Штамм микромицета clonostachys candelabrum f-1466, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии francisella tularensis 15/10

Предложен штамм микромицета Clonostachys candelabrum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 15/10. Штамм микромицета выделен из почвы и депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером F-1466. Фугат культуральной жидкости штамма микромицета Clonostachys candelabrum проявляет высокую активность в отношении Francisella tularensis 15/10 начиная с третьих суток культивирования. При этом наибольшая активность достигается на четвертые сутки культивирования. Диаметр зоны подавления роста Francisella tularensis 15/10 на четвертые сутки составляет 45±5 мм. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии.

Среди микробов, подавляющих развитие возбудителя туляремии, грибы являются наименее изученной группой микроорганизмов. В научной литературе известны лишь единичные работы, посвященные данной проблеме. Из них заслуживает внимание работа по поиску новых антибиотиков из метаболитов высших грибов, обладающих бактерицидным действием в отношении возбудителя туляремии [Шариков, A.M. Выраженность бактерицидной активности гриба Inonotus obliouus pilot в отношении Francisella tularensis линии 15 НИИЭГ / A.M. Шариков, Н.В. Пашенова, И.А. Новицкий // Сибирское медицинское обозрение. - Красноярск, 2008. - №1]. Среди микромицетов выявлено 95 культур, обладающих антагонистическими свойствами в отношении Francisella tularensis, из них 41 культура показала высокую активность [Юскевич В.В. Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москтитоцидными свойствами // Автореферат канд. дис. - Оболенск, 2012]. В этой же работе приводится перечень 27 родов, в которых отмечены активные штаммы грибов. Указывается, что наиболее высокую активность проявляют следующие виды грибов: Beauveria bassiana, Acremonium pteridii, Calcarisporum arbuscula, Cosmospora berkeleyana, Clonostachys candelabrum, Fusarium oxysporum, Humicola fuscoatra, Penicillium vulpinum, P. chrysogenum, P. lilacinum, Trichoderma harzianum, T. asperellum. Однако в приведенной работе отсутствуют данные по изучению биотехнологических свойств штаммов грибов, активных в отношении возбудителя туляремии.

Известно, что грибы являются продуцентами многих биологически активных веществ, нашедших в настоящее время широкое применение в фармакологии [Петров, П.Т. Новые лекарственные средства на основе биологически активных соединений мицелиальных грибов / П.Т. Петров, А.Д. Скрипко, Е.В. Литвинова, Н.А. Дедюшко, Л.Н. Гриневич // Успехи медицинской микологии. - М., 2006. - Т. 7. - С. 198-199]. К настоящему времени только из анаморфных видов грибов выделено около 1500 антибиотиков [Дудник Ю.В. Вторичные метаболиты грибов // Современная микология в России. Первый съезд микологов России. Тезисы докладов. М: 2002 г., с. 263-264].

Известно, что по сравнению с продуктами химического синтеза грибные метаболиты менее токсичны и более эффективны при применении в медицинской практике [Holliday, J. Medicinal value of the Caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A review / J. Holliday, M. Cleaver // International Journal of Medicinal Mushrooms. - 2008. - Vol. 10, N3. - P. 219-234].

Развитие биотехнологии и микологии привело к появлению новой отрасли - фармацевтической микологии, разрабатывающей и создающей лекарственные препараты на основе природных соединений мицелиальных грибов [Феофилова, Е.П. Вклад современной микологии в создание биотехнологий медицинского назначения / Е.П. Феофилова, А.А. Алексеев, В.М. Терешина, А.С. Меморская // Успехи медицинской микологии. - М., 2004. - Т. 1 - С. 139-141].

Установлено, что на долю метаболитов грибного синтеза приходится более 50% от всех вновь открываемых биологически активных природных соединений [Бибикова, М.В. Биотехнология микромицетов - реальность и перспектива. Современная микология в России. Т. 2 / М.В. Бибикова, А.В. Катлинский // Материалы 2-го съезда микологов России. - М.: Национальная академия микологии, 2008]. Поэтому поиск грибов в качестве продуцентов биологически активных веществ, подавляющих возбудителя туляремии, является актуальной задачей современной медицинской биотехнологии.

Задачей изобретения является получение нового штамма микромицета Clonostachys candelabrum (Bonoren) Schroers с выраженными антибактериальными свойствами в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis.

Штамм гриба Clonostachys candelabrum AS-2011 выделен из почвы Звенигородкой биостанции МГУ (Одинцовский район Московской области) в августе 2011 года. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - Оболенск). Свидетельство о депонировании №393 от 25.05.2012. Штамму присвоен регистрационный номер F-1466. Штамм отобран для исследования его антибактериальных свойств путем скрининга свыше 500 штаммов 48 родов микромицетов из рабочей коллекции ГНЦ ПМБ.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма

Культурально-морфологические свойства штамма гриба Clonostachys candelabrum F-1466 исследовали после культивирования его при 24°C в течение 7 суток на овсяном агаре, агаре Чапека, агаре Сабуро. Колонии достигают 30 мм в диаметре через 7 дней при 24°C. Обратная сторона колонии от бледно-желтоватой до бледно-оранжевой. Поверхность колонии белая, порошистая до гранулированной из-за конидиофоров и конидиальных масс, воздушный мицелий скудный или отсутствует. Конидиофоры мономорфные, кисточковидные или мутовчатые, по 3-4 в мутовке. Ножка до 100 µм высотой, до 4 µм шириной в основании, кисточки до 130 µм высотой и шириной. Первичные веточки расходящиеся, формирующие свободные боковые веточки; конечные веточки и фиалиды расходящиеся или прижатые, промежуточные фиалиды под одиночными конечными фиалидами в мутовках, иногда в мутовках вместе с конечными фиалидами, почти цилиндрические, по размеру близки к конечным фиалидам. Фиалиды бутылевидные или цилиндрические, сужающиеся в верхней части, 5-8-12 µм длиной, 3-4 µм в самой широкой части и около 1 µм шириной в верхней точке, иногда деградирующие в относительно молодых колониях. Конидии в белых колонках внахлест, гладкостенные, одноклеточные от эллипсоидных до субшаровидных, 3-5,5×1,8-3,4 µм.

Биохимические особенности штамма

Штамм гриба Clonostachys candelabrum F-1466 утилизирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, не утилизирует арабинозу, ксилозу, лактозу, маннит, маннозу, сорбит. Не разлагает эскулин и салицин. Продуцирует фермент протеазу. Из источников азота лучше всего усваивает дрожжевой экстракт. В глубинной культуре на третьи сутки образуется пигмент желтого цвета.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования

Плотные питательные среды: ММС, агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар. Оптимальная температура для роста 18-24°С, максимальная - 30°С. Длительность культивирования до массовой споруляции 7-15 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования. Жидкая питательная среда: соевая мука 20 г/л, дрожжевой экстракт - 8 г/л, глюкоза - 30 г/л, KH2PO4 - 3 г/л, MgSO4 - 0.7 г/л. Глубинное культивирование при 25°С в течение 3-4 суток на качалке со скоростью вращения мешалки 220 об/мин.

Антагонистические свойства

Штамм гриба Clonostachys candelabrum F-1466 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения

1. В обезвоженном состоянии на ионообменной смоле, хранение при температуре (4-8)°С, перезакладка через 3 года.

2. Под минеральным маслом на агаре Чапека, хранение при температуре(4-8)°С, перезакладка через 1 год.

3. В жидком азоте, срок хранения не ограничен.

4. В лиофилизированном виде, хранение при температуре (4-8)°С, не менее трех лет.

Пример 1. Выращивание штамма Clonostachys candelabrum F-1466 на твердой питательной среде и оценка его антимикробного спектра действия

Для определения антимикробного спектра действия грибной культуры Clonostachys candelabrum F-1466 использовали метод агаровых блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задерживать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии. Гриб выращивают на плотной питательной микологической среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; агар - 15,0; глюкоза - 10,0; мальтоза - 10, NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; FeSO4×7H2O - 0,01; MgSO4×7H2O - 0,5; K2HPO4 - 1,0; гентамицин - мкг/мл. Штамм выращивают в течение 5-13 дней в термостате при температуре (24±0,5)°С. Затем из агара с исследуемой культурой Clonostachys candelabrum F-1466 пробочным сверлом вырезают блоки диаметром 5 мм и помещают на засеянные и подсушенные газоны тест-культур.

Для приготовления газонов тест-объектов используют суточные культуры, полученные из музея ГНЦ ПМБ, которые выращивают на чашках Петри со средой ГРМ (гидролизат рыбной муки). Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводят по шкале McFarlanda, используют стандарты мутности. Суспензии суточных тест-культур плотностью 106 кл/мл высевали на чашки Петри диаметром 90 мм по 0,2 мл, растирали шпателем для получения однородного газона и оставляли на 30 мин для полного впитывания в агар. Параллельно используют метод глубинного посева. В чашки Петри предварительно разливают по 10 мл питательной среды ГРМ и оставляют на сутки в термостате (для проверки на контаминацию). На следующие сутки в расплавленный агар - 100 мл добавляют 2 мл суспензии суточной тест-культуры плотностью 108 кл/мл, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в чашки Петри. Диски с культурой гриба помещают на поверхность второго слоя агара после застывания. Каждый опыт проводили в трех повторностях.

Антимикробную активность Clonostachys candelabrum F-1466 определяли на следующих бактериальных тест-культурах: Bacillus cereus В-1447, Staphylococcus aureus В-4849, Bacillus anthracis (вакцинный штамм СТИ-1), Francisella tularensis (вакцинный штамм 15/10), дрожжеподобный гриб - Candida albicans В-4845. Активность штамма гриба определяли по диаметру зоны подавления роста микробных культур. Была принята следующая шкала активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм; низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

При изучении антибактериальных свойств Clonostachys candelabrum F-1466 в отношении возбудителя туляремии оказалось, что культура F.tularensis растет гораздо медленнее, чем культура гриба. В связи с этим возникало опасение, что мицелий гриба, проникая в питательную среду и обильно разрастаясь, затруднит процесс тестирования. Для устранения этого недостатка был опробован методический прием с применением целлофановой подложки под агаровый блок. Опыты показали, что целлофановая пленка препятствует проникновению мицелия гриба на поверхность питательной среды. Вместе с тем метаболиты грибов свободно проникали через подложку и оказывали воздействие на бактериальную культуру. Данные по тестированию штамма Clonostachys candelabrum F-1466 на различных микробных культурах представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Антимикробной спектр действия штамма гриба Clonostachys candelabrum F-1466 (диаметр зоны подавления тест - культур)

Из приведенных данных следует, что штамм гриба Clonostachys candelabrum F-1466 оказывает антагонистическое воздействие на патогенные микроорганизмы различных таксономических групп. Исходя из шкалы активности наибольшая антибактериальная активность штамма гриба отмечена в отношении возбудителя золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) и особенно в отношении возбудителя туляремии (Francisella tularensis).

Пример 2. Выращивание штамма Clonostachys candelabrum F-1466 на жидкой питательной среде, получение грибной субстанции и ее испытание на активность в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis

Культуру С.candelabrum F-1466 предварительно оживляют путем засева пробирок с плотной питательной средой (агар Чапека, агар Сабуро, сусло - агар). Засеянные косяки выращивают в термостате при температуре +22-25°С в течение 5÷7 суток до массовой споруляции в зависимости от состава среды и температуры культивирования.

Для культивирования штамма в колбах используют питательную среду следующего состава (г/л):

Для засева питательной среды готовят 3-суточный инокулят. Для получения инокулята в среду помещали агаровый блок с газоном гриба, выращенного на среде Чапека. Для засева питательной среды используют инокулюм в количестве 5 мл. Культивирование осуществляют в качалочных колбах V=750 мл, содержащих 100 мл среды, при температуре 25°С на подвесной качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение 6 суток.

Культуральную жидкость каждой пробы центрифугировали при скорости вращения ротора 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получали фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который использовали для определения бактерицидной активности в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis (вакцинный штамм 15/10).

Грибная субстанция в форме ФКЖ может служить источником получения грибных метаболитов посредством ее экстрагирования и фракционирования. Для определения активности ФКЖ использовали метод лунок, в которые закапывали по 0,1 мл (100 мкл) ФКЖ. Повторность опытов 4-кратная. При этом применяли следующую шкалу активности ФКЖ: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм; низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

Таблица 2 - Активность ФКЖ штамма Clonostachys candelabrum F-1466 в отношении вакцинного штамма Francisella tularensis 15/10

Из приведенных данных следует, что ЖКЖ штамма Clonostachys candelabrum F-1466, полученные в течение 1-2 суток культивирования, не обладают активностью. Начиная с третьих суток культивирования ФКЖ проявляет высокую активность, которая сохраняется на высоком уровне в течение последующих суток.

Таким образом, штамм микромицета Clonostachys candelabrum F-1466 обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis и может быть рекомендован для получения метаболитов грибного синтеза с антибиотическими свойствами.

Штамм микромицета Clonostachys candelabrum F-1466, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 15/10, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - Оболенск), регистрационный номер F-1466.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения терминального алкена, в конкретном варианте - изобутелена, применение мевалонатдифосфат декарбоксилазы и микроорганизма, продуцирующего мевалонатдифосфат декарбоксилазу, для получения терминального алкена, а также композиция для получения терминального алкена.

Группа изобретений относится вариантам добавок к питательной среде для формирования бактериальных биопленок. Предложена добавка, состоящая из биополимера фибрина в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды и ингибитора протеиназ.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н.

Предложен способ определения антиоксидантной активности вещества, предусматривающий приготовление контрольных проб, содержащих буферный раствор и биолюминесцентный сенсор, определения исходной интенсивности биолюминесценции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к пероральной композиции для снижения холестерина в сыворотке у субъекта. Данная композиция содержит пробиотические бактерии Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 с высокой активностью гидролазы солей желчных кислот bsh, их изолят или супернатант и носитель.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотических препаратов. Защитная среда высушивания для получения симбиотического препарата содержит желатин, сахарозу, пищевой хитозан и калий фосфатный буфер в заданных соотношениях.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению бактериальных штаммов, обладающих фунгицидными и ростстимулирующими свойствами.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в фармакологии и медицине. Предложен штамм Lactobacillus rhamnosus, депонированный в ВКПМ под номером В-11816.

Представленная группа изобретений касается штаммов Bifidobacterium longum и их применений в качестве пробиотиков в виде различных составов и композиций. Изолированные штаммы Bifidobacterium longum BL1207 (PTA-9608), AH121A (NCIMB 41675), AH1714 (NCIMB 41676) экспрессируют экзополисахарид и индуцируют соотношение [IL10]:[IL12], равное, по меньшей мере, 10, по результатам анализа ко-инкубированием с мононуклеарными клетками периферической крови (РМВС), при концентрации бактерий 1×107 КОЕ/мл.

Изобретение относится к ветеринаринарной микробиологии. Питательная среда для выявления возбудителя некробактериоза содержит среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ный раствор глюкозы в заданных соотношениях компонентов.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Штамм Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 применяется в качестве продуцента ингибитора Mycoplasma hominis и может быть использован при лечении микоплазменных инфекций.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов. Штамм Тrichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 является продуцентом мембраноактивных антибиотиков-пептаиболов, обладающих антигрибковой и антибактериальной активностью.

Группа изобретений относится к микробиологии, микологии, в частности к выращиванию съедобных грибов. Предложены штамм гриба шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 (учетный номер: KCCM11135P) и плодовое тело, продуцируемое при культивировании указанного штамма.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа производств вакцины для профилактики и терапии трихофитоза крупного рогатого скота. Охарактеризованное решение включает засев матрасов культурой гриба Trichopyton verrucosum штамма ТФ-130 Л ВГНКИ на твердую питательную среду.

Изобретение относится к способу получения состава ферментационного бульона. Способ предусматривает инкубацию смеси, содержащей один или несколько ферментационных бульонов, первый компонент органической кислоты, второй компонент органической кислоты, при pH от 3,5 до 5, температуре от 20°C до 50°C в течение 8-36 ч.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и представляет собой штамм Colephoma empetri, депонированный в CGMCC с учетным номером CGMCC 4129, продуцирующий антибиотики с высоким выходом.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma hamatum обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus niger В-6 является продуцентом лимонной кислоты.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу профилактики инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с субмукозной миомой матки после гистерорезектоскопии.

Предложен штамм микромицета Clonostachys candelabrum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 1510. Штамм микромицета выделен из почвы и депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов под регистрационным номером F-1466. Фугат культуральной жидкости штамма микромицета Clonostachys candelabrum проявляет высокую активность в отношении Francisella tularensis 1510 начиная с третьих суток культивирования. При этом наибольшая активность достигается на четвертые сутки культивирования. Диаметр зоны подавления роста Francisella tularensis 1510 на четвертые сутки составляет 45±5 мм. 2 табл., 2 пр.

Наверх