Способ получения трехмерного остеотрансплантата



Способ получения трехмерного остеотрансплантата
Способ получения трехмерного остеотрансплантата

 


Владельцы патента RU 2574942:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и предназначено для замещения дефектов костной ткани и коррекции травматических повреждений костей. Описан способ получения трехмерного остеотрансплантата, заключающийся в остеогенной дифференцировке пластического материала, где в качестве пластического материала используют трехмерный хондротрансплантат из культивированных хондробластов и межклеточного матрикса, а остеогенную дифференцировку осуществляют путем направленной дифференцировки трехмерного хондротрансплантата. Трансплантат с остеогенными потенциями отвечает всем требованиям био-, гистосовместимости и механической прочности для коррекции и замещения дефектов костной ткани. 3 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и предназначено для замещения дефектов костной ткани и коррекции травматических повреждений костей.

Известны способы создания органоподобных трехмерных структур почки, печени, нервной ткани (Захарова И.С., Шевченко И.А. Органы «из пробирки» // Наука из первых рук №1 (55) 2014) и костной ткани на основе дифференцированных плюрипотентных клеток.

Известен способ получения трехмерного хондротрансплантата для замещения дефектов костной ткани, из культивированных хондробластов позвоночника мини-поросенка, RU №2392973 (МПК A61L 27/38, опубл. 27.06.2010). Способ осуществляется следующим образом. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм2, которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°C в течение 8 часов, объем раствора превышает в 10 раз объем обрабатываемой ткани. Далее суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, производят подсчет витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева.

Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°C, при 90% влажности и 5% CO2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среду меняют через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации (50-60 млн) производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА, далее клетки центрифугируют при 2000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-ти луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель. Смену среды осуществляют 2 раза в неделю, с интервалом 2-3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2 мм3.

Недостатком трехмерного хондротрансплантата является то, что он не обладает достаточными прочностными свойствами, поэтому не применим для регенерации значительных по площади дефектов костной ткани. Трехмерный хондротрансплантат может быть использован для коррекции межпозвонкового остеохондроза, а также небольших по площади дефектов и повреждений костной ткани. Кроме того, к недостаткам трехмерного хондротрансплантата следует отнести необходимость длительной фиксации зоны трансплантации.

Известен способ получения тканеинженерного эквивалента костной ткани путем заселения деминерализованного костного матрикса стромальными клетками с потенциями ММСК. Данный тканеинженерный эквивалент разрабатывали для дальнейшего лечения пациентов с объемными повреждениями костей (Бозо И.Я., Деев Р.В., Цупкина Н.В., Гребнев А.Р., Пинаев Г.П. Экспериментальное обоснование использования тканеинженерного эквивалента для устранения дефектов длинных трубчатых костей // Вопросы морфологии XXI века. Гистогенез и регенерация С. 61-66).

Основными требованиями, предъявляемыми к пластическому материалу, являются биосовместимость, гистосовместимость и механическая прочность. Тканеинженерный эквивалент костной ткани на основе деминерализованного костного матрикса, заселенного клетками, этими свойствами не обладает. При его использовании могут возникать проблемы резорбции, а деминерализация костного матрикса существенно снижает механическую прочность полученного на его основе эквивалента костной ткани.

Известен способ получения биотрансплантата для восстановления объема костной ткани при дегенеративных заболеваниях и травматических повреждениях по патенту РФ на изобретение №2530622 (МПК A61L 27/24, A61K 35/28, A61P 19/10, опубл. 10.10.2014), принятый в качестве прототипа. Способ характеризуется тем, что для его изготовления используют смесь мезенхимальных стромальных клеток, культивированных в стандартных условиях и ММСК, дифференцированные в остеогенном направлении, смешанные с матрицей-носителем. Выделенные ММСК помещают в стандартную среду культивирования AdvanceSTEMTM/Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (фирма-производитель HyClone) с добавлением 10% аутологичной сыворотки крови пациента и выращивают в CO2 инкубаторе (5% CO2) при 37°C до первого пассажа. После чего ММСК снимают с подложки и разделяют на 2 равные части: одну часть клеток продолжают культивировать в стандартных условиях (AdvanceSTEMTM/Antibiotic/Antimycotic Solution 100x/10% аутологичной сыворотки крови пациента), а другую часть дифференцируют в остеогенном направлении за счет добавления в стандартную среду культивирования аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мг/л и Дексаметазона в концентрации 0.1 мк/моль.

Культивирование осуществляют в конфлюентном монослое в течение 2 недель, меняя среду на свежую каждые 3 дня. Затем все ММСК снимают с подложек и смешивают в соотношении 1:1. Перед использованием матрицу-носитель (коллаген-минеральный носитель, например гранулы «КоллапАн-Г») смачивают в небольшом объеме среды AdvanceSTEMTM. В емкости, предназначенной для изготовления биотрансплантата, клетки смешивают с матрицей-носителем в количестве 107 клеток на 1 г веса матрицы-носителя и инкубируют в течение суток при 37°C в атмосфере 5% CO2. Продолжительность всего технологического процесса изготовления биотрансплантата составляет от 20 до 30 суток. Полученный трансплантат должен быть использован в течение 4-8 часов.

В основе структуры матрицы носителя используют коллаген-минеральный комплекс, идентичный по составу костному материалу.

Преимущество данного способа заключается в использовании комбинации недифференцированных и дифференцированных в остеогенном направлении ММСК, что позволяет одновременно решить две основные задачи: обеспечение трофики за счет формирования сосудов (за счет продукции ММСК, культивированными в стандартной среде, факторов роста, цитокинов и трофических факторов) и формирование минерализованной костной ткани.

К основным недостаткам способа по патенту РФ №2530622 следует отнести использование коллаген-минерального матрицы-носителя, который является искусственно синтезированным компонентом тканеинженерной конструкции и не обладает свойствами био- и гистосовместимости.

Еще одним недостатком матриксов и матриц-носителей является проблема равномерного заселения, миграции и размещения клеток в объеме матрицы и отсутствие биодеградации вещества матрицы. Так как от равномерного распределения клеток в объеме матрицы зависит их способность к адгезии, пролиферации, последующей дифференцировке и синтетической активности. Также недостатком вышеизложенного способа получения трансплантатов является проблема резорбции матриц-носителей и ремоделирования биотрансплантата в костную ткань.

Задачей данного изобретения является формирование трансплантата с остеогенными потенциями, отвечающего всем требованиям био-, гистосовместимости и механической прочности для коррекции и замещения дефектов костной ткани.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения трехмерного остеотрансплантата, заключающемся в остеогенной дифференцировке пластического материала, согласно изобретению в качестве пластического материала используют трехмерный хондротрансплантат из культивированных хондробластов и межклеточного матрикса, а остеогенную дифференцировку осуществляют путем направленной дифференцировки трехмерного хондротрансплантата.

Использование в качестве пластического материала трехмерного хондротрансплантата из культивированных хондробластов и межклеточного матрикса позволяет получить трансплантат, состоящий только из клеток и матрикса и обладающий способностью к формированию диффинитивной костной ткани.

Остеогенная дифференцировка предлагаемого пластического материала путем направленной дифференцировки трехмерного хондротрансплантата обеспечивает дифференцировку клеток трехмерного хондротрансплантата в остеогенном направлении, изменение их фенотипа и синтетической активности. Причем дифференцировка пластического материала в данном случае является эволюционно закрепленным механизмом формирования кости (мезенхима-хрящ-кость) как при регенерации, так и в эмбриогенезе.

Полученный по предлагаемому способу остеогенный трансплантат содержит остеогенные клетки, предкостный матрикс, содержащий гидроксиапатит и коллаген I типа, а также формирующиеся примитивные сосуды и капилляры. Это обеспечивает активный метаболизм, быструю адаптацию и формирование органоспецифической костной ткани в зоне пересадки.

Целесообразно направленную дифференцировку трехмерного хондротрансплантата осуществлять в стандартной питательной среде с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки: β-глицерофосфата (10 мМ), аскорбиновой кислоты (0,05 мМ) и дексаметазона (4 мг/мл на 200 мл среды).

Предлагаемое изобретение поясняется микрофотографиями гистологических срезов заявляемого остеотрансплантата, где на фиг. 1 представлена морфологическая структура остеотранспланатата (×400); на фиг. 2 - формирование сосуда в трехмерном остеотрансплантате (×400); на фиг. 3 - синтез матрикса остеогенными клетками трехмерного остеотрансплантата, окраска альциановым синим (×400).

На представленных микрофотографиях хорошо видны кальцификаты 1 (фиг. 1, 2), формирующиеся сосуды 2 (фиг.1), эндотелиальные клетки 3 (фиг. 1, 2), остеогенные клетки 4 (фиг. 1, 2), межклеточный матрикс 5 (фиг. 3).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Известными методами, например по способу, описанному в патенте РФ №2392973 «Способ получения трехмерного хондротрансплантата», получают хондротрансплантат из культивированных хондробластов и межклеточного матрикса. Осуществляют направленную дифференцировку полученного хондротрансплантата в остеогенном направлении путем культивирования его в питательной среде, содержащей индукторы остеогенной дифференцировки клеток, до получения трехмерного остеотрансплантата.

В качестве питательной среды для остеогенной дифференцировки целесообразно использовать питательную среду DMEM F12, содержащую 15% FBS, стрептомицин-пенициллин, амфотеризин B и индукторы остеогенной дифференцировки клеток: 10 милимоль/л β-глицерофосфата, 100 наномоль/л дексометазона и 0,2 милимоль/л аскорбиновой кислоты. Трехмерные трансплантаты с остеогенным потенциалом дифференцировки культивируются в течение от 3 до 6 недель. Смену питательной среды производят каждые 3-е суток. Состав и количество добавляемых веществ в культуральную среду не меняется.

Пример конкретного выполнения способа формирования остеопластического трансплантата.

Новорожденный мини-поросенок вводится в наркоз. Путем верхнего доступа извлекается позвоночник и помещается в физиологический раствор. В стерильных условиях ламинарного шкафа выделяются хрящевые тела позвонков. Материал дважды промывают раствором фосфатного буфера и измельчают в чашке Петри скальпелем. Кусочки переносятся в пробирки с раствором 1,5% коллагеназы в среде RPMI 1640 с добавлением 20% FBS. Инкубируют в течение 12 часов. Далее суспензию дважды промывают от коллагеназы раствором фосфатного буфера. Клетки ресуспензируют в PBS. Жизнеспособность клеток оценивается с помощью красителя трипанового синего в счетной камере Горяева.

Выделенные хондробласты культивируют в условиях инкубатора при 37°C при 90% влажности и 5% CO2 в чашках Петри в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л в течение 3-4 недель. Далее производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА. Клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат культивируют в 6-луночном планшете с питательной средой и 10% FBS.

Через 7 суток в планшетах с сформированным хондротрансплантатом производят замену питательной среды на DMEM F12, содержащую 15% FBS, стрептомицин-пенициллин, амфотеризин B и индукторы остеогенной дифференцировки клеток: 10 милимоль/л β-глицерофосфата, 100 наномоль/л дексометазона и 0,2 милимоль/л аскорбиновой кислоты. Трансплантат культивируется в присутствии индукторов остеогенеза в течение 3-х недель до получения остеотрансплантата.

Способ получения трехмерного остеотрансплантата, заключающийся в остеогенной дифференцировке пластического материала, отличающийся тем, что в качестве пластического материала используют трехмерный хондротрансплантат из культивированных хондробластов и межклеточного матрикса, а остеогенную дифференцировку осуществляют путем направленной дифференцировки трехмерного хондротрансплантата в стандартной питательной среде с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки: β-глицерофосфата (10 мМ), аскорбиновой кислоты (0,05 мМ) и дексаметазона (4 мг/мл на 200 мл среды).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к амидному производному формулы (I), обладающему свойством ингибирования продукции proMMP-9, а также к фармацевтической композиции и лекарственному средству на их основе и средству для ингибирования продукции ММР-9.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для лечения детей с посттравматическими контрактурами локтевого сустава.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению натрийуретического пептида C-типа (CNP), и может быть использовано в медицине. Получают пептид структуры PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37), который используют для лечения дегенеративных костных патологий, отвечающих на CNP.
Изобретение относится к медицине, а именно к вертебрологии, и может быть использовано для комплексного лечения заболеваний шейного отдела позвоночника. Для этого проводят сеансы аппаратного вытяжения позвоночника в горизонтальном положении пациента с индивидуальным подбором угла наклона шейного отдела позвоночника на аппарате DRX9500.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новому пиразолопиридиновому производному формулы (I), а также к его таутомеру, геометрическому изомеру, оптически активным формам, таким как энантиомеры, диастереомеры и рацематы, и к его фармацевтически приемлемой соли, где G1 выбирают из -С(О)-R1; R1 выбирают из C1-С6-алкокси-C1-С6-алкила; C1-С6-алкила; замещенного С6-арил-C1-С6-алкила; замещенного пиперидина; G2 выбирают из необязательно замещенного С6-арила; G3 выбирают из C1-С6-алкила; G4 выбирают из пиридин-C1-С6-алкила; G5 выбирают из Н; где термин «замещенный» обозначает группы, замещенные 1 заместителем, выбираемым из группы, которая включает «C1-С6-алкил», «C1-С6-алкокси», «C1-С6-алкоксикарбонил» и «галоген».

Изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенное антитело-антагонист против FGFR3 и его функциональный фрагмент, а также полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ получения антитела против FGFR3 или его функционального фрагмента.

Изобретение относится к новым 2-арилзамещенным N-арилимидазолинам формулы 1 или их фармацевтически приемлемым солям, возможно в форме кристаллов. Соединения обладают свойствами селективных ингибиторов циклооксигеназы-2 и могут найти применение для лечения воспалительных заболеваний.

Изобретение представляет собой новый способ и композицию, которая усиливает восстановление кости, образование, поддержание и замедление резорбции кости. Способ создания пищевого композиционного материала включает этапы, на которых: a) отделяют твердые вещества от жидкостей в материале, полученном из молочной сыворотки, с получением твердой части и жидкой части, где твердая часть содержит минералы молока, а жидкая часть содержит белки, полученные из молока; b) подвергают раствор белка, полученного из молока, этапа а), этапу ионного обмена, чтобы усилить весовой процент основных белков, полученных из молока, в растворе; c) удаляют минералы на основе натрия и натриевые соли из раствора основных белков, полученных из молока; d) очищают твердые минералы, полученные из молока, путем смешивания минералов с растворителем и нагревания раствора; e) комбинируют очищенный раствор твердых минералов, полученных из молока, предыдущего этапа с усиленным раствором основного белка, полученного из молока этапа с); f) удаляют растворитель предыдущего этапа для получения пищевого композиционного материала.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается терапевтического средства от грыжи межпозвоночного диска, которое представляет собой хондроитиназу ABC в качестве активного ингредиента и вводится таким образом, что ингредиент может вводиться в межпозвоночный диск человека в количестве 1-3 единиц на межпозвоночный диск.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к композитному матриксу для регенерации костной ткани, способу его получения и применения.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в том числе к медицинской и косметической трансплантологии, и представляет собой микротрансплантат (MKT), состоящий из клеток человека, прикрепившихся на поверхности микроносителя, состоящего из полигликолидных волокон, или их группы, диаметром до 20 мкм и длиной от 100 до 1000 мкм.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано при лечении дефектов покровных тканей. Проводят подготовку раны.

Группа изобретений относится к медицине. Описан биоматериал, имеющий многомерную структуру и содержащий дифференцированную MSCs ткань и деминерализованный костный матрикс, который диспергирован в дифференцированной MSCs ткани, способ его приготовления и применение.
Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба.

Изобретение относится к медицине. Описаны новые усиленные биоразлагаемые каркасы для регенерации мягких тканей, а также описаны способы поддержки, наращивания и регенерации живой ткани, где усиленный биоразлагаемый каркас применяют для лечения симптомов, где требуется повышенная прочность и устойчивость помимо необходимости регенерации живой ткани пациента.

Изобретение относится к способам, техническим устройствам и композициям для изготовления в краткие сроки графта или трансплантата в форме каркаса, которые могут найти применение для лечения или заживления повреждений и травм разнообразных тканей и органов центральной или периферической локализации организма человека или животного.

Изобретения касаются мембраны, используемой в качестве подложки для выращивания клеток ретинального пигментного эпителия, ее применения для поддержания клеток и способа засевания клеток на такую мембрану.
Группа изобретений относится к медицине. Описан биологический материал, включающий: a) жидкий носитель, включающий вязкий раствор, содержащий, по меньшей мере, один натуральный и/или полусинтетический полисахарид и имеющий динамическую вязкость, измеренную при 20ºС и при скорости сдвига D=350 с-1, в диапазоне от 100 до 250 сантипуаз и/или кинематическую вязкость в диапазоне от 99 до 248 сантистокс (измеренную в тех же условиях); b) культуру мезенхимальных стволовых клеток аутологичного или гетерологичного типа и/или c) обогащенный тромбоцитами продукт крови.

Группа изобретений относится к области медицины и касается способов создания зуба, обладающего требуемым размером, и восстановления утраченной части зубов ротовой полости путем трансплантации созданного зуба в область утраты зубов.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к регенеративной медицине и тканевой инженерии. Предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие, по меньшей мере, один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере, один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток.
Изобретение относится к экспериментальной медицине, травматологии и ортопедии, хирургическому лечению травматических повреждений спинного мозга с одновременным ускорением его регенерации.
Наверх