Способ неинвазивной диагностики хронического гастродуоденита у детей
Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики хронического гастродуоденита у детей. Определяют уровень катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в кале методом иммуноферментного анализа. При достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в интервале величин от 31,2 нг/г до 87 нг/г диагностируют наличие активного хронического гастродуоденита. При достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина равной или более 87 нг/г диагностируют наличие хронического гастродуоденита высокой степени активности. Способ позволяет проводить скрининговые исследования и дифференциальную диагностику тяжести поражения слизистой оболочки желудка при хроническом гастродуодените у детей. 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и детской гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики хронического гастродуоденита у детей.
Изучение болезней органов пищеварения у детей занимает одно из ведущих мест в общем ряду важнейших медицинских проблем XX и XXI века. Это связано, прежде всего, с огромной частотой встречаемости гастродуоденальной патологии, которая в настоящее время составляет более 12000 случаев на 100000 детского населения (Эрдес С. Структура гастроэнтерологической заболеваемости у детей стала иной // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. - №5, 2011. С. 4-6). С другой стороны, отмечается неуклонная тенденция к росту заболеваемости под действием как эндогенных, так и экзогенных факторов. В свою очередь, болезни органов пищеварения значительно снижают качество жизни детей, их способность к обучаемости, приводят к тяжелым осложнениям и, как следствие, - к инвалидизации как детского, так и в последующем взрослого населения (A.M. Запруднов. Современные особенности подростковой гастроэнтерологии // A.M. Запруднов, К.И. Григорьев. Педиатрия, - .№2, 2011. - С. 6). Таким образом, изучение патологии желудочно-кишечного тракта у детей, и хронического гастродуоденита в частности, является одним из наиболее перспективных и значимых направлений в педиатрии, и в частности в решении проблем детской гастроэнтерологии. Выраженные воспалительные изменения в слизистой оболочки желудка, согласно каскаду Correa (Correa P. The gastric precancerous cascade. / P. Correa, M.B. Piazuelo // J. Dig. Dis. - 2012. - Vol. 13(1). - P. 2-9) запускают развитие атрофических процессов. Последние, по мнению Шиманской А.Г., являются стартовой площадкой в многокаскадном процессе канцерогенеза и важным показателем риска развития рака желудка кишечного типа (Шиманская А.Г. Морфологические методы и экспертный подход при верификации атрофии слизистой оболочки желудка в биопсийной диагностике атрофического гастрита / А.Г. Шиманская // Молодой ученый, - №4, 2012. - С. 496-505). Золотым стандартом диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта является эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС), с последующей биопсией слизистой оболочки пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки, позволяющие оценить особенности анатомических структур и перистальтики, просвет и содержимое обследуемых органов, а также определить состояние стенки и слизистой оболочки пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, в том числе признаки воспалительных, атрофических, гиперпластических и деструктивных изменений (Minimal standart terminology for gastrointestinal endoscopy of European Socienty for Gastrointestinal Endoscopy, 2008). Однако существуют определенные группы детей, которым противопоказаны инвазивные методы диагностики, а также дети, родители которых отказываются от проведения ЭГДС. Кроме того, само морфологическое исследование биоптатов является трудоемким, длительным процессом. В этом аспекте становится наиболее актуальным поиск неинвазивных методов диагностики, позволяющих быстро, просто и точно оценивать состояние слизистой оболочки желудка при хроническом гастродуодените.
Несмотря на наличие множества современных исследований в области диагностики, профилактики и лечения данного заболевания, всем им присущ ряд недостатков, таких как недостаточное патогенетическое обоснование, а также низкая чувствительность и специфичность разработанных методов, их инвазивность и техническая сложность выполнения.
Проведенными исследованиями по патентной информации найдены различные способы диагностики хронического гастродуоденита.
Известен способ диагностики хронического гастродуоденита и функциональной диспепсии (патент РФ №2255337, МПК: G01N 33/49, опубликован 27.06.2005 г.), включающий исследование клинико-лабораторных показателей, при этом дополнительно определяют спонтанную адгезию лейкоцитов и их чувствительность к модуляторам клеточной адгезии - фитогемаглютинину, теофиллину, тималину. При показателях функциональной активности лейкоцитов в пределах нормы устанавливают диагноз функциональной диспепсии. При показателях функциональной активности лейкоцитов, превышающих пределы нормы, диагностируют хронический гастродуоденит.
К недостатку данного способа относится использование сложных инвазивных методик. Кроме того, вышеуказанные показатели являются неспецифическими и участвуют в развитии различных патологических процессов, что снижает чувствительность и специфичность метода, а также усложняет интерпретацию полученных результатов, снижая степень их достоверности.
Известен также способ диагностики хронического гастродуоденита и функциональной диспепсии (патент РФ №2270610, МПК: G01N 33/483, опубликован 27.02.2006 г.), включающий определение газохроматографическим методом в слюне уксусной, пропионовой и масляной кислот, и при концентрации любой из трех кислот: уксусной больше 0,910 ммоль/л, пропионовой больше 0,150 ммоль/л, масляной больше 0,013 ммоль/л диагностируют хронический гастродуоденит, а при концентрациях кислот: уксусной в пределах больше 0,010 до 0,910 ммоль/л, пропионовой до 0,150 ммоль/л, масляной до 0,013 ммоль/л диагностируют функциональную диспепсию.
Недостатками данного способа являются трудоемкость исследования, что затрудняет широкое использование вышеуказанного метода в практическом использовании, а также невозможность оценки степени поражения слизистой оболочки желудка.
Известен также способ определения патологии гастродуоденальной зоны (патент РФ №2128335, МПК G01N 33/48, опубликован 27.03.1999 г.), включающий кристаллографическое исследование с NaCl слюны, анализ результатов по системе кристаллизации NaCl и величине морфотипов жидкокристаллических структур, а также кристаллографическое исследование экссудата.
Недостатками данного способа являются трудоемкость исследования и субъективность при интерпретации полученных результатов анализа, что снижает его достоверность.
Известен также способ неинвазивной диагностики активного гастрита (патент РФ №2216022, МПК: G01N 33/48, опубликован 10.11.2003 г.), основанный на иммунологическом исследовании крови больных путем количественной оценки сенсибилизации лимфоцитов к тканевому антигену желудка в реакции торможения миграции лейкоцитов. При проценте миграции более 80% диагностируют неактивный гастрит, в пределах 70-80% - гастрит с минимальной активностью, менее 70% - гастрит с умеренной и выраженной активностью.
Данный способ диагностики является инвазивным и не может использоваться в качестве скринингового метода.
Таким образом, разработка новых высокоэффективных способов диагностики гастродуоденита является актуальной задачей современной медицины.
Однако при проведении анализа научно-медицинской и патентной литературы нами не было найдено наиболее близкого технического решения для реализации поставленной задачи, которое можно бы было взять за прототип.
Задачей предложенного изобретения является разработка способа неинвазивной диагностики хронических воспалительных заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта у детей с помощью молекулярного биомаркера β-2-дефензина, позволяющего с помощью неинвазивной методики точно, просто и быстро оценивать состояние слизистой оболочки желудка, что необходимо для определения дальнейшей тактики лечения и выбора профилактических мероприятий.
Поставленная задача достигается тем, что определяют у детей уровень катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в кале методом иммуноферментного анализа. При этом, при достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в интервале величин от 31,2 нг/г до 87 нг/г, диагностируют наличие активного хронического гастродуоденита. При достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина величины равной или более 87 нг/г диагностируют наличие хронического гастродуоденита высокой степени активности.
Техническим результатом, объективно проявляющимся при осуществлении предлагаемого способа диагностики, является диагностика степени воспалительных изменений при хроническом гастродуодените у детей, подтвержденная результатами фиброгастродуоденоскопии с биопсией антрального отдела желудка и статистической обработкой полученных результатов.
Антимикробные пептиды и в частности β-2-дефензин играют важную роль в развитии хронической патологии, в связи с множеством их биологических эффектов, таких как про- и противовоспалительное, антимикробное, ранозаживляющее и другие действия. Эспрессия β-2-дефензина эпителиоцитами желудка усиливается лишь индуцибельно под действием различных факторов. В связи с тем, что β-2-дефензин (кроме эпителия желудка) синтезируется клетками толстого кишечника, а также альвеоцитами 2 типа в легких, отсутствие у ребенка заболеваний вышеперечисленных органов дает возможность использовать β-2-дефензин в качестве диагностического маркера воспалительных заболеваний верхнего отдела пищеварительного тракта.
Способ неинвазивной диагностики хронического гастродуоденита у детей осуществлялся следующим образом.
Образец кала собирают в чистую пробирку в день поступления ребенка в стационар до начала получения стандартной терапии, утром, не позднее 8.00. После этого экстрагируют 30 мг исходного образца в пробирку (типа «эппендорф»). Количественное определение содержания β-2-дефензина в образцах стула проводят методом иммуноферментного анализа (ELISA) на анализаторе Tecan Sunrise (Швейцария) с помощью стандартного набора реагентов для определения уровня β-2-дефензина (ВСМ DIAGNOSTICS, Германия). В пробирку с образцом кала добавляют 1,5 мл буферного раствора для экстракции (фактор разведения: 1:50). Смесь в течение 30 минут энергично встряхивают на вортексе, затем 1,5 мл гомогената переносят в чистую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 об/мин. Дальнейшее тестирование в дублях проводят следующим образом: β-2-дефензин, содержащийся в стандартах и образцах, связывается с присутствующими в избытке поликлональными антителами к β-2-дефензину, сорбированными в лунках микропланшета. При последующей промывке из лунок удалялись все несвязавшиеся компоненты, а количественная оценка связавшегося β-2-дефензина выполнялась при добавлении биотинилированных поликлональных антител к β-2-дефензину, которые выявлялись с помощью стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой. Количество субстрата, конвертированного пероксидазой, прямо пропорционально количеству связавшегося β-2-дефензина и было измерено фотометрически на микропланшетном фотометре при длине волны 450 нм. Расчет концентрации дефензина проводился с помощью метода 4-параметрической аппроксимации.
С целью апробации данного метода нами было обследовано 70 детей в возрасте от 8 до 14 лет с хроническим гастродуоденитом в стадии обострения и 21 здоровый ребенок I и IIa групп здоровья. У всех родителей было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Постановка предварительного диагноза осуществлялась на основании жалоб, данных анамнеза заболевания, результатов объективного обследования больных. Окончательный диагноз подтверждался данными фиброэзофагогастродуоденоскопии (ФЭГДС), гистологического исследования гастробиоптатов. Для получения достоверной информации полное обследование пациентов проводилось в первые дни с момента госпитализации в стационар, при этом все исследования проводили натощак во временном интервале с 8.00 ч до 10.00 ч утра. Всем детям было проведено ФЭГДС, исследование выполнялось утром, натощак, по стандартной методике в эндоскопическом кабинете с применением видеосистемы EXERA II (NBI-технологии) с последующей прицельной биопсией антрального отдела слизистой оболочки желудка, необходимой для уточнения диагноза.
Эндоскопическую картину оценивали согласно MST 3.0 version (Minimal standart terminology for gastrointestinal endoscopy of European Socienty for Gastrointestinal Endoscopy, 2008), морфологические изменения слизистой оболочки желудка оценивались согласно «визуально-аналоговой» шкале Модифицированной Сиднейской системы (1996 г.) с учетом «Новой классификации хронического гастрита» (Аруин Л.И., Кононов А.В., Мозговой С.И. Новая классификация хронического гастрита. - М., 2009. - 19 с.).
При анализе зависимости между уровнем β-2-дефензина в кале и выраженностью морфологических изменений в слизистой оболочке желудка были получены следующие результаты: средний уровень β-2-дефензина в кале среди детей с низкой степенью активности гастрита составил 41,8 нг/г, тогда как с высокой степенью активности гастрита 96,1 нг/г, что является достоверным показателем (р=0,000001), и значительно превышает концентрацию β-2-дефензина группы контроля (р=0,001) (см. таблицу 1).
Примечание: 
Согласно проведенному ROC-анализу при уровне β-2 дефензина в кале выше 31,2 нг/г диагностируют у ребенка наличие активного хронического гастродуоденита (р=0,0122), а при уровне 87 нг/г и более этой величины - наличие хронического гастродуоденита с выраженными воспалительными изменениями в слизистой оболочке желудка (p<0,0001).
Пример 1. Девочка С., 11 лет. На основании данных комплексного клинико-лабораторного обследования, а также результатов фиброгастроскопии с морфологическим исследованием гастробиоптатов был поставлен окончательный диагноз: хронический поверхностный гастрит, период обострения. Морфологический диагноз: Гастрит поверхностный, 1 степени активности воспалительных изменений. Уровень β-2-дефензина в кале 37,5 нг/г.
Пример 2. Мальчик А., 10 лет. На основании данных комплексного клинико-лабораторного обследования, а также результатов фиброгастроскопии с морфологическим исследованием гастробиоптатов был поставлен окончательный диагноз: хронический поверхностный гастрит, период обострения. Морфологический диагноз: Гастрит поверхностный, 2 степени активности воспалительных изменений. Уровень β-2-дефензина в кале 150 нг/г.
Таким образом, уровень β-2-дефензина в кале имеет высокую корреляционную связь со степенью активности воспаления в слизистой оболочке желудка. Разработанный способ не имеет аналогов, неинвазивен, прост в исполнении и может использоваться в качестве скринингового метода, а также с целью дифференциальной диагностики тяжести поражения слизистой оболочки желудка при хроническом гастродуодените.
Способ неинвазивной диагностики хронического гастродуоденита у детей путем исследования клинико-лабораторных показателей, характеризующийся тем, что определяют уровень катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в кале методом иммуноферментного анализа, при этом, при достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в интервале величин от 31,2 нг/г до 87 нг/г, диагностируют наличие активного хронического гастродуоденита, а при достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина величины 87 нг/г или более диагностируют наличие хронического гастродуоденита высокой степени активности.
