Штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, адаптированный к перевиваемой культуре клеток cos-1



Штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, адаптированный к перевиваемой культуре клеток cos-1
Штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, адаптированный к перевиваемой культуре клеток cos-1
Штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, адаптированный к перевиваемой культуре клеток cos-1

 


Владельцы патента RU 2575079:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Представленный штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейства Asfarviridae, род Asfivirus, адаптирован к перевиваемой культуре клеток COS-1 и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096. Изобретение может быть использовано для разработки диагностических препаратов и проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению адаптированного к репродукции в перевиваемых клеточных линиях штамма вируса АЧС 8-го сероиммунотипа, и может быть использовано в научно-исследовательских и диагностических учреждениях при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований и разработке диагностических препаратов.

В работе использовали вирулентный штамм Волгоград-2012 вируса АЧС, полученный из музея ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, прошедший 2 пассажа в первичной культуре ККМС.

Для стандартизации проведения молекулярно-генетических исследований с изолятами и штаммами вируса АЧС, а также при разработке диагностических препаратов, как правило, используют культуральные вируссодержащие материалы, которые получают в перевиваемых культурах клеток.

Адаптацию вирулентного вируса АЧС 8 сероиммунотипа штамма Волгоград-2012 первоначально проводили в перевиваемой культуре клеток ПТП в присутствии 2,0% свиной сыворотки с инкубацией вируса при 38°C в течение 8-10 суток (4 пассажа). Далее пассировали в течение последовательных 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток COS-1 в присутствии 1,0% сыворотки крупного рогатого скота с инкубацией при 37°C в течение 6-8 суток. В процессе адаптации использовали культуральную жидкость предыдущего пассажа вируса в объеме 1 мл. Заражение на первом пассаже проводили в дозе 4,0-5,0 lg ГАЕ50/мл. В первых 4 пассажах отмечали снижение титра вируса с 4,0-5,0 до 1,0-1,5 lg ГАЕ50/мл., а после адаптации на уровне 10-14 пассажей его накопление составляло 7,5-8,5 lg ГАЕ50/мл.

С использованием реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд), предложенной для серологического типирования штаммов, установлено 8 серотипов вируса АЧС, отличающихся между собой в иммунологической пробе, что обуславливает необходимость получения адаптированных штаммов для каждой сероиммуногруппы (1, 2).

Полученный адаптированный штамма Волгоград/14с вируса АЧС был проверен на соответствие по серотиповому признаку в реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд) и типируется в РЗГАд специфической референс-сывороткой 8-го сероиммунотипа, а по результатам генотипирования отнесен ко 2 генотипу.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является адаптированный в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии аттенуированный штамм КК-262 вируса АЧС, используемый для разработки диагностических и вакцинных препаратов. Штамм КК-262 типируется в РЗГАд специфической референс-сывороткой 2-го сероиммунотипа, а по результатам генотипирования отнесен к 1 генотипу.

Целью изобретения является получение адаптированного в перевиваемой культуре клеток штамма вируса 8-го сероиммунотипа, циркулирующего в настоящее время в РФ для проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований и разработки диагностических препаратов.

Получение вируссодержащего сырья вируса АЧС штамма Волгоград/14с в стационарном монослое перевиваемой культуры клеток COS-1

С этой целью культуру клеток, выращенную в матрасах вместимостью 0,5 или 1,0 дм3, заражают штаммом Волгоград/14c в дозе 103-105 ГАЕ50/мл. В качестве ростовой среды при выращивании вируса применяют среду Игла MEM с 1,0% сыворотки крови крупного рогатого скота. Через 5-6 суток культивирования вируса при температуре (37,0±0,5)°C вирус накапливался до 7,5-8,5 lg ГАЕ50/мл.

Штамм Волгоград/14с 8-го серотипа депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3096.

Адаптированный штамм Волгоград/14с вируса АЧС обладает следующими свойствами.

Культуральные свойства. Размножается в перевиваемой культуре клеток COS-1, выращенной стационарным (матрасы) способом с характерными для вируса АЧС цитоплазматическими изменениями (ЦПИ) с последующей деструкцией монослоя. При этом он сохраняет способность размножаться в культуре ККМС и ЛС (лейкоцитов свиньи), вызывая в них выраженную гемадсорбцию и последующий лизис клеток, что дает возможность использовать эти культуры клеток для определения инфекционной активности вируса. Титр вируса, выращенного в культуре клеток COS-1 при стационарном способе культивирования, достигает 7,5-8,5 lg ГАЕ50/мл.

Антигенные свойства.

Выявляется прямым методом флюоресцирующих антител с применением антигенспецифических ФИТЦ иммуноглоулинов (ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии) (Рис. 1).

Основные биологические свойства штамма Волгоград/14с вируса АЧС 8 серотипа приведены в табл. 1

Сероиммунобиологическая характеристика штамма Волгоград/14с

Как видно из таблицы, адаптированный штамм Волгоград/14с вируса АЧС 8 серотипа накапливается в перевиваемой культуре клеток COS-1 до 8,5 lg ГАЕ50/мл, по результатам РЗГАд относится к 8 серотипу и по генотипированию ко 2 генотипу.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков

Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 20 пассажей культивирования в культуре клеток COS-1 и KMC (срок наблюдения). Адаптированный вирус Волгоград/14с обладает гемадсорбирующими свойствами в перевиваемой культуре клеток COS-1. Титр вируса определяется по наличию феномена гемадсорбции в ГАЕ50/мл (Рис. 2).

Патогенность и вирулентность. При заражении подсвинков 3-4 месячного возраста адаптированным вариантом вируса АЧС Волгоград/14с отмечали подъем температуры до 41-42°C на третий день после заражения и гибель животных на 7-9 день. Таким образом, вирус АЧС штамм Волгоград/14с является патогенным и вирулентным.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Вирус не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и другими микроорганизмами.

Способ, срок хранения, периодичность пассажей

Штамм Волгоград/14с хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°C и «освежают» пассированием в культурах клеток COS-1 один раз в 3 года.

Для подтверждения преимущества настоящего изобретения приведены примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Адаптация вируса АЧС к перевиваемой культуре клеток COS-1. Адаптацию вируса к культуре клеток проводили путем инокуляции ее вирулентным штаммом Волгоград, выращенным в первичной культуре клеток KMC (первые 2 пассажа), а в последующих пассажах материалом предыдущего в культурах ПТП и COS-1. Инфицированную культуру клеток, выращенную в матрасах, инкубировали при (37,±0,5)°C в течение 5-6 суток. О размножении вируса в клетках судили по проявлению цитопатических изменений. На уровне 6-8-х пассажей специфическую дегенерацию у инфицированных клеток (30,0-40,0% монослоя) отмечали на 5-6 сутки, титр вируса на 6-7 сутки выращивания составлял 6,5-7,0 lg ГАЕ50/мл. Репродукция вируса в последующих пассажах характеризовалась специфическими дегенеративными изменениями, появление которых отмечали на 4-5 сутки, и накопление вируса на 5-6 сутки составило 7,5-8,5 lg ГАЕ50/мл.

Пример 2. Культивирование штамма Волгоград/14с вируса АЧС в перевиваемой культуре клеток COS-1 стационарным монослойным способом. В результате выполненных исследований были подобраны оптимальные параметры стационарного способа культивирования штамма, которыми являлись:

множественность заражения 3,0-5,0 lg ГАЕ50/мл;

- содержание сыворотки крови КРС в среде Игла-MEM 1,0%;

- pH среды 7,2-7,4;

- длительность культивирования 6-8 суток;

- температурный режим (37,0±0,5)°C.

Данный режим культивирования позволяли получать вируссодержащий материал с активностью 8,0-8,5 lg ГАЕ50/мл.

Полученные данные показывают, что адаптированный к перевиваемой культуре клеток COS-1 штамм Волгоград/14с, может быть использован в научно-исследовательских центрах для проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований вируса АЧС и разработки диагностических препаратов.

Источники информации

1. Моргунов Ю.П., Петров Ю.И. Изучение иммунобиологических свойств вируса африканской чумы свиней 5-го типа: выделение, типизация и определение референс-штамма // Научно-теоретический журнал ПБПЖ. 2010. №4. С. 104-112.

2. Моргунов Ю.П. и др. Адаптация вируса африканской чумы свиней различных сероиммунотипов к новым перевиваемым культурам клеток. 2013.

3. Прудникова Е.Ю. и др. Адаптация вируса африканской чумы свиней к перевиваемым культурам клеток. 2012.

Штамм Волгоград/14с вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейство Asfarviridae, род Asfivirus, адаптированный к перевиваемой культуре клеток COS-1, депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096 для разработки диагностических препаратов и проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики острого лимфобластного лейкоза у пациента, включающий выявление признаков лейкоза, тестирование клеток крови на лейкоз, инкубирование клеток крови фактором, идуцирующим лейкоз, с тем, чтобы индуцировать экспрессию клеточных поверхностных маркеров, которые являются признаком лейкоза, где фактор, индуцирующий лейкоз - это супернатант Aspergillus flavus, EBV-инфицированный CCL87 супернатант, очищенная EBV культура или их комбинации.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления нарушения энергетического обмена в синцитиотрофобласте плаценты беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, и предназначено для оценки риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных с клиническими проявлениями атеросклероза.

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к медицинской лабораторной диагностике, и описывает способ экспресс-диагностики женского эндокринного бесплодия.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) у подростков в возрасте от 14 до 17 лет включительно с помощью измерения соотношения 2-ОНЭ1/16α-ОНЭ1 в моче, отличающийся тем, что проводят количественное определение метаболитов эстрогенов 2-гидроксиэстрона и 16α-гидроксиэстрона в моче in vitro, вычисляют их соотношение и сравнивают полученные значения с установленными нормативами для здоровых сверстниц, при значении 0,71±0,03 диагностируют СПКЯ.

Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, эндокринологии, и может быть использовано для прогнозирования неблагоприятного исхода в течение двенадцати месяцев у больных после эпизода острого коронарного синдрома с сопутствующим сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ ранней диагностики эндогенной интоксикации путем расчета раннего интегрального индекса интоксикации (РИИ), отличающийся тем, что РИИ для мужчин рассчитывается по формуле: а РИИ для женщин рассчитывается по формуле: где Гомоцист.
Изобретение относится к медицине и предназначено для иммунодиагностики заболеваний, вызванных Helicobacter pylori-инфекцией у лиц с аллергическими заболеваниями. Определяют в сыворотке крови slgE к Helicobacter pylori методом иммуноферментного анализа.
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для лечения асимптоматической бактериоспермии. Для этого пациенту назначают Уро-ваксом по 1 капсуле 2 раза в день перорально в течение 1 месяца при бактериоспермии в титре более 103, а при титре 103 и менее - по 1 капсуле через день.

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен бактериальный штамм Pseudomonas denitrificans ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» В-1299.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен новый бактериальный штамм Pseudomonas delhiensis KТ-13 ВКПМ В-11400 - деструктор нефти и нефтепродуктов.

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Штамм микроводорослей Haematococcus pluvialis ВМ1 депонирован в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, применение индикатора для вышеуказанного способа, где индикатором является теллурит или смесь теллурита и мочевины, твердая среда для способа испытания чувствительности, применение твердой среды, нагревательный термостат для способа испытания чувствительности и бокс культивирования для способа испытания чувствительности.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения полимера, включающего фукозу, полимер, содержащий фукозу, и его применения.

Изобретение относится к хлебопекарной промышленности. Настоящее изобретение предлагает дрожжи, пригодные для производства хлебобулочных изделий с применением большого количества дрожжей, а также композиции, которые могут дать хлебобулочное изделие, содержащие указанные дрожжи.

Заявленная группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus jensenii депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им Г.К.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Изобретение относится к области экологии. Предложен способ очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов на искусственных двухфазных питательных средах.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, санитарии и предназначено для дезодорации помещений. Дезодорирующее средство для помещений содержит концентрат селекционированных высокоспецифичных бактериофагов видов Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa.
Наверх