирма Bachem). Результаты выражены в виде ОП после вычитания фоновых значений. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.12 представляет ACI-11-Ab-9-опосредованное подавление агрегирования Aβ1-42 в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.13 представляет ACI-11-Ab-9-опосредованное дезагрегирование ранее агрегированного Aβ1-42 в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку трех независимых экспериментов.

Фиг.14 представляет ACI-12-Ab-11-опосредованное подавление агрегирования Aβ1-42 в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.15 представляет ACI-12-Ab-11-опосредованное дезагрегирование ранее агрегированного Aβ1-42 в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42. Результаты показывают среднее значение ±1 стандартную ошибку двух независимых экспериментов.

Фиг.16 представляет связывание антитела ACI-12-Ab-11 (А) и контрольного антитела 6Е10 (Б) с мономерами и олигомерами пептида Aβ1-42. Результаты выражают в виде средних величин оптической плотности (ОП) (±SEM) в трех независимых экспериментах.

Фиг.17 схематически показывает стадии исследования ELISA, которые могут применяться для анализа связывания rhApoE4 с Aβ42-биотином.

Фиг.18 представляет результаты, полученные от применения метода анализа ELISA для связывания rhApoE4 с Aβ42-биотином. Для оптимизации концентраций rhApoE4 и Aβ42-биотина исследуют разведения rhApoE4 при постоянной концентрации Aβ42-биотина.

Фиг.19 представляет воздействие избытка Aβ42-биотина на связывание Aβ42-биотина, объединенного с rhApoE4 в описанном исследовании ELISA.

Фиг.20 представляет определение образца оптимальной концентрации Aβ42-биотина для описанного анализа ELISA.

Таблица 1.1. Антитела и антигенные конструкции, применяемые для получения определенных антител, описанных в настоящем изобретении.

Таблица 1.2. Связывание пептидов Aβ с ACI-24-Ab-3. Результаты выражены в виде ОП после вычитания фоновых значений.

Таблица 1.3. Связывание ACI-24-Ab-3 с 33 перекрывающимися пептидами Aβ 1-42 по данным анализа методом ELISA. Связывание со всей последовательностью Aβ 1-42 используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды состоят из 8-10 аминокислот в длину. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Aβ 1-42, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).

Таблица 1.4. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) с препаратами, обогащенными высокомолекулярным протофибриллярным олигомером, и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида пептида Aβ 1-42.

Таблица 1.5. Связывание контрольного антитела 6Е10 с препаратами, обогащенными высокомолекулярным протофибриллярным олигомером, и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Aβ 1-42.

Таблица 1.6. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) с мономерами и олигомерами пептида Aβ 1-42. Результаты выражены в виде значений ОП.

Таблица 1.7. Связывание контрольного антитела 6Е10 с мономерами и олигомерами пептида Aβ 1-42. Результаты выражены в виде значений ОП.

Таблица 2.1. Антитела и антигенные конструкции, используемые для создания определенных антител, описанных в настоящем изобретении.

Таблица 2.2. Связывание пептидов Aβ с ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11. Результаты выражены в виде величин оптической плотности (ОП) после вычитания фоновых значений.

Таблица 2.3. Связывание ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с 33 перекрывающимися пептидами Aβ 1-42 по данным анализа методом ELISA. Связывание со всей последовательностью Aβ 1-42 используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды состоят из 8-10 аминокислот в длину. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Aβ 1-42, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).

Таблица 2.4. Связывание антитела ACI-12-Ab-11 (клон FK2A6A6) с мономерами и олигомерами пептида Aβ1-42. Результаты выражены в виде величин оптической плотности (ОП).

Таблица 2.5. Связывание контрольного антитела 6Е10 с мономерами и олигомерами пептида Aβ1-42. Результаты выражены в виде величин оптической плотности (ОП).

SEQ ID NO:1. Антигенный пептид Аβ22-35.

SEQ ID NO:2. Антигенный пептид Аβ29-40.

SEQ ID NO:3. Фрагмент Аβ пептида Аβ1-28.

SEQ ID NO:4. Фрагмент Аβ пептида Аβ17-40.

SEQ ID NO:5. Фрагмент Аβ пептида Аβ1-40.

SEQ ID NO 6: Фрагмент Аβ1-42 Аβ пептида.

SEQ ID NO:7. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-24-Ab-3.

SEQ ID NO:8. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи ACI-24-Ab-3.

SEQ ID NO:9. Аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи.

SEQ ID NO:10. Аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи.

SEQ ID NO:11. Аминокислотная последовательность CDR3 легкой цепи.

SEQ ID NO:12. Аминокислотная последовательность CDR1 тяжелой цепи.

SEQ ID NO:13. Аминокислотная последовательность CDR2 тяжелой цепи.

SEQ ID NO:14. Аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи.

SEQ ID NO:15. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-24-Ab-3.

SEQ ID NO:16. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи ACI-24-Ab-3.

SEQ ID NO:17. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-11-Ab-9.

SEQ ID NO:18. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи ACI-11-Ab-9

SEQ ID NO:19. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-12-Ab-11.

SEQ ID NO:20. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи ACI-12-Ab-11.

SEQ ID NO:21. Аминокислотная последовательность области CDR1 легкой цепи.

SEQ ID NO:22. Аминокислотная последовательность области CDR2 легкой цепи.

SEQ ID NO:23. Аминокислотная последовательность области CDR3 легкой цепи.

SEQ ID NO:24. Аминокислотная последовательность области CDR1 тяжелой цепи.

SEQ ID NO:25. Аминокислотная последовательность области CDR2 тяжелой цепи.

SEQ ID NO:26. Аминокислотная последовательность области CDR3 тяжелой цепи.

SEQ ID NO:27. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-11-Ab-9.

SEQ ID NO:28. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи ACI-11-Ab-9.

SEQ ID NO:29. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-12-Ab-11.

SEQ ID NO:30. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-12-Ab-11.

Подробное описание настоящего изобретения

Определения

Понятия «полипептид», «пептид» и «белок» в контексте настоящего изобретения взаимозаменяемы и означают биомолекулу, состоящую из аминокислот, связанных пептидными связями.

В контексте настоящего изобретения существительные в единственном числе могут означать «один или несколько» или подразумевать множественное число, если это не противоречит контексту.

Понятия «обнаружение» и «обнаруженный», применяемые в контексте настоящего изобретения, означают применение известных методик для выявления биологических молекул, например, иммунохимических или гистологических методик, и относятся к качественному или количественному определению наличия или концентрации исследуемой биомолекулы.

Понятия «амилоид β, Aβ или β-амилоид» представляют известный в данной области термин и относятся к белкам и пептидам амилоида β, белку-предшественнику амилоида β (АРР), а также к модификациям, фрагментам и каким-либо их функциональным эквивалентам. В частности амилоид β в контексте настоящего изобретения означает какой-либо фрагмент, получаемый в результате протеолитического расщепления АРР, но особенно те фрагменты, которые вовлечены или связаны с амилоидными патологиями, включая, но ими не ограничиваясь, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-411-42 и Aβ1-43.

Структуры и последовательности амилоидных β пептидов, указанных выше, известны специалистам в данной области, а способы получения указанных пептидов или их экстракции из мозга и других тканей описаны, например, в работе Glenner, Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 1984, cc.885-890. Кроме того, амилоидные Р пептиды в различных формах также коммерчески доступны.

Понятия «Aβ фибриллы», или «Aβ филаменты», или «амилоидные фибриллы», или «протофибриллы» означают полимерные формы мономерного белка, сформированные отдельными или собранными в пучок волокнами с постоянным диаметром волокон, которые нерастворимы в водной среде и содержат большие количества поперечно связанной Р структуры в сердцевине, главным образом с бета-цепями, перпендикулярными оси фибрилл.

Понятие «мономерный Aβ» или «Aβ мономер» означает полностью растворимый амилоидный β белок без агрегированных комплексов в водной среде.

Понятие «протофибриллы» или «протофибриллярный препарат» в контексте настоящего изобретения означает фракции полимерных Aβ амилоидных пептидов повышенной молекулярной массы, обогащенные растворимыми олигомерами амилоида Aβ.

Понятия «полимерный растворимый амилоид», «олигомерные амилоидные пептиды» и «Aβ олигомер» в контексте настоящего изобретения употребляются взаимозаменяемо и относятся к составным агрегированным мономерам амилоидных пептидов, или амилоид-подобных пептидов, или модифицированных или усеченных амилоидных пептидов или модифицированных или усеченных амилоидных пептидов, или других производных амилоидных пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы и in vitro в водной среде, и in vivo в организме млекопитающего или человека, особенно в мозге, но особенно к составным агрегированным мономерам амилоидных пептидов или модифицированным или усеченным амилоидным пептидам или их производным, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, особенно предпочтительно в мозге.

Понятия «полимерные растворимые амилоидные Aβ пептиды», «олигомерные амилоидные Aβ пептиды» и «Aβ олигомер» в контексте настоящего изобретения употребляются взаимозаменяемо и относятся к составным агрегированным мономерам амилоидных Aβ пептидов, или амилоид-подобных пептидов, или модифицированных или усеченных амилоидных пептидов или модифицированных или усеченных амилоидных Aβ пептидов, или других производных амилоидных Aβ пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы и in vitro в водной среде, и in vivo в организме млекопитающего или человека, особенно в мозге, но особенно к составным агрегированным мономерам амилоида β (Aβ) или модифицированным или усеченным амилоидным β (Aβ) пептидам или их производным, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, особенно предпочтительно в мозге.

Что касается моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, то оно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и проявляет промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42, и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40; понятие «существенно слабее связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 80%, особенно по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% меньше по сравнению со связыванием с Aβ мономерным пептидом 1-40.

Что касается моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, то оно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-42 и полимерными растворимыми Aβ пептидами, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов и фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40; понятие «существенно слабее связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 60%, особенно по меньшей мере примерно на 65%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, но особенно по меньшей мере примерно на 90% и до 100% меньше, чем связывание с Aβ мономерным пептидом 1-42.

Что касается моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, то оно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и промежуточно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-42, и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40; понятие «промежуточно связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 60%, особенно по меньшей мере примерно на 65%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% меньше, чем связывание с Aβ мономерным пептидом 1-40.

Что касается моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, то оно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Aβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ1-42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Aβ мономерным пептидом 1-28 и промежуточно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-42, и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40; понятие «практически не связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 95%, особенно по меньшей мере примерно на 98%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% меньше, чем связывание с Aβ мономерным пептидом 1-40.

Что касается моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, то оно связывается с Aβ мономерным пептидом 1-42 и полимерными растворимыми Aβ пептидами, включая

множество Aβ1-42 мономерных пептидов и Aβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с

Aβ мономерным пептидом 1-28 и практически не связывается с Aβ мономерным пептидом 17-40; понятие «практически не связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 85%, особенно по меньшей мере примерно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 98%, но особенно по меньшей мере примерно на 99% и до 100% меньше, чем связывание с Aβ мономерным пептидом 1-42.

Связывание антитела по настоящему изобретению, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, с Aβ мономерными пептидами определяют методом типа ELISA, особенно методом ELISA, используя биотинилированные Aβ мономерные пептиды, но особенно методом ELISA, описанным ниже в примерах 1.16 и 2.16.

Понятие «выделенный» означает биологическую молекулу, освобожденную от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми она в естественных условиях находится.

Понятие «заболевания и расстройства, которые вызываются или которые связаны с амилоидными или амилоидоподобными белками» относится, но ими не ограничивается, к заболеваниям и расстройствам, вызванным наличием или действием амилоидоподобных белков в мономерной, фибрильной или полимерной форме, или какой-либо комбинации всех трех форм. К таким заболеваниям и расстройствам относятся, но ими не ограничиваются, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерация желтого пятна.

Понятие «амилоидоз» относится к группе заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая, но ими не ограничиваясь, вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное нарушение (УКН), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, а также заболевания глаз, включая дегенерацию желтого пятна, зрительную невропатию, связанную со старческими бляшками, и катаракту, вызванную отложением бета-амилоида.

Понятия «антитело» или «антитела» в контексте настоящего изобретения являются известными в данной области терминами и означают молекулы или действующие фрагменты молекул, которые связываются с известными антигенами, особенно молекулы иммуноглобулина, и иммунологически действующие части молекул иммуноглобулина, т.е. молекул, которые содержат сайт связывания, который специфически связывает антиген. Иммуноглобулин по настоящему изобретению может принадлежать к какому-либо типу (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY), или классу (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), или подклассу молекул иммуноглобулинов.

В контексте настоящего изобретения понятие «антитела» в рамках охвата настоящего изобретения означает моноклональные антитела, поликлональные антитела, химерные, одноцепочечные, биспецифические или двойного действия, симинизированные, принадлежащие человеку и гуманизированные антитела, а также их действующие фрагменты. К примерам действующих фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, относятся разделенные легкие и тяжелые цепи, фрагменты Fab, Fab/c, Fv, Fab' и F(ab')2, включая продукты библиотеки экспрессии Fab иммуноглобулинов и эпитоп-связывающие фрагменты какого-либо антитела и фрагментов, указанных выше.

Такие действующие фрагменты могут быть получены от антитела по настоящему изобретению с помощью ряда методов. Например, моноклональные антитела могут быть расщеплены ферментом, например, пепсином, и подвержены гель-фильтрации HPLC. Соответствующая фракция, содержащая фрагменты Fab, затем может быть собрана и сконцентрирована мембранной фильтрацией или другим методом. Дополнительное описание основных методов по выделению действующих фрагментов антитела см., например, работы Khaw В. А. и др. J. Nucl. Med. 23, 1982, cc.1011-1019, Rousseaux и др. Methods Enzymology, изд-во Academic Press, 121, 1986, cc.663-669.

Понятие «гуманизированное антитело» относится к типу сконструированного антитела, обладающего областями CDR, производными от иммуноглобулина-донора, не являющегося иммуноглобулином человека, а оставшиеся части молекулы иммуноглобулина происходят от одного (или более) иммуноглобулинов человека. Кроме того, поддерживающие остатки каркасного участка могут быть изменены для сохранения связывающего сродства. Способы получения «гуманизированных антител» известны в данной области (см., например, Queen и др., Proc. Natl Acad Sci USA, 86, 1989, cc.10029-10032, Hodgson и др., Bio/Technology, 9, 1991, с.421).

«Гуманизированное антитело» может также быть получено с помощью нового генноинженерного подхода, который позволяет получать поликлональные антитела типа антител человека со сформировавшимся сродством у многих животных, например, у кроликов (см., например, US 7129084).

Понятие «моноклональное антитело» также известно в данной области и относится к антителу, которое в большом количестве получают в лаборатории из одного клона и которое распознает только один антиген. Моноклональное антитела обычно получают путем гибридизации нормально короткоживущих антитело-продуцирующих В-клеток с быстрорастущими клетками, например, раковыми клетками (иногда называемыми «бессмертными» клетками). Образуемые гибридные клетки, или гибридомы, быстро размножаются, создавая клон, который вырабатывает антитело. Для цели настоящего изобретения понятие «моноклональное антитело» также подразумевает антитела, которые вырабатываются материнским клоном, который еще не достигает полной моноклональности.

Понятие «CDR» относится к гипервариабельной области антитела. Понятие «гипервариабельной области» (hypervariable region - HVR или HV), используемое в настоящем изобретении, относится к областям вариабельного домена антитела, которые гипервариабельны по последовательности и/или формируют структурно выраженные петли. Обычно антитела включают шесть гипервариабельных областей, три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Ряд очерченных гипервариабельных областей используют, и они включены в настоящее изобретение. Комплементарно детерминируемые области по Kabat основаны на вариабельности последовательности и являются наиболее применимыми (см. кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», изд-во Министерства здравоохранения и социального обеспечения США, Национальный институт здоровья, 1991, 5-е изд., Bethesda, MD).

Аббревиатуры «НС» и «LC», предшествующие понятию «CDR», относятся, соответственно, к CDR тяжелой цепи и легкой цепи. Напротив, обозначение по Chothia относится к расположению структурных петель (Chothia, Lesk J. Mol. Biol.196, 1987, cc.901-917). Гипервариабельные области AbM представляют компромиссный вариант между областями CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia, и их используют в программном моделировании антитела Oxford Molecular's AbM. «Контактные» гипервариабельные области основаны на анализе доступных сложных кристаллических структур. Остатки каждой из таких гипервариабельных областей приводятся ниже.

Петля Kabat AbM Chothia Контакт
L1 L24--L34 L24--L34 L26--L32 L30--L36
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L52 L46--L55
L3 L89--L97 L89--L97 L91--L96 L89--L96
H1 Н31--Н35В Н26--Н35В Н26--Н32 Н30--Н35В
Нумерация по Kabat
H1 Н31--Н35 Н26--Н35 Н26--Н32 Н30--Н35
Нумерация по Chothia
Н2 Н50--Н65 Н50--Н58 Н52--Н56 Н47--Н58
Н3 Н95--Н102 Н95--Н102 Н95--Н102 Н93--Н101

Гипервариабельные области могут включать следующие «протяженные гипервариабельные области»: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельного домена пронумерованы по Kabat и др., см. выше, для каждого из этих определений.

Понятие «остаток вариабельного домена, пронумерованный по системе Kabat», или «аминокислотное положение по нумерации Kabat», и их варианты, относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи по компиляции антител (см. кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», изд-во Министерства здравоохранения и социального обеспечения США, Национальный институт здоровья, 1991, 5-е изд., Bethesda, MD).

Используя указанную систему нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может включать меньше или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или инсерции в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать инсерт из одной аминокислоты (остаток 52а по нумерации Kabat) после остатка 52 в Н2 и инсертированные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с, и др. по нумерации Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания по областям гомологии последовательности антитела со «стандартной» нумерованной последовательностью по Kabat.

Понятие «функционально эквивалентное антитело» в рамках охвата настоящего изобретения относится к антителу, которое существенным образом разделяет по меньшей мере одно важное функциональное свойство с указанным выше антителом, и в контексте настоящего изобретения включает: связывающую специфичность в отношении β-амилоидного белка, особенно Aβ1-42 белка, и более конкретно в отношении области эпитопа 4-16 белка Aβ1-42, иммунореактивность in vitro, подавление агрегирования мономеров Aβ1-42 в высокомолекулярные полимерные фибриллы и/или дезагрегирования заранее сформированных полимерных фибрилл Aβ1-42, и/или свойство разрушения β-слоя и облегчения проявлений заболеваний и расстройств, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна, при профилактическом или терапевтическом введении. Антитела могут относиться к какому-либо классу, например, IgG, IgM, or IgA и др. или какому-либо подклассу, например, IgG1, IgG2a и др., и другим подклассам, описанным в настоящем изобретении или известным в данной области, но особенно к классу IgG4. Кроме того, антитела могут быть получены каким-либо способом, например, фаговым дисплеем, или могут быть получены в каком-либо организме или линии клеток, включая бактерий, насекомых, млекопитающих, или клеток или линии клеток другого типа, которые вырабатывают антитела с определенными свойствами, например, гуманизированные антитела. Антитела могут также быть получены комбинированием части Fab и области Fc от разных видов.

Понятие «биспецифическое» или «бифункциональное» и «биэффективное» используют взаимозаменяемо в рамках охвата настоящего изобретения для описания антитела, которое проявляет и способность подавлять формирование амилоидных или амидлоидоподобных волокон, а также способность дезагрегировать амилоидные или амилоидоподобные волокна.

Понятие «антиген» относится к целому соединению или к его фрагменту, способному вызвать в организме иммунный ответ, особенно у животного, более предпочтительно у млекопитающего, включая человека. Понятие «антиген» включает иммуногены и их области, ответственные за антигенность или антигенные детерминанты.

В контексте настоящего изобретения понятие «растворимый» означает частичную или полную растворимость в водном растворе.

Также в контексте настоящего изобретения понятие «иммуногенный» относится к веществам, которые вызывают или повышают выработку антител, Т-клеткам или другим реактивным иммунным клеткам, направленным против иммуногенного агента и участвующим в иммунном ответе у людей или животных.

Иммунный ответ происходит, когда индивидуум производит достаточное количество антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток против введенных иммуногенных композиций настоящего изобретения для ослабления или облегчения расстройства, подвергаемого лечению.

Понятие «полимерным растворимый амилоид» относится к многократно агрегированным мономерам амилоидных пептидов, или амилоидоподобным пептидам, или модифицированным или усеченным амилоидным пептидам, или другим производным амилоидных пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы в организме млекопитающего, в частности человека, более предпочтительно в мозге, но особенно к многократно агрегированным мономерам амилоида β (Aβ) или модифицированным или усеченным амилоид β (Aβ) пептидам или его производным, которые растворимы в организме млекопитающего, в частности человека, более предпочтительно в мозге.

Понятие «гибридома» применяется в данной области и известно всем специалистам. Оно означает клетки, полученные гибридизацией вырабатывающей антитело клетки и бессмертной клетки, например, разных клеток миелом. Такая гибридная клетка способна постоянно вырабатывать антитело. См. выше определение понятия «моноклональное антитело» и примеры, приведенные ниже, для более подробного описания метода гибридизации, известного в данной области.

Понятие «носитель» в контексте настоящего изобретения означает структуру, в которую антигенный пептид или надмолекулярная конструкция могут быть включены или с которой могут быть ассоциированы, тем самым презентируя или экспонируя антигенные пептиды или часть пептида иммунной системе человека или животного. Какая-либо частица, которая может быть должным образом использована для лечения животного или человека, например, таким образом, что пузырек, частица или макрочастица могут применяться в качестве носителя в контексте настоящего изобретения. Это понятие также относится к способам доставки, причем композиции надмолекулярной антигенной конструкции, включающие антигенный пептид, могут быть транспортированы к соответствующим сайтам с помощью механизмов доставки. Одним из примеров такой системы доставки являются коллоидные металлы, например, коллоидное золото. Понятие «носитель» также включает механизмы доставки, известные специалистам в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, гемоцианин моллюска блюдечка, бычий сывороточный альбумин и другие адъюванты.

В надмолекулярной антигенной конструкции по настоящему изобретению липосома может выполнять двоякую функцию, заключающуюся в том, что она может использоваться в качестве носителя, включая надмолекулярную конструкцию, описанную в настоящем изобретении, и в то же время, в качестве адъюванта для повышения или стимулирования иммунного ответа у животного или человека, подвергаемого лечению терапевтической вакциной по настоящему изобретению. Также следует учитывать, что композиции надмолекулярных антигенных конструкций по настоящему изобретению могут также включать дополнительные адъюванты, например, липид А, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы полисахаридов и белков, но особенно детоксифицированный липид А, например, монофосфорильный или дифосфорильный липид А, или квасцы, дополнительные консерванты, растворители, эмульгаторы, стабилизаторы и другие компоненты, которые известны и используются в вакцинах в данной области. Кроме того, какая-либо адъювантная система, известная в данной области, может применяться в композиции по настоящему изобретению. К таким адъювантам относятся, но ими не ограничиваются, полный или неполный адъювант Фройнда, полидиспергированный β-(1,4) связанный ацетилированный маннан («ацеманнан»), продукт titermax® (адъюванты сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена фирмы CytRx Corporation), модифицированные липидные адъюванты фирмы Chiron Corporation, адъюванты производного сапонина фирмы Cambridge Biotech, убитая бактерия Bordetella pertussis, липополисахариды грамотрицательных бактерий, крупные полимерные анионы, например, декстран сульфат, и неорганические гели, например, квасцы, алюминий гидроксид или алюминий фосфат.

Носителями-белками, которые могут применяться в композициях надмолекулярной антигенной конструкции по настоящему изобретению, являются, но ими не ограничиваются, белок, связывающий мальтозу (БСМ), бычий сывороточный альбумин (БСА), гемоцианин моллюска блюдечка (keyhole lympet hemocyanin - KLH), овальбумин, флагеллин, тироглобулин, сывороточный альбумину каких-либо видов, гаммаглобулин каких-либо видов, изогенные клетки, изогенные клетки, несущие Ia антигены и полимеры D- и/или L-аминокислот.

Кроме того, понятие «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, которое при введении человеку или животному вызывает иммунный ответ, достаточный для получения терапевтического эффекта у указанного человека или животного. Эффективное количество легко определить специалисту в данной области с помощью рутинных процедур.

Понятие «гомология» применительно к двум последовательностям определяют по идентичности последовательностей. Если две последовательности, которые сравнивают друг с другом, отличаются по длине, их идентичность предпочтительно относятся к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которая идентична нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательности может быть определена условно с применением компьютерных программ, например, программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Программа Bestfit использует алгоритм локальной гомологии (Smith, Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, cc.482-489), чтобы найти сегмент, обладающий наивысшей идентичностью последовательностей при сравнении двух последовательностей. При использовании Bestfit или другой программы выравнивания последовательности для определения, имеет ли конкретная последовательность, например, 95 процентов идентичности с контрольной последовательностью по настоящему изобретению, параметры обычно выверяют таким образом, что процент идентичности подсчитывают по всей длине контрольной последовательности, и допускают гэпы гомологии до 5% от общего числа нуклеотидов в контрольной последовательности. При использовании Bestfit так называемые необязательные параметры предпочтительно остаются на их заранее установленных («по умолчанию») величинах. Отклонения, проявляемые при сравнении данной последовательности и описанных выше последовательностей по настоящему изобретению, могут быть вызваны, например, добавлением, делецией, замещением, инсерцией или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей предпочтительно также может быть выполнено по программе «fasta20u66» (версия 2.0u66, сентябрь 1998, William R. Pearson и Университет Вирджинии; см. также W.R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 1990, cc.63-98, приводимые ниже примеры и http://workbench.sdsc.edu/). Для этого могут быть использованы установочные параметры «по умолчанию».

Понятие «консервативное изменение» в контексте настоящего изобретения относится к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, вызывают минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или вызывают минимальные изменения антигенных детерминантов мутантных полипептидов, соответственно, при сравнении с нативным белком. В отношении антител и фрагментов антител по настоящему изобретению консервативное изменение означает аминокислотное замещение, в результате которого антитело не утрачивает способности связываться с рецептором субъекта. Специалист в данной области может предварительно определить, какие аминокислотные замещения могут быть произведены, чтобы сохранить высокую вероятность конформационной и антигенной нейтральности. Такое руководство разработано, например, Berzofsky, Science 229, 1985, cc.932-940, и Bowie и др., Science 247, 1990, cc.1306-1310. К факторам, которые рассматривают в качестве воздействующих на вероятное поддержание конформационного и антигенного нейтралитета, относятся, но ими не ограничиваются: (а) менее вероятно, чтобы замещения гидрофобных аминокислот влияли на антигенность, поскольку более вероятно, что гидрофобные остатки локализованы внутри белка, (б) с точки зрения физхимии замещения схожи, менее вероятно, чтобы изменилась конформация, поскольку замещенные аминокислоты имитируют исходные аминокислоты, (в) изменение эволюционно консервативных последовательностей вероятно неблагоприятно воздействует на конформацию, поскольку консервативность означает, что аминокислотные последовательности могут иметь важное функциональное значение. Специалист в данной области может оценить изменения в конформации белка с помощью известных методов, например, но ими перечень не ограничивается, методами фиксации микрокомплемента (см., например, Wasserman и др., J. Immunol. 87, 1961, cc.290-295, Levine и др., Meth. Enzymol. 11, 1967, cc.928-936), а также методами исследования связывания, используя конформационно-зависимые моноклональные антитела (см., например, Lewis и др., Biochem. 22, 1983, cc.948-954).

Понятие «гибридизировать» в контексте настоящего изобретения относится к обычным условиям гибридизации, предпочтительно к условиям гибридизации, при которых используют раствор 5×SSPE, 1% SDS, 1х раствор Денхардта и/или величины температуры гибридизации от 35°С до 70°С, предпочтительно 65°С. После гибридизации промывание предпочтительно проводят сначала раствором 2×SSC, 1% SDS, а затем 0,2×SSC при температуре от 35°С до 70°С, предпочтительно при 65°С (расшифровку SSPE, SSC и раствора Денхардта см. в статье Sambrook и др. в кн.: «Molecular Biology: A Laboratory Manual», 1989, изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк). Условия жесткой гибридизации, которые, например, описаны в статье Sambrook и др., приведенной выше, особенно предпочтительны. Особенно предпочтительными условиями жесткой гибридизации являются, например, условия гибридизации и промывки при 65°С, описанные выше. Условиями нежесткой гибридизации являются, например, условия гибридизации и промывки при 45°С, и менее предпочтительно при 35°С и даже при более низкой температуре.

Настоящее изобретение может быть понято легче по приводимому ниже подробному описанию конкретных вариантов его осуществления, включенных в настоящее описание. Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на определенные подробности его конкретных осуществлений, эти подробности не следует рассматривать в качестве ограничений вариантов осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение предусматривает антитела и его функциональные части, которые являются конформационно чувствительными антителами. Эти антитела распознают специфические эпитопы среди большого разнообразия амилоидных белковых антигенов. Антитела используют для диагностики и терапевтического воздействия в случае заболеваний и расстройств, которые вызываются или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, особенно при болезни Альцгеймера.

Антитела могут быть введены индивидуумам для их пассивной иммунизации против различных заболеваний и расстройств, которые вызываются или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, особенно против болезни Альцгеймера.

Антитела, предусмотренные в настоящем изобретении, являются моноклональными или поликлональными антителами, обладающими специфичностью связывания в отношении антигенных пептидов, участвующих в инициации, прогрессировании и/или ухудшении различных заболеваний и расстройств, которые вызываются или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, особенно при болезни Альцгеймера.

Антитела по настоящему изобретению получают путем иммунизации животного, например, мыши, крысы, кролика или животного какого-либо другого вида, которое может выработать нативные антитела или антитела человека, композицией надмолекулярной антигенной конструкции.

Надмолекулярные антигенные конструкции, описанные в настоящем изобретении, обычно включают пептиды, модифицированные для повышения антигенного эффекта, причем такие пептиды модифицированы путем пэгелирования (используя полиэтиленгликоль или модифицированный полиэтиленгликоль) или другими методами, например, применением пальмитиновой кислоты, полиаминокислот (например, полиглициновой, полигистидиновой), полисахаридов (например, полигалактуроновой кислоты, полимолочной кислоты, полигликолида, хитина, хитозана), синтетических полимеров (полиамидов, полиуретанов, полиэфиров) или сополимеров (например, сополимер полиметакриловой кислоты и N-(2-гидроксипропилметакриламида)) и др.

Модификация с применением пальмитиновой кислоты (пальмитилирование) для получения якоря у пептида в двойном слое липосомы из-за относительно уменьшенной длины части молекулы, представленной жирной кислотой С16:0, приводит к получению пептида, который практически лежит на поверхности липосомы. Следовательно, клеткам, процессирующим антиген, придется поглотить всю липосому с пептидом, которая в большинстве случаев, приводит к пониженному иммунному ответу, выраженному в относительных единицах.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный амилоидный Aβ22-35 пептид и Aβ29-40, пептид, соответственно, используют для получения антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный амилоидный Аβ1-15 пептид используют для получения антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению.

Модифицированный амилоидный Aβ1-15 пептид может быть синтезирован методами, описанными Nicolau и др., 2002. Подход, описанный Nicolau и др., включает модифицирование антигенного пептида путем перенесения на смолу липофильной или гидрофильной части молекулы, к концевым аминокислотным остаткам ранее сформированного пептида, в результате образуется продукт достаточно высокой степени чистоты. В частности, защищенную аминокислоту, особенно Fmoc-защищенную аминокислоту, присоединяют к смоле, используя известную комбинаторную химию. Защитную группу удаляют и второй замещенный аминокислотный остаток присоединяют. Стандартный автоматизированный пептидный синтез с известным применением химических защитных групп, особенно с применением Fmoc/tBu, и стандартных защищенных групп боковой цепи затем используют для синтеза Aβ антигенного пептида путем соединения аминокислот 22-25, 29-40 и 1-15, соответственно, амилоидного белка Aβ1-42 для получения пептидного фрагмента. На заключительной стадии две дополнительные защищенные аминокислоты присоединяют к растущему пептидному фрагменту. Группы Mtt затем могут быть избирательно разъединены и соединены с пальмитиновой кислотой. После промывки смолы защитную группу удаляют и смолу одновременно отсоединяют с последующим удалением защитных групп с боковой цепи по стандартным методикам. В результате конечный продукт может быть получен с высокой степенью чистоты, и его идентичность подтверждают известными в данной области методами, например, масс-спектрометрией электроспреем.

Липофильная и гидрофильная часть молекулы по настоящему изобретению может быть жирной кислотой, триглицеридом или фосфолипидом, причем углеродный каркас жирной кислоты содержит по меньшей мере 10 атомов углерода. В частности липофильной или гидрофобной частью молекулы является жирная кислота с углеродным каркасом, составляющим по меньшей мере примерно от 14 атомов углерода и примерно до 24 атомов углерода, причем каждое количество атомов углерода из указанного диапазона также относится к настоящему изобретению. Более конкретно, липофильная и гидрофильная часть молекулы по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 14 атомов углерода в углеродном каркасе. К примерам гидрофобной части молекулы относятся, но ими не ограничиваются, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, миристиновая кислота, лауриновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота и холестерин или DSPE. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липофильной или гидрофобной частью молекулы является пальмитиновая кислота.

Для повышения иммунного ответа может быть применен другой соответствующий якорь/спейсер для восстановления пептида в липосоме, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ).

ПЭГ ковалентно присоединен связью с аминокислотным остатком по обоим концам пептида, в частности по аминокислотным остаткам Glu, Cys или Lys или с каким-либо другим аминокислотным остатком, который может быть соответствующим образом использован для ковалентной связи ПЭГ с пептидом. По другому концу цепи гидрофобная часть молекулы может быть ковалентно связана для функционирования в качестве заякоривающего элемента в двойном слое липосомы, например, фосфатидилэтаноламином (ФЭА). Таким образом, липосома продолжает функционировать в качестве адъюванта, а пептид, довольно далеко удаленный от двойного слоя, может быть процессирован отдельно, и таким образом повышается его иммуногенность по сравнению с пальмотилированным антигеном.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения надмолекулярные антигенные конструкции, используемые в рамках охвата настоящего изобретения, включают пептидную последовательность, ковалентно присоединенную к пэгелированному лизину - по одному с каждого конца. Длина цепи ПЭГ (полиэтиленгликоля) может варьировать от n=8 до n=150000 или более, особенно от n=10 до n=80000, более предпочтительно от n=20 до n=10000. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения длина цепи ПЭГ не превышает n=45, особенно составляет от n=5 до n=40, более предпочтительно от n=10 и до n=30, и еще более предпочтительно n=10.

Надмолекулярные конструкции, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы, используя автоматизированный синтез пептидов и известные в химии методы защиты, особенно Fmoc/tBu, и стандартные защитные группы боковой цепи. Обычно пэгелирование пептидов приводит к получению смесей региоизомеров.

Для достижения сайт-специфичного присоединения конъюгата ПЭГ-липида и к С-, и к N-концу Aβ, могут быть добавлены частично защищенные пептиды. Для таких пептидных последовательностей, содержащих внутренние остатки Lys или His, к каждому концу добавляют ортогонально защищенный Lys(ivDde). Дополнительный остаток Gly может быть добавлен к С-концу для облегчения синтеза. Защитную группу удаляют и N-ацетилируют, используя уксусный ангидрид с последующим избирательным расщеплением групп ivDde.

Смола, особенно 2-хлортритиловая смола, предпочтительна, поскольку чувствительна к кислоте и, таким образом, способствует выделению защищенных пептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения реакцию связывания проводят в растворимой фазе. Избирательное отщепление от смолы в мягких условиях затем высвобождает внутренне защищенные пептиды.

Связывание в фазе раствора успешно проводят с пептидами, производными от последовательности β-амилоидного белка, например, таким образом, что Аβ22-35 и Aβ29-40, соответственно, или Аβ1-15, к молекуле ПЭГ, модифицированной жирной кислотой - фосфатидилхолин, например, DSPE. Разделение моно- и ди-соединеных продуктов перед конечной стадией снятия защиты с боковой цепи может быть достигнуто путем применения катион-обменной хроматографии. Последующее снятие защиты с боковой цепи пептида приводит к выделению требуемых конъюгатов с приемлемой степенью чистоты. Очистка может быть достигнута методами, известными в данной области, например, ВЭЖХ и др.

Такой подход к синтезу N- и С-концевых липид-ПЭГ В-амилоидных антигенов, используя защищенные пептиды, применим к широкому кругу пептидных последовательностей.

Липосомальные антигены по настоящему изобретению могут быть получены согласно описанию Nicolau и др., 2002. Модифицированный амилоидный Aβ антигенный пептид, особенно модифицированный пэгелированный Aβ22-35 и Аβ29-40 антигенный пептид, или пальмитилированный Aβ1-15 антигенный пептид, может быть перестроен в конструкцию, состоящую из липосом, особенно липосом, полученных из димиристоилфосфатидилхолина (dimyristoyl phosphatidyl choline - DMPC), димиристоилфосфатидилэтаноламина (dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine - DMPEA), димиристоилфосфатидилглицерина (dimyristoyl phosphatidyl glycerol - DMPG) и холестерина, необязательно содержащих монофосфорильный липид А.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липосомы с липидом А используют в качестве адъюванта для получения антиамилоидной вакцины. Димиристоилфосфатидил-холин, -глицерин и -холестерин перемешаны предпочтительно в мольном соотношении 0,9:1,0:0,7. Сильный иммуномодулятор, например, монофосфорильный липид А, затем добавляют в соответствующей концентрации, особенно в концентрации 30-50 мг/моль, более предпочтительно 40 мг/моль фосфолипидов. Модифицированный антигенный Aβ пептид затем добавляют в мольном соотношении пептида к фосфолипидам от 1:30 до 1:200, предпочтительно в мольном соотношении 1:1000, 1:50 и 1:120, более предпочтительно 1:100. Растворители удаляют, например, путем выпаривания, и получаемую пленку гидратируют стерильным буферным раствором, например, ФСБ.

Липосомы могут быть получены методом инъекции перетоком, например, описанным Wagner и др., Journal of Liposome Research, 12(3), 2002, cc.259-270. Во время инъекции липидных растворов в водную буферную систему липиды проявляют тенденцию к формированию «осадков», с последующей самоорганизацией в пузырьки. Размер полученных пузырьков зависит от ряда факторов, например, концентрации липидов, скорости перемешивания, скорости инъекции и выбора липидов. Система для получения липосом может состоять из инъекционного модуля перетока, сосудов для полярной фазы (например, буферного раствора ФСБ), сосуда для раствора этанола/липида и насоса, особенно устройства для давления азота. Хотя водный или полярный раствор накачивают через инъекционный модуль перетока, раствор этанола/липида впрыскивают в полярную фазу при разном подаваемом давлении.

Липосомы продолжают функционировать в качестве адъюванта и пептид, находящийся достаточно далеко от двойного слоя, может быть переработан отдельно, и таким образом повышается его иммуногенность по сравнению с пальмитилированным антигеном.

Конец без ПЭГ ковалентно присоединен к молекуле фосфатидилэтаноламина (в которой может быть жирная кислота миристимовая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая или их комбинация) для функционирования в качестве элемента заякоривания. Такая надмолекулярная структура может быть заякорена путем восстановления в липосомах, состоящих из фосфолипидов и холестерина (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, холестерин в варьирующих мольных соотношениях). Могут быть использованы другие фосфолипиды. Липид А используют в концентрации примерно 40 мкг/мкмоль фосфолипидов.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пальмотилированные или пэгелированные надмолекулярные антигенные конструкции включают пептид, имеющий аминокислотную последовательность β-амилоида. Пептиды могут также включать или соответствовать целому амилоид-бета пептиду и его действующих фрагментов. Кроме того, пептиды, применимые для настоящего изобретения, в частности включают Аβ22-35 и Аβ29-40, соответственно, или Aβ1-15 и его действующие фрагменты.

Для индукции и получения антител и для определения иммуногенности модифицированной Aβ антигенной конструкции соответствующее животное выбирают из группы, состоящей из мышей, крыс, кроликов, свиней, птиц и др., но особенно мышей, особенно мышей линии C57BL/6, и иммунизируют антигенным пептидом. Иммуногенность антигенной конструкции определяют путем зондирования образцов сыворотки через определенные временные интервалы после иммунизации, используя иммуноанализ, например, анализ ELISA.

Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть получены, используя классическое клонирование и методы гибридизации клеток, известные в данной области. Исследуемый иммуноген (антиген) обычно вводят (например, внутрибрюшинной инъекцией) животным дикого типа или имбредным мышам (например, BALB/c или особенно мышам C57BL/6), крысам, кроликам или животным других видов, которые могут вырабатывать нативные антитела или антитела человека. Иммуноген может вводиться отдельно, или в смеси с адъювантом, или экспрессируются с вектора (вектора репликона VEE, вакцина), или в виде ДНК, или в виде гибридного белка для индукции иммунного ответа. Гибридные белки включают пептид, против которого желателен иммунный ответ, соединенный с белками носителями, например, бета-галактозидазой, глутатион-S-трансферазой, гемоцианином моллюска блюдечка (keyhole limpet hemocyanin - KLH) и бычьим сывороточным альбумином. В этих случаях пептиды выступают в качестве гаптенов с несущими белками. После иммунизации животных, например, два или несколько раз, клетки селезенки отбирают от иммунизированных животных, и гибридомы, полученные слиянием сенсибилизированных клеток селезенки с линией клеток миеломы, например, клетками миеломы мыши SP2/0 (коллекция культур АТСС, Manassas, Вирджиния), используя известные методики Kohler и Milstein (Nature 256, 1975, cc.495-497) и Harlow и Lane (кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, изд. Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенная конструкция по настоящему изобретению, особенно вакцинная композиция, включающая указанную антигенную конструкцию в фармацевтически приемлемой форме, вводят в виде повторяющихся доз, предпочтительно 1-15 доз, более предпочтительно 2-10 доз, еще более предпочтительно 3-7 доз, но особенно предпочтительно 4-6 доз с интервалами 1-10 недель, особенно временными интервалами 1-6 недель, более предпочтительно с временными интервалами 1-4 недели и еще более предпочтительно с временными интервалами 2-3 недели. Иммунный ответ подвергают мониторингу, отбирая пробы с определенными интервалами после иммунизации, особенно через 3-10 суток после иммунизации, более предпочтительно 4-8 суток после иммунизации, и более предпочтительно через 5-6 суток после иммунизации и определения иммуногенности антигенной конструкции, используя известные методики, особенно один из наиболее распространенных методов иммуноанализа, например, метод ELISA.

Иммунизация антигенной конструкцией по настоящему изобретению, но особенно вакцинной композицией, включающей антигенную конструкцию по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе, приводит к существенному иммунному ответу у подвергаемого обработке животного. Животных, но особенно мышей, с терапевтическими титрами выбирают для гибридизации вырабатывающих антитела клеток, особенно В-лимфоцитов, с линиями постоянно растущих или бессмертных клеток, например, клетками миеломы. Клетки индуцируют к слиянию добавлением полиэтиленгликоля. Терапевтическими титрами являются те титры, которые показывают положительный результат в методе ELISA в разведении от 1:4000 до 1:6000, особенно от 1:4500 до 1:5500, более предпочтительно в разведении 1:5000.

Образуемые гибридные клетки затем клонируют традиционным способом, например, используя серийные разведения, и полученные клоны, которые образуют требуемое моноклональное антитело, культивируют.

Полученные указанным способом гибридомы отбирают химически, помещая клетки в селективную среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin, thymidine - HAT).

Гибридомы последовательно подвергают скринингу для определения способности вырабатывать моноклональные антитела против специфических связанных с амилоидом заболеваний и расстройств. Гибридомы, вырабатывающие исследуемые антитела, клонируют, размножают и хранят замороженными для будущего использования. Предпочтительная гибридома вырабатывает моноклональное антитело с изотипом IgG.

Поликлональные антитела получают иммунизацией животных, например, мышей или кроликов, или каких-либо других соответствующих животных композициями надмолекулярной антигенной конструкцией по настоящему изобретению. Сыворотку последовательно отбирают у животных, и антитела в сыворотке подвергают скринингу на связывающую способность в отношении амилоидного белка. Например, антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в частности моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и/или эксципиентом для формирования терапевтической композиции. Соответствующие фармацевтические носители, растворители и/или эксципиенты известны в данной области и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, например, эмульсии по типу масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильных растворов и др.

Состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть завершен стандартным методом, известным специалистам в данной области.

Композиции настоящего изобретения могут быть введены субъекту в твердой, жидкой или аэрозольной форме в соответствующей фармацевтически эффективной дозе. К примерам твердых композиций относятся таблетки, мази и имплантированные дозированные единицы. Таблетки могут быть введены перорально. Терапевтические мази могут применяться местно. Имплантированные дозированные единицы могут быть введены местно, например, по месту опухоли, или могут быть имплантированы для системного высвобождения терапевтической композиции, например, подкожно. К примерам жидких композиций относятся составы, адаптированные для внутримышечной, подкожной, внутривенной, внутриартериальной инъекции, и составы для местного и внутриглазного введения. Примерами аэрозольных составов являются ингаляционные составы для введения в легкие.

Композиции могут вводиться стандартными способами. Обычно композиции вводят местно, перорально, ректально, назально, внутрикожно, внутрибрюшинно или парентерально (например, внутривенно, подкожно или внутримышечно). Кроме того, композиция может быть внедрена в матрицы устойчивого высвобождения, например, биодеградируемые полимеры, полимеры, имплантированные поблизости от места, где требуется высвобождение, например, около места опухоли. Способ включает введение одной дозы, введение повторяющихся доз с заранее определенными интервалами, и устойчивое введение на протяжении заранее установленного периода.

Матрица устойчивого высвобождения, используемая в настоящем изобретении, является матрицей, обычно полимерами, которая разрушается ферментами или кислотным/щелочным гидролизом или растворением. При внедрении в организм на матрицу воздействуют ферменты и тканевые жидкости. Матрицу устойчивого высвобождения желательно выбирать из биосовместимых материалов, например, используемых для липосом: полилактидов (полимолочная кислота), полигликолида (полимера гликолевой кислоты), сополимера гликолида и полилактида (сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидридов, полиортоэфиров, полипептидов, гиалуроновой кислоты, коллагена, хондроитина сульфата, карбоновых кислот, жирных кислот, фосфолипидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот, полиаминокислот, аминокислот, например, фенилаланина, тирозина, изолейцина, полинуклеотидов, поливинилпропилена, поливинилпирролидона и силикона. Предпочтительной биоразрушаемой матрицей является полилактид, полигликолид, или сополимер гликолида и полилактида (сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты).

Специалистам в данной области известно, что доза композиции зависит от разных факторов, например, условий обработки, определенной используемой композиции и других клинических факторов, например, массы, размера, пола и общего состояния здоровья пациента, площади поверхности тела, определенного вводимого соединения или композиции, других лекарственных средств, вводимых одновременно, а также от способа введения.

Композиция может вводиться в комбинации с другими композициями, включающими биологически активное вещество или соединение, по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей: соединения против окислительного стресса, противоапоптические соединения, хелаторы металлов, ингибиторы репарации ДНК, например, пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновую кислоту, 1,3-пропандисульфонат, активаторы секретазы, ингибиторы β- и γ-секретазы, тау белки, нейротрансмиттеры, разрушители β-слоев, противовоспалительные молекулы, «атипичное антипсихотическое средство», например, клозапин, ципразидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, или ингибиторы холинэстеразы (ChEIs), например, витамин В12, цистеин, предшественник ацетилхолина, лецитин, холин, гингко билоба, ацетил-L-карнитин, идебенон, пропентофиллин или производное ксантина, вместе с антителом по настоящему изобретению и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент и инструкции для лечения заболеваний.

Белковый материал фармацевтического действия может быть в количестве от 1 нг до 10 мг на дозу. Обычно режим введения должен быть в диапазоне от 0,1 мкг до 10 мг антитела по настоящему изобретению, особенно в диапазоне от 1,0 мкг до 1,0 мг, и более предпочтительно в диапазоне от 1,0 мкг до 100 мкг, причем число отдельных попаданий в такие диапазоны также является частью настоящего изобретения. Если вводят непрерывной инфузией, более точно дозировка может составлять от 0,01 мкг до 10 мг единиц на кг массы тела в час, причем число отдельных попаданий в такие диапазоны также является частью настоящего изобретения.

Введение обычно может быть парентеральным, например, внутривенным. Препараты для парентерального введения включают водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. К неводным растворам относятся, но ими не ограничиваются, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и инъекционные органические эфиры, например, этилолеат. Водные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, включая солевые и буферные среды. К парентеральным растворителям относятся раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера, декстрозы и натрия хлорида, раствор лактата Рингера и нелетучие масла. Внутривенные растворители включают жидкие и пищевые наполнители, электролитные наполнители (например, основанные на растворе декстрозы Рингера) и другие. Консерванты также могут быть, например, антимикробными, антиоксидантными, хелатирующими агентами, инертными газами и др.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать белковые носители, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, особенно от человека. Другие биологически действующие агенты могут содержаться в фармацевтической композиции настоящего изобретения в зависимости от их назначения.

Если связывающая мишень расположена в мозге, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают перенос антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер. Некоторые нейродегенеративные заболевания связаны с повышением проницаемости гематоэнцефалитного барьера таким образом, что антитело или его действующий фрагмент могут быть легко внедрены в мозг. Если гематоэнцефалитный барьер остается интактным, имеется несколько известных в данной области подходов по транспортировке молекул через него, включая, но ими не ограничиваются, физические методы, методы, основанные на липидах, и методы, основанные на рецепторе и канале.

К физическим методам транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер относятся, но ими не ограничиваются, обход гематоэнцефалитного барьера, или создание проходов в гематоэнцефалитном барьере. К методам обхода относятся, но ими не ограничиваются, прямая инъекция в мозг (см., например, Papanastassiou и др., Gene Therapy 9, 2002, cc.398-406) и имплантация устройства по доставке в мозг (см., например, Gill и др., Nature Med. 9, 2003, cc.589-595, и Gliadel Wafers™, фирма Guildford Pharmaceutical). Методы по созданию проходов в барьере включают, но ими не ограничиваются, ультразвук (см., например, US 2002/0038086), осмотическое давление (например, введение гипертонического маннита (Neuwelt E. А. в кн.: «Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation», 1989, тт.1 и 2, изд. Plenum Press, Нью-Йорк)), обеспечение проницаемости, например, брадикинином или агентом обеспечения проницаемости А-7 (см., например, US 5112596, 5268164, 5506206 и 5686416), и трансфекцией нейронов, которые проходят гематоэнцефалитный барьер с векторами, содержащими гены, которые кодируют антитело или антигенсвязывающий фрагмент (см., например, US 2003/0083299).

Основанные на липидах способы транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер включают, но ими не ограничиваются, инкапсулирование антитела или его действующего фрагмента в липосомы, которые соединены с его действующими фрагментами, которые связываются с рецепторами на эндотелии сосудов гематоэнцефалитного барьера (см., например, US 20020025313), и покрытие антителом или его действующим фрагментом частиц липопротеина низкой плотности (см., например, US 20040204354) или аполипопротеина Е (см., например, US 20040131692).

Методы транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер, основанные на рецепторе и канале, включают, но ими не ограничиваются, применение глюкокортикоидных блокаторов для повышения проницаемости через гематоэнцефалитный барьер (см., например, US 2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533), активирование калиевых каналов (см., например, US 2005/0089473), ингибирование переносчиков ABC лекарственных средств (см., например, US 2003/0073713), нанесение антител с трансферином и модулирующим действием одного или нескольких рецепторов трансферина (см., например, US 2003/0129186), и катионизации антител (см., например, US 5004697).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы и наборы для выявления и диагностики заболеваний или состояний, связанных с амилоидом, для диагностики предрасположенности к заболеванию или состоянию, связанному с амилоидом, или для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента, а также для прогнозирования реактивности пациента на лечение композицией антитела или вакцины по настоящему изобретению. Эти способы включают известные иммунологические способы, обычно используемые для выявления или количественной оценки веществ в биологических образцах или в условиях in situ.

Диагностика связанного с амилоидом заболевания или состояния или предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию у пациента может быть осуществлена путем выявления иммуноспецифического связывания антитела по настоящему изобретению, особенно моноклонального антитела или его действующего фрагмента, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, которое включает приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом, которое связывает эпитоп амилоидного белка, позволяя антителу связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса, выявление формирования иммунологического комплекса и корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, необязательно сравнивая количество указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с контрольной величиной означает, что указанный пациент подвержен риску развития заболевания или состояния, связанного с амилоидом. Амилоидный белок может быть в мономерной, фибриллярной и/или полимерной форме. Антитело или его действующая часть может быть специфичной для мономерной, фибриллярной и/или полимерной формы амилоидного белка.

Мониторинг минимального остаточного заболевания у пациента после лечения композицией антитела или вакцины по настоящему изобретению может быть достигнут выявлением иммуноспецифического связывания антитела по настоящему изобретению, особенно моноклонального антитела или его действующего фрагмента, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, и включает приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом, которое связывает эпитоп амилоидного белка, предоставление возможности для антитела связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса, выявление формирования иммунологического комплекса и корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, и необязательно сравнение количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что у указанного пациента все еще сохранилось минимальное остаточное заболевание. Амилоидный белок может быть в мономерной, фибриллярной и/или полимерной форме. Антитело или его действующая часть могут быть специфичными для мономерной, фибриллярной и/или полимерной формы амилоидного белка.

Прогнозирование восприимчивости пациента к лечению вакцинной композицией по настоящему изобретению может быть достигнуто путем определения иммуноспецифического связывания моноклонального антитела или его действующего фрагмента с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, которое включает приведение образца, или специфической части тела, или области тела, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом, которое связывает эпитоп амилоидного белка, предоставление возможности для антитела связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса, выявление формирования иммунологического комплекса и выявление корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, необязательно сравнение количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения, причем снижение количества указанного агрегата показывает, что у указанного субъекта велика вероятность проявления восприимчивости к лечению. Амилоидный белок может быть в мономерной, фибриллярной и/или полимерной форме. Антитело или его действующая часть могут быть специфичными для мономерной, фибриллярной и/или полимерной формы амилоидного белка.

Биологическими образцами, которые могут быть применены для диагностики связанного с амилоидом заболевания или состояния, диагностики предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию, для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента или для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению антителом или вакцинной композицией по настоящему изобретению являются, например, жидкости, например, сыворотка, плазма, слюна, желудочный секрет, слизь, спинномозговая жидкость, лимфатическая жидкость и другие, или образцы тканей или клеток, полученные из организма, например, нервной ткани, мозга, сердца или сосудов. Для определения наличия или отсутствия амилоидного белка в образце может быть применен какой-либо иммуноанализ, известный специалистам в данной области, например, анализы, в которых используют непрямые способы выявления, используя вторичные реагенты для выявления, ELISA и методы иммунопреципитации и агглютинации. Подробное описание таких исследований приводится, например, в кн. Harlow и Lane «Antibodies: A Laboratory Manual», изд. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Нью-Йорк, cc.555-612, WO96/13590, WO96/29605.

Для диагностики in situ антитело или какая-либо его действующая часть могут вводиться в диагностируемый организм способами, известными в данной области, например, внутривенно, интраназально, внутрибрюшинно, подоболочечно, внутриартериально таким образом, что может произойти специфическое связывание антитела по настоящему изобретению с областью эпитопа амилоидного белка. Комплекс антитело/антиген может быть определено обычными методами с помощью метки, присоединенной к антителу или его функциональному фрагменту, или каким-либо другим известным способом обнаружения.

Иммуноисследования, применяемые для диагностики или для прогноза предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию, или для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента, для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению антителом или вакцинной композицией по настоящему изобретению, обычно основаны на антигенах и антителах с нанесенной меткой или на вторичных реагентах для выявления. На такие белки или реагенты может быть нанесена метка в виде соединений, обычно известных специалистам в данной области, включая ферменты, радиоизотопы и флуоресцентные, люминесцентные и хромогенные вещества, включая, но ими не ограничиваясь, окрашенные частицы, например, коллоидное золото и гранулы латекса. Из таких соединений радиоактивная метка может применяться почти для всех типов анализов с большинством вариаций. Метки в виде конъюгированного фермента особенно применимы, если радиоактивности следует избежать или если нужно быстро получить результаты. Флюорохромы, хотя для их использования требуется дорогое оборудование, представляют очень чувствительный метод выявления. Антитела, применимые в таких анализах, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела и поликлональные антитела аффинной очистки.

В другом варианте, антитело может быть мечено косвенно путем реакции с мечеными веществами, проявляющими сродство с иммуноглобулином, например, белком А или G, или вторыми антителами. Антитело может быть объединено со вторым веществом и выявлено с меченым третьим веществом, имеющим сродство со вторым веществом, объединенным с антителом. Например, антитело может быть объединено с биотином и конъюгат антитело-биотин выявляют, используя меченый авидин или стрептавидин. Сходным образом антитело может быть конъюгировано с гаптеном, и конъюгат антитело-гаптен выявляют, используя меченое анти-гаптеновое антитело.

Специалистам в данной области известны указанные и другие соответствующие метки, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением. Связывание таких меток с антителами или их фрагментами может быть выполнено, используя стандартные методики, обычно известные специалистам в данной области. Типичные методики описаны Kennedy J. Н. и др., Clin. Chim. Acta 70, 1976, cc.1-31, и Schurs A. H. W. M. и др., Clin. Chim Acta 81, 1977, cc.1-40). Методики соединения, указанные в приведенных ссылках, представляют метод с применением глутаральдегида, метод с применением периодата, метод с применением дималеимида и другие, каждый из которых включен в настоящее изобретение в виде ссылки.

В современных иммуноисследованиях используют метод двойных антител для обнаружения наличия определенного соединения, причем антитело метят косвенным образом путем взаимодействия со вторым антителом, на которое была нанесена выявляемая метка. Второе антитело предпочтительно является таким антителом, которое связывается с антителами животного, из которого моноклональное антитело получено. Иначе говоря, если моноклональное антитело является антителом мыши, тогда второе антитело с нанесенной меткой является антителом против антитела мыши. Для антитела, используемого в описанном в настоящем изобретении анализе, такая метка предпочтительно представляет гранулы, покрытые антителом, особенно магнитные гранулы. Для антитела, применяемого в описанном в настоящем изобретении иммуноанализе, предпочтительно меткой является выявляемая молекула, например, радиоактивное, флуоресцентное или электрохемилюминесцентное вещество.

Другая система двойного антитела, которую часто относят к формату систем быстрого действия, поскольку они адаптированы для быстрого определения наличия определяемого вещества, также может быть применена в рамках охвата настоящего изобретения. Система требует высокого сродства между антителом и определяемым веществом. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения определяют наличие амилоидного белка, используя пару антител, каждое специфичное для амилоидного белка. Одно из указанных пар антител в настоящем изобретении обозначают «идентифицирующим антителом», а второе из пары антител в настоящем изобретении обозначают «иммобилизованным антителом». Моноклональное антитело по настоящему изобретению может применяться или в качестве иммобилизованного антитела, или в качестве идентифицирующего антитела. Моноклональное антитело по настоящему изобретению также может применяться и в качестве идентифицирующего, и в качестве иммобилизованного антитела в одном исследовании. Таким образом, настоящее изобретение использует метод сэндвича двойного антитела для выявления амилоидного белка в образце биологической жидкости. В этом методе исследуемое вещество (амилоидный белок) оказывается «в сэндвиче» - между иммобилизованным и идентифицирующим антителами, иммобилизованное антитело становится обратимо иммобилизованным на твердой основе. Идентифицирующее антитело может содержать выявляемую метку для идентификации наличия выявляемого сэндвича антитела-выявляемого вещества, и, таким образом, наличия выявляемого вещества.

Примерами твердых веществ являются, но ими не ограничиваются, планшеты для микротитрований, пробирки из полистерола, магнитные, пластиковые или стеклянные гранулы и пластины, известные специалистам в области радиоиммуноанализа и ферментного иммуноанализа. Способы соединения антител с твердой фазой хорошо известны специалистам в данной области. Ранее ряд пористых материалов, например, нейлона, нитроцеллюлозы, ацетата целлюлозы, стеклянных волокон и других пористых полимеров использовали в качестве твердых основ.

Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для выявления амилоидного белка в биологическом образце, который включает описанную выше композицию. Кроме того, настоящее изобретение относится к указанному диагностическому набору, который помимо указанной выше композиции также включает описанный выше реагент для выявления. Понятие «диагностический набор» относится в целом к какому-либо диагностическому набору, известному в данной области. Более конкретно это понятие относится к диагностическому набору, описанному Zrein и др. (1998).

В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрены новые иммунозонды и наборы для исследования и диагностики связанных с амилоидом заболеваний и состояний, включающих антитела по настоящему изобретению. Для иммунозондов антитела непосредственно или опосредованно присоединяют к соответствующей репортерной молекуле, например, к ферменту или радионуклиду. Набор для исследования включает контейнер, содержащий одно или несколько антител по настоящему изобретению и инструкции для применения антител для связывания амилоидного антигена для формирования иммунологического комплекса и выявления формирования иммунологического комплекса, например, наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

Примеры

Пример 1. Антитела, полученные путем иммунизации надмолекулярными антигенными конструкциями пальмитилированного Aβ1-15

Пример 1.1. Способы получения надмолекулярных антигенных конструкций пальмитилированного Aβ1-15

1.1.1. Синтез тетра(пальмитоил-лизин)-Aβ1-15 пептидного антигена

Пальмитилированный амилоидный 1-15 пептид синтезируют ранее усовершенствованным опубликованным методом (Nicolau и др., 2002). Этот новый подход применительно к присоединению на смоле пальмитиновой кислоты к концевым остаткам Lys у ранее сформированного пептида предпочтительнее по сравнению с последовательным твердофазным синтезом, включающим модифицированную аминокислоту 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc)-Lys(Pal)-OH. Этот новый подход улучшает эффективность соединения и приводит к образованию продукта гораздо более высокой чистоты. Таким образом, ортогонально защищенная аминокислота Fmoc-Lys(Mtt)-OH присоединена к смоле Ванга, используя реакцию присоединения [2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафлюорофосфат] (HBTU). Группу Fmoc удаляют, используя 20% пиперидин в DMF, а второй остаток Fmoc-Lys(Mtt)-OH присоединяют. Затем применяют стандартный автоматизированный синтез пептидов, используя химию Fmoc/tBu и стандартные защитные группы боковой цепи, для связывания следующих 15 аминокислот для получения пептидной последовательности. В итоге двумя последними присоединенными аминокислотами являются Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Группы Mtt затем избирательно расщепляют, используя 1% трифторуксусную кислоту в дихлорметане для высвобождения пептидного фрагмента, и затем соединяют с пальмитиновой кислотой, используя HBTU. После промывки смолы группу Fmoc удаляют 20% пиперидином в диметилформамиде и в итоге одновременно смолу расщепляют и снимают защиту с боковых цепей, используя трифторуксусную кислоту в стандартных условиях. В результате растирания из холодного диэтилового эфира получают продукт в виде белого сухого остатка. Электроспрей масс-спектрометрия подтверждает идентичность продукта (ожидаемая m/z: 1097,9 ([М]3+), выявленная: 1096,8 ([М-3Н]3+) а также отсутствие три-, ди- и монопальмитилированных пептидов.

Пример 1.2. Антитела, индуцированные надмолекулярными антигенными конструкциями

Получение антител mAb, возникших против надмолекулярной антигенной конструкции пальмитилированного Aβ1-15

Пальмитилированный антиген (ACI-24, Aβ1-15) используют для иммунизации мышей C57BL/6 с двухнедельными интервалами. По 10-12 животных иммунизируют каждым антигеном (инъекционный объем: 200 мкл, содержащих 8 нмолей пептида). Последнюю инъекцию вводят за 4 суток до умерщвления животных. После 5 иммунизацией мышей с терапевтическими титрами (при разведении сыворотки 1:5000 положительная реакция при оценке методом ELISA) выбирают для слияния. Клетки селезенки отбирают у иммунизированных животных и получают гибридомы путем слияния сенсибилизированных клеток с линией клеток миеломы. Гибридизацию В-лимфоцитов мыши из селезенки проводят с клетками линии клеток миеломы SP2-0 (фирма АТСС, Manassas, Вирджиния), используя известные методы Kohler, Milstein (Nature 256, 1975, cc.495-497) и Harlow, Lane (в кн: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, изд. Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк).

Клетки индуцируют к слиянию путем добавления полиэтиленгликоля. Получаемые гибридные клетки затем культивируют в течение 10±14 суток общепринятым образом для роста клона. Первоначальный отбор клона проводят, используя метод серийных разведении. Клоны гибридомы, вырабатывающие IgG, выбирают и исследуют на специфическое связывание с пептидом Aβ1-42 методом ELISA и культивируют получаемые клоны, которые вырабатывают требуемые моноклональные антитела.

Полученные таким образом гибридомы отбирают химически путем помещения клеток в селективную среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin, thymidine - HAT).

Гибридомы подвергают последовательному скринингу для выявления способности вырабатывать моноклональные антитела против специфических связанных с амилоидом заболеваний и расстройств. После выявления материнского клона его субклонируют четыре раза для подтверждения моноклональности и получения стабилизации гибрида. Гибридомы, вырабатывающие исследуемые антитела, клонируют, размножают и хранят в замороженном виде для последующего применения.

Проводят изотипирование антитела коммерчески доступным набором для изотипирования мышиных моноклональных антител, и стабильный клон адаптируют к среде без сыворотки и помещают в биореактор для получения антитела.

Предпочтительная гибридома вырабатывает моноклональное антитело изотипа IgG1.

Пример 1.3. Определение специфичности антитела mACI-24-Ab3

Для анализа специфичности антитела mACI-24-Ab3 различные концентрации ранее сформированного амилоида 1-42, 1-40 и 17-40, 1-28 фибрилл наносят на мембрану из нитроцеллюлозы Hybond ECL (фирма Amersham Biosciences). После блокирования 10% сухим молоком и 0,7% твин 20 мембраны инкубируют с основным антителом в концентрации 20 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки мембраны инкубируют с пероксидазой хрена, объединенной с овечьим антителом против мышиного IgG (фирма Amersham Biosciences), в течение 1 ч при комнатной температуре, промывают и инкубируют с хемилюминесцентным раствором с последующим экспонированием мембраны на рентгеновской пленке.

Для измерения связывания моноклонального антитела mACI-24-Ab3 с амилоидом β 1-42, 1-40 и 17-40, волокна 1-28 заранее формируют в течение семи суток при 37°С и наносят на мембрану. 20 мкг/мл антитела используют для измерения связывающей способности, и связанное антитело выявляют объединенным с пероксидазой хрена овечьим антителом против IgG мыши в течение 20 мин обработки.

Пример 1.4. Исследование флуоресценции с применением тиофлавина Т (Th-T)

Для измерения подавления ингибирования и дезагрегирования, свойственных моноклональному антителу, используют анализ флуоресценции с применением_тиофлавина Т (Th-T), который специфически связывается с фибриллярными молекулами Aβ1-42, и впоследствии интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Aβ1-42 филаментов в растворе.

Порошок лиофилизированного Aβ 1-42 восстанавливают в гексафлюороизопропаноле в концентрации до 1 мМ. Раствор пептида обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре, перемешивают в течение ночи, и аликвоты помещают в микроцентрифужный пробирки (без силикона). Гексафлюороизопропанол затем выпаривают в струе аргона. Полученную пептидную пленку высушивают в вакууме в течение 10 мин и хранят при -80°С до применения.

1.4.1. Исследование агрегирования Aβ1-42

Для исследования опосредованного антителом подавления агрегирования Aβ1-42 антитело, предварительно разведенное в ФСБ, и раствор для исследования, содержащий приведенные ниже компоненты, получают в пробирках без силикона: 3,3 или 0,33 мкмоля предварительно разведенного антитела, 10 мкмолей тиофлавина Т, 33 мкмоля Aβ1-42 и 8,2% ДМСО. Следовательно, итоговые мольные соотношения антитела к Aβ1-42 составляют 1:10 и 1:100. Также получают соответствующие контрольные растворы. Растворы затем инкубируют в течение 24 ч при 37°С и спектральную флуоресценцию (в относительных единицах флуоресценции - ОЕФ) считывают в шести повторах в черных 384-луночных планшетах (фирма Perkin-Elmer) на спектрофлуорометре Perkin-Elmer FluoroCount. Подавление агрегирования или дезагрегирование выражают в виде среднего процента подавления или дезагрегирования, соответственно, по следующему уравнению:

Процент подавления = ( ОЕФ положительного контроля-ОЕФ отрицательного контроля ) ( О Е Ф   о бразца с A β 1-42-ОЕФ образца без A β 1-42 ) ( ОЕФ положительного контроля-ОЕФ отрицательного контроля ) × 100 %

относительно контроля. Мольное соотношение антитела к Aβ1-42 1:100 подавляет в среднем на 26% (2 независимых эксперимента), причем при мольном соотношении 1:10 подавление составляет 51% (2 независимых эксперимента).

1.4.2. Исследование дезагрегирования Aβ1-42

Для анализа способности моноклонального антитела к дезагрегированию используют флуоресцентный анализ с применением тиофлавина Т (ThT), который специфически связывает фибриллярные молекулы Aβ1-42, и интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Aβ1-42 филаментов, имеющихся в растворе.

Для исследования опосредованного антителом дезагрегирования ранее агрегированного Aβ1-42, низкомолекулярный Aβ1-42, полученный согласно описанному выше, получают 110 мкМ раствор в 27% ДМСО и 1х ФСБ. Этот раствор затем агрегируют при 37°С в течение 24 ч, после чего добавляют: 3,3 или 0,33 мкМ предварительно разведенное антитело и 10 мкМ тиофлавина Т. Это приводит к мольному соотношению 1:10 и 1:100 антитела к Aβ1-42 в 8,2% ДМСО. Этот раствор затем инкубируют в течение дополнительных 24 ч при 37°С. Затем измеряют спектральную флюоресценцию и рассчитывают процент дезагрегирования, описанный выше.

Антитело ACI-24-Ab-3 показывает существенное дезагрегирование ранее агрегированного Aβ1-42 в анализе дезагрегирования. При мольном соотношении антитела к Aβ1-42 1:100 дезагрегирование в среднем составляет 12% (2 независимых эксперимента), хотя при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 20% (2 независимых эксперимента).

Из указанных выше результатов следует, что антитело ACI-24-Ab-3 проявляет двойную функциональность при взаимодействии с Aβ1-42 филаментами, которая заключается в том, что антитело способно ингибировать агрегирование Aβ1-42 и способно дезагрегировать ранее сформированные волокна Aβ1-42.

Пример 1.5. Взаимодействия mACI-01Ab7 C2 с амилоидным пептидом Aβ1-42.

Исследуют взаимодействия между антителом ACI-24-Ab-3 и амилоидным пептидом Aβ1-42, используя резонанс поверхностного плазмона. Определяют связывание антитела мыши с мономерами или фибриллами Aβ1-42.

Все эксперименты по резонансу поверхностного плазмона проводят на приборе Biacore X (фирма Biacore AB). Реагенты для иммобилизации (EDC, NHS и этаноламин), сенсорные чипы СМ5 и SA, а также текущий буфер и буфер для образцов HBS-EP получают от фирмы Biacore AB. Натрий ацетат (10 мМ, рН 5,0) используют в качестве соединяющего буфера для повышения связывания. Фибриллярный пептид Aβ1-42 (фирма BAchem) получают добавлением буфера ФСБ к Aβ1-42 до конечной концентрации 3 мг/мл и емкости оставляют при 37°С на 7 суток. Фибриллярный пептид Aβ1-42 соединяют с сенсорным чипом СМ5, содержащим связанную с поверхностью матрицу из карбоксиметилдекстрана.

Биотинилированный мономерный пептид Aβ1-42 (фирма Bachem) соединяют с сенсорным чипом SA, состоящим из матрицы из карбоксиметилдекстрана с ковалентно присоединенным страптавидином. Обычно четыре или пять концентраций моноклонального антитела исследуют серийными разведениями, используя текущий буфер. Впрыскивания проводят, начиная с самой низкой концентрации, и пропускают через проточные кюветы 1 и 2 при скорости тока 30 мкл/мин в течение 3 мин. Проточную кювету 2 не изменяют и ответы вычитают из проточной кюветы 1 для коррекции аппаратурного шума и массы рефракторных изменений. После завершения впрыскиваний поверхности немедленно промывают текущим буфером в течение 5 мин. Для удаления связанного антитела с Aβ1-42 фибрилл регенерируют поверхность путем впрыскиваний 10 мМ NaOH. Проводят кинетический анализ, используя алгоритмы для численного интегрирования и глобального анализа с применением программного обеспечения BIAevaluation 3.0. Кривые, полученные при впрыскивании определяемого в анализе вещества в разных концентрациях, накладывают и исходные данные доводят до нуля. Для подгонки кривой все данные согласовывают одновременно с гомогенным комплексом 1:1.

Определяют связывание антитела мыши ACI-24-Ab-3 с амилоидом.

Пример 1.6. Связывание моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 с амилоидными волокнами

Для анализа молекулярного связывания стороны антитела ACI-24-Ab-3 с ранее сформированными волокнами проводят отрицательно контрастированную трансмиссионную электронную микроскопию.

Антитело ACI-24-Ab-3 соединяют с 8 нм коллоидным золотом по методике Slot JW, Geuze HJ (1985). Для совместного инкубирования амилоидных 1-42 (Aβ 1-42) волокон, 6,65 мкмолей волокон инкубируют в течение 24 ч при комнатной температуре с антителом, меченым золотом, в мольном соотношении 1:100. Впоследствии 5 мкл образца инкубируют на свежей испускающей свет медной сетке (ячейка 200), покрытой парлодий/С пленкой в течение 45 сек, промывают трижды водой и 1 раз 2% свежеприготовленным и фильтрованным уранил ацетатом. Образцы окрашивают 2% уранил ацетатом в течение 15-20 сек. Избыток красителя на сетке отсасывают и затем высушивают на воздухе. Приготовляют по три сетки каждого образца. Сетки анализируют с помощью электронного трансмиссивного микроскопа Hitachi 7000.

Пример 1.7. Фракционирование ультрацентрифугированием в градиенте плотности

Способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 к ингибированию полимеризации Aβ1-42 волокон и дезагрегировнанию Aβ1-42-волокон исследуют ультрацентрифугированием в градиенте плотности (Rzepecki и др., 2004), основанным на распределении полученных пептидных волокон разного размера после инкубирования с антителами и без антител после анализа SDS-PAGE осаждения на ранее полученном градиенте (OptiPrep™). Одновременный анализ популяций ранее сформированных Aβ-волокон, способностей к дезагрегированию и ингибированию агрегирования совместно инкубируемых антител и связывание антител с волокнами являются очевидными преимуществами этих способов.

Для ингибирования агрегирования Aβ1-42 мономеры Aβ1-42 инкубируют с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3 при двух разных мольных соотношениях (мольное содержание мономера Aβ1-42 в тридцать или сто раз выше мольного содержания моноклонального антитела) с конечной концентрацией Aβ 50 мкМ. После 24 ч инкубирования при 37°С образцы наслаивают поверх ступенчатого градиента Optiprep™ и пробирки центрифугируют при 259000 g в течение 3 ч при 4°С. Собирают 15 фракций (по 140 мкл каждая), фракция 1 наименее плотная фракция градиента от дна, а фракция 15 самая плотная фракция от дна градиента. Осадок также отбирают. Собранные фракции анализируют SDS-PAGE с окрашиванием серебром. Концентрация Aβ1-42 для исследования ингибирования в пять раз ниже, чем для исследования дезагрегирования, которые снижают кинетику агрегирования амилоида и обеспечивают измерение в линейной фазе.

Для дезагрегирования ранее сформированных фибрилл Aβ1-42 путем совместного инкубирования с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3 (при двух разных мольных соотношениях 1:30 и 1:100, mAb + мономер Aβ1-42 с итоговой концентрацией Aβ 246 мкМ), образцы инкубируют в течение 24 ч при 37°С. Через 24 ч образцы фракционируют ультрацентрифугированием и разделяют методом SDS-PAGE, описанным выше и ранее (Rzepecki и др., 2004).

Пример 1.8. Флуоресцентное исследование для оценки подавления агрегирования Aβ1-42 филаментов и дезагрегирования ранее сформированных Aβ1-42 филаментов путем совместного инкубирования с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3

Для оценки способности моноклонального антитела к ингибированию проводят флуоресцентное исследование BIS-ANS (LeVine, 2002), которое выявляет мономерную или нефибриллезную популяцию Aβ1-42 филаментов. До флуоресцентного измерения мономеры Aβ1-42 предварительно инкубируют либо с буфером (контроль), либо с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3 (мольное соотношение моноклонального антитела к пептиду Aβ1-42 составляет 1:100) в течение 14 ч при 37°С. Единицы относительной флуоресценции автоматически записывают и результаты выражают в виде изменений относительно контроля, выраженных в процентах.

Пример 1.9. Описание методами ЯМР и флуоресценции взаимодействия моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 с 13С-меченым β-амилоид 1-42 пептидом

Для оценки возможного механизма, с помощью которого mAb растворяет ранее сформированные волокна или ингибирует формирование волокон, проводят сопоставление метода флуоресцентного исследования с применением Th-T и метода ЯМР в твердом теле U-13С Tyr10 и Val12-меченого β-амилоидного 1-42 пептида. Следовательно, цель настоящего исследования заключается в анализе спектроскопией ЯМР в твердом теле перехода β-слоя в β-амилоидном пептиде, и в присутствии моноклонального антитела, и для прямого сравнения со способностью к дезагрегированию, измеренной методом флуоресцентного исследования с применением Th-T.

Спектроскопии ЯМР в твердом теле не только определяет переход вторичной структуре, но также позволяет локализовать домены Aβ1-42-пептида, которые определяют структурный переход. Метод ЯМР в твердом теле подтвердил свою применимость для решения указанной задачи, поскольку способствует определению структуры Aβ1-42-волокон (Petkova и др., 2004, Petkova и др., 2002). В частности корреляция 13Сα и 13Сβ химического сдвига с вторичной структурой (Cornilescu и др., 1999, Luca и др., 2001, Iwadate и др, 1999) является полезным инструментом для анализа изменения вторичной структуры пептида.

Синтез меченого пептида, включающего 13С предварительно меченый аланин в положении 12 (12Val) и 13С предварительно меченый тирозин в положении 10 (10Tyr), осуществляют по протоколу синтеза Fmoc. Идентичность и чистоту пептида подтверждают масс-спектроскопией MALDI. Меченый β-амилоидный пептид (1-42) используют для получения волокон путем инкубирования пептидного раствора в буфере ФСБ в течение 1 недели при 37°С. Главная проблема - плохая растворимость амилоидного β-пептида в буфере ФСБ, может быть решена следующим образом: величина рН буфера ФСБ временно повышается малыми количествами аммония для растворения амилоидного β-пептида. Исходную величину рН буфера ФСБ восстанавливают инкубированием образца в присутствии большего объема ФСБ, используя способность аммония улетучиваться.

Для измерения воздействия антител на изменение β-слоя, раствор волокон инкубируют с антителом в течение 24 ч при 37°С и для ЯМР, и для Th-T анализа. Для сравнения в реальном масштабе времени аликвоту одного и того же раствора используют для анализа Th-T флуоресценции, а оставшийся раствор лиофилизируют для измерений методом ЯМР.

Способность антитела ACI-24-Ab-3 к дезагрегированию исследуют путем совместного культивирования с ранее сформированным С-меченными амилоидными β-волокнами, используя флуоресцентный анализ Th-T.

Для исследования различий между ФСБ (контроль) и mAb инкубированием, каждый спектр распутывают, используя PeakFit (www.systat.com/- products/PeakFit). Линии подобраны с помощью смешанной процедуры подгонки (Lorentzian/Gaussian).

Пример 1.10. Воздействие антитела ACI-24-Ab-3 на амилоидные волокна

12.1. Модификация конформации Aβ1-42 волокон и инициация дезагрегирования после связывания антитела ACI-24-Ab-3

Для оценки возможного механизма, с помощью которого антитело дезагрегирует ранее сформированные бета-амилоидные волокна (Aβ1-42), проводят сопоставление тиофлавин Т (Th-T) флуоресцентного анализа, который проводят для измерения дезагрегирования, и метода ЯМР в твердом теле, который проводят для измерения вторичной конформации U-13С Tyr10 и Val12-меченого β-амилоидного 1-42 пептида.

Пример 1.11. Картирование эпитопа моноклонального антитела ACI-24-Ab-3

Картирование эпитопа моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 проводят методом ELISA, используя пептидную библиотеку, включающую в общей сложности 33 биотинилированных пептида, покрывающих полную аминокислотную (аа) последовательность Aβ1-42 (фирма Mimotopes, Clayton Victoria, Австралия, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Wangen, Швейцария). Пептиды в пептидной библиотеке состоят из 8, 9 или 10 аминокислот. Биотинилированный полный пептид Aβ1-42 (последовательность человека) используют в качестве положительного контроля (фирма Bachem, Bubendorf, Швейцария). Кроме того, более длинные пептиды, охватывающие Aβ1-28, Aβ17-40, Aβ1-40 и Aβ1-42, используют для определения более широкой области, с которой эти антитела могут связаться. Эти 4 пептида также биотинилированы (фирма Anaspec, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Швейцария). Картирование эпитопа проводят по инструкциям производителя (фирма Mimotopes). Вкратце, планшеты, покрытые страптавидином (фирма NUNC, Roskilde, Дания), блокируют 0,1% БСА в ФСБ в течение ночи при 4°С. После промывки ФСБ-0,05% Твин 20 на планшеты в течение 1 ч при комнатной температуре наносят покрытие разными пептидами из библиотеки, разведенными в 0,1% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ до конечной концентрации 10 мкМ. После промывки планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с разными антителами, разведенными до 10 мкг/мл для ACI-24-Ab-3 в 2% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ. Планшеты опять промывают и инкубируют со щелочной фосфатазой, объединенной с козьим антителом против IgG мыши (фирма Jackson Immunresearch West Grove, Пенсильвания, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. После заключительного промывания планшеты инкубируют с фосфатазным субстратом (pNPP, Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури, США) и считывают через 3 ч инкубирования при 405 нм, используя ридер для планшетов ELISA.

Неожиданно было установлено, что антитело ACI-24-Ab-3 существенным образом не связывается с Aβ1-42, а также не проявляет какого-либо связывания с какими-либо другими пептидами из библиотеки, несмотря на его способность ингибировать агрегирование Aβ1-42.

Чтобы определить, может ли антитело ACI-24-Ab-3 распознавать другие Aβ пептиды, оценивали связывание с Aβ1-28, Aβ17-40, Aβ1-40 и Aβ1-42. Антитело ACI-24-Ab-3 не проявляет связывания с Aβ17-40, не связывается или слабо связывается с Aβ1-28 и Aβ1-42, но существенно связывается с Aβ1-40. Этот результат означает, что ACI-24-Ab-3 может быть специфичным в отношении Aβ1-40.

Пример 1.12, Влияние пассивной вакцинации антителом ACI-24-Ab-3 на нагрузку амилоида в мозге однократно трансгенных hAPP мышей

Для оценки in vivo способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 связать растворимый амилоид и очистить от него мозг, 6-месячных однократно трансгенных hAPP мышей, подобранных по полу и возрасту, используют для исследования пассивной иммунизации разными дозами. Нагрузку растворимого амилоида анализируют в конце исследования по мозгу животных, исследуя Aβ 1-40 и Aβ 1-42 методом ELISA (фирма TGC, Германия).

Животным, по 8-13 животных на группу, вводят с интервалом в одну неделю две инъекции моноклонального антитела в количестве 100, 300 и 1000 мкг в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции животных умерщвляют для биохимического анализа растворимой амилоидной фракции. Для подсчета количества Aβ 1-40 человека и Aβ 1-42 человека в растворимой фракции гомогенатов мозга и/или в спинномозговой жидкости (СМЖ) используют коммерчески доступные наборы для фермент-связанного иммуносорбентного анализа (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay - ELISA) (h амилоид β 40 или β 42 ELISA высокой чувствительности, фирма TGC, Швейцария). Анализ ELISA проводят по протоколу производителя. Вкратце, стандарты (разведения синтетических Aβ 1-40 или Aβ 1-42) и образцы получают в 96-луночном полипропиленовом планшете, не связывающем белки (фирма Greiner, Германия). Разведения стандарта с конечной концентрацией 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 и 15,6 пг/мл и образцы получают в образце растворителя, поставляемого в наборе ELISA, до конечного объема 60 мкл. Поскольку уровни амилоида у мышей повышаются с возрастом, и поскольку реальная оценка может быть получена при считывании образцов в рамках линейной части стандартной кривой, образцы для анализа Aβ 40 разводят 2:3, образцы для анализа Aβ 42 не разводят.

Образцы, стандарты и пустые пробы (50 мкл) добавляют в планшет из полистерола с покрытием анти-Aβ (иммобилизованное антитело избирательно распознает С-конец антигена) дополнительно с селективным конъюгатом анти-Aβ-антитело (биотинилированное выявляемое антитело) и инкубируют в течение ночи при 4°С для того, чтобы допустить формирование комплекса антитело-амилоид-антитело. На следующий день добавляют конъюгат стрептавидина-пероксидазы, через 30 мин добавляют смесь ТМВ/пероксид, что приводит к конверсии субстрата в окрашенный продукт и интенсивность окраски измеряют с помощью фотометрии на ELISA-ридере с фильтром 450 нм. Количественную оценку содержания Aβ в образцах получают путем сравнения поглощения со стандартной кривой, полученной с синтетическим Aβ 1-40 или Aβ 1-42. Данные выражают в виде индивидуальных изменений относительно средней контрольной величины (в проценте к контролю).

Пример 1.13. Влияние постоянного пассивного введения ACI-24-Ab-3 на нагрузку бляшек у дважды трансгенных мышей hAPP×PS1

Для оценки in vivo способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 связывать и уменьшать амилоидные бляшки в мозге, дважды трансгенных мышей hAPP×PS1 в возрасте 3,5 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в течение 4 месяцев в исследовании постоянной пассивной иммунизации. Амилоидные бляшки анализируют в конце исследования методами гистохимии мозга животных путем связывания тиофлавина S.

15 трансгенных мышей получают 16 еженедельных инъекций 500 мкг моноклонального антитела в ФСБ. 15 животным вводят инъекцией только ФСБ в качестве контроля. Все инъекции вводят внутрибрюшинно. При умерщвления мышей анестезируют и промывают через сердце физиологической сывороткой при 4°С для удаления крови из сосудов мозга. Затем мозг удаляют из черепной коробки, а задний мозг и передний мозг разделяют ножом в корональном/фронтальном разрезе. Передний мозг ровно разделяют на левую и правую полусферу, используя сагиттальный скальпель. Одну полусферу фиксируют в течение ночи в 4% параформальдегиде для гистологического исследования. Сагиттальные вибратомные срезы (40 мкм) нарезают для свободного плавающего инкубирования и хранят при 4°С до окрашивания в ФСБ с 0,1% азидом натрия. Пять срезов на разных уровнях окрашивают для выявления плотных бляшек тиофлавином S. Срезы всех используемых животных рандомизируют для окрашивания и подсчитывают «вслепую». Для визуализации используют микроскоп Leica DMR, оборудованный камерой Sony DXC-9100P, и анализируют, используя программное обеспечение Leica Q-Win. Интенсивность света и установку конденсора для микроскопа сохраняют постоянными на протяжении всего анализа изображений. Все полученные изображения обрабатывают на одной и той же компьютерной подпрограмме для сведения к минимуму предвзятости исследователя. Для всех анализов выбирают одинаковую пороговую плотность срезов. Область основания выбирают для автоматического подсчета амилоидной нагрузки при окрашивании тиофлавином S.

Пример 1.14. Влияние пассивной вакцинации антителом ACI-24-Ab-3 на емкость памяти у однократно трансгенных мышей hAPP

Для оценки in vivo способности антитела ACI-24-Ab-3 модифицировать или повышать когнитивную функциональность, однократно трансгенных мышей hAPP в возрасте 9 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в исследовании пассивной иммунизации. Непространственное распознавание измеряют в конце периода иммунизации с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT).

Животным, по 12 животных на группу, вводят дважды внутрибрюшинной инъекцией по 400 мкг моноклонального антитела в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции когнитивную емкость исследуют с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT)12,13. Для регистрации ORT мышей помещают на 10 мин в зону оценки поведения и оставляют с новым неизвестным объектом. Время исследования записывают. Через 3 ч тех же животных переносят в ту же зону на второй сеанс, но им предъявляют старый, ранее ими исследованный, объект, а также дополнительно новый объект. Опять записывают время исследования животными обоих объектов, а получаемый когнитивный индекс рассчитывают в виде соотношения времени исследования нового объекта относительно общего времени исследования, и выражают в виде пропорциональных изменений к контролю.

Пример 1.15. Предпочтительное связывание моноклонального антитела мыши с препаратом, обогащенным высокомолекулярным протофибриллярным олигомером пептида Aβ 1-42 сверх низкомолекулярных мономеров

Связывание моноклональных антител мыши против амилоида бета с низкомолекулярным мономер Aβ 1-42 и высокомолекулярными протофибриллярными олигомер-обогащенными препаратами пептида Aβ1-42 может быть выполнено, используя метод ELISA.

Высокоразрешающей хроматографию по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC) с использованием двух SEC колонок, Superdex 75 HR 10/30 (диапазон 3-70 кДа) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5,000 кДа), используют для получения Aβ1-42 пептидных фракций, состоящих из высокомолекулярных протофибриллярных обогащенных олигомерами и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Aβ1-42. Затем получаемые элюаты окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии элюированных фракций Aβ1-42.

Затем проводят анализ ELISA путем нанесения фракций Aβ1-42 на планшет для анализа высокого связывания в концентрации 2 мкМ на ночь. Планшеты с нанесением затем блокируют 1,0% БСА и антитело ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) добавляют в серийное разведение, начиная с 20 мкг/мл. Также используют серийное разведение стандартного антитела (6Е10, фирма Chemicon). Антитело против IgG мыши, конъюгированное со щелочной фосфатазой, и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм. Все условия исследуют с повтором с коэффициентом вариации <0,2.

Связывание антитела мыши ACI-24-Ab-3 против Aβ (мышь EJ1A9) и контрольного антитела 6Е10 измеряют методом ELISA. Таблица 1.4 и фиг.5 показывают величины оптической плотности (ОП) для антитела ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) при связывании с протофибриллярными олигомерами обогащенными и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Аβ1-42. Таблица 1.5 и фиг.6 показывают величины оптической плотности (ОП) для 6Е10 анти-Aβ1-42 контрольного антитела при связывании с протофибриллярными олигомерами обогащенными и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Aβ1-42 человека.

Эти результаты показывают, что моноклональное антитело ACI-24-Ab-3 проявляет повышенное связывание с Aβ1-42 пептидами, имеющими PF/олиго морфологию более высокого порядка по сравнению с низкомолекулярным мономерным пептидом. Кроме того, эти результаты подтверждают, что ACI-24-Ab-3 связывается с эпитопом, который преимущественно проявлен на протофибриллярных обогащенных олигомером фракциях Aβ1-42.

Пример 1.16. Связывание моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 с мономерами и олигомерами амилоидного пептида β 1-42

Оценивают связывание антитела ACI-24-Ab-3 против амилоида Р (клон: EJ1A9) с мономерами и олигомерами пептида Aβ1-42. До связывания в этом исследовании антитело хранят при -80°С. Пептид Aβ 1-42 (W.M. Keck Facility, Иельский Университет) хранят в виде лиофильно высушенного порошка до использования. Все другие используемые реактивы приобретают на фирме Sigma-Aldrich (фирма Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Швейцария), если не указано иначе.

Для получения мономерных и высокомолекулярных фракций с улучшенным обогащенным олигомером пептидом Aβ1-42, используют улучшенную методологию с применением высокоразрешающей хроматографии по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC). Две колонки SEC, Supeico TSK G4000PW-XL (диапазон: 10-1500 кДа, фирма Sigma) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5000 кДа, фирма GE Healthcare Bio-Sciences AB Уппсала, Швеция) используют для получения пептидных фракций Aβ1-42, обогащенных низкомолекулярными мономерными и высокомолекулярными олигомерными фракциями. Получаемые SEC элюаты затем окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии фракций Aβ 1-42 (данные не представлены). Для исследования связывания антитела с фракциями Aβ 1-42 используют метод ELISA. Фракции Aβ 1-42 наносят в планшеты для анализа высокого связывания в количестве 2,2 мкМ в ФСБ в течение 2 ч. Планшеты с покрытием затем промывают пять раз 0,05% твин-20 в ФСБ и блокируют 1,0% БСА. Анти-Aβ антитела, включая контрольное антитело (6Е10), добавляют к серийному разведению, начиная с указанных концентраций. Антитело против IgG мыши, соединенное со щелочной фосфатазой (фирма Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Великобритания), и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм после 14 ч инкубирования при комнатной температуре. Анализ повторяют трижды. Фиг.7 показывает величины средней оптической плотности (±SEM), полученные в трех независимых анализах ELISA. Антитело ACI-24-Ab-3 показывает повышенное связывание с препаратом Aβ1-42, обогащенным олигомерами, по сравнению с фракцией, не обогащенной олигомерами и состоящей преимущественно из мономеров Aβ1-42 (фиг.7А). Напротив, контрольное антитело 6Е10 связывается одинаково хорошо с обеими фракциями Aβ1-42. Таблицы 1.6 и 1.7 показывают величины ОП, полученные в анализах ELISA 1, 2 и 3, для антител ACI-24-Ab-3 и 6Е10, соответственно.

Эти результаты показывают, что антитело ACI-24-Ab-3 (клон: EJ1A9) проявляет повышенное сродство с обогащенными олигомерами препаратами Aβ1-42, по сравнению со сродством с мономерными препаратами Aβ1-42.

Пример 2. Антитело, выработанное путем иммунизации пэгелированной надмолекулярной антигенной конструкцией

Пример 2.1. Способы получения надмолекулярных антигенных конструкций

2.1.1. Синтез антигена пэгелированного β-амилоидного пептида

Для повышения иммунного ответа используют якорь/спейсер для восстановления пептида в липосоме, например полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ ковалентно присоединен к остатку лизина по двум концам пептида. С другим концом цепи (ПЭГ n=70) ковалентно связан фосфатидилэтаноламин (ФЭА) для функционирования в качестве элемента заякоривания в двойном слое липосомы. Таким образом, липосома продолжает функционировать в качестве адъюванта и пептид, достаточно далеко расположенный от двойного слоя, может быть процессирован отдельно, и таким образом повышается его иммуногенность по сравнению с пальмитилированным антигеном.

Надмолекулярные конструкции, описанные в настоящем изобретении, синтезируют, используя только стандартную Fmoc/tBu аминокислотную защиту боковой цепи. Обычно пэгелирование пептидов приводит к смесям региоизомеров. В настоящем изобретении применяют обычный способ сайт-специфического присоединения конъюгата ПЭГ-липид к обоим концам, С- и N-, пептида Aβ, используя частично защищенные пептиды.

Для таких пептидных последовательностей, содержащих внутренние остатки Lys или His (22-35), к каждому концу добавляют ортогонально защищенный Lys(ivDde). Дополнительный остаток Gly добавляют к С-концу для облегчения синтеза. Группу Fmoc удаляют 20% пиперидином в DMF и N-ацетилируют, используя уксусный ангидрид. Селективного расщепления групп ivDde достигают 3% гидразингидратом в DMF в течение 1 ч. 2-хлортритиловая смола предпочтительнее по сравнению с более широко используемой смолой Ванга, поскольку установлено, что она более устойчива к гидразинолизису. Кроме того, 2-хлортритиловая смола чрезвычайно чувствительна к кислотам и поэтому, в отличие от смолы Ванга, позволяет выделять защищенные пептиды. В самом деле, необходимо провести реакцию объединения в растворе в виде объединения смолы-связанного пептида с ранее активированным липидным реагентом DSPE-ПЭГ-8РА не приводит к какому-либо объединенному продукту. Такое избирательное отщепление от смолы в мягких условиях (уксусная кислота/ трифторэтанол/ дихлорметан, 1:1:8, 1 ч, комнатная температура) дает внутренне защищенные пептиды.

Соединение в фазе раствора успешно достигают с пептидами, производными от последовательностей Aβ22-35 и Aβ29-40, соответственно, с DSPE-ПЭГ-SPA в ДМСО при избытке основания. Реакции затем заглушают добавлением избытка этаноламина в течение 2 и раствор лиофилизируют.

Для последовательности 29-40 не требуется специальной стратегии защиты.

Оценка методом ВЭЖХ (полупрепаративная обратной фазы С4 колонка) позволяет получить чистоту 50-70% N- и С- концевых конъюгатов ПЭГ-липид, идентичность которых подтверждают методом MALDI (matrix assisted laser desorption ionization - масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией при содействии матрицы). Каждую последовательность, проявившую существенную вариацию, касающуюся легкости вступления реакции соединения, и условия соответствующим образом выверяют (температура, число мольных эквивалентов ОЗРЕ-ПЭГ-ЗРА, время). Для отделения избытка DSPE-FOF-SPA от желаемого продукта применяют очистку ВЭЖХ. Разделение моно- и ди- соединенных продуктов до итогового снятия защиты с боковых цепей может быть достигнуто с помощью использования катион-обменной хроматографии. Последующее удаление защиты боковой цепи пептида и удаление избытка закаленного DSPE-ПЭГ-SPA приводит к выделению целевых конъюгатов с приемлемой степенью чистоты.

Такой подход к синтезу N- и С-концевых липид-ПЭГ β-амилоидных антигенов, используя защищенные пептиды, может быть применен к широкому кругу различных пептидных последовательностей.

Пример 2.2. Антитела, индуцированные надмолекулярными антигенными конструкциями

Получение моноклональных антител, содержание которых повышается против пэгелированных Aβ22-35 и Aβ29-40 надмолекулярных антигенных конструкций

Липосомальные антигены получают согласно описанию Nicolau и др. (PNAS, 99, 2002, cc.2332-37). Последовательности ПЭГ-Aβ22-35 и -Aβ29-40 восстановлены в конструкцию, состоящую из липосом, полученных из димиристоилфосфатидилхолина (dimyristoyl phosphatidyl choline - DMPC), димиристоилфосфатидилэтаноламина (dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine - DMPEA), димиристоилфосфатидилглицерина (dimyristoyl phosphatidyl glycerol - DMPG) и холестерина (мольные соотношения 0,9:0,1:0,1:0,7), содержащих монофосфорильный липид А (40 мг/мМ фосфолипидов). Эти антигены используют для иммунизации мышей C57BL/6 с двухнедельными интервалами. По 10-12 животных иммунизируют каждым из антигенов. После 3-6 иммунизации мышей с терапевтическими титрами (при которых разведение сыворотки 1:5000 положительны по методу ELISA) отбирают для слияния. Клетки селезенки собирают от иммунизированных животных и получают гибридомы путем гибридизации сенсибилизированных клеток селезенки с линией клеток миеломы. Гибридизацию В-лимфоцитов мыши из селезенки проводят с клетками линии миеломы SP2-0 (фирма АТСС, Manassas, Вирджиния), используя хорошо известные способы Kohler и Milstein (Nature 256, 1957, cc.495-497) и Harlow и Lane (кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, изд. Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк).

Клетки индуцируют к слиянию добавлением полиэтиленгликоля. Получаемые гибридные клетки затем клонируют обычным образом, например, используя серийные разведения. Клоны гибридомы, вырабатывающие IgG, отбирают и исследуют на специфичность связывания с пептидом Aβ1-42 методом ELISA, и получаемые клоны, которые вырабатывают требуемые моноклональные антитела, культивируют.

Полученные таки образом гибридомы отбирают химически, помещая клетки в селективную среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin, thymidine - HAT).

Гибридомы последовательно подвергают скринингу для определения способности вырабатывать моноклональные антитела против специфических связанных с амилоидом заболеваний и расстройств. Гибридомы, вырабатывающие исследуемые антитела, клонируют, размножают и хранят замороженными для будущего использования. Предпочтительная гибридома вырабатывает моноклональное антитело с изотипом IgG.

Пример 2.3. Специфическое определение антител ACI-H-Ab-9 и ACI-12-Ab-11

Для анализа специфичности антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 различные концентрации ранее сформированного амилоида 1-42, 1-40 и 17-40, 1-28 фибрилл наносят на мембрану из нитроцеллюлозы Hybond ECL (фирма Amersham Biosciences). После блокирования 10% сухим молоком и 0,7% твин 20 мембраны инкубируют с основным антителом в концентрации 20 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки мембраны инкубируют с пероксидазой хрена, объединенной с овечьим антителом против мышиного IgG (фирма Amersham Biosciences), в течение 1 ч при комнатной температуре, промывают и инкубируют с хемилюминесцентным раствором с последующим экспонированием мембраны на рентгеновской пленке.

Для измерения связывания моноклональных антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с амилоидом β 1-42, 1-40 и 17-40, волокна 1-28 заранее формируют в течение семи суток при 37°С и наносят на мембрану. 20 мкг/мл антитела используют для измерения связывающей способности, и связанное антитело выявляют объединенным с пероксидазой хрена овечьим антителом против IgG мыши в течение 20 мин обработки.

Пример 2.4. Исследование флуоресценции с применением тиофлавина Т (Th-T)

Для измерения подавления ингибирования и дезагрегирования, свойственных моноклональному антителу, используют анализ флуоресценции с применением_тиофлавина Т (Th-T), который специфически связывается с фибриллярными молекулами Aβ1-42, и впоследствии интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Aβ1-42 филаментов в растворе.

Порошок лиофилизированного Aβ1-42 восстанавливают в гексафлюороизопропаноле до концентрации 1 мМ. Раствор пептида обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре, перемешивают в течение ночи, и аликвоты помещают в микроцентрифужный пробирки (без силикона). Гексафлюороизопропанол затем выпаривают в струе аргона. Полученную пептидную пленку высушивают в вакууме в течение 10 мин и хранят при -80°С до применения.

2.4.1. Исследование агрегирования Aβ1-42

Для исследования опосредованного антителом подавления агрегирования Aβ1-42, антитело, предварительно разведенное в ФСБ, и раствор для исследования, содержащий приведенные ниже компоненты, получают в пробирках без силикона: 3,3 или 0,33 мкмоля предварительно разведенного антитела, 10 мкмолей тиофлавина Т, 33 мкмоля Aβ1-42 и 8,2% ДМСО. Следовательно, итоговые мольные соотношения антитела к Aβ1-42 составляют 1:10 и 1:100. Также получают соответствующие контрольные растворы. Растворы затем инкубируют в течение 24 ч при 37°С и спектральную флуоресценцию (в относительных единицах флуоресценции - ОЕФ) считывают в шести повторах в черных 384-луночных планшетах (фирма Perkin-Elmer) на спектрофлуорометре Perkin-Elmer FluoroCount. Подавление агрегирования или дезагрегирование выражают в виде среднего процента подавления или дезагрегирования, соответственно, по следующему уравнению:

Процент подавления = ( ОЕФ положительного контроля-ОЕФ отрицательного контроля ) ( О Е Ф   о бразца с A β 1-42-ОЕФ образца без A β 1-42 ) ( ОЕФ положительного контроля-ОЕФ отрицательного контроля ) × 100 %

Антитело ACI-11-Ab-9 проявляет существенное подавление агрегирования Aβ1-42 относительно контроля. Мольное соотношение антитела к Aβ1-42 1:100 подавляет в среднем на 34% (3 независимых эксперимента), причем при мольном соотношении 1:10 подавление составляет 69% (2 независимых эксперимента).

Антитело ACI-12-Ab-11 также проявляет существенное подавление агрегирования Aβ1-42 относительно контроля. Мольное соотношение антитела к Aβ1-42 1:100 подавляет в среднем на 30% (2 независимых эксперимента), причем при мольном соотношении 1:10 подавление составляет 66% (2 независимых эксперимента).

2.4.2. Исследование Aβ1-42 дезагрегирования

Для анализа способности моноклонального антитела к дезагрегированию используют флуоресцентный анализ с применением тиофлавина Т (ThT), который специфически связывает фибриллярные молекулы Aβ1-42, и интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Aβ1-42 филаментов, имеющихся в растворе.

Для исследования опосредованного антителом дезагрегирования ранее агрегированного Aβ1-42, низкомолекулярный Aβ1-42, полученный согласно описанному выше, получают в виде 110 мкМ раствора в 27% ДМСО и 1х ФСБ. Этот раствор затем агрегируют при 37°С в течение 24 ч, после чего добавляют: 3,3 или 0,33 мкМ предварительно разведенного антитела и 10 мкМ тиофлавина Т. Это приводит к мольному соотношению 1:10 и 1:100 антитела к Aβ1-42 в 8,2% ДМСО. Этот раствор затем инкубируют в течение дополнительных 24 ч при 37°С. Затем измеряют спектральную флюоресценцию и рассчитывают процент дезагрегирования, описанный выше.

Антитело ACI-11-Ab-9 показывает существенное дезагрегирование ранее агрегированного Aβ1-42 в анализе дезагрегирования. При мольном соотношении антитела к Aβ1-42 1:100 дезагрегирование в среднем составляет 22% (3 независимых эксперимента), хотя при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 52% (3 независимых эксперимента).

Антитело ACI-12-Ab-11 также показывает существенное дезагрегирование ранее агрегированного Aβ1-42 в анализе дезагрегирования. При мольном соотношении антитела к Aβ1-42 1:100 дезагрегирование в среднем составляет 18% (2 независимых эксперимента), хотя при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 54% (2 независимых эксперимента).

Из указанных выше результатов следует, что антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 проявляют двойную функциональность при взаимодействии с Aβ1-42 филаментами, которая заключается в том, что оба антитела способны ингибировать агрегирование Aβ1-42 и способны дезагрегировать ранее сформированные волокна Aβ1-42.

Пример 2.5. Взаимодействия ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11

Исследуют взаимодействия между антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 и амилоидным пептидом Aβ1-42, используя резонанс поверхностного плазмона. Определяют связывание антитела мыши с мономерами или фибриллами Aβ1-42.

Все эксперименты по резонансу поверхностного плазмона проводят на приборе Biacore X (фирма Biacore AB). Реагенты для иммобилизации (EDC, NHS и этаноламин), сенсорные чипы СМ5 и SA, а также текущий буфер и буфер для образцов HBS-EP получают от фирмы Biacore AB. Натрий ацетат (10 мМ, рН 5,0) используют в качестве соединяющего буфера для повышения связывания. Фибриллярный пептид Aβ1-42 (фирма BAchem) получают добавлением буфера ФСБ к Aβ1-42 до конечной концентрации 3 мг/мл и емкости оставляют при 37°С на 7 суток. Фибриллярный пептид Aβ1-42 соединяют с сенсорным чипом СМ5, содержащим связанную с поверхностью матрицу из карбоксиметилдекстрана. Биотинилированный мономерный пептид Aβ1-42 (фирма Bachem) соединяют с сенсорным чипом SA, состоящим из матрицы из карбоксиметилдекстрана с ковалентно присоединенным страптавидином. Обычно четыре или пять концентраций моноклонального антитела исследуют серийными разведениями, используя текущий буфер. Впрыскивания проводят, начиная с самой низкой концентрации, и пропускают через проточные кюветы 1 и 2 при скорости тока 30 мкл/мин в течение 3 мин. Проточную кювету 2 не изменяют и ответы вычитают из проточной кюветы 1 для коррекции аппаратурного шума и массы рефракторных изменений. После завершения впрыскиваний поверхности немедленно промывают текущим буфером в течение 5 мин. Для удаления связанного антитела с Aβ1-42 фибрилл регенерируют поверхность путем впрыскиваний 10 мМ NaOH. Проводят кинетический анализ, используя алгоритмы для численного интегрирования и глобального анализа с применением программного обеспечения BIAevaluation 3.0. Кривые, полученные при впрыскивании определяемого в анализе вещества в разных концентрациях, накладывают и исходные данные доводят до нуля. Для подгонки кривой все данные согласовывают одновременно с гомогенным комплексом 1:1.

Определяют связывание антител мыши ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с амилоидом.

Пример 2.6. Связывание моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с амилоидными волокнами

Для анализа молекулярного связывания стороны антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с ранее сформированными волокнами проводят отрицательно контрастированную трансмиссионную электронную микроскопию.

Антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 соединяют с 8 нм коллоидным золотом по методике Slot JW, Geuze HJ (1985). Для совместного инкубирования амилоидных 1-42 (Aβ1-42) волокон, 6,65 мкмолей волокон инкубируют в течение 24 ч при комнатной температуре с антителом, меченым золотом, в мольном соотношении 1:100. Впоследствии 5 мкл образца инкубируют на свежей испускающей свет медной сетке (ячейка 200), покрытой парлодий/С пленкой в течение 45 сек, промывают трижды водой и 1 раз 2% свежеприготовленным и фильтрованным уранил ацетатом. Образцы окрашивают 2% уранил ацетатом в течение 15-20 сек. Избыток красителя на сетке отсасывают и затем высушивают на воздухе. Приготовляют по три сетки каждого образца. Сетки анализируют с помощью электронного трансмиссивного микроскопа Hitachi 7000.

Пример 2.7. Фракционирование ультрацентрифугированием в градиенте плотности

Способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 к ингибированию полимеризации Aβ1-42 волокон и дезагрегировнанию Aβ1-42-волокон исследуют ультрацентрифугированием в градиенте плотности (Rzepecki и др., 2004), основанным на распределении полученных пептидных волокон разного размера после инкубирования с антителами и без антител после анализа SDS-PAGE осаждения на ранее полученном градиенте (OptiPrep™). Одновременный анализ популяций ранее сформированных Aβ-волокон, способностей к дезагрегированию и ингибированию агрегирования совместно инкубируемых антител и связывание антител с волокнами являются очевидными преимуществами этих способов.

Для ингибирования агрегирования Aβ1-42 мономеры Aβ1-42 инкубируют с моноклональныма антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 при двух разных мольных соотношениях (мольное содержание мономера Aβ1-42 в тридцать или сто раз выше мольного содержания моноклонального антитела) с конечной концентрацией Aβ 50 мкМ. После 24 ч инкубирования при 37°С образцы наслаивают поверх ступенчатого градиента Optiprep™ и пробирки центрифугируют при 259000 g в течение 3 ч при 4°С. Собирают 15 фракций (по 140 мкл каждая), из которых фракция 1 наименее плотная фракция градиента от дна, а фракция 15 самая плотная фракция от дна градиента. Осадок также отбирают. Собранные фракции анализируют SDS-PAGE и окрашивают серебром. Концентрация Aβ1-42 для исследования ингибирования в пять раз ниже, чем для исследования дезагрегирования, что снижает кинетику агрегирования амилоида и обеспечивает измерение в линейной фазе.

Для дезагрегирования ранее сформированных фибрилл Aβ1-42 путем совместного инкубирования с моноклональными антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 (при двух разных мольных соотношениях 1:30 и 1:100, mAb + мономер Aβ1-42 с итоговой концентрацией Aβ 246 мкМ), образцы инкубируют в течение 24 ч при 37°С. Через 24 ч образцы фракционируют ультрацентрифугированием и разделяют методом SDS-PAGE, описанным выше и ранее (Rzepecki и др., 2004).

Пример 2.8. Флуоресцентное исследование для оценки подавления агрегирования Aβ1-42 филаментов и дезагрегирования ранее сформированных Aβ1-42 филаментов путем совместного инкубирования с моноклональными антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11, соответственно

BIS-ANS флуоресцентный анализ

Для оценки способности моноклональных антител к ингибированию проводят флуоресцентное исследование BIS-ANS (LeVine, 2002), которое специфически выявляет мономерную или нефибриллезную популяцию Aβ1-42 филаментов. До флуоресцентного измерения мономеры Aβ1-42 предварительно инкубируют либо с буфером (контроль), либо с моноклональными антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 (мольное соотношение моноклональных антител к пептиду Aβ1-42 составляет 1:100) в течение 14 ч при 37°С. Единицы относительной флуоресценции автоматически записывают и результаты выражают в виде изменений относительно контроля, выраженных в процентах.

Пример 2.9. Описание методом ЯМР и методом флуоресценции взаимодействия моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с С-меченым β-амилоидным 1-42 пептидом

Для оценки возможного механизма, с помощью которого mAb растворяет ранее сформированные волокна или ингибирует формирование волокон, проводят сопоставление метода флуоресцентного исследования с применением Th-T и метода ЯМР в твердом теле U-13C Tyr10 и Val12-меченого β-амилоидного 1-42 пептида. Следовательно, цель настоящего исследования заключается в анализе спектроскопией ЯМР в твердом теле перехода β-слоя в β-амилоидном пептиде, и в присутствии моноклонального антитела, и для прямого сравнения со способностью к дезагрегированию, измеренной методом флуоресцентного исследования с применением Th-T.

Спектроскопии ЯМР в твердом теле не только определяет переход вторичной структуре, но также позволяет локализовать домены Aβ1-42-пептида, которые определяют структурный переход. Метод ЯМР в твердом теле подтвердил свою применимость для решения указанной задачи, поскольку способствует определению структуры Aβ1-42-волокон (Petkova и др., 2004, Petkova и др., 2002). В частности корреляция 13Сα и 13Сβ химического сдвига с вторичной структурой (Cornilescu и др., 1999, Luca и др., 2001, Iwadate и др, 1999) является полезным инструментом для анализа изменения вторичной структуры пептида.

Синтез меченого пептида, включающего 13С предварительно меченый аланин в положении 12 (12Val) и 13С предварительно меченый тирозин в положении 10 (10Tyr), осуществляют по протоколу синтеза Fmoc. Идентичность и чистоту пептида подтверждают масс-спектроскопией MALDI. Меченый β-амилоидный пептид (1-42) используют для получения волокон путем инкубирования пептидного раствора в буфере ФСБ в течение 1 недели при 37°С. Главная проблема - плохая растворимость амилоидного β-пептида в буфере ФСБ, может быть решена следующим образом: величина рН буфера ФСБ временно повышается малыми количествами аммония для растворения амилоидного β-пептида. Исходную величину рН буфера ФСБ восстанавливают инкубированием образца в присутствии большего объема ФСБ, используя способность аммония улетучиваться.

Для измерения воздействия антител на изменение β-слоя, раствор волокон инкубируют с антителом в течение 24 ч при 37°С и для ЯМР, и для Th-T анализа. Для сравнения в реальном масштабе времени аликвоту одного и того же раствора используют для анализа Th-T флуоресценции, а оставшийся раствор лиофилизируют для измерений методом ЯМР.

Способность антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11_ к дезагрегированию исследуют путем совместного культивирования с ранее сформированным 13С-меченными амилоидными β-волокнами, используя флуоресцентный анализ Th-T.

Для исследования различий между ФСБ (контроль) и mAb инкубированием, каждый спектр распутывают, используя программу PeakFit (www.systat.com/-products/PeakFit). Линии подобраны с помощью смешанной процедуры подгонки (Lorentzian/Gaussian).

Пример 2.10. Воздействие антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на амилоидные волокна

2.10.1. Модификация конформации Aβ1-42 волокон и инициация дезагрегирования после связывания антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11

Для оценки возможного механизма, с помощью которого антитело дезагрегирует ранее сформированные бета-амилоидные волокна (Aβ1-42), проводят сопоставление тиофлавин Т (Th-T) флуоресцентного анализа, который проводят для измерения дезагрегирования, и метода ЯМР в твердом теле, который проводят для измерения вторичной конформации U-13C Tyr10 и Val12-меченого β-амилоидного 1-42 пептида.

Пример 2.11. Картирование эпитопа моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11

Картирование эпитопа моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 проводят методом ELISA, используя пептидную библиотеку, включающую в общей сложности 33 биотинилированных пептида, покрывающих полную аминокислотную (аа) последовательность Aβ1-42 (фирма Mimotopes, Clayton Victoria, Австралия, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Wangen, Швейцария). Пептиды в пептидной библиотеке состоят из 8, 9 или 10 аминокислот. Биотинилированный полный пептид Aβ1-42 (последовательность человека) используют в качестве положительного контроля (фирма Bachem, Bubendorf, Швейцария). Кроме того, более длинные пептиды, охватывающие Aβ1-28, Aβ17-40, Aβ1-40 и Aβ1-42, используют для определения более широкой области, с которой эти антитела могут связаться. Эти 4 пептида также биотинилированы (фирма Anaspec, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Швейцария). Картирование эпитопа проводят по инструкциям производителя (фирма Mimotopes), Вкратце, планшеты, покрытые страптавидином (фирма NUNC, Roskilde, Дания), блокируют 0,1% БСА в ФСБ в течение ночи при 4°С. После промывки ФСБ-0,05% Твин 20 на планшеты в течение 1 ч при комнатной температуре наносят покрытие разными пептидами из библиотеки, разведенными в 0,1% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ до конечной концентрации 10 мкМ. После промывки планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с разными антителами, разведенными до 10 мкг/мл для антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 в 2% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ. Планшеты опять промывают и инкубируют со щелочной фосфатазой, объединенной с козьим антителом против IgG мыши (фирма Jackson Immunresearch West Grove, Пенсильвания, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. После заключительного промывания планшеты инкубируют с фосфатазным субстратом (pNPP, Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури, США) и считывают через 3 ч инкубирования при 405 нм, используя ридер для планшетов ELISA.

Было установлено, что антитело ACI-11-Ab-9 существенным образом связывается с Aβ1-42, но не связывается с какими-либо другими пептидами из библиотеки. Следовательно, антитело должно иметь более 8 аминокислот для связывания с эпитопом, и/или антитело ACI-11-Ab-9 может распознать конформационный эпитоп, который имеется только в целой последовательности Aβ1-42.

Антитело ACI-12-Ab-11 также проявляет существенное связывание с Ab1-42, но подобно ACI-11-Ab-9, антитело ACI-12-Ab-11 не связывается с каким-либо из более коротких пептидов из пептидной библиотеки.

Чтобы определить, могут ли антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 распознавать другие Aβ пептиды, оценивают связывание с Aβ1-28, Aβ17-40, Aβ1-40 и Aβ1-42.

ACI-11-Ab-9 проявляет существенное связывание с Aβ1-28, Aβ1-40, Aβ1-42, но не проявляет какого-либо связывания с Aβ17-40.

Вместе эти результаты означают, что эпитоп антитела ACI-11-Ab-9 лежит в области 1-28 в Aβ, и что эпитоп или длине 8 аминокислот, и/или связывание с Aβ зависит от конформации Aβ.

ACI-12-Ab-11 проявляет существенное связывание с Ab1-40 и Ab1-42, но не проявляет какого-либо связывания с Apl-28 или с Aβ17-40. Таким образом, ACI-12-Ab-11 может связываться только с Aβ1-40 и Aβ1-42 полной длины, но не с какими-либо более короткими пептидами Aβ. Эти результаты означают, что эпитоп, который распознается антителом ACI-12-Ab-11, зависит от конформации Aβ, поскольку Aβ даже из 24 или 28 аминокислот недостаточны для связывания антитела.

Пример 2.12. Влияние пассивной вакцинации антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на нагрузку амилоида в мозге у однократно трансгенных hAPP мышей

Для оценки in vivo способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 связать растворимый амилоид и очистить от него мозг, 6-месячных однократно трансгенных hAPP мышей, подобранных по полу и возрасту, используют для исследования пассивной иммунизации разными дозами. Нагрузку растворимого амилоида анализируют в конце исследования по мозгу животных, исследуя Aβ 1-40 и Aβ 1-42 методом ELISA (фирма TGC, Германия).

Животным, по 8-13 животных на группу, вводят с интервалом в одну неделю две инъекции моноклонального антитела в количестве 100, 300 и 1000 мкг в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции животных умерщвляют для биохимического анализа растворимой амилоидной фракции. Для подсчета количества Aβ 1-40 человека и Aβ 1-42 человека в растворимой фракции гомогенатов мозга и/или в спинномозговой жидкости (СМЖ) используют коммерчески доступные наборы для фермент-связанного иммуносорбентного анализа (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay - ELISA) (h амилоид β 40 или β 42 ELISA высокой чувствительности, фирма TGC, Швейцария). Анализ ELISA проводят по протоколу производителя. Вкратце, стандарты (разведения синтетических Aβ 1-40 или Aβ 1-42) и образцы получают в 96-луночном полипропиленовом планшете, не связывающем белки (фирма Greiner, Германия). Разведения стандарта с конечной концентрацией 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 и 15,6 пг/мл и образцы получают в образце растворителя, поставляемого в наборе ELISA, до конечного объема 60 мкл. Поскольку уровни амилоида у мышей повышаются с возрастом, и поскольку реальная оценка может быть получена при считывании образцов в рамках линейной части стандартной кривой, образцы для анализа Aβ 40 разводят 2:3, образцы для анализа Aβ 42 не разводят.

Образцы, стандарты и пустые пробы (50 мкл) добавляют в планшет из полистерола с покрытием анти-Aβ (иммобилизованное антитело избирательно распознает С-конец антигена) дополнительно с селективным конъюгатом анти-Aβ-антитело (биотинилированное выявляемое антитело) и инкубируют в течение ночи при 4°С для того, чтобы допустить формирование комплекса антитело-амилоид-антитело. На следующий день добавляют конъюгат стрептавидина-пероксидазы, через 30 мин добавляют смесь ТМВ/пероксид, что приводит к конверсии субстрата в окрашенный продукт и интенсивность окраски измеряют с помощью фотометрии на ELISA-ридере с фильтром 450 нм. Количественную оценку содержания Aβ в образцах получают путем сравнения поглощения со стандартной кривой, полученной с синтетическим Aβ 1-40 или Aβ 1-42. Данные выражают в виде индивидуальных изменений относительно средней контрольной величины (в проценте к контролю).

Пример 2.13. Влияние хронического пассивного введения ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на нагрузку бляшек у дважды трансгенных мышей hAPP×PS1.

Для оценки in vivo способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 связывать и уменьшать амилоидные бляшки в мозге, дважды трансгенных мышей hAPP×PS1 в возрасте 3,5 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в течение 4 месяцев в исследовании постоянной пассивной иммунизации. Амилоидные бляшки анализируют в конце исследования методами гистохимии мозга животных путем связывания тиофлавина S.

15 трансгенных животных получают 16 еженедельных инъекций 500 мкг моноклонального антитела в ФСБ. 15 животным вводят инъекцией только ФСБ в качестве контроля. Все инъекции вводят внутрибрюшинно. При умерщвления мышей анестезируют и промывают через сердце физиологической сывороткой при 4°С для удаления крови из сосудов мозга. Затем мозг удаляют из черепной коробки, а задний мозг и передний мозг разделяют ножом в корональном/фронтальном разрезе. Передний мозг ровно разделяют на левую и правую полусферу, используя сагиттальный скальпель. Одну полусферу фиксируют в течение ночи в 4% параформальдегиде для гистологического исследования. Сагиттальные вибратомные срезы (40 мкм) нарезают для свободного плавающего инкубирования и хранят при 4°С до окрашивания в ФСБ с 0,1% азидом натрия. Пять срезов на разных уровнях окрашивают для выявления плотных бляшек тиофлавином S. Срезы всех используемых животных рандомизируют для окрашивания и подсчитывают «вслепую». Для визуализации используют микроскоп Leica DMR, оборудованный камерой Sony DXC-9100P, и анализируют, используя программное обеспечение Leica Q-Win. Интенсивность света и установку конденсора для микроскопа сохраняют постоянными на протяжении всего процесса анализа изображений. Все полученные изображения обрабатывают на одной и той же компьютерной подпрограмме для сведения к минимуму предвзятости исследователя. Для всех анализов выбирают одинаковую пороговую плотность срезов. Область основания выбирают для автоматического подсчета амилоидной нагрузки при окрашивании тиофлавином S.

Пример 2.14. Влияние пассивной вакцинации антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на емкость памяти у однократно трансгенных мышей hAPP.

Для оценки in vivo способности антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 модифицировать или повышать когнитивную функциональность, однократно трансгенных мышей hAPP в возрасте 9 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в исследовании пассивной иммунизации. Непространственное распознавание измеряют в конце периода иммунизации с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT).

Животным, по 12 животных на группу, вводят дважды внутрибрюшинной инъекцией по 400 мкг моноклонального антитела в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции когнитивную емкость исследуют с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT)12,13. Для регистрации ORT мышей помещают на 10 мин в зону оценки поведения и оставляют с новым неизвестным объектом. Время исследования записывают. Через 3 ч тех же животных переносят в ту же зону на второй сеанс, но им предъявляют старый, ранее ими исследованный, объект, а также дополнительно новый объект. Опять записывают время исследования животными обоих объектов, а получаемый когнитивный индекс рассчитывают в виде соотношения времени исследования нового объекта относительно общего времени исследования, и выражают в виде пропорциональных изменений к контролю.

Пример 2.15. Предпочтительное связывание моноклонального антитела мыши с фракциями, обогащенными высокомолекулярным протофибриллярным олигомером, пептида Aβ 1-42 сверх низкомолекулярных мономеров

Связывание моноклональных антител мыши против амилоида бета с низкомолекулярным мономер Aβ 1-42 и высокомолекулярными протофибриллярными олигомер-обогащенными препаратами пептида Aβ 1-42 может быть выполнено, используя метод ELISA.

Высокоразрешающей хроматографию по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC) с использованием двух SEC колонок, Superdex 75 HR 10/30 (диапазон 3-70 кДа) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5,000 кДа), используют для получения Aβ 1-42 пептидных фракций, состоящих из высокомолекулярных протофибриллярных обогащенных олигомерами и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Aβ1-42. Затем получаемые элюаты окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии фракций Aβ1-42.

Затем проводят анализ ELISA путем нанесения фракций Aβ1-42 на планшет для анализа высокого связывания в концентрации 2 мкМ на ночь. Планшеты с нанесением затем блокируют 1,0% БСА и антитело ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) добавляют в серийное разведение, начиная с 20 мкг/мл. Также используют серийное разведение стандартного антитела (6Е10, фирма Chemicon). Антитело против IgG мыши, конъюгированное со щелочной фосфатазой, и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм. Все условия исследуют с повтором с коэффициентом вариации <0,2.

Пример 2.16. Связывание моноклонального антитела ACI-12-Ab-11 (клон FK2A6A6) с обогащенными мономерами и олигомерами фракциями пептида Аβ 1-42

Оценивают связывание анти-Aβ дополнительного ACI-12-Ab-11 (клон: FK2A6A6) с мономерами и олигомерами пептида Aβ1-42. До применения в исследовании антитело хранят при -80°С. Пептид Aβ1-42 (W.M. Keck Facility, Йельский университет) хранят в виде лиофильного порошка до дня использования. Все другие материалы от фирмы Sigma-Aldrich (фирма Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Швейцария) если не указано иначе.

Для получения мономерных и высокомолекулярных фракций с улучшенным обогащенным олигомером пептидом Aβ1-42, используют улучшенную методологию с применением высокоразрешающей хроматографии по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC). Две колонки SEC, Supeico TSK G4000PW-XL (диапазон: 10-1500 кДа, фирма Sigma) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5000 кДа, фирма GE Healthcare Bio-Sciences АВ Уппсала, Швеция) используют для получения пептидных фракций Aβ1-42, обогащенных низкомолекулярными мономерными и высокомолекулярными олигомерными фракциями. Получаемые SEC элюаты затем окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии фракций Aβ1-42 (данные не представлены). Для исследования связывания антитела с фракциями Aβ1-42 используют метод ELISA. Фракции Aβ1-42 наносят в планшеты для анализа высокого связывания в количестве 2,2 мкМ в ФСБ в течение 2 ч. Планшеты с покрытием затем промывают пять раз 0,05% твин-20 в ФСБ и блокируют 1,0% БСА. Анти-Aβ антитела, включая контрольное антитело (6Е10), добавляют к серийному разведению, начиная с указанных концентраций. Антитело против IgG мыши, соединенное со щелочной фосфатазой (фирма Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Великобритания), и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм после 14 ч инкубирования при комнатной температуре. Анализ повторяют трижды.

Фиг.16 показывает среднюю (±SEM) оптическую плотность (ОП), полученную в трех отдельных исследованиях методом ELISA. Антитело ACI-12-Ab-11 показывает повышенное связывание с Aβ1-42 фракцией, обогащенной олигомерами, по сравнению с фракцией, не обогащенной олигомерами, и состоящей преимущественно из Aβ1-42 мономеров (фиг.16А). Для сравнения, контрольное антитело 6Е10 связывается одинаково хорошо с обеими фракциями Aβ1-42 (фиг.16Б). Таблицы 2.4 и 2.5 показывают величины ОП, полученные в анализах ELISA 1, 2 и 3, для антител ACI-12-Ab-11 и 6Е10, соответственно.

Эти результаты показывают, что антитело ACI-12-Ab-11 (клон: FK2A6A6) проявляет повышенное связывающее сродство с олигомер-обогащенными фракциями Aβ1-42 по сравнению с мономерным Aβ1-42.

Пример 3. Подавление связывания Aβ42-ApoE4

Оценивают связывание ApoE4 с амилоидом и способность моноклональных антител по настоящему изобретению ингибировать взаимодействие между ApoE4 и Aβ42.

Рекомбинантный ApoE4 человека разводят в ФСБ до 200 нМ и хранят в виде аликвот объемом 0,5 мл при -80°С. 1 мг пептида Aβ42-биотин ресуспендируют в 20 мкл ДМСО и затем в 1980 мкл ФСБ/О, 1% БСА/0,1% азиде натрия для получения конечной концентрации раствора 0,5 мг/мл. Анализ ELISA применяют для определения связывания rhApoE4 с Aβ42. rhApoE4 (100 нМ) инкубируют в течение 3 ч при 37°C с Aβ42-биотином (1 мкМ) для осуществления связывания белка с пептидом. Смесь наносят на планшет, покрытый стрептавидином, ранее трижды промытый ФСБТ (ФСБ+0,05% Твин 20). После 1 ч инкубирования при комнатной температуре планшеты промывают трижды ФСБТ и блокируют в течение ночи при 4°С в ФСБ, содержащем 0,1% БСА. Связанный белок ApoE4 выявляют с антителом IgG1 мыши против ApoE человека в разведении 1:3000 в ФСБ и наносят на планшет в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Планшет промывают 4 раза буфером ФСБТ и затем инкубируют 1 ч при комнатной температуре с антителом для выявления, антимышиным IgG, соединенным со щелочной фосфатазой (Alkaline Phosphatase - АР) в разведении 1:5000 в ФСБ. После последнего промывания в 4х ФСБТ планшеты инкубируют в течение 5,5 ч с АР субстратом pNPP (фосфатазный субстрат, 4-нитрофенилфосфат двухнатриевая соль гексагидрат) и считывают при 405 нм, используя ридер для планшетов ELISA. Фиг.17 представляет результаты эксперимента.

Анализ ELISA проводят, осуществляя 8 раз двукратные разведения смеси rhApoE4 (150 пМ) и Aβ42-биотина (1,5 мкМ). Затем добавляют отрицательные контроли: (1) только rhApoE4, (2) Aβ42-биотин и (3) rhApoE4-Aβ42-биотин (протокол без мышиного анти-ApoE4). Фиг.18 показывает, что положительный сигнал получают, только если присутствует и rhApoE4, и Aβ42-биотин, и если соблюдают полный протокол ELISA.

Для оптимизации концентраций rhApoE4 и Aβ42-биотина в анализе исследуют разведения rhApoE4 (например, 150 нМ) с постоянной концентрацией Aβ42-биотина (например, нормальной: 1,5 мкМ или избыточной: 15 мкМ). Фиг.19 показывает, что избыток Aβ42-биотина разбавляет сигнал анализа ELISA, поскольку меньше Aβ42-биотина, объединенного с rhApoE4, связывается с планшетом. Основываясь на этом исследовании, выбирают оптимальную концентрацию rhApoE4.

Концентрацию Aβ42-биотина в исследовании оптимизируют, используя константную концентрацию rhApoE4, составляющую 100 нМ. Разведения Aβ42-биотина (например, со стартовой концентрации 1,5 мкМ (разведенной до пониженных концентраций, например, до более низкой концентрации 1500 нМ)) исследуют методом ELISA. Основываясь на результатах, представленных на фиг.20, выбрана оптимальная концентрация 1 мкМ Aβ42-биотина для определения влияния моноклональных антител на связывание rhApoE4 с Aβ42-биотином.

Воздействие одного или нескольких антител по настоящему изобретению на связывание rhApoE4 с Aβ42-биотином оценивают, используя описанный выше анализ ELISA, но дополнительно включают антитело по настоящему изобретению в связывающуюся смесь перед нанесением. Например, могут быть применены двукратные разведения антитела, начиная с концентрации 50 мкг/мл. Включение антитела может быть в момент первого комбинирования ApoE4 и Aβ42-биотина или может быть позднее (например, через несколько часов) первого комбинирования ApoE4 и Aβ42-биотина. В указанном выше случае оценивают способность антитела по настоящему изобретению предупреждать или ингибировать взаимодействие ApoE4 и Aβ42-биотина, причем в последнем случае оценивают способность антитела прерывать ранее существовавший комплекс между ApoE4 и Aβ42-биотин.

Таблицы

Депонирование

Приведенные ниже линии клеток гибридом депонированы в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ) в Брауншвейге по адресу: Mascheroder Weg 1 В, 38124 Branuschweig, согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры:

Литература

Bard F, Cannon С, Barbour R, Burke RL, Games D, Grajeda H, Guido Т, Hu K, Huang J, Johnson-Wood K, Khan K, Kholodenko D, Lee M, Lieberburg I, Motter R, Nguyen M, Soriano F, Vasquez N, Weiss K, Welch B, Seubert P, Schenk D, Yednock T. Nature Med. 6, 2000, cc.916-919.

Barghorn S, Nimmrich V, Striebinger A, Krantz C, Keller P, Janson B, Bahr M, Schmidt M, Bitner RS, Harlan J, Barlow E, Ebert U, Hillen H. Globular amyloid beta-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J Neurochem 95, 2005, cc.834-847.

Baschong W, Wrigley NG. Small colloidal gold conjugated to Fab fragments or to immunoglobulin G as high-resolution labels for electron microscopy: a technical overview. J Electron Microsc Tech 14, 1990, cc.313-323.

Blond, Goldberg, PNAS, 84(5), 1987, cc.1147-1151.

Cornilescu G, Delaglio F, Bax A. J.Biomol.NMR, 13, 1999, cc.289-302.

Burdick D. и др. Assembly and aggregation properties of synthetic Alzheimer's A4/beta amyloid peptide analogs. J. Biol. Chem. 267, 1992, cc.546-554.

DeMattos Bales KR, Cummins DJ, Dodart JC, Paul SM, Holtzmann D.M. Proc Natl Acad Sci USA 98, 2001, cc. 8850-8855.

Dewachter I, Van DJ, Smeijers L, Gilis M, Kuiperi C, Laenen I, Caluwaerts N, Moechars D, Checler F, Vanderstichele H, Van LF. Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilin1. J Neurosci 20, 2000, cc.6452-6458.

Dewachter I, Reverse D, Caluwaerts N, Ris L, Kuiperi C, Van den HC, Spittaels K, Umans L, Serneels L, Thiry E, Moechars D, Mercken M, Godaux E, Van Leuven F Neuronal deficiency of presenilin 1 inhibits amyloid plaque formation and corrects hippocampal long-term potentiation but not a cognitive defect of amyloid precursor protein [V717I] transgenic mice. J Neurosci 22, 2002, cc.3445-3453.

Glenner, Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 1984, cc.885-890.

Harlow, Lane, кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, изд. Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк.

Heneka MT, Sastre M, Dumitrescu-Ozimek L, Dewachter I, Walter J, Klockgether T, Van LF. Focal glial activation coincides with increased BACE1 activation and precedes amyloid plaque deposition in APP[V717I] transgenic mice. J Neuroinflammation 2, 2005, с.22.

Hodgson и др., Bio/Technoloy, 9, 1991, с.421.

Iwadate M, Asakura Т, Williamson MP. J.Biomol.NMR, 13, 1999, cc.199-211.

Kirschner, D.A., Abraham, C., & Selkoe, D.J. X-ray diffraction from intraneuronal paired helical filaments and extraneuronal amyloid fibers in Alzheimer disease indicates cross-beta conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 1986, cc.503-507.

Khaw, В. А. и др. J. Nucl. Med. 23, 1982, cc.1011-1019.

Kennedy, J. H., и др., Clin. Chim. Acta 70, 1976, cc.1-31.

Klein WL (2002) Abeta toxicity in Alzheimer's disease: globular oligomers (ADDLs) as new vaccine and drug targets. Neurochem Int 41(5), 2002, cc.345-352.

Kohler, Milstein, Nature, 256, 1975, cc.495-497

LeVine, H. Ill, Arch Biochem Biophys 404, 2002, cc.106-115.

Luca и др., 2001

McGeer и др., 1994

Moechars D, Dewachter I, Lorent K, Reverse D, Baekelandt V, Naidu A, Tesseur I, Spittaels K, Haute CV, Checler F, Godaux E, Cordell B, Van LF. Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem 274, 1999, cc.6483-6492.

Nelson, R. & Eisenberg, D. Recent atomic models of amyloid fibril structure. Curr. Opin. Struct. Biol., 2006.

Nicolau, C., Greferath, R,, Balaban, T. S., Lazarte, J. E., and Hopkins, R. J. Proc Natl Acad Sci USA 99, 2002, cc.2332-2337.

Queen и др., Proc. Natl Acad Sci USA, 86, 1989, cc.10029-10032.

Pearson W.R., Methods in Enzymology 183, 1990, cc.63-98.

Petkova AT, Buntkowsky G, Dyda F, Leapman RD, Yau WM, Tycko R. J.Mol.Biol., 335, 2004, cc.247-260.

Petkova AT, Ishii Y, Balbach JJ, Antzutkin ON, Leapman RD, Delaglio F, Tycko R. Proc.Nat..Acad.Sci.U.S.A, 99, 2002, cc.16742-16747.

Rousseaux и др., Methods Enzymology, 121, 1986, cc.663-669, Academic Press.

Rzepecki, P., Nagel-Steger, L., Feuerstein, S., Linne, U., Molt, O., Zadmard, R., Aschermann, K., Wehner, M., Schrader, T. and Riesner, D. J Biol Chem 279, 2004, cc.47497-47505.

Sambrook и др. Molecular Biology: A Laboratory Manual, изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989.

Schenk D, Barbour R, Dunn W, Gordon G, Grajeda H, Guido T, Hu K, Huang J, Smith, S. O., and Bormann, B. J. Proc Natl Acad Sci USA 92, 1995, cc.488-491.

Schenk и др., 1999

Schurs, A. H. W. M., и др. Clin. Chim Acta 81, 1977, cc.1-40.

Selkoe DJ. Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 2000, cc.17-25.

Slot JW, Geuze HJ. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur J Cell Biol 38, 1985, cc.87-93.

Smith, Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, cc.482-489.

Van dA I, Wera S, Van LF, Henderson ST A ketogenic diet reduces amyloid beta 40 and 42 in a mouse model of Alzheimer's disease. Nutr Metab (Lond) 2, 2005, с.28.

Wagner и др. Journal of Liposome Research Vol 12(3), 2002, cc.259-270.

Ye, J., Dave, U. P., Grishin, N. V., Goldstein, J. L., and Brown, M. S. Proc Natl Acad Sci USA 97, 2000, cc.5123-5128.

Zrein и др., Cinincal and Diagnostic Laboratory Immunology, 5(1), 1998, cc.45-49.

Experimental Eye Research 78, 2004, cc.243-256.

WO 2004/058258

WO 96/1359

WO 96/29605

1. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающий β-амилоидный пептид 1-40 (Аβ 1-40), причем указанное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент включает:
(а) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и
(б) вариабельную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, где аминокислота в положении 52 SEQ ID NO: 8 является цистеином.

2. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающий β-амилоидный пептид 1-42 (Аβ 1-42) и 1-40 (Аβ 1-40), причем указанное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент включает:
(а) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и
(б) вариабельную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

3. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающий β-амилоидный пептид 1-40 (Аβ 1-40), в котором: определяющие комплементарность области CDR указанного антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента представляют собой:
(i) вариабельную область CDR1 легкой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9;
(ii) вариабельную область CDR2 легкой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10;
(iii) вариабельную область CDR3 легкой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11;
(iv) вариабельную область CDR1 тяжелой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12;
(v) вариабельную область CDR2 тяжелой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, где Хаа в положении 3 является цистеином, и
(vi) вариабельную область CDR3 тяжелой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.

4. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающий β-амилоидный пептид 1-42 (Аβ 1-42) и 1-40 (Аβ 1-40), в котором: CDRs указанного антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента представляют собой:
(i) вариабельную область CDR1 легкой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21;
(ii) вариабельную область CDR2 легкой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22;
(iii) вариабельную область CDR3 легкой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23;
(iv) вариабельную область CDR1 тяжелой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24;
(v) вариабельную область CDR2 тяжелой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25; и
(vi) вариабельную область CDR3 тяжелой цепи антитела с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26.

5. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по п.1, где антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент вырабатывается гибридомными клетками линии EJ1A9, депонированной с получением коллекционного номера DSM АСС2844.

6. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по п.2, где антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент вырабатывается гибридомными клетками линии FG1F9E4, депонированной с получением коллекционного номера DSM АСС2845.

7. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающий β-амилоидный пептид 1-42 (Аβ 1-42) и 1-40 (Аβ 1-40), включающий вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и вариабельную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и где антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент вырабатывается гибридомными клетками линии FK2A6A6, депонированной с получением коллекционного номера DSM АСС2846.

8. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1-7, где антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент связывают олигомерный бета амилоид и/или протофибриллы с большим молекулярным весом.

9. Антитело по любому из пп.1-8, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

10. Антитело по любому из пп.1-9, где антитело является выделенным антителом.

11. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело представляет собой химерное антитело или человеческое антитело.

12. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

13. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1-12, где эпитоп-связывающий фрагмент представляет собой Fab, F(ab′)2, scFv или фрагмент Fv.

14. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1-13.

15. Выделенный полинуклеотид по п.14, включающий по меньшей мере одну из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:15-16.

16. Выделенный полинуклеотид по п.14, включающий по меньшей мере одну из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:27-30.

17. Терапевтическая композиция для лечения заболеваний или расстройств, вызванных или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками, причем указанная терапевтическая композиция включает антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по одному из пп.1-13 в терапевтически эффективном количестве.

18. Терапевтическая композиция по п.17, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или эксципиент.

19. Терапевтическая композиция по п.17, дополнительно включающая также биологически действующее вещество, выбранное из одного или нескольких соединений, применяемых в лечении заболеваний и расстройств, вызванных или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая амилоидоз, соединений против окислительного стресса, противоапоптических соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, например, пирензепина и метаболитов, 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты, 1,3-пропандисульфоната, активаторов секретазы, ингибиторов β- и γ-секретазы, тау белков, нейротрансмиттеров, разрушителей β-слоев, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы, например, такрина, ривастигмина, донепезила, галантамина и/или пищевых добавок.

20. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по одному из пп.1-13, предназначенное для использования при:
а) лечении заболеваний или расстройств, вызываемых или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками, в том числе амилоидоза; или
б) лечении или облегчении симптомов заболеваний или расстройств, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, или
в) снижении нагрузки бляшек в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге; или
г) снижении количества бляшек в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге; или
д) снижении общего количества растворимого бета амилоида в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого бета амилоида в мозге; или
е) сохранении или повышении когнитивного объема памяти у субъекта, у которого проявляется связанное с амилоидом заболевание или состояние.

21. Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по п.18, где заболевания или расстройства, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, выбраны из группы, состоящей из амилоидоза, неврологических заболеваний, болезни Альцгеймера (БА), заболеваний или состояний, отличающихся утратой когнитивного объема памяти, умеренного когнитивного поражения, болезни диффузных поражений телец Леви, синдрома Дауна, наследственного цереброспинального кровоизлияния с амилоидозом (типа Dutch); комплекса паркинсонизм-деменция Гуама, прогрессирующего супрануклеарного паралича, рассеянного склероза, болезни Крейсфельда-Якоба, болезни Паркинсона, слабоумия, связанного со СПИД, амиотропного латерального склероза, миозита с включенными тельцами (МВТ), диабета взрослых, старческого кардиального амилоидоза, эндокринных опухолей и дегенерации желтого пятна.

22. Линия клеток, которая вырабатывает моноклональное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1, 3 или 5, где линия клеток представляет собой гибридому EJ1A9, депонированную с получением коллекционного номера DSM АСС2844.

23. Линия клеток, которая вырабатывает моноклональное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.2, 4 или 6, где линия клеток представляет собой гибридому FG1F9E4, депонированную с получением коллекционного номера DSM АСС2845.

24. Линия клеток, которая продуцирует антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по п.7, где линия клеток представляет собой гибридому FK2A6A6, депонированную с получением коллекционного номера DSM АСС2846.

25. Линия клеток, которая продуцирует антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по любому из пп.1-13, где линия клеток включает полинуклеотид по любому из пп.14-16.

26. Способ диагностики предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию у пациента, включающий определение иммуноспецифического связывания антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента с эпитопом амилоидного белка в образце, полученном от пациента, который включает стадии:
(а) приведения образца, полученного от пациента, который предположительно содержит амилоидный белок, в контакт с антителом или его эпитоп-связывающим фрагментом по одному из пп.1-13,
(б) предоставления возможности для антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса,
(в) выявления образования иммунологического комплекса, и
(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце.

27. Способ по п.26, где субъектом является человек.

28. Способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани субъекта, включающий:
(а) исследование в образце ткани, полученном от подвергаемого обследованию пациента, наличия амилоидного белка, связанного с антителом или его эпитоп-связывающим фрагментом по одному из пп.1-13, где указанный образец контактирует с антителом или эпитоп-связывающим фрагментом по любому из пп. 1-13,
(б) определение количества антитела или эпитоп связывающего фрагмента, связанного с антигеном, и
(в) расчет нагрузки бляшек в ткани субъекта.

29. Способ по п.28, где субъектом является человек.

30. Способ мониторинга минимального остаточного заболевания, связанного с амилоидом, у субъекта, причем указанный способ включает:
(а) приведение образца, полученного от пациента, который предположительно содержит амилоидный белок, в контакт с моноклональным антителом или его эпитоп-связывающим фрагментом по одному из пп.1-13,
(б) предоставление возможности для антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса,
(в) выявление образования иммунологического комплекса,
(г) корреляцию наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, и
(д) сравнение количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной,
причем повышение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что у указанного субъекта все еще сохранилось минимальное остаточное заболевание.

31. Способ по п.30, где субъектом является человек.

32. Способ прогнозирования восприимчивости субъекта, подвергаемого лечению по меньшей мере одним моноклональным антителом или его эпитоп-связывающим фрагментом по одному из пп.1-13, включающий:
(а) приведение образца, полученного от субъекта, который предположительно содержит амилоидный белок, в контакт с моноклональным антителом или его эпитоп-связывающим фрагментом по одному из пп.1-13,
(б) предоставление возможности для антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса,
(в) выявление формирования иммунологического комплекса,
(г) корреляцию наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, и
(д) сравнение количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения,
причем снижение количества указанного иммунологического комплекса показывает, что у указанного субъекта велика вероятность проявления восприимчивости к лечению.

33. Способ по п.32, где субъектом является человек.

34. Набор для обнаружения амилоидного белка в биологическом образце, где набор включает антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент по одному из пп.1-13.

35. Набор для анализа по п.34, дополнительно включающий инструкции по применению антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента для связывания амилоидного белка для формирования иммунологического комплекса и выявления формирования иммунологического комплекса таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

36. Применение антитела или эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13 при изготовлении лекарственного средства для:
а) лечения заболеваний или расстройств, вызываемых или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками; или
б) лечения или облегчения симптомов; заболеваний или расстройств, вызываемых или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками.

37. Применение антитела или эпитоп-связывающего фрагмента по п.36, где заболевания или расстройства, которые связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, выбраны из группы, состоящей из амилоидоза, неврологического заболевания, болезни Альцгеймера (БА), заболевания или состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, умеренного когнитивного поражения, болезни диффузных поражений телец Леви, синдрома Дауна, наследственного цереброспинального кровоизлияния с амилоидозом (типа Dutch); комплекса паркинсонизм-деменция Гуама, прогрессирующего супрануклеарного паралича, рассеянного склероза, болезни Крейсфельда-Якоба, болезни Паркинсона, слабоумия, связанного со СПИД, амиотропного латерального склероза, миозита с включенными тельцами (МВТ), диабета взрослых, старческого кардиального амилоидоза, эндокринной опухоли и дегенерации желтого пятна.

38. Применение антитела или эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства для
а) снижения нагрузки бляшек в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге; или
б) снижения количества бляшек в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге.

39. Применение антитела или эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства для снижения общего количества растворимого бета амилоида в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого бета амилоида в мозге.

40. Применение антитела или эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства для сохранения или повышения когнитивного объема памяти у субъекта, у которого проявляется связанное с амилоидом заболевание или состояние.

41. Способ получения антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по любому из пп.1, 3 или 5, включающий стадии культивирования линии клеток по п.22.

42. Способ получения антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по любому из пп.2, 4 или 6, включающий стадии культивирования линии клеток по п.23.

43. Способ получения антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по п.7, включающий стадии культивирования линии клеток по п.24.

44. Способ получения антитела его эпитоп-связывающего фрагмента по любому из пп.1-13, включающий экспрессию полинуклеотида по любому из пп.14-16.

45. Способ по любому из пп.41-44, дополнительно включающий стадию выделения антитела.

46. Способ для:
а) лечения заболеваний или расстройств, вызываемых или связанных с амилоидом или амилоидоподобными белками, в том числе амилоидоза; или
б) лечения или облегчения симптомов заболеваний или расстройств, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобными белками, где этот способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13.

47. Способ по п.46, где заболевания или расстройства, вызываемые или связанные с амилоидом или амилоидоподобными белками, выбирают группы, состоящей из амилоидоза, неврологических заболеваний, болезни Альцгеймера (БА), заболеваний или состояний, отличающихся утратой когнитивного объема памяти, умеренного когнитивного поражения, болезни диффузных поражений телец Леви, синдрома Дауна, наследственного цереброспинального кровоизлияния с амилоидозом (типа Dutch); комплекса паркинсонизм-деменция Гуама, прогрессирующего супрануклеарнго паралича, рассеянного склероза, болезни Крейсфельда-Якоба, болезни Паркинсона, слабоумия, связанного со СПИД, амиотропного латерального склероза, миозита с включенными тельцами (МВТ), диабета взрослых, старческого кардиального амилоидоза, эндокринных опухолей и дегенерации желтого пятна у субъекта.

48. Способ по п.46, где субъектом является человек.

49. Способ для:
а) снижения нагрузки бляшек в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге; или
б) снижения количества бляшек в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге;
где этот способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп. 1-13.

50. Способ по п.49, где субъектом является человек.

51. Способ снижения общего количества растворимого бета амилоида в мозге субъекта с заболеванием или состоянием, связанным с повышенными концентрациями растворимого бета амилоида в мозге; где этот способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13.

52. Способ по п.51, где субъектом является человек.

53. Способ сохранения или повышения когнитивного объема памяти у субъекта, у которого проявляется связанное с амилоидом заболевание или состояние, где этот способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его эпитоп-связывающего фрагмента по одному из пп.1-13.

54. Способ по п. 53, где субъектом является человек.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus Bpm Vd-9, депонированный в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-31.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus Bpm Vd-8, депонированный в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-30.

Данное изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена гибридомная клеточная линия FP12H3-C2, депонированная под номером DSM ACC2750, продуцирующая антитело против бета-амилоида.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и генетической инженерии. Предложена тригибридная клетка для экспрессии белков, полученная путем гибридизации первой клетки, представляющей собой стволовую клетку или клетку, происходящую из некоммитированной клетки-предшественника, второй клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, и третьей клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, где указанная первая клетка не является клеткой миеломы, а также способ её получения и способ получения белков с её использованием.
Изобретение относится к биотехнологии. Описывается штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L.

Изобретение относится к области биотехнологиии и может быть использовано в гибридомной технологии для получения антител заданной специфичности против рекомбинантных антигенов, экспрессированных в клетках мыши.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены: изолированное антитело или его вариант, специфически распознающие PCSK9, и фармацевтическая композиция для снижения уровня холестерина-LDL на их основе.

Изобретение относится к иммунологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены варианты выделенного антитела или его фрагмента, которые специфично связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) человека, в том числе в форме меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конструкции с константным доменом иммуноглобулина, конъюгата с терапевтическим или цитотоксическим средством и в кристаллизованной форме.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложена коллекция антител (или их функциональных фрагментов), содержащих эмбриональные каркасные участки.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело против фракталкина (ФКН, CX3CL1) и его фракталкин-связывающий фрагмент, охарактеризованные последовательностями вариабельных доменов.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенное антитело-антагонист против FGFR3 и его функциональный фрагмент, а также полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ получения антитела против FGFR3 или его функционального фрагмента.

Настоящее изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, включающий выравнивание аминокислотной последовательности четвертой каркасной области (FR4) тяжелой цепи иммуноглобулина с референсной последовательностью ххххТххТххх и, в случае выявления в положении 5 и/или 8 указанной последовательности маленьких гидрофобных или неполярных аминокислотных остатков, отличных от треонина, их замену на треонин.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложено гуманизированное антитело и его фрагмент, способные специфически связывать бета-амилоид, охарактеризованные фрагментами последовательностей на основе антитела мыши 8F5, и Fc-областью человеческого IgG1, содержащей аминокислотную замену D265A; а также кодирующая нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, продуцирующие антитело или его фрагмент клетки, способ продуцирования антитела или его фрагмента; композиция, применение антитела и его фрагмента для изготовления лекарственного средства, способ предупреждения, лечения или облегчения эффектов амилоидоза; способ диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний или состояний, способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек и тест-набор для выявления и диагностики амилоид-ассоциированных бляшек.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или фрагменту этого антитела, которое специфически связывается с TNFα человека, причем антитело или фрагмент антитела содержит последовательность каркасной области тяжелой цепи человека и последовательности CDR, происходящие из антитела кролика, а также к композиции для лечения заболеваний, опосредованных TNFα, содержащей вышеуказанное антитело или фрагмент.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлен акцепторный каркас вариабельной области тяжелой цепи антитела человека или гуманизированного антитела для пересадки CDR от антитела зайцеобразного, где каркас содержит треонин (T) в положении 24; аланин (A) или глицин (G) в положении 56; треонин (T) или аспарагин (N) в положении 84 и лейцин (L) или валин (V) в положении 89 (нумерация AHo).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному антителу, которое специфически связывается с TAT211, или его функциональному фрагменту. Также раскрыты конъюгат, содержащий указанное антитело и который специфически связывает TAT211, нуклеиновая кислота, кодирующая заявленное антитело, и клетка, которая продуцирует заявленное антитело.

Изобретение относится к биохимии. Описаны способы определения: пептида Aβ(1-17) в образце; имеется ли у субъекта умеренная форма болезни Альцгеймера; имеется ли у субъекта умеренное когнитивное нарушение с продромальной формой болезни Альцгеймера и мониторинга болезни Альцгеймера.
Наверх