Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)



Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)
Нетоксичный рекомбинантный шига токсин 2-го типа (stx2)

 


Владельцы патента RU 2573924:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (RU)

Изобретение относится к области молекулярной и медицинской биологии, а именно к генетически модифицированным белкам. Представлен белок Stx2[E167Q/R170H], который несет точечные замены двух аминокислотных остатков в участке каталитического центра субъединицы Stx2A, ответственном за протонирование аденинового кольца остатка А4324 28S РНК эукариотических рибосом, а именно точечную замену [E167Q] остатка глутаминовой кислоты в положении 167 на остаток глутамина и точечную замену [R170H] остатка аргинина в положении 170 на остаток гистидина. Полученный белок обладает более чем в 106 раз сниженной цитотоксичностью и высокой иммуногенностью. Изобретение может быть использовано для иммунизации животных, предоставляя защиту от действия сверхлетальных доз токсина Stx2 дикого типа, а также в качестве вакцины для иммунизации против ряда острых кишечных инфекций человека и животных. 4 ил., 5 табл.

 

Изобретение относится к молекулярной и медицинской биологии, а именно к генетически модифицированному белку - нетоксичному варианту шига токсина второго типа Stx2. Полученный рекомбинантный белок может служить в качестве вакцины для иммунизации против ряда острых кишечных инфекций человека и животных, а также быть использован для разработки и производства диагностических и терапевтических антител.

Обоснование проблемы

Ряд штаммов бактерии кишечной палочки Escherichia coli продуцируют один или несколько шига токсинов (Stx), составляющих семейство функционально и иммунологически различающихся мультимерных белков. Такие штаммы получили обозначение STEC (от Shiga Toxin producing Е. coli). Шига токсины кодируются двумя генами - stxA и stxB, которые считываются с общего промотора и объединены в один оперон. В составе холотоксина Stx энзиматически-активная субъединица StxA нековалентно ассоциирована с пятью субъединицами StxB, ответственными за связывание со специфическими рецепторами на поверхности некоторых эукариотических клеток (Fraser ME, Chernaia MM, Kozlov YV, James MN. (1994) Crystal structure of the holotoxin from Shigella dysenteriae at 2.5 resolution. Nat Struct Biol 1:59-64). Количественное соотношение субъединиц обеспечивается на уровне трансляции за счет более эффективной последовательности для связывания рибосом перед геном stxB. После синтеза полипептиды Stx секретируются из цитоплазмы в периплазму бактерий, где осуществляется их правильное сворачивание и происходит сборка холотоксина. При заражении STEC холотоксин высвобождается из периплазмы бактерий в полость кишечника и поражает сначала слизистую оболочку, а затем всасывается в кровь и разносится по всему организму. На поверхности чувствительных эукариотических клеток холотоксин связывается со специфическим рецептором, поглощается посредством клатрин-зависимого эндоцитоза и транспортируется по ретроградному пути через комплекс Гольджи в эндоплазматический ретикулум. Здесь субъединица StxA разрезается на StxA1 и StxA2, после чего StxA1 переносится в цитоплазму, где взаимодействует с рибосомами. StxA1 связывается с 28S РНК эукариотических рибосом и депуринизует специфический остаток аденина А4324 так называемой сарцин-рициновой петли (SRL). Это приводит к инактивации рибосом и гибели клетки (Endo Y, Tsurugi К, Yutsudo Т, Takeda Y, Ogasawara T, et al. (1988) Site of action of a Vero toxin (VT2) from Escherichia coli O157:H7 and of Shiga toxin on eukaryotic ribosomes. RNA N-glycosidase activity of the toxins. Eur J Biochem 171: 45-50; Szewczak AA, Moore PB, Chan Y-L, Wool IG. (1993) The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci USA 90: 9581-9585).

Заражение STEC вызывает у человека водную диарею, которая часто сопровождается тяжелым осложнением - геморрагическим колитом (НС) (Riley LW. (1987) The epidemiologic, clinical, and microbiologic features of hemorrhagic colitis. Annu Rev Microbiol 41: 383-407; Gyles CL. (2007) Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. J Anim Sci.85: E45-E62). Примерно в 5-10% случаев НС прогрессирует далее и развивается в смертельно опасное системное заболевание - гемолитический уремический синдром (HUS), причем особенно высокий уровень летальности наблюдается у новорожденных детей (Taylor МС. (2008) Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr Nephrol 23:1425-1431). Патогенный эффект обусловлен интоксикацией зараженного организма шига токсинами, которые являются поэтому основными факторами вирулентности (Paton JC, Paton AW. (1998) Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clin Microbiol Rev 11:450-479). Наиболее тяжелые последствия ассоциированы с продукцией токсина 2-го типа Stx2, связывающегося с рецептором Gb3/CD77.

Основными источниками заражения STEC служат, как правило, загрязненные бактериями вода и пищевые продукты. STEC широко распространены в природе: эти микроорганизмы колонизируют пищеварительный тракт практически всех домашних и многих диких животных, прекрасно адаптированы к жизни в почве, сточных водах и других водных экосистемах. В неживой природе патогенные бактерии сохраняют активность в течение продолжительных промежутков времени (JW. Yoon, Hovde CJ. (2008) All blood, No stool: enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 infection. J. Vet. Sci. 9(3):219-231). В последнее время эпидемии, вызванные STEC, были отмечены в более чем трех десятках стран шести континентов, нанося огромный материальный ущерб. Только в США ежегодно регистрируется около 100 тыс. случаев геморрагического колита, а сопутствующие медицинские расходы оцениваются в 1 млрд долларов (Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, Griffin PM & Tauxe RV. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5: 607-625; Buzby JC, Roberts T, Lin C-TJ, MacDonald JM. (1996) Bacterial foodborne disease - Medical cost and productivity losses. Agricultural Economic Report 741: 21-29. Food and Customer Economics Division, Economic Research Service, USDA, Washington DC). Несмотря на ужесточение мер санитарного контроля, заболеваемость продолжает расти.

Текущий терапевтический подход

Текущий подход к лечению STEC инфекций ограничивается применением антимикробных агентов общего действия и обладает существенными недостатками:

1) антимикробные агенты только убивают бактерии, но не способны удалить уже синтезированный токсин - ведущий фактор патогенности. Поскольку в норме E.coli является одним из основных обитателей пищеварительного тракта человека, при заражении штаммами STEC реакция иммунной системы организма-хозяина на вирулентные микроорганизмы происходит с задержкой. Первые видимые симптомы заболевания выявляются только после того, как продуцированный бактериями токсин был уже поглощен в кишечнике, поступил в кровь и распространяется по организму больного. Антимикробная терапия оказывается поэтому слишком запоздалой;

2) недостаточная селективность используемых соединений не позволяет дифференцировать патогенные штаммы от непатогенных микроорганизмов. Поэтому их применение часто служит причиной последующих долговременных нарушений динамики флоры кишечника, что приводит к серьезным расстройствам пищеварения (Guarner F, Malagelada JR. (2003) Gut flora in health and disease. Lancet 361:512-519);

3) вследствие адаптивной эволюции штаммы STEC приобрели множественную лекарственную устойчивость, и все известные современные антибиотики являются неэффективными (Safdar N, Said A, Gangnon RE, Maki DG. (2002) Risk of hemolytic uremic syndrome after antibiotic treatment of Escherichia coli O157:H7 enteritis. A meta-analysis. JAMA 288: 996-100). Более того, применение ряда препаратов, широко используемых для терапии других кишечных инфекций (триметоприм-сульфаметоксазол, ципрофлоксацин и др.), даже стимулирует продукцию Stx в организме больного и приводит к дальнейшему обострению болезни (Zhang X, McDaniel AD, Wolf LE, Keusch GT, Waldor MK, Acheson DWK. (2000) Quinolone antibiotics induce shiga toxinencoding bacteriophages, toxin production, and death in mice. J Infect Dis 181:664-670).

Таким образом, эффективных медикаментозных средств против последствий вызываемой STEC интоксикации Stx2 в широкой медицинской практике в настоящее время не существует.

Перспективные направления терапии

В современной медицине все более широкое применение находит иммунотерапия (Chames Р, Van Regenmortel М, Weiss Е, Baty D. (2009) Therapeutic antibodies: Successes, limitations and hopes for the future. Br. J. Pharmacol. 157:220-233). На фармацевтическом рынке представлено уже более 20 моноклональных антител для терапии различных воспалительных процессов (Reichert JM. (2011) Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs 3: 76-99). Иммунологические подходы представляются весьма перспективными и для терапии интоксикации Stx2, поскольку: 1) специфические антитела являются единственными известными агентами, способными непосредственно нейтрализовать токсин; 2) Stx2 является хорошей антигенной мишенью для специфических антител, так как значительно отличается по структуре от аутоантигенов, экспрессируемых клетками хозяина.

Для борьбы с интоксикацией Stx2 возможны два основных направления - иммунопрофилактическое и иммунотерапевтическое. В первом случае посредством превентивной иммунизации у человека или животных генерируется высокий титр специфических защитных антител, которые нейтрализуют токсин Stx2 в случае его поступления в кровь при заражении STEC. Эксперименты на животных показали, что иммунизация различными вариантами Stx полностью предотвращает развитие у подопытных особей патологических симптомов, вызываемых введением соответствующего токсина или заражением продуцирующими токсин бактериями (см., например, Bielaszewska М, Clarke I, Karmali MA and M Petric. (1997) Localization of intravenously administered verocytotoxins (Shiga-like toxins) 1 and 2 in rabbits immunized with homologous and heterologous toxoids and toxin subunits. Infect. Immun. 65: 2509-2516; Bosworth ВТ, JE Samuel, HW Moon, AD O'Brien, VM Gordon, and SC Whipp. (1996) Vaccination with genetically modified Shiga-like toxin IIe prevents edema disease in swine. Infect. Immun. 64: 55-60; Ishikawa S, К Kawahara, Y Kagami, Y Isshiki, A Kaneko, H Matsui, N Okada, and H Danbara. (2003) Protection against Shiga toxin 1 challenge by immunization of mice with purified mutant Shiga toxin 1. Infect. Immun. 71: 3235-3239).

Токсин, циркулирующий в организме больного, можно нейтрализовать посредством введения защитных антител, предварительно синтезированных с использованием биотехнологических методов. Экспериментальные данные носят здесь также весьма обнадеживающий характер. Так, введение специфических антител позволяет подопытным животным перенести воздействие смертельных доз токсина и снимает патологические симптомы, наблюдаемые при заражении летальными дозами токсин-продуцирующих бактерий (см., например, Yamagami S, М Motoki, Т Kimura, Н Izumi, Т Takeda, Y Katsuura, and Y Matsumoto. (2001) Efficacy of postinfection treatment with anti-Shiga toxin (Stx) 2 humanized monoclonal antibody TMA-15 in mice lethally challenged with Stx-producing Escherichia coli. J. Infect. Dis. 184: 738-742; Mukherjee J, К Chios, D Fishwild, D Hudson, S O'Donnell, SM Rich, A Donohue-Rolfe, and S Tzipori. (2002) Human Stx2-infection. Infect. Immun. 70: 612-619; Sheoran AS, S Chapman, P Singh, A Donohue-Rolfe, and S Tzipori. (2003) Stx2-specific human monoclonal antibodies protect mice against lethal infection with Escherichia coli expressing Stx2 variants. Infect. Immun. 71: 3125-3130).

Несмотря открывающиеся перспективы, все иммунные препараты против Stx2 находятся в настоящее время только в стадии разработки (см., например, Tzipori S, А Sheoran, D Akiyoshi, A Donohue-Rolfe, and Н Trachtman. (2004) Antibody therapy in the management of Shiga toxin-induced hemolytic uremic syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 17: 926-941; Chow S-K and A Casadevall. (2012) Monoclonal Antibodies and Toxins-A Perspective on Function and Isotype. Toxins 4: 430-454).

Поставленная в работе задача

Ключевым условием для успешной вакцинации, а также для получения хороших диагностических и терапевтических антител является наличие качественного токсоида в достаточных количествах. Нами была поставлена задача разработки генетически модифицированного нетоксичного варианта холотоксина Stx2, пригодного для генерации защитных антител.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является синтез генетически модифицированного белка для эффективной иммунизации животных и человека против шига токсина второго типа Stx2. Полученный белок Stx2[E167Q/R170H] является нетоксичным вариантом холотоксина Stx2. Рекомбинантный белок продуцируется в клетках E. coli с помощью экспрессионной конструкции pET-Stx2M2 на основе векторной плазмиды pET22b(+), содержащей модифицированные гены stx2 в оптимальном для транскрипции и трансляции окружении. Направленные изменения нуклеотидной последовательности обеспечивают точечную замену [E167Q] остатка глутаминовой кислоты в положении 167 на остаток глутамина и точечную замену [R170H] остатка аргинина в положении 170 на остаток гистидина в участке каталитического центра субъединицы Stx2A, ответственном за протонирование аденинового кольца остатка А4324 28S РНК эукариотических рибосом. Конструкция pET-Stx2M2 обеспечивает в штамме Е. coli BL21(DE3) высокий уровень продукции и эффективную сборку нетоксичного варианта холотоксина. Использование полученного рекомбинантного белка для иммунизации подопытных животных индуцирует высокий уровень синтеза антител, обладающих высокой специфичностью и защитным действием.

1. Описание экспрессионных конструкций и способа их получения

Выбор структуры токсоида

При получении токсоидов Stx2 возможны три варианта:

1) использование инактивированной энзиматической субъединицы Stx2A. Ранее было показано, что иммунизация субъединицей Stx2A вызывает появление в крови подопытных животных антител, защищающих от действия Stx2 (Padhye VV, Zhao T & Doyle MP. (1989) J. Med. Microbiol. 30:219-226). Однако получение этого белка в достаточных количествах носит весьма проблемный характер из-за нестабильности Stx2A в периплазме бактерий в отсутствие субъединиц Stx2B (Kim SH, Ryu SH, Lee SH, Lee YH, Lee SR, Huh JW, Kim SU, Kim E, Kim S, Jon S, Bishop RE, Chang KT. (2011) Instability of toxin A subunit of AB(5) toxins in the bacterial periplasm caused by deficiency of their cognate В subunits. Biochim Biophys Acta. 1808(10):2359-65);

2) использование субъединицы Stx2B, участвующей в связывании с рецептором. Продукция высокоиммуногенных Stx2B субъединиц в штаммах Е. coli также является малоэффективной, возможно, из-за низкой стабильности пентамеров в периплазме (Acheson DW, De Breucker SA, Jacewicz M, Lincicome LL, Donohue-Rolfe A, Kane AV and Keusch GT. (1995) Expression and purification of Shiga-like toxin II В subunits. Infect Immun 63:301-308). Существенно также, что антитела, генерируемые посредством иммунизации Stx2B, не способны нейтрализовать цитотоксическое действие холотоксина Stx2 (Marcato Р, Mulvey G, Read RJ, Vander Helm K, Nation PN, Armstrong GD. (2001) Immunoprophylactic Potential of Cloned Shiga Toxin 2 В Subunit. J Infect Dis. 183:435-443);

3) третий подход, на котором мы остановились в настоящей работе, предусматривает использование минимально видоизмененного холотоксина, где генетически-инактивированная субъединица Stx2A ассоциирована с пентамером из субъединиц Stx2B. Это позволяет сохранить максимально нативную структуру белка, необходимую для биологической активности, а также обеспечивает наибольшее число иммуногенных эпитопов.

Выбор экспрессионной системы

В качестве организма-продуцента рекомбинантного токсина Stx2 мы использовали Escherichia coli, так как: 1) этот микроорганизм достаточно хорошо изучен; 2) для E. coli разработан ряд экспрессионных систем вектор-хозяин для синтеза рекомбинантных белков; 3) шаммы E. coli являются природными хозяевами генов stx и обладают адекватными механизмами для продукции активного белка.

Поскольку субъединица Stx2A может быть токсичной и для бактериальных рибосом (Suh J-K, Hovde CJ, Robertus JD. (1998) Shiga Toxin Attacks Bacterial Ribosomes as Effectively as Eucaryotic Ribosomes. Biochemistry, 37: 9394-9398), для минимизации интоксикации организма-продуцента необходимо обеспечить координированный биосинтез субъединиц А и В, их транспорт в периплазму, правильное сворачивание и сборку холотоксина. Мы остановились на экспрессионной системе для строго контролируемой продукции рекомбинантных белков, сочетающей вектор pET22b(+) и штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3).

Экспрессионный вектор pET22b(+) (фирма Novagen, Cat. No. 69744-3) имеет размер 5.5 т.п.о. и содержит:

1) Т7/lac промотор: 333-377;

Т7 промотор 361-377;

TATA box 373-377;

сайт начала транскрипции 360;

lac оператор 333-358;

2) сайт связывания рибосом 299-303;

3) последовательность, кодирующую лидерный пептид pelB 224-289, где последовательность стартового кодона ATG входит в состав последовательности, узнываемой рестриктазой NdeI;

4) сайты множественного клонирования (MCS: NcoI-XhoI) 158-225;

5) последовательность, кодирующую С-концевой His-Tag (используется опционально) 140-157;

6) терминатор Т7 26-72;

7) последовательность, кодирующую lacI репрессор 764-1843;

8) ori репликации плазмиды pBR322 3277;

9) ген устойчивости к ампициллину bla (последовательность, кодирующую бета-лактамазу) 4038-4895;

10) ori репликации одноцепочечного фага f1 5027-5482.

Фрагмент ДНК, несущий гены stxA и stxB шига токсина, клонировали по сайтам рестрикции NdeI-XhoI. При этом делетировались последовательности pelB и MCS. Полученная конфигурация представлена на фиг. 1.

Штамм BL21(DE3) (фирма Novagen, Cat. No. 69450-3) обладает генотипом (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm). Гены протеаз lon и ompT в нем делетированы для снижения деградации синтезируемых рекомбинантных белков в процессе выделения. Также штамм содержит лизогенный фаг λJDE3, несущий ген Т7 РНК полимеразы под контролем промотора lacUV5. В векторе pET22b(+) транскрипция генов рекомбинантных белков осуществляется Т7 РНК полимеразой с синтетического промотора T7lac, состоящего из промотора Т7 и lac оператора. Кроме того, в составе вектора присутствует ген lacI, кодирующий lac репрессор. В нормальных условиях lac репрессор действует двояким образом: его связывание с промотором lacUV5 блокирует синтез Т7 РНК полимеразы, а связывание с промотором T7lac блокирует транскрипцию рекомбинантного гена. При добавлении в среду индуктора (IPTG) оба промотора дерепрессируются, и синтезируемая Т7 РНК полимераза осуществляет транскрипцию рекомбинантного гена с промотора T7lac. Такая система двойной репрессии позволяет осуществлять строгий контроль экспрессии рекомбинантного гена, что особенно важно в случае синтеза токсичного продукта.

Стратегия направленного мутагенеза каталитического центра субъединицы Stx2A

Для получения эффективных защитных антител важно, чтобы инактивирующие мутации минимально изменяли структуру холотоксина. Поэтому была выбрана стратегия точечной замены ключевых аминокислотных остатков каталитического центра субъединицы Stx2A. Ряд токсинов растительного происхождения, в частности рицин, также инактивируют эукариотические рибосомы посредством депуринизации рибосомной 28S РНК и обнаруживают структурное сходство с шига токсинами. Молекулярная структура и энзиматическая активность рицина была довольно подробно изучена и предложена модель каталитического действия (Kim Y, Robertus JD. (1992) Analysis of several key active-site residues of ricin-A chain by mutagenesis and x-ray crystallography. Protein Eng 5: 775-779; Ekstrom F, Hornberg A, Artursson E, Hammarstrom L-G, Schneider G, et al. (2009) Structure of HI-6Nsarin-acetylcholinesterase determined by X-ray crystallography and molecular dynamics simulation: reactivator mechanism and design. PLoS ONE 4:e5957; Ho MC, Sturm MB, Almo SC, Schramm VL. (2009) Transition state analogues in structures of ricin and saporin ribosome-inactivating proteins. Proc Natl Acad Sci USA 106:20276-20281). По аналогии для действия Stx можно предположить следующую гипотетическую модель: депуринизация начинается с внедрения аденинового кольца основания А4324 28S рРНК субъединицы 60S эукариотических рибосом между ароматическими кольцами аминокислотных остатков Tyr77 и Tyr114 субъединицы Stx2A. Протонирование аденинового кольца катионным остатком Arg170 Stx2A приводит к отрезанию аденина от рибозы, стабилизируемой на стадии транзиции анионным остатком Glu167. Поэтому в настоящей работе для направленного мутагенеза субъединицы Stx2A природного шига токсина были выбраны аминокислотные остатки предполагаемого N-гликозидазного активного центра: тирозина в положении 77 (Tyr77), глутаминовой кислоты в положении 167 (Glu167) и аргинина в положении 170 (Arg170). На фиг. 2А приведена последовательность аминокислотных остатков субъединицы Stx2A природного шига токсина без лидерного пептида, где изменяемые остатки выделены жирным шрифтом.

Получение вариантов экспрессионной конструкции

Фрагмент ДНК, несущий кодирующую часть оперона stx2 (гены stx2A и stx2B), был амплифицирован с помощью ПЦР (набор Expand High FidelityPLUS PCR System, Roche). В качестве праймеров служили олигонуклеотиды Stx2FOR и Stx2REV (см. Таблицу 1), а в качестве матрицы использовали 100 нг хромосомной ДНК штамма Е. coli O157:Н7 #37. Условия амплификации: 35 циклов (10 сек при 92°C, 20 сек при 55°C, 1 мин при 68°C). Праймер Stx2FOR содержал на 5′-конце последовательность сайта узнавания рестриктазы NdeI, включающую в свой состав стартовый кодон ATG гена stx2A. Это позволило сохранить интактным второй кодон (AAG), кодирующий остаток лизина в сигнальной последовательности Stx2A. Праймер Stx2REV после стоп-кодона TGA гена stx2B кодировал сайт узнавания рестриктазы XhoI. Фрагмент клонировали с помощью набора ТА Cloning Kit (Invitrogen, Cat. No. K2070-20) в вектор pCRII. Здесь и далее для всех генно-инженерных манипуляций использовали лабораторный штамм Е. coli JM109. Полное секвенирование клонированного фрагмента показало ожидаемое полное совпадение с нуклеотидной последовательностью кодирующей части классического оперона stx2 (GenBank accession No X07865, см. также: Jackson MP, Neill RJ, O′Brien AD, Holmes RK, Newland JW. (1987) Nucleotide sequence analysis and comparison of the structural genes for Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II encoded by bacteriophages from Escherichia coli 933. FEMS Microbiol. Lett. 44: 109-114). Согласно современной классификации последовательность клонированных генов соответствует последовательности генов stx2a варианта Stx2a-O157-EDL933 (см. Scheutz F, Teel LD, Beutin L, Pierard D, Buvens G, Karch H, Mellmann A, Caprioli A, Tozzoli R, Morabito S, Strockbine NA, Melton-Celsa AR, Sanchez M, Persson S, O'Brien AD. (2012) Multicenter evaluation of a sequence-based protocol for subtyping Shiga toxins and standardizing Stx nomenclature. J Clin Microbiol. 50(9): 2951-63). Полученная плазмида получила обозначение pCR-Stx2. После верификации нуклеотидной последовательности клонированный фрагмент субклонировали в экспрессионный вектор pET22b(+) по сайтам рестрикции Ndel и Xhol, что обеспечивало оптимальное для транскрипции и трансляции окружение генов stx2. Полученная конфигурация приведена на фиг. 1.

Введение нуклеотидных замен осуществляли с помощью ПЦР мутагенеза (так называемый SOEing). Сначала на ДНК матрице синтезировали 1) левое плечо - с помощью фланкирующего Stx2FOR и соответствующего мутагенного M-REV праймеров; 2) правое плечо - с помощью соответствующего мутагенного M-FOR и фланкирующего Stx2REV праймеров. ДНК правого и левого плеча затем объединяли и использовали в качестве матрицы для амплификации с помощью фланкирующих праймеров Stx2FOR и Stx2REV фрагмента, несущего кодирующую часть генов stx. Стратегия мутагенеза и нуклеотидные последовательности использованных олигонуклеотидов приведены в Таблицах 1 и 2. Например, при введении замены [Y77E] для амплификации левого плеча служили праймеры Stx2FOR и M1-REV, а правого плеча - M1-FOR и Stx2REV. В качестве матрицы использовали 5 пг ДНК плазмиды pCR-Stx2. Условия амплификации: 35 циклов (10 сек при 92°C, 20 сек при 55°C, 40 сек при 68°C). По 5 пг ДНК правого и левого плеча затем объединяли и амплифицировали с помощью праймеров Stx2FOR и Stx2REV. Условия амплификации: 35 циклов (10 сек при 92°C, 20 сек при 55°C, 1 мин при 68°C). Синтезированный фрагмент ДНК клонировали в вектор pCRII и, после верификации нуклеотидной последовательности, субклонировали в вектор pET22b(+) по сайтам NdeI и XhoI, экспрессионная плазмида получила обозначение pET-Stx2M1. Аналогично была получена плазмида pET-Stx2M2, кодирующая вариант Stx2[E167Q/R170H] с точечной заменой [E167Q] остатка глутаминовой кислоты в положении 167 на остаток глутамина и точечной заменой [R170H] остатка аргинина в положении 170 на остаток гистидина. Аминокислотная последовательность субъединицы Stx2A варианта Stx2[E167Q/R170H] приведена на фиг. 2Б без лидерного пептида, введенные замены аминокислотных остатков обозначены жирным латинским шрифтом.

Оптимизация условий экспрессии вариантов рекомбинантного холотоксина

Полученными плазмидами pET-Stx2M1 и pET-Stx2M2 трансформировали клетки экспрессионного штамма Е. coli BL21(DE3). Эксперименты по оптимизации условий выращивания показали, что сочетание низкого уровня индукции, пониженной температуры инкубации и относительно короткого времени выращивания после индукции позволяет минимизировать интоксикацию клеток хозяина и обеспечивает наиболее высокий уровень продукции токсина. Клетки, несущие экспрессионные плазмиды, выращивали в бульоне Луриа, содержащем 150 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30°C. 40 мл ночной культуры засевали в 1 л подогретого (30°C) бульона с антибиотиком и подращивали в течение 2 ч. После этого добавляли IPTG до 10 мкМ/мл и продолжали инкубацию в течение 4 часов. Клетки затем осаждали центрифугированием, осадок суспендировали в 50 мл р-ра: 30 мМ трис-HCl, pH 8.0, 20% сахароза, 2 мМ ЭДТА, и оставляли на льду на 1 ч. Клетки осаждали центрифугированием, осадок ресуспендировали в 50 мл 5 мМ MgCl2 и суспензию выдерживали на льду в течение ночи. Клетки затем осаждали центрифугированием и супернатант использовали в качестве периплазматического экстракта. Для выделения вариантов холотоксина Stx2 использовали аффинную хроматографию на смоле Isosep (Швеция) согласно рекоментациям фирмы-производителя (см. Ishikawa S, Kawahara К, Kagami Y, Isshiki Y, Kaneko A, Matsui H, Okada N and H Danbara. (2003) Protection against Shiga Toxin 1 Challenge by Immunization of Mice with Purified Mutant Shiga Toxin 1. Infect Immun, v. 71, 6: 3235-3239). Коротко: периплазматический экстракт фильтровали через мембрану с размером пор 0.22 мкм и наносили на колонку с 1 мл смолы. Колонку затем промывали 15 мл р-ра PBS, после чего токсин элюировали 15 мл р-ра 4М MgCl2 в PBS, диализовали против PBS и концентрировали до объема примерно 1 мл. Приведенная процедура обеспечивает получение 1 мг холотоксина из 1 л индуцированной культуры. Согласно SDS/PAGE анализу, чистота выделенного белка составляла более 95%.

2. Анализ цитотоксичности мутантных вариантов Stx2 на культуре клеток

Вариантами холотоксина, полученными с использованием конструкций рЕТ-Stx2Ml и pET-Stx2M2, обрабатывали клетки Vero, несущие на поверхности большое количество специфического рецептора Gb3/CD77 и поэтому высокочувствительные к действию Stx2. В экспериментах клетки Vero выращивали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone), пенициллина (100 ед./мл) (Sigma) и стрептомицина (100 мкг/мл) (Sigma). Клетки высевали на 96-луночный планшет в 100 мкл среды с плотностью 2×104 клеток на лунку и растили в течение 24 часов при 5% CO2 и 37°C. Затем добавляли различные количества вариантов токсина в объеме 2 мкл и клетки инкубировали еще 48 часов. В качестве контроля использовали разведения Stx2 дикого типа. После инкубации клетки окрашивали кристаллвиолетом. Цитотоксическое действие определяли по степени включения красителя в живые клетки, измеряя поглощение при длине волны 620 нм. Результаты экспериментов приведены на фиг. 3 и в Таблице 3.

В варианте Stx2[Y77E], синтезированном с помощью конструкции pET-Stx2Ml, была произведена аминокислотная замена одного из двух остатков тирозина, предположительно участвующих в связывании пуринового кольца специфического остатка аденина А4324 28S рРНК. Как видно на фиг. 3 и из Таблицы 3, концентрация белка, вызывающая гибель 50% клеток (LD50), составляла для Stx2[Y77E] 270-320 нг/мл, что примерно в 104 раз превышало таковую для токсина Stx2 дикого типа (25-30 пг/мл). Таким образом, для Stx2[Y77E] наблюдалось снижение цитотоксичности в 104 раз. Сравнимый эффект наблюдался ранее другими авторами для токсинов, где мутации затрагивали центр протонирования (снижение в 104 раз для вариантов, несущих замены E167Q или E167Q/R170K). Обнаруженный эффект указывает на ключевую роль остатка Tyr77 в каталитическом действии токсина и подтверждает гипотетическую модель, приведенную выше.

В варианте Stx2[E167Q/R170H], синтезированном с помощью конструкции рЕТ-Stx2M2, была произведена точечная замена [E167Q] остатка глутаминовой кислоты в положении 167 на остаток глутамина и точечная замена [R170H] остатка аргинина в положении 170 на остаток гистидина в участке субъединицы Stx2A, предположительно ответственном за протонирование специфического остатка аденина А4324 28S рРНК (фиг. 2Б). Этот вариант показал чрезвычайно низкую цитотоксичность (фиг. 3 и Таблица 3). Для него концентрация белка, вызывающая гибель 50% клеток (LD50), составляла >100 мкг/мл. Это более чем в 106 выше, чем для Stx2 дикого типа. Таким образом, вариант Stx2[E167Q/R170H] оказался для клеток Vero практически нетоксичным.

Полученные нами варианты представляются перспективными для более детального изучения каталитического действия токсина.

3. Получение и анализ поликлональной сыворотки против Stx2, испытания на животных

Поскольку на культуре чувствительных клеток полученный нами вариант холотоксина Stx2[E167Q/R170H] был практически нетоксичным, было интересно протестировать его токсическое действие на животных. В экспериментах, проведенных ранее в ряде лабораторий, было установлено, что инъекция в ушную вену кролика токсина Stx2 дикого типа уже в количестве 1-2 мкг на 1 кг живого веса вызывает развитие у всех подопытных животных тяжелых симптомов (диарея, повышенная температура, учащенный пульс, судороги и т.д.), причем 30-50% животных погибает в течение первых трех суток (т.е. для Stx2 LD50 составляет 1-2 мкг/кг), а при введении 30-50 мкг/кг погибают все животные (LD100=30-50 мкг/кг). В наших экспериментах после внутривенного введения кроликам Stx2[E167Q/R170H] в количестве 50 мкг/кг (т.е. примерно одной летальной дозы) все животные не только не погибли, но и не обнаружили каких-либо отклонений по сравнению с контролем. Таким образом, Stx2[E167Q/R170H] оказался нетоксичным и для животных, что полностью коррелировало с данными, полученными в экспериментах на клетках. Эти результаты открывали возможность использования для иммунизации более высоких концентраций Stx2[E167Q/R170H]. Иммунизацию кроликов проводили по стандартной методике. Каждому кролику подкожно вводилось примерно 1 мг Stx2[E167Q/R170H] в смеси с адъювантом, спустя три недели проводился первый буст, а еще через две недели - второй. Кровь отбирали из ушной вены и получали сыворотку по стандартной методике. Следует отметить, что для кроликов 1 мг/кг соответствует 20-30 абсолютно летальным дозам токсина дикого типа Stx2. Все инъецированные животные, однако, не обнаружили каких-либо отклонений от нормы, т.е. белок не оказывал на них токсического действия и в сверхлетальных концентрациях. В экспериментах по иммунодиффузии в агарозном геле по Ухтерлони сыворотки, выделенные из всех трех использованных кроликов, давали четкую полосу преципитации с антигеном Stx2, причем два образца даже при десятикратном разведении. Это свидетельствовало о присутствии специфических антител в высоком титре.

Качество генерируемых антител оценивали посредством Вестерн-блот анализа. В качестве первичных антител использовали полученные сыворотки, а в качестве вторичных антител использовали конъюгат пероксидазы с ослиными антителами против иммуноглобулина IgG кролика (фирма Amersham). Для детекции использовали набор ECL plus Western Plotting Detection System фирмы Amersham. На фиг. 4 приведены результаты одного из таких экспериментов. Даже очень высокое (1:20000) разведение сыворотки, полученной из кролика №3, выявляет специфические полосы, соответствующие Stx2A и Stx2B субъединицам шига токсина. Наблюдается также минорная полоса Stx2A1, возникающая в результате процессинга субъединицы Stx2A. Положение специфических полос указано на чертеже стрелками слева, справа показано положение белковых маркеров молекулярного веса. Следует отметить, что для выявления специфических полос было достаточно очень короткого (3 сек) времени экспонирования, т.е. сигнал очень высок. Аналогичная картина наблюдалась и для сывороток, полученных из двух других животных.

Таким образом, иммунизация полученным нами нетоксичным вариантом холотоксина Stx2[E167Q/R170H] генерирует в крови подопытных животных специфические антитела в высоком титре. Высокая избирательность этих антител позволяет использовать их как в исследовательских целях, так и в целях диагностики (например, для Вестерн-блот анализа).

4. Защитное действие поликлональной анти-Stx2 сыворотки в экспериментах на культуре клеток

Было интересно посмотреть, приводит ли иммунизация нетоксичным вариантом Stx2[E167Q/R170H] к появлению в крови животных защитных антител, нейтрализующих действие токсина на чувствительные эукариотические клетки. В экспериментах 2 нг токсина Stx2 дикого типа инкубировали с 10 мкл разных разведений сыворотки из кроликов №2 и №3, иммунизированных вариантом Stx2[E167Q/R170H]. Образцы выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре для взаимодействия антител с токсином, после чего добавляли к клеткам Vero и проводили тест на цитотоксичность (как описано выше). Результаты экспериментов приведены в Таблице 4. В контроле добавление в культуральную среду 2 нг Stx2 дикого типа приводило к гибели >90% клеток. Однако если Stx2 предварительно инкубировали с сывороткой кроликов №2 или №3, последующее добавление токсина к клеткам не оказывало на них какого-либо видимого действия. Это наблюдалось даже при использовании 20-кратных разведений сыворотки. Эти эксперименты свидетельствуют о том, что при иммунизации вариантом Stx2[E167Q/R170H] в крови подопытных животных генерируются антитела, защищающие чувствительные клетки Vero от действия токсина.

5. Иммунизация нетоксичным вариантом Stx2 защищает животных от действия токсина дикого типа.

Для дальнейшей оценки защитного эффекта иммунизации нетоксичным вариантом Stx2 нами был проведен следующий эксперимент. Кроликов предварительно иммунизировали Stx2[E167Q/R170H] по стандартной методике, а через неделю после последней инъекции антигена контрольным и иммунизированным животным вводили в ушную вену активный токсин Stx2 дикого типа в количестве 1 мг на 1 кг живого веса. Эта доза тысячекратно превосходит дозу, при введении которой у всех подопытных кроликов должны развиваться тяжелые симптомы поражения токсином, а 30-50% животных погибает, и составляет 20-30 абсолютно летальных доз (LD100). Результаты эксперимента приведены в Таблице 5. Все контрольные животные, которым предварительно вводился только чистый адъювант, погибли в течение первых трех суток после инъекции токсина Stx2 дикого типа. Наоборот, у всех животных, предварительно иммунизированных нетоксичным вариантом Stx2[E167Q/R170H], после инъекции Stx2 не выявлялось никаких симптомов, обусловленных действием токсина. И впоследствии эти животные по всем признакам сохраняли нормальную жизнедеятельность.

Таким образом, иммунизация нетоксичным вариантом Stx2[E167Q/R170H] легко переносится подопытными животными и генерирует в крови высокий титр специфических антител. Такая иммунизация полностью защищает от действия сверхлетальных доз шига токсина 2-го типа.

Выводы

Нами получен нетоксичный вариант холотоксина Stx2 - шига токсина второго типа. Генетически модифицированный рекомбинантный белок Stx2[E167Q/R170H] синтезируется в Е. coli BL21(DE3) с использованием экспрессионной конструкции рЕТ-Stx2M2. Оптимизация условий экспрессии позволила синтезировать белок в больших количествах, выход конечного продукта превышает 1 мг на 1 л индуцированной культуры. Точечные замены аминокислотных остатков в каталитическом центре субъединицы Stx2A позволили обеспечить сборку холотоксина, сохраняющего максимально нативную структуру, и одновременно добиться резкого (более чем в 106 раз) снижения цитотоксичности. Иммунизация полученным нетоксичным вариантом проходит для животных бессимптомно и генерирует высокий титр специфических антител, способных защитить против действия сверхлетальных доз токсина Stx2 дикого типа. Отсутствие токсичности и высокие иммуногенные качества синтезированного варианта делают его привлекательным для непосредственной вакцинации против геморрагического колита и гемолитического уремического синдрома человека. Практическому применению способствует и достигнутый высокий выход конечного продукта. Stx2[E167Q/R170H] сохраняет максимальное число иммуногенных эпитопов и обладает высоким потенциалом для разработки и производства соответствующих диагностических и терапевтических антител.

Генетически модифицированный нетоксичный белок шига токсина второго типа (Stx2) несет точечную замену [E167Q] остатка глутаминовой кислоты в положении 167 на остаток глутамина и точечную замену [R170H] остатка аргинина в положении 170 на остаток гистидина в активном центре субъединицы Stx2A, вызывает иммунный ответ и защищает иммунизированных животных от действия природного токсина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой модифицированный полипептид c гомосерин-O-ацетилтрансферазной активностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 или с по меньшей мере 95% гомологией с ней, в котором аминокислоту в положении 111 от начальной аминокислоты метионина последовательности заменяют глутаминовой кислотой.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются слитого белка для специфического ингибирования свертывания крови, экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей такой слитый белок, бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной такой ДНК, и способу получения слитого белка.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и касается способа анализа процесса Арг-Х протеолиза в положительно заряженных фракциях белков супрамолекулярных структур в растущей популяции Escherichia coli.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения предшественника гирудина. .

Изобретение относится к медицине и касается терапевтического агента для лечения аутоиммунного заболевания. .

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии, иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики HTLV-I/II. .

Изобретение относится к новым и известным производным пиримидина, обладающим свойствами ингибитора PDE4, и их применению для лечения заболеваний, опосредованных активностью указанного рецептора.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения антибактериального препарата. Способ получения антибактериального препарата путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного петролейным эфиром с температурой кипения 40-70°C, объединяют экстракты, упаривают, высушивают и сухой остаток растворяют в 95% этиловом спирте, при определенных условиях.
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для превентивной и интенсивной терапии очаговых гнойно-септических и желудочно-кишечных заболеваний, стимуляции системы иммунитета и метаболических процессов у животных.

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции для профилактики и лечения ран или ожоговых ран, содержащей митогенный белок, бактерицидное средство сульфадиазин серебра и бактериостатическое средство хлоргексидина глюконат.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболевания, вызываемого бактерией, включающей экстракт жимолости, содержащий секологановую кислоту в определенном количестве и антибиотик.

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, а именно к новым индивидуальным соединениям класса мезоионных гетероциклических систем - замещенным хлоридам 2-[(1Z)-1-(3,5-диарил-1,3,4-тиадиазол-2(3Н)-илиден)метил]-3,5-диарил-1,3,4-тиадиазол-3-ия общей формулы I, где: R=3,5-диFC6H4; R1=4-FC6H4 (Ia); R=4-FC6H4; R1=Ph (Iб); R=3,5-диFC6H4; R1=Ph (Iв); R=3,5-диClC6H4; R1=Ph (Iг); R=4-NO2C6H4; R1=Ph (Iд); R=Bn; R1=Ph (Ie).

Группа изобретений относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и предназначена для лечения ушных инфекций, обусловленных хинолон-резистентными микробами, в частности Ципрофлоксацин резистентными микробами.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, фтизиатрии и торакальной хирургии, и может быть использовано для лечения больных с плевральным выпотом различной этиологии.

Изобретение относится к новым соединениям, применимым в качестве антибактериального средства в фармацевтической промышленности, формулы где R= , а n=1-10. Предложены новые эффективные антибиотики и способ их получения путем проведения реакции ацилирования 11,12-циклического карбоната 2'-O-ацетил-4′′-O-(ω- аминоалкил)карбамоилазитромицина эремомицином, ванкомицином или агликоном тейкопланина в присутствии конденсирующего агента с последующим удалением 2′-O-ацетил-защитной группы.
Изобретение относится к координационным соединениям металлов, а именно имидазолмалату меди(II) общей формулы Cu(C3H4N2)C4H4O5 · 2H2O, проявляющему антибактериальную активность в широком диапазоне концентраций. Также предложен способ его получения. Техническим результатом является расширение арсенала легкорастворимых антибактериальных препаратов. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.
Наверх