Гуманизированное антитело против олигомера бета-амилоида

Изобретение относится к иммунологии. Предложено гуманизированное антитело против Аβ-олигомера, которое не связывается с Аβ-мономерами, характеризующееся наличием вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. Описаны: средство против когнитивной дисфункции, лекарственный препарат для лечения болезни Альцгеймера, средство для подавления образования сенильных бляшек и ингибитор образования β-амилоидных волокон, содержащие гуманизированное антитело в качестве активного ингредиента. Предложены также: способ профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера и способ подавления прогрессирования болезни Альцгеймера, включающие стадию введения гуманизированного антитела. Описан способ получения антитела с помощью рекомбинантного вектора с ДНК, кодирующей гуманизированное антитело, путем культивирования трансформанта с образованием и накоплением гуманизированного антитела в культуре. Использование изобретения обеспечивает новое гуманизированное антитело против Аβ-олигомера, которое не связывается с Аβ-мономерами, что может найти применение в медицине. 9 н.п. ф.-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с олигомером β-амилоидного белка (далее обозначенного как «Аβ») и к его применению.

Уровень техники

Основываясь на различных данных, было сделано предположение, что снижение памяти при болезни Альцгеймера (далее обозначенной как «AD») происходит результатом дисфункции синапсов, возникающей за счет растворимых олигомеров β-амилоидного белка (далее β-амилоидный белок обозначен как «Аβ» и олигомер β-амилоидного белка обозначен как «Аβ-олигомер») (непатентные документы 1 и 2).

Следовательно, существует вероятность, что избыточное накопление или отложение Аβ-олигомеров в мозге «запускает» серию патологических каскадов, которые могут привести к развитию AD. Это определяет возможность эффективности медикаментозного лечения, направленного на Аβ-олигомеры, для замедления или профилактики начала и прогрессирования клинического проявления AD.

Однако информация, касающаяся нейродегенерации, вызванной молекулами, лежащими в основе гипотезы амилоидного каскада в качестве основного фактора, в частности, Аβ-олигомерами, была в основном получена в экспериментах in vitro (непатентный документ 3) и не была подтверждена непосредственно in vivo.

Поскольку структуры, специфические для Аβ-олигомеров, не изучались в опытах in vivo, о которых сообщалось ранее (непатентный документ 4), то токсичность эндогенных Аβ-олигомеров для синапсов не исследовалась.

Кроме того, несмотря на то, что проводились опыты на различных моделях AD на мышах, ранее не была выявлена нейрональная токсичность Аβ-олигомеров в мозге пациентов, страдающих AD.

Кроме того, ранее не было установлено, почему образование нейрофибриллярного узла (далее обозначен как «NFT») и потеря нервных клеток имеют место до патологического формирования сенильных бляшек в энториальной области коры и каким образом Аβ-олигомеры связаны с дегенерацией ткани и возникновением дисфункций.

В качестве антител против Аβ-олигомеров известны моноклональные антитела мышей против Аβ-олигомеров NAB61 (непатентный документ 4), 1A9, 2C3, E12, 1C10 и 4D3 (патентный документ 1).

В общих чертах известно, что когда антитело, отличное от антитела человека, такое как антитело мыши, вводят человеку, то оно распознается как чужеродное вещество таким образом, что в организме человека индуцируется образование антител человека на антитело мыши (антимышиные антитела человека: HAMA). Известно, что HAMA взаимодействуют с введенным антителом мыши, вызывая побочные реакции (непатентные документы 5-8), ускоряя выведение антитела мыши из организма (непатентные документы 6, 9 и 10) и снижая терапевтический эффект антитела мыши (непатентные документы 11 и 12).

Для решения этих проблем предпринимались попытки получить рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело человека и гуманизированное антитело из антитела, отличного от антитела человека, с использованием методов генетической рекомбинации.

Химерное антитело человека, гуманизированное антитело и тому подобное имеет различные преимущества для клинического применения антитела человека по сравнению с антителом, отличным от антитела человека, таким как антитело мыши. Например, сообщалось, что его иммуногенность снижалась, и его период полураспада удлинялся в опыте на обезьянах по сравнению с антителом мыши (непатентный документ 13).

То есть, поскольку химерное антитело человека, гуманизированное антитело и тому подобное реже вызывают побочные эффекты у человека по сравнению с антителами, отличными от антител человека, предполагается, что их терапевтический эффект будет сохраняться в течение длительного периода времени.

Также, поскольку рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело человека, гуманизированное антитело и антитело человека готовят с использованием рекомбинантных методов, то его можно получить в различных молекулярных формах.

Например, подкласс γ1 можно использовать в качестве константной области (далее обозначена как «С-область») тяжелой цепи (далее обозначена как «Н-цепь») антитела человека (С-область Н-цепи обозначена как «СН») для получения рекомбинантного антитела, обладающего высокими эффекторными функциями, такими как антителозависимая клеточная цитотоксичность (далее обозначена как «ADCC-активность»). Кроме того, подкласс γ2 или γ4 можно использовать в качестве тяжелой цепи для получения рекомбинантного антитела, которое обладает пониженной эффекторной функцией и, как полагается, обладает пролонгированным периодом полураспада в крови по сравнению с антителами мыши (непатентный документ 14).

В частности, поскольку цитотоксичность, такая как комплемент-зависимая цитотоксичность (далее обозначена как «CDC-активность») и ADCC-активность опосредуются через Fc-область антитела (область, находящаяся после шарнирной области тяжелой цепи антитела) являются важными для проявления терапевтической эффективности, то химерное антитело человека, гуманизированное антитело или антитело человека являются предпочтительными по сравнению с антителом, отличным от антитела человека, таким как антитело мыши (непатентные документы 15 и 16).

Кроме того, используя недавние достижения в области инженерии белков и генной инженерии, также можно получить рекомбинантное антитело в виде фрагмента антитела, обладающего меньшей молекулярной массой, такого как Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечное антитело (далее обозначено как «scFv») (непатентный документ 17), фрагмент димеризованной V-области (далее обозначен как «диатело») (непатентный документ 18), фрагмент стабилизированной дисульфидной связью V-области (далее обозначен как «dsFv») (непатентный документ 19) и пептид, содержащий CDR (непатентный документ 20). Эти фрагменты антител обладают преимуществом в переносе к тканям-мишеням по сравнению с молекулами цельного антитела (непатентный документ 21).

Вышеприведенные факты указывают, что химерное антитело человека, гуманизированное антитело, антитело человека или фрагмент антитела являются более предпочтительными для использования при лечении человека по сравнению с антителами, отличными от антител человека, такими как антитело мыши.

Перечень источников

Патентный документ 1: WO 2009/051220

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Klein W.L., Trends Neurosci., 24:219-224, 2011.

Непатентный документ 2: Selkoe D.J., Science, 298:789-791, 2002.

Непатентный документ 3: Hass C. et al., Nature Review 8:101-112, 2007.

Непатентный документ 4: Lee E.B. et al., J. Biol. Chem., 281:4292-4299, 2006.

Непатентный документ 5: J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984).

Непатентный документ 6: Blood, 65, 1349 (1985).

Непатентный документ 7: J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988).

Непатентный документ 8: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242 (1985).

Непатентный документ 9: J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985).

Непатентный документ 10: J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988).

Непатентный документ 11: J. Immunol., 135, 1530 (1985).

Непатентный документ 12: Cancer Res., 46, 6489 (1986).

Непатентный документ 13: Cancer Res., 56, 1118 (1996).

Непатентный документ 14: Immunol., 85, 668 (1995).

Непатентный документ 15: J. Immunol., 144, 1382 (1990).

Непатентный документ 16: Nature, 322, 323 (1988).

Непатентный документ 17: Science, 242, 423 (1988).

Непатентный документ 18: Nature Biotechnol., 15, 629 (1997).

Непатентный документ 19: Molecular Immunol., 32, 249 (1995).

Непатентный документ 20: J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996).

Непатентный документ 21: Cancer Res., 52, 3402 (1992).

Сущность изобретения

Техническая проблема, решаемая изобретением

В вышеприведенном непатентном документе 4 и патентном документе 1 описаны антитела к Аβ-олигомерам. Однако данные антитела связываются не только с Аβ-олигомером, но также с Аβ-мономером. Следовательно, существует проблема, связанная с серьезными побочными эффектами антитела во время лечения пациентов с AD антителами, которые направлены на патологию в мозге.

По этой причине настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое не связывается с Аβ-мономером и специфически связывается только с Аβ-олигомером, и к его применению. Более конкретно, изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с Аβ-олигомером, к способу определения Аβ-олигомера с использованием антитела, к способу диагностики AD с использованием антитела и к лекарственному препарату, содержащему антитело.

Средства для решение проблемы

В результате интенсивных размышлений по поводу вышеуказанной проблемы заявители настоящего изобретения обнаружили гуманизированное антитело, которое не связывается с Аβ-мономером, а специфически связывается только с Аβ-олигомером, и на этом основании было создано настоящее изобретение.

Таким образом, в настоящем изобретении описано следующее:

1. Гуманизированное антитело, которое не связывается с мономером β-амилоидного белка, но связывается с олигомером β-амилоидного белка, и которое содержит следующую (а) вариабельную область тяжелой цепи и (b) вариабельную область легкой цепи:

(а) вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, в которой проведена по меньшей мере одна модификация из аминокислотных модификаций для замещения Lys в положении 12 на Val, Val в положении 20 на Leu, Arg в положении 38 на Lys, Gln в положении 39 на Leu, Leu в положении 45 на Phe, Met в положении 48 на Ile, Arg в положении 67 на Lys, Val в положении 68 на Ala, Ile в положении 70 на Leu, Ala в положении 72 на Val, Thr в положении 74 на Lys и Ala в положении 97 на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(b) вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, в которой проведена по меньшей мере одна модификация из аминокислотных модификаций для замещения Ile в положении 2 на Val, Pro в положении 15 на Leu, Gln в положении 50 на Lys и Tyr в положении 92 на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

2. Гуманизированное антитело по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или 15, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, 16 или 17.

3. Средство против когнитивной дисфункции, содержащее гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

4. Лекарственный препарат для лечения болезни Альцгеймера, содержащий гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

5. Средство для подавления образования сенильных бляшек, содержащее гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

6. Ингибитор образования β-амилоидных волокон, содержащий гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

7. Способ по меньшей мере профилактики и/или лечения когнитивной дисфункции, включающий введение гуманизированного антитела по п.п. 1 или 2.

8. Способ по меньшей мере для одного из профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по пп.1 или 2.

9. Способ подавления прогрессирования болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по пп.1 или 2.

Преимущественные эффекты изобретения

Предполагается, что антитело по настоящему изобретению будет использоваться в способах профилактики и лечения AD и в качестве диагностического маркера на ранней стадии заболевания за счет направленного воздействия на Аβ-белок, который является вызывающей AD молекулой.

Существует проблема относительно внутрицеребрального переноса антитела во время лечения пациентов с AD антителом, направленным на патологию в мозге. Однако имеется вероятность того, что антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения в клинике путем введения в периферическую вену, и можно полагать, что прогресс в лечении AD антителом будет очевиден сразу же.

Краткое описание фигур

[Фиг.1] На фиг.1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области Н-цепи HV0 и модифицированные аминокислотные остатки из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 и HV12. Первая и вторая линия на фигуре указывают номера аминокислот в вариабельной области Н-цепи, и буквы на других соответствующих линиях указывают замещенную аминокислоту (представлена однобуквенным кодом).

[Фиг.2] На фиг.2 показана аминокислотная последовательность вариабельной области L-цепи LV0 и модифицированные аминокислотные остатки из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14 в LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV3 и LV4. Первая и вторая линия на фигуре указывают номера аминокислот в вариабельной области L-цепи, и буквы на других соответствующих линиях указывают модифицированную аминокислоту (представлена одной буквой).

[Фиг.3] На фиг.3 приведены сенсограммы, полученные при оценке связывающей активности каждого гуманизированного антитела против Аβ-олигомера для Аβ-мономеров с использованием системы Biacore.

Описание вариантов осуществления

Гуманизированное антитело против Аβ-олигомера по настоящему изобретению (далее также обозначено как «антитело по настоящему изобретению» или «гуманизированное антитело по настоящему изобретению») представляет собой гуманизированное антитело, отличающееся тем, что оно не связывается с Аβ-мономером. Антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой выделенное антитело, очищенное антитело или композицию антитела.

Выделенное антитело, очищенное антитело и композиция антитела представляют собой антитела, которые по существу содержат 100% желаемого антитела и не содержат каких-либо примесей, таких как загрязняющие белки, появление которых возможно при получении антитела из антитело-продуцирующих клеток, тканей, антитело-продуцирующих животных и тому подобное.

Антитело является гетеротетрамерным белком, состоящим из двух тяжелых цепей (Н-цепи) и двух легких цепей (L-цепи). Антитело классифицируется как поликлональное антитело и моноклональное антитело, которые распознают один и тот же антиген.

Поликлональное антитело представляет собой смесь антител, которые распознают один и тот же антиген. Примеры поликлонального антитела включают антисыворотку животного-хозяина, иммунизированного антигеном.

Моноклональное антитело представляет собой антитело, секретированное одним клоном антитело-продуцирующих клеток, и которое распознает только один эпитоп (также называемый антигенной детерминантой) и обладает однородностью в аминокислотной последовательности (первичной структуре).

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Примеры моноклонального антитела по настоящему изобретению включают моноклональное антитело, в котором гипервариабельные участки 1-3 (далее обозначены как «CDR») тяжелой цепи антитела (далее обозначена как «Н-цепь») содержат соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-2, и CDR 1-3 в L-цепи содержат соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6; моноклональное антитело, в котором вариабельная область Н-цепи антитела (далее обозначена как «VH») содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельная область L-цепи (далее обозначена как «VL») содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 и моноклональное антитело мыши против Аβ-олигомера 6Е4.

В качестве примера эпитопа можно привести одну аминокислотную последовательность, которая распознается и связывается моноклональным антителом, конформацию, содержащую вышеприведенную аминокислотную последовательность, вышеприведенную аминокислотную последовательность, с которой связана сахарная цепь, и конформацию, содержащую вышеприведенные аминокислотные последовательности, с которыми связаны сахарные цепи.

Эпитоп для распознавания антителом по настоящему изобретению может представлять собой любой белок, при условии, что он включает по меньшей мере один Аβ-белок и его фрагмент, и он находится на Аβ-олигомере, с которым образует комплекс.

Примеры эпитопа, с которым связывается антитело по настоящему изобретению, включают эпитоп, содержащий первичную аминокислотную последовательность Аβ, которая находится на Аβ-олигомере, эпитоп, содержащий конформацию Аβ-олигомера и тому подобное.

Известно, что Аβ-белок, являющийся основным компонентом амилоида, представляет пептид, содержащий 40-42 аминокислоты и образуется из белка-предшественника, называемого предшественником белка амилоида (далее обозначен как «APP») под действием протеазы.

Молекулы амилоида, образующиеся из АРР, включают нефибриллярный полимер растворимых мономеров и растворимых олигомеров в дополнении к амилоидным волокнам, находящимся в осадке при ультрацентрифугировании.

В настоящем изобретении Аβ-олигомер представляет собой нефибриллярный полимер, и он является Аβ-олигомером, который содержит по меньшей мере один из Аβ-белков и его фрагмент, и образует комплекс.

В частности, примеры Аβ-олигомера включают Аβ40(Аβ1-40)олигомер, Аβ42(Аβ1-42)олигомер и Аβ-олигомер, содержащий по меньшей мере один из Аβ40 и Аβ42.

Кроме того, примеры Аβ-олигомера по настоящему изобретению также включают Аβ-олигомер, содержащий Аβ-фрагмент без N-конца Аβ по меньшей мере в одном из Аβ40 и Аβ42.

В частности, Аβ42-олигомер по настоящему изобретению представляет молекулы с молекулярной массой 45-160 кДа по данным SDS-PAGE и молекулярной массой 22,5-1,035 кДа по данным Blue Native-PAGE.

Аβ42-олигомер выделяют в основном до >100 кДа, удерживая жидкость в молекулярном сите. Кроме того, Аβ-олигомер является смесью конфигураций, которая состоит из молекул в форме частиц, каплевидных молекул и круглых молекул с высотой 1,5-3,1 нм под атомно-силовым микроскопом.

Кроме того, вышеуказанный Аβ42-олигомер элюируется в истинной объемной фракции 8, соответствующей молекулярной массе 680 кДа или выше, и во фракции 15, соответствующей молекулярной массе 17-44 кДа, при использовании гель-фильтрации.

Антитело по настоящему изобретению можно использовать при условии, что оно является гуманизированным антителом, которое связывается с Аβ-олигомером и не связывается с Аβ-мономером, и его источник и форма не ограничиваются.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению не распознает растворимый β-амилоидный (Аβ) мономер, который является физиологической молекулой, и взаимодействует только с растворимым Аβ-олигомером.

В настоящем изобретении связывание только с растворимым Аβ-олигомером без связывания с растворимым Аβ-мономером означает, что среди Аβ-мономеров и Аβ-олигомеров, которые разделяются ультрафильтрацией и молекулярным ситом, антитело не распознает мономеры (примерно 4,5 кДа), но специфически распознает растворимый Аβ-олигомер, который аналогичен или крупнее Аβ-димеров. Следовательно, предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению специфически связывалось с растворимым Аβ-олигомером, который аналогичен или крупнее Аβ-димера.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере одной активностью из следующего (1)-(5):

(1) активностью против нейротоксичности;

(2) способностью подавлять образование Аβ-амилоидных волокон;

(3) специфичностью распознавать только Аβ-олигомер;

(4) способностью захватывать Аβ-олигомер в мозге пациентов с AD;

(5) способностью предупреждать AD-подобный патогенез (снижение памяти, накопление Аβ в мозге) у APPswe-трансгенных мышей (Tg2576).

Активность антитела по настоящему изобретению, относящиеся к вышеприведенным (1)-(5), можно подтвердить с использованием способа, описанного в международной заявке WO 2009/051220.

Антитело по настоящему изобретению можно получить в виде рекомбинантного антитела. В настоящем изобретении рекомбинантное антитело включает антитела, полученные рекомбинантной технологией, такие как химерное антитело человека, гуманизированное антитело (или антитело с трансплантированным CDR), антитело человека и фрагмент антитела.

Рекомбинантное антитело, имеющее свойства моноклональных антител, обладающее низкой иммуногенностью и длительным периодом полураспада, является предпочтительным в качестве лекарственного препарата. Примеры рекомбинантного антитела включают антитело, полученное модификацией моноклонального антитела по настоящему изобретению с использованием рекомбинантной технологии.

Химерное антитело человека представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (далее обозначено как «VH») и вариабельную область легкой цепи (далее обозначено как «VL») антитела животного, отличного от человека, и константную область тяжелой цепи (далее обозначено как «CH») и константную область легкой цепи (далее обозначено как «CL») антитела человека.

Химерное антитело человека можно получить с помощью кДНК, кодирующих вышеуказанные VH и VL, из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфически связывается с Аβ-олигомером, путем встраивания кДНК в вектор экспрессии животной клетки, содержащий ДНК, кодирующие CH и CL, тем самым конструируя вектор для экспрессии химерного антитела человека, и затем введением вектора в животную клетку для экспрессии антитела.

В качестве вышеприведенной СН химерного антитела человека можно использовать любые СН, при условии, что они относятся к иммуноглобулину человека (далее обозначено как «hIgG»), и которые относятся к классу hIgG, являются предпочтительными, и можно использовать любой из подклассов, относящихся к классу hIgG, такой как hIgG1, hIgG2, hIgG3 и hIgG4.

В качестве вышеприведенной CL химерного антитела человека можно использовать любые CL, при условии, что они относятся к классу hIg, и которые относятся к классу κ или классу λ.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению представляет антитело, в котором аминокислотные последовательности CDR VH и VL антитела, полученные у животного, отличного от человека, пересаживают в соответствующие положения VH и VL антитела человека.

Гуманизированное антитело можно получить конструированием аминокислотной последовательности V-областей, в которых аминокислотные последовательности CDR обеих VH и VL моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой животного, отличного от человека, и специфически связывается с Аβ-олигомером, пересаживаются в каркасные области (далее обозначены как «FR») VH и VL любого антитела человека соответственно, конструированием кДНК, кодирующих V-области, вставкой каждой из них в вектор экспрессии животных клеток, содержащих гены, кодирующие CH и CL антитела человека, тем самым получив вектор для экспрессии гуманизированного антитела, и его введением в животную клетку для экспрессии и продукции гуманизированного антитела.

В качестве аминокислотных последовательностей FR VH и VL гуманизированного антитела можно использовать любые аминокислотные последовательности, при условии, что они являются аминокислотными последовательностями VH и VL, соответственно, полученными из антитела человека.

Примеры включают аминокислотные последовательности FR VH и VL антител человека, зарегистрированных в базе данных, такой как Protein Data Bank, обычные аминокислотные последовательности каждой подгруппы FR VH и VL антител человека, описанных в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) и тому подобное.

Примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению включают гуманизированное антитело, в котором CDR 1-3 в VH антитела содержат аминокислотные последовательности, соответственно SEQ ID NO:1-3, и CDR 1-3 в VL антитела содержат аминокислотные последовательности, соответственно SEQ ID NO:4-6.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой гуманизированное антитело, содержащее по меньшей мере одну из следующих (а) VH и (b) VL. Кроме того, в следующих (а) и (b) число введенных замен не ограничивается: (а) VH, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещен другим аминокислотным остатком;

(b) VL, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещен другим аминокислотным остатком.

Предпочтительные примеры VH, входящей в состав гуманизированного антитела по настоящему изобретению, включают, например, VH, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками.

Кроме того, VH, выбранная из следующих (1)-(9), также является предпочтительной в качестве VH, входящей в гуманизированное антитело по настоящему изобретению:

(1) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(2) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(3) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(4) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(5) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(6) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(7) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(8) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(9) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками.

Примеры аминокислотной последовательности VH включают аминокислотную последовательность, в которую введена по меньшей мере одна модификация, выбранная из модификаций замещением Lys в положении 12 на Val, Val в положении 20 на Leu, Arg в положении 38 на Lys, Gln в положении 39 на Leu, Leu в положении 45 на Phe, Met в положении 48 на Ile, Arg в положении 67 на Val, Val в положении 68 на Ala, Ile в положении 70 на Leu, Ala в положении 72 на Val, Thr в положении 74 на Lys и Ala в положении 97 на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Более конкретные примеры аминокислотной последовательности VH включают аминокислотные последовательности, в которые введено от 12 до 1 следующих замен.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 12 замен, включают аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 11 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(12):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 10 замен, включают, например, следующие аминокислотные последовательности (1)-(66):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(13) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(14) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(15) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(16) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(17) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(18) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(19) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(20) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(21) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(22) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(23) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(24) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(25) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(26) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(27) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(28) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(29) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(30) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положеии 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(31) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(32) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(33) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(34) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(35) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(36) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(37) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(38) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(39) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(40) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(41) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(42) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(43) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(44) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(45) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(46) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(47) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(48) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(49) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(50) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(51) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(52) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(53) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(54) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(55) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(56) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(57) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(58) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(59) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(60) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(61) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(62) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(63) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(64) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(65) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(66) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 9 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(10):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 8 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(47):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 67 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(13) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(14) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(15) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(16) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(17) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(18) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(19) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(20) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(21) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(22) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(23) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(24) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(25) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(26) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(27) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(28) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(29) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(30) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(31) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(32) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(33) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(34) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(35) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(36) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(37) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(38) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(39) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(40) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(41) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(42) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(43) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(44) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(45) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(46) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(47) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 7 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(22):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(13) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(14) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(15) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(16) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(17) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(18) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(19) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(20) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(21) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замешен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(22) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 6 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(7):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен ан Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 5 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(8):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 4 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(9):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 3 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(19):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(13) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(14) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(15) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(16) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(17) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(18) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(19) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 2 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(66):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Val в положении 20 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Arg в положении 38 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Arg в положении 38 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(13) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(14) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(15) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(16) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(17) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(18) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(19) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(20) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(21) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(22) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(23) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(24) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(25) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(26) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(27) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(28) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(29) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(30) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(31) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(32) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(33) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(34) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(35) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(36) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(37) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(38) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(39) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(40) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(41) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(42) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(43) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(44) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(45) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(46) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(47) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(48) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(49) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(50) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(51) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(52) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(53) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(54) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(55) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(56) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(57) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(58) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(59) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(60) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(61) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(62) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(63) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(64) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(65) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(66) аминокислотную последовательность, в которой Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введена 1 замена, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(12):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Среди приведенных выше аминокислотных последовательностей VH аминокислотная последовательность SEQ ID NO:12, аминокислотная последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, являются предпочтительными.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению предпочтительно включает VL, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50, Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками, и предпочтительные примеры VL по настоящему изобретению также включают VL, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15, Gln в положении 50, Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками.

Кроме того, VL, выбранная из следующих (1)-(4), также является предпочтительной в качестве VL, входящей в состав гуманизированного антитела по настоящему изобретению:

(1) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками;

(2) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками;

(3) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками;

(4) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 и Gln в положении 50 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками.

Аминокислотная последовательность VL включает, например, аминокислотную последовательность, в которую введена по меньшей мере одна модификация, выбранная из модификаций с замещением Ile в положении 2 на Val, Pro в положении 15 на Leu, Gln в положении 50 на Lys и Tyr в положении 92 на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

Более конкретные примеры аминокислотной последовательности VL в антителе по настоящему изобретению, в которую введены вышеуказанные модификации, включают, например, аминокислотную последовательность VL, в которую введено от 4 до 1 следующих замен.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введено 4 замены, включают аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введено 3 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(4):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu и Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введено 2 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(6):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val и Pro в положении 15 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val и Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu и Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введена 1 замена, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(4):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

Среди вышеприведенных аминокислотных последовательностей VL аминокислотная последовательность SEQ ID NO:14, аминокислотная последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и аминокислотная последовательность, в которой Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, являются предпочтительными.

Конкретные примеры антитела по настоящему изобретению включают любое из антител, каждое из которых получено комбинированием вышеуказанных соответственно VH и VL.

Предпочтительные примеры антитела по настоящему изобретению включают, например, следующие антитела (1)-(4):

(1) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;

(2) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.2;

(3) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;

(4) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.2.

Среди аминокислотных последовательностей VH, приведенных на фиг.1, 6E4HV0 и HV12 являются предпочтительными. Кроме того, среди аминокислотных последовательностей VL, приведенных на фиг.2, 6E4LV0, LV2a и LV4 являются предпочтительными.

Следовательно, в качестве гуманизированного антитела, содержащего VH, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг.1, и VL, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг.2, гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей 6E4HV0 и HV12, и VL, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей 6E4LV0, LV2a и LV4, является предпочтительным.

Более конкретно, примеры включают гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или 15, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, 16 и 17.

В качестве комбинации аминокислотной последовательности VH, приведенной на фиг.1, и аминокислотной последовательности VL, приведенной на фиг.2, комбинации HV0 и LV0, HV0 и LV2a, HV0 и LV4, HV12 и LV4 являются предпочтительными.

Следовательно, в качестве антитела по настоящему изобретению следующие гуманизированные антитела (1)-(4) являются более предпочтительными:

(1) гуманизированное антитело (HV0LV0), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV0 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV0 на фиг.2;

(2) гуманизированное антитело (HV0LV2a), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV0 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV2a на фиг.2;

(3) гуманизированное антитело (HV0LV4), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV0 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV4 на фиг.2;

(4) гуманизированное антитело (HV12LV4), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV12 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV4 на фиг.2.

Конкретные примеры вышеприведенных антител включают гуманизированное антитело, в котором комбинация аминокислотных последовательностей, входящих в состав VH и VL, представляет SEQ ID NO:12 и 14; SEQ ID NO:12 и 16; SEQ ID NO:12 и 17 и SEQ ID NO:15 и 17.

Кроме того, примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению включают гуманизированное антитело, которое конкурирует с вышеприведенным антителом в связывании с Аβ-олигомером, и гуманизированным антителом, которое связывается с эпитопом, который является таким же, как эпитоп, распознаваемый вышеприведенным гуманизированным антителом.

В настоящем изобретении первоначально антитело человека представляет антитело, находящееся в организме человека, в естественном состоянии, и оно включает антитела, полученные из фаговой библиотеки антител человека, от трансгенного животного, продуцирующего антитела человека, и тому подобное, которые получают на основе последних достижений в генной инженерии, клеточной инженерии и методов инженерии процессов развития.

Антитело, находящееся в организме человека, можно получить, например, выделением лимфоцитов периферической крови человека, их иммортализацией заражением вирусом EB или тому подобное, и затем клонированием с получением лимфоцитов, способных продуцировать антитело, культивированием полученных таким образом лимфоцитов, и выделением антитела из культурального супернатанта.

Фаговая библиотека антител человека представляет библиотеку, в которой фрагменты антитела, такие как Fab и scFv, экспрессируются на поверхности фага вставкой гена, кодирующего антитело, полученное из линии В-клеток человека, в фаговый ген.

Фаг, экспрессирующий фрагмент антитела, обладающий требуемой антигенсвязывающей активностью, на поверхности клеток, можно выделить из библиотеки, используя его способность связываться с иммобилизованным на поверхности антигеном в качестве показателя. Затем фрагмент антитела можно превратить в молекулу антитела человека, содержащую две полных Н-цепи и две полных L-цепи с использованием методов генной инженерии.

Трансгенное животное, продуцирующее антитело человека, является животным, у которого ген антитела человека встроен в клетки. Более конкретно, трансгенное животное, продуцирующее антитело человека, можно получить введением гена, кодирующего антитело человека, в клетку ES мыши, пересадкой клетки ES в эмбрион другой мыши на ранней стадии эмбриогенеза и затем его развитием в полноценное животное.

Антитело человека, полученное у трансгенного животного, продуцирующего антитело человека, можно получить с помощью гибридомы, продуцирующей антитело человека, методом гибридом, что обычно проводят на животных, отличных от человека, культивированием полученной гибридомы и продукцией или накоплением антитела человека в культуральном супернатанте.

Антитело или фрагмент антитела, в которых делецирована, замещена, вставлена или добавлена одна или более аминокислот в аминокислотной последовательности, составляющей вышеуказанные антитело или фрагмент антитела, обладающее активностью, аналогичной для вышеуказанного антитела или фрагмента антитела, также входят в антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению.

Число аминокислотных остатков, которые делецированы, замещены, вставлены и/или добавлены, составляет одно или более, и конкретно не ограничивается, но оно находится в пределах, при которых возможна делеция, замена, вставка или добавление с использованием известных способов, таких как сайт-направленный мутагенез, описанный в Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Willey&Sons (1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) или тому подобное. Например, число находится в пределах от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 и наиболее предпочтительно от 1 до 5.

Делеция, замена, вставка или добавление одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности вышеуказанного антитела означают следующее. То есть, это означает делецию, замену, вставку или добавление одного или множества аминокислотных остатков в любых положениях в одной или множестве аминокислотных последовательностей антитела в одной последовательности. Также делеция, замена, вставка или добавление могут иметь место одновременно, и аминокислота, которая заменена, вставлена или добавлена, может быть природного или неприродного типа.

Природные аминокислоты включают L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-аргинин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, L-цистеин и тому подобное.

Предпочтительные примеры взаимозаменяемых аминокислот приведены ниже. Аминокислоты в одной группе являются взаимозаменяемыми аминокислотами.

Группа А: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминомасляная кислота, метионин, О-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, циклогексилаланин.

Группа В: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, изоаспарагиновая кислота, изоглутаминовая кислота, 2-аминоадипиновая кислота, 2-аминосубериновая кислота.

Группа С: аспарагин, глутамин.

Группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминомасляная кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота.

Группа Е: пролин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин.

Группа F: серин, треонин, гомосерин.

Группа G: фенилаланин, тирозин.

Фрагмент антитела по настоящему изобретению включает Fab, F(ab')₂, Fab', scFV, диатело, dsFv, пептид, содержащий CDR и тому подобное.

Fab представляет фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, в котором примерно половина N-концевого участка Н-цепи и полная L-цепь, из фрагментов, полученных обработкой молекулы IgG антитела протеазой, папином (расщепленного по аминокислотному остатку в положении 224 Н-цепи), связаны вместе дисульфидной связью.

Fab-фрагмент по настоящему изобретению можно получить обработкой моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, протеазой, папаином. Также Fab можно получить вставкой ДНК, кодирующей Fab антитела, в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab.

F(ab')₂ представляет фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, и содержащий две Fab-области, связанные в шарнирной области, полученный расщеплением нижнего участка двух дисульфидных связей в шарнирной области IgG ферментом, пепсином.

F(ab')₂-фрагмент по настоящему изобретению можно получить обработкой моноклонального антитела, специфически распознающего Aβ-олигомер и связывающегося с внеклеточным доменом, протеазой, пепсином. Также F(ab')₂ можно получить связыванием Fab', описанным ниже, через тиоэфирную связь или дисульфидную связь.

Fab' представляет фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, полученный расщеплением дисульфидной связи в шарнирной области вышеуказанного F(ab')₂.

Fab' по настоящему изобретению можно получить обработкой F(ab')₂, который специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, восстановителем, дитиотреитолом.

Также Fab' можно получить вставкой ДНК, кодирующей Fab'-фрагмент антитела в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab'.

scFv представляет полипептид VH-P-VL или VL-P-VH, в котором цепь VH и цепь VL связаны подходящим пептидным линкером (далее обозначен как «Р») представляет фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей активностью.

scFv по настоящему изобретению можно получить с помощью кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, конструированием ДНК, кодирующей scFv, встраивая ДНК в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии scFv.

Диатело представляет фрагмент антитела, в котором scFv димеризован, и оно обладает двухвалентной антигенсвязывающей активностью. При двухвалентной антигенсвязывающей активности два антигена могут быть одинаковыми или различными.

Диатело по настоящему изобретению можно получить с помощью кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, конструированием ДНК, кодирующей scFv, таким образом, чтобы длина аминокислотной последовательности Р равнялась 8 или менее остаткам, вставкой ДНК в вектор экспрессии для прокариотической клетки или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии диатела.

dsFv получают связыванием полипептидов, в которых один аминокислотный остаток каждой VH или VL замещен цистеиновым остатком через дисульфидную связь между остатками цистеина. Аминокислотный остаток, предназначенный для замены цистеиновым остатком, можно выбрать, основываясь на установлении трехмерной структуры антитела методом, описанным Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].

dsFv по настоящему изобретению можно получить с помощью кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, конструированием ДНК, кодирующей dsFv, встраивая ДНК в вектор экспрессии для прокариотичекой клетки или в вектор экспрессии для эукариотической клетки, и затем введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии dsFv.

Пептид, содержащий CDR, получают включением по меньшей мере одного или более CDR VH или VL. Пептид, содержащий множество CDR, можно получить соединением CDR прямо или посредством подходящего пептидного линкера.

Пептид, содержащий CDR, по настоящему изобретению можно получить конструированием кДНК, кодирующей CDR VH и VL гуманизированного антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер по настоящему изобретению, встраивая ДНК в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и затем введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии пептида, содержащего CDR. Также пептид, содержащий CDR, можно получить химическим синтезом, таким как протокол с использованием Fmoc и tBoc.

Антитело по настоящему изобретению включает производное антитела, когда гуманизированное антитело против Aβ-олигомера по настоящему изобретению или фрагмент этого антитела химически или генетически связывают с радиоизотопом, низкомолекулярным агентом, высокомолекулярным агентом, белком, терапевтическим антителом и тому подобное.

Производное антитела по настоящему изобретению можно получить химической конъюгацией радиоизотопа, низкомолекулярного агента, высокомолекулярного агента, белка, терапевтического антитела и тому подобное с N-концевым или С-концевым участком Н-цепи или L-цепи гуманизированного антитела против Aβ-олигомера или фрагмента этого антитела, с подходящим заместителем или боковой цепью антитела или фрагмента этого антитела, сахарной цепью в антителе или фрагменте этого антитела и тому подобное [Antibody Engineering Handbook, опубликованная Chijiin Shokan].

Также производное антитела по настоящему изобретению можно получить генетически связыванием ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к Aβ-олигомеру по настоящему изобретению или фрагмента этого антитела с другой ДНК, кодирующей белок, предназначенный для конъюгации, или с ДНК, кодирующей терапевтическое антитело, включением ДНК в вектор для экспрессии и введением вектора экспрессии в клетку-хозяин.

В случае, когда вышеуказанное антитело используют в качестве детектирующего реагента, реагента для количественного анализа или диагностического агента соответственно для детектирующего способа, количественного способа или диагностического способа, то примеры агента, с которым конъюгируют гуманизированное антитело к Aβ-олигомеру или фрагмент антитела по настоящему изобретению, включают метку, которую обычно применяют в иммунологическом способе детектирования или количественного анализа.

Метка включает ферменты, такие как щелочная фосфатаза, пероксидаза и люцифераза, люминесцентные вещества, такие как эфир акридиния и лофин, флуоресцентные вещества, такие как изотиоцианат флуоресцеина (FITC) и изотиоцианат тетраметилродамина (RITC).

Ниже описан способ получения антитела.

1. Получение моноклонального антитела к Аβ-олигомеру.

В настоящем изобретении моноклональное антитело к Аβ-олигомеру можно получить следующим образом.

(1) Получение антигена

В способе получения Аβ-олигомера в качестве антигенов, синтетический Аβ1-42 (Peptide Institute, Inc. Osaka) растворяют в деионизированной дистиллированной воде или в фосфатном буфере 10 ммоль/л и инкубируют при 37°С в течение 18 ч, пептид разделяют в 4-12% SDS-PAGE и полученное вещество визуализируют окрашиванием СВВ, затем отбирают только Аβ1-42-тетрамер без примесей Аβ1-42-мономера и тем самым получают Аβ1-42-олигомеры.

Можно получить Аβ1-40-олигомеры, содержащие больше олигомеров, химической конъюгацией 6-карбокситетраметилродамина (6-TAMRA) (SIGMA) с N-концом синтезированного Аβ1-40-пептида с использованием обычного метода с последующей полимеризацией синтетического Аβ1-40 (Peptide Institute, Inc. Osaka).

(2) Иммунизация животных

Вначале 2,5 мкг Аβ1-42-тетрамеров или Аβ1-40-олигомеров эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда. Затем проводят иммунизацию введением антигена в подушечку лапы мышей Balb-c. Затем проводят еще шесть дополнительных иммунизаций. Слияние антигенпродуцирующих клеток и миеломных клеток проводят известным методом, таким как метод Kohler and Milstein et al. (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol. (1981), 73, 3-46) и тому подобное. В частности, иммуноциты, продуцирующие антитело, получают из паховых лимфатических узлов мыши, иммунизированной антигеном.

Иммунизацию проводят введением антигена животному с помощью подкожной, внутривенной или внутрибрюшинной инъекции вместе с подходящим адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда и комбинация геля гидроксида алюминия и вакцины против коклюша.

В том случае, когда в качестве антигена используют неполный пептид, то получают конъюгат с белковым носителем, таким как BSA (бычий сывороточный альбумин) и KLH (гемоцианин из морского моллюска) для применения в качестве антигена.

Животное, иммунизированное антигеном, может представлять собой любое животное, при условии, что можно получить гибридому, и предпочтительно используемыми животными являются мышь, крыса, хомяк, курица, кролик или тому подобное. Также антитело по настоящему изобретению включает антитело, продуцированное гибридомой, полученной слиянием миеломной клетки с клеткой, обладающей антитело-продуцирующей активностью, полученной от такого животного после иммунизации in vitro.

(3) Получение миеломных клеток

В качестве миеломных клеток используют постоянные клеточные линии, полученные от мыши. Примеры включают линию резистентных к 8-азагуанину миеломных клеток мыши (полученную от BALB/c) P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 [J. Immunology, 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] и тому подобное.

Миеломные клетки субкультивируют в обычной среде [среде RPMI1640, содержащей глутамин, 2-меркаптоэтанол, гентамицин, FBS и 8-азагуанин]. Клетки трансфектируют в обычной среде в течение 3-4 суток перед слиянием клеток для гарантии получения титра 2×10⁷ клеток или выше на день проведения слияния.

(4) Слияние клеток и получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела

Гибридому можно получить слиянием клеток, продуцирующих антитело, полученных для слияния на стадии (2), и миеломных клеток, полученных на стадии (3), с использованием полиэтиленгликоля 1500.

После культивирования отбирают порцию культурального супернатанта и подвергают скринингу гибридом с использованием метода, такого как дот-блоттинг и тест оценки связывания для идентификации популяции клеток, продуцирующих антитела, которые реагируют с Aβ-олигомерами, но не с Aβ-мономерами, как описано ниже. Затем дважды проводят клонирование методом ограниченного разведения [используют среду HT (среда HT без аминоптерина) в первом раунде и используют обычную среду во втором раунде], и выбирают гибридому со стабильно высоким титром антител, в качестве гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело.

(5) Получение очищенных моноклональных антител

Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные на стадии (4), вводят внутрибрюшинно 8-10-недельным мышам или голым мышам, которых предварительно обрабатывают внутрибрюшинным введением пристана (0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентадекана (пристана) с последующим содержанием в течение 2 недель).

В течение 10-21 суток гибридома образует асцитную опухоль. Собирают асцитную жидкость от мышей, центрифугируют для удаления твердых кусочков опухоли, подвергают высаливанию 40-50% сульфатом аммония и затем осаждают каприловой кислотой, пропускают через колонку с DEAE-сефарозой, колонку с белком А или колонку для гель-фильтрации для сбора фракций IgG или IgM в качестве очищенных моноклональных антител.

(6) Отбор моноклональных антител

В качестве примера метода скрининга антитела, можно привести отбор антитела, в котором используется способность антитела связываться с Aβ-олигомером в качестве показателя.

Связывающую активность антитела к антигену (Aβ-олигомеру) по настоящему изобретению можно анализировать с использованием по меньшей мере одного из методов, таких как определение поглощения, твердофазный иммуноферментный метод (дот-блоттинг, ELISA), иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммуноанализ (RIA), иммунофлуоресцентный метод и Biacore (Biacore Life Science), используя метод поверхностного плазмонного резонанса (метод SPR).

Более конкретно, связывание моноклонального антитела к Aβ-олигомеру с Aβ-олигомером можно оценить дот-блоттингом, в котором 2,5 мкл Аβ1-42 (2,5 мкг/дот) предварительно инкубируют в течение 18 ч с последующей иммобилизацией на нитроцеллюлозной мембране. После блокирования неспецифического связывания на мембране раствором фосфатного буфера, содержащим 5% обезжиренного молока, 1% BSA и 0,05% твина-20, мембрану инкубируют с культуральным супернатантом и тем самым можно детектировать способность антитела связываться с Aβ-олигомером в культуральным супернатанте с помощью меченного пероксидазой из хрена овечьего антимышиного F(ab')₂ (1:3000; Amersham) с использованием набора для активированной хемилюминесценции (ECL) и LAS3000mini (Fujitsu, Tokyo, Япония) (WO 2009/051220).

ELISA проводят иммобилизацией антитела на планшете, добавлением антигена для антитела на планшет и добавлением пробы, содержащей желаемые антитела, такой как культуральный супернатант клеток, продуцирующих антитело, и очищенное антитело. Затем добавляют вторичное антитело, распознающее первичное антитело, которое является антителом, меченным ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и планшет инкубируют. После отмывки в планшет вносят субстрат для фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и определяют поглощение для оценки способности антитела связываться с пробой-мишенью.

Кроме того, также можно определить реактивность антитела с использованием твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» с использованием хемилюминесценции (хемилюминесценции-ELISA) для специфического детектирования Aβ-олигомеров, но не Aβ-мономеров в настоящем изобретении (WO 2009/051220).

Дополнительно в настоящем изобретении для оценки эффективности моноклонального антитела, которое введено в периферическую кровь мыши in vivo, можно поставить ELISA с HPR-меченным 6E10 (Senetec PLC, Napa, CA, США), специфичным для олимера человека, в целях анализа Aβ-олигомеров в плазме и органах, отобранных от мыши, которой ввели антитело (WO 2009/051220).

Кроме того, возможно определить, насколько гуманизированное антитело против Aβ-олигомера может связываться с Aβ-олигомерами в мозге больных, страдающих AD, посредством иммунопреципитации (Ghiso G. et al., Biochem. J., 1993) с амилоидной фракцией (Matsubara E. et al., Neurobiol. Aging, 2004), содержащей большое количество Aβ-олигомеров (WO 2009/051220).

(7) Оценка активности антитела против Aβ-олигомера

В настоящем изобретении возможно определить, что антитело против Аβ-олигомера специфически связывается с Aβ-олигомерами и обладает цитопротективной активностью при инкубации с Aβ в тесте с тиофлавином (ThT), в тесте Aβ-индуцированной нейротоксичности и при анализе оценки реактивности против многочисленных Aβ-олигомеров различного размера, фракционированных ультрафильтрацией и гель-фильтрацией, которые все были раскрыты Yamamoto N. et al., J. Biol. Chem., 282:2646-2655, 2007 или WO 2009/051220.

Кроме того, можно оценить активность подавлять образование Aβ-амилоидных волокон с использованием теста ThT и электронной микроскопии.

В настоящем изобретении можно определить способность захватывать Aβ-олигомеры в мозге больных, страдающих AD, по наличию SDS-стабильного 4-,5-,8-,12-мера при иммунопреципитации с использованием гуманизированного антитела к Aβ-олигомеру.

Кроме того, в настоящем изобретении примеры способа оценки способности антитела профилактировать AD-подобный патогенез у APPswe-трансгенных мышей (Tg2576) включают способ, в котором гуманизированное антитело по настоящему изобретению вводят мыши для установления того, насколько оно можно предупредить или нет развитие признаков AD-подобного патогенеза, таких как потеря памяти, сенильные бляшки, дисфункция синапсов и Аβ-накопление (WO 2009/051220).

2. Получение рекомбинантного антитела

Можно получить трансформант для стабильной экспрессии рекомбинантного антитела и рекомбинантное антитело, как описано ниже.

(1) Конструирование вектора для экспрессии рекомбинантного антитела

Вектор для экспрессии рекомбинантного антитела представляет собой вектор экспрессии животной клетки, в которую встроены ДНК, кодирующие CH и CL антитела человека, и его конструируют клонированием каждой ДНК, кодирующей CH и CL антитела человека, в вектор экспрессии животной клетки.

С-область антитела человека может представлять CH и CL любого антитела человека. Примеры включают СН, относящуюся к γ1 подклассу, CL, относящуюся к κ классу и тому подобное. В качестве ДНК, кодирующих CH и CL антитела человека, можно использовать хромосомную ДНК, содержащую экзон и интрон, или кДНК.

В качестве вектора экспрессии животной клетки можно использовать любой вектор экспрессии при условии, что ген, кодирующий С-область антитела человека, можно вставить в него и экспрессировать. Примеры включают ppAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 91981)], pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)] и тому подобное.

Примеры промотора и энхансера, используемых для вектора экспрессии животной клетки, включают ранний промотор SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], LTR вируса лейкоза мышей Молони [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], промотор Н-цепи иммуноглобулина [Cell, 41, 479 (1985)] и энхансер [Cell, 33, 717 (1983)] и тому подобное.

Вектор для экспрессии рекомбинантного антитела может быть вектором любого типа, когда ген, кодирующий Н-цепь антитела и ген, кодирующий L-цепь антитела, находятся в отдельных векторах или в векторе типа, когда оба гена находятся в одном векторе (тандемный тип). С учетом простоты конструирования вектора для экспресиии рекомбинантного антитела, простоты введения в животные клетки и баланса между уровнем экспрессии H-цепи и L-цепи в животных клетках, то тандемный тип вектора для экспрессии рекомбинантного антитела является более предпочтительным [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994].

Примеры векторов тандемного типа для экспрессии рекомбинантного антитела включают pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] и тому подобное.

(2) Получение кДНК, кодирующей V-область антитела, полученного у животного, отличного от человека, и анализ аминокислотной последовательности

Фракцию мРНК экстрагируют из гибридомных клеток, продуцирующих антитело, полученное от животного, отличного от человека, для синтеза кДНК. Синтезированную кДНК клонируют в вектор и проводят секвенирование с использованием ДНК-секвенатора для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих VH и VL.

Насколько полученные кДНК кодируют полноразмерные аминокислотные последовательности VL и VH антитела, содержащего последовательность секреторного сигнала, можно подтвердить установлением полноразмерных аминокислотных последовательностей VH и VL из определенной нуклеотидной последовательности и сравнением их с полноразмерными аминокислотными последовательностями VH и VL известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].

Длину последовательности секреторного сигнала и N-концевой аминокислотной последовательности можно определить сравнением полноразмерных аминокислотных последовательностей VH и VL антитела, содержащего последовательность секреторного сигнала, с полноразмерными аминокислотными последовательностями VH и VL известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], и также можно узнать подгруппу, к которой они относятся.

Кроме того, можно определить аминокислотную последовательность каждого CDR VH и VL сравнением полученных аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями VH и VL известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].

(3) Конструирование вектора для экспрессии химерного антитела человека

кДНК, кодирующие VH и VL антитела животного, отличного от человека, клонируют слева от генов, кодирующих CH или CL антитела человека, в вектор для экспрессии рекомбинантного антитела со стадии (1) для конструирования вектора для экспрессии химерного антитела человека.

Например, кДНК, кодирующие VH и VL, составляют и конструируют для включения линкерных последовательностей, кодирующих соответствующие аминокислоты и содержащих соответствующие сайты узнавания рестриктаз, для обеспечения таким образом соединения между 3'-концом кДНК VH и VL из антитела животного, отличного от человека, и 5'-концом CH или CL из антитела человека.

Каждую полученную кДНК, кодирующую VH и VL, клонируют таким образом, чтобы каждая из них экспрессировалась в соответствующей форме слева от гена, кодирующего CH или CL антитела человека из вектора для экспрессии гуманизированного антитела, со стадии (1), для конструирования вектора для экспрессии химерного антитела человека.

Кроме того, кДНК, кодирующую VH и VL от животного, отличного от человека, амплифицируют ПЦР с использованием синтетической ДНК, содержащей последовательность узнавания соответствующей рестриктазы на обоих концах, и каждую из них клонируют в вектор для экспрессии рекомбинантного антитела со стадии (1).

(4) Конструирование кДНК, кодирующей V-область гуманизированного антитела

кДНК, кодирующие VH и VL гуманизированного антитела, можно получить следующим образом.

Вначале, отбирают аминокислотные последовательности каркасной области (далее обозначена как «FR») в VH и VL антитела человека, на которые трансплантируют аминокислотные последовательности CDR в VH и VL, полученные из антитела животного, отличного от человека. Можно использовать любые аминокислотные последовательности FR в VH и VL антитела человека при условии, что они происходят от человека.

Примеры включают аминокислотные последовательности FR в VH и VL антител человека, зарегистрированных в базе данных Protein Data Bank, и аминокислотные последовательности, общие для подгрупп FR в VH и VL антител человека [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] и тому подобное.

Для ингибирования связывающей активности антитела выбирают аминокислотные последовательности, обладающие высокой гомологией (по меньшей мере, 60% или выше) с аминокислотной последовательностью FR в VH и VL исходного антитела.

Затем аминокислотные последовательности CDR VH и VL исходного антитела пересаживают на выбранную аминокислотную последовательность FR в VH и VL антитела человека соответственно для конструирования каждой аминокислотной последовательности VH и VL гуманизированного антитела.

Сконструированные аминокислотные последовательности превращают в ДНК-последовательности с учетом частоты использования кодонов, установленной в нуклеотидных последовательностях генов антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] и конструируют ДНК-последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность VH и VL гуманизированного антитела.

(5) Модификация аминокислотной последовательности V-области гуманизированного антитела

Известно, что когда гуманизированное антитело получают просто пересадкой только CDR в VH и VL антитела, полученного у животного, отличного от человека, в FR VH и VL антитела человека, то его антигенсвязывающая активность снижается по сравнению с исходным антителом, полученным у животного, отличного от человека [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].

В гуманизированных антителах среди аминокислотных последовательностей FR в VH и VL антитела человека идентифицируют аминокислотные остатки, которые непосредственно ассоциированы со связыванием антигена, аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с аминокислотным остатком в CDR и аминокислотные остатки, которые поддерживают трехмерную структуру антитела и опосредованно ассоциированы со связыванием антигена, и модифицируют в аминокислотные остатки, обнаруженные в исходном антителе от животного, отличного от человека, тем самым, повысив антигенсвязывающую активность, которая была снижена.

Для идентификации аминокислотных остатков, связанных с антигенсвязывающей активностью в FR, конструируют трехмерную структуру антитела рентгеновской кристаллографией [J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)], компьютерным моделированием [Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] или тому подобное.

Кроме того, модифицированное гуманизированное антитело, обладающее антигенсвязывающей активностью, можно идентифицировать, повторяя различные попытки получить несколько видов модификации каждого антитела и исследуя корреляцию между каждым из модифицированных антител и его антигенсвязывающей активностью.

Модификацию аминокислотной последовательности FR в VH и VL антитела человека можно осуществить с использованием различных синтетических ДНК для модификации с помощью ПЦР, как описано на стадии (4). Нуклеотидную последовательность амплифицированного ПЦР продукта определяют согласно методу, описанному на стадии (2), для подтверждения того, что предполагаемая модификация имела место.

(6) Конструирование вектора для экспрессии гуманизированного антитела

Вектор для экспрессии гуманизированного антитела можно сконструировать клонированием каждой кДНК, кодирующей VH или VL в сконструированном рекомбинантном антителе, слева от каждого гена, кодирующего CH или CL антитела человека в векторе для экспрессии рекомбинантного антитела, как описано на стадии (1).

Например, последовательности узнавания соответствующих рестриктаз вводят в 5'-конец синтетических ДНК, располагая их на обоих концах синтетических ДНК, использованных для конструирования VH или VL гуманизированного антитела со стадий (4) и (5), для обеспечения клонирования VH или VL слева от каждого гена, кодирующего CH или CL антитела человека в вектор экспрессии для гуманизированного антитела, как описано выше на стадии (1), для экспрессии в соответствующей форме.

(7) Временная экспрессия рекомбинантного антитела

Для эффективной оценки антигенсвязывающей активности различных полученных гуманизированных антител, рекомбинантные антитела можно временно экспрессировать с использованием вектора для экспрессии рекомбинантного антитела, как описано выше на стадиях (3) и (6), или их модифицированного вектора экспрессии.

Любую клетку можно использовать в качестве клетки-хозяина для интродукции вектора экспрессии при условии, что клетка-хозяин может экспрессировать реокмбинантное антитело. Как правило, используют клетки COS-7 (ATCC CRL1651) [Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283 (1991)]. Примеры способов введения вектора экспрессии в клетки COS-7 включают DEAE-декстрановый метод [Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283 (1991)], липофекцию [Proc. Natl. Aacad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] и тому подобное.

(8) Установление трансформанта, который стабильно экспрессирует рекомбинантное антитело и получение рекомбинантного антитела

Трансформант со стабильной экспрессией рекомбинантного антитела можно получить введением вектора для экспрессии рекомбинантного антитела, описанного на стадиях (3) и (6), в соответствующую клетку-хозяин.

Примеры метода введения вектора экспрессии в клетку-хозяин включают электропорацию [опубликованная, не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии № 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] и тому подобное.

В качестве клетки-хозяина, в которую вводят вектор для экспрессии рекомбинантного антитела, можно использовать любую клетку, при условии, что она является клеткой-хозяином, которая может экспрессировать рекомбинантное антитело. Примеры включают клетки CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUKXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat. No. 11619), клетки крысы YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (в дальнейшем также относящиеся к YB2/0; ATCC CRL1662), клетки мышиной миеломы NS0, мышиной миеломы SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), клетки мыши P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), клетки СНО, дефектные по гену дигидрофолатредуктазы (далее обозначены как «dhfr») [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], резистентная к лектину линия Lec13 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)], клетки СНО, дефектные по гену α1,6-фукозилтрансферазы (WO 2005/35586, WO 02/31140) и тому подобное.

Кроме того, также можно использовать клетки-хозяева, в которых снижена или делецирована активность белка, такого как фермент, связанный с синтезом внутриклеточного сахар-содержащего нуклеотида, GDP-фукозы, белка, такого как фермент, связанный с модификацией сахарной цепи, в которой положение 1 фукозы связано с положением 6 в N-ацетилглюкозамине в редуцирующем конце через α-связь в N-гликозид-связанной сахарной цепи сложного типа, или белка, связанного с транспортом внутриклеточного сахар-содержащего нуклеотида, GDP-фукозы к тельцам Гольджи, такие как клетки СНО, которые являются дефектными по гену α1,6-фукозилтрансферазы, описанные в WO 2005/35586, WO 02/31140.

После интродукции вектора экспрессии отбирают трансформанты, стабильно экспрессирующие рекомбинантное антитело, культивированием в среде для культивирования животных клеток, содержащей агент, такой как G418 (далее обозначен как «G418») (опубликованная, не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии № 257891/90).

Примеры среды для культивирования клеток животных включают среду RPMI1640 (производства Invitrogen), среду GIT (производства Nihon Pharmaceutical), среду EX-CELL301 (производства JRH), среду IMDM (производства Invitrogen), среду Hybridoma-SFM (производства Invitrogen), производные сред, содержащие различные добавки, такие как FBS.

Рекомбинантное антитело можно получить и накопить в культуральном супернатанте культивированием отобранных трансформантов в среде. Можно определить уровень экспрессии и антигенсвязывающую активность рекомбинантного антитела в культуральном супернатанте с использованием ELISA или тому подобное.

Также в трансформанте можно повысить уровень экспрессии рекомбинантного антитела при использовании DHFR амплификационной системы или тому подобное согласно способу, раскрытому в опубликованной, не прошедшей экспертизу заявке на патент Японии № 257891/90.

Рекомбинантное антитело можно выделить из культурального супернатанта трансформанта на колонке с белком А [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].

Например, рекомбинантное антитело можно выделить комбинацией гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, ультрафильтрации и тому подобное.

Молекулярную массу Н-цепи или L-цепи очищенного рекомбинантного антитела или молекулы антитела обычно определяют электрофорезом в полиакриламидном геле (далее обозначен как «SDS-PAGE») [Nature, 227, 680 (1970)], вестерн-блоттингом [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] и тому подобное.

3. Способ регуляции эффекторной активности антитела

В качестве способа регуляции эффекторной активности гуманизированного антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению известен способ регуляции количества фукозы (далее обозначена как «кор фукоза»), которая связана α1,6-связью с N-ацетилглюкозамином (GlcNAc), находящимся в редуцирующем конце N-связанной сахарной цепи сложного типа, которая соединена с аспарагином (Asn) в положении 297 Fc-области антитела (WO 2005/035586, WO 2002/31140 и WO 00/61739); способ регуляции эффекторной активности моноклонального антитела модификацией аминокислотной группы(п) Fc-области антитела; способ конструирования подкласса антитела и тому подобное. Эффекторную активность гуманизированного антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению можно регулировать с использованием любого из способов.

«Эффекторная активность» означает антителозависимую активность, которая опосредуется Fc-областью антитела. В качестве эффекторной активности известны антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC-активность), комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC-активность), антителозависимый фагоцитоз (ADP-активность), которые осуществляют фагоцитарные клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки и тому подобное.

Регулируя содержание кор фукозы в N-связанной сахарной цепи сложного типа Fc-области антитела, можно повысить или снизить эффекторную активность антитела. Что касается способа снижения содержания фукозы, связанной с N-связанной сахарной цепью сложного типа Fc-области антитела, то можно получить антитело без фукозы, экспрессией антитела с использованием клеток СНО, дефектных по гену, кодирующему α1,6-фукозилтрансферазу. Антитело без фукозы обладает высокой ADCC-активностью.

С другой стороны, согласно способу повышения содержания фукозы, связанной с N-связанной сахарной цепи сложного типа Fc-области антитела, антитело с фукозой, можно получить экспрессией антитела с использованием клеток-хозяев, в которые введен ген, кодирующий α1,6-фукозилтрансферазу. Антитело с фукозой обладает более низкой ADCC-активностью по сравнению с антителом без фукозы.

Кроме того, модификацией аминокислотного остатка(в) в Fc-области антитела можно повысить или снизить ADCC-активность или CDD-активность. Например, CDD-активность антитела можно повысить, используя аминокислотную последовательность Fc-области, описанной в заявке на патент США US2007/0148165. Кроме того, ADCC-активность или CDD-активность можно повысить или снизить модификацией аминокислоты, как описано в патентах США № 6737056, 7297775 или 7317091.

Кроме того, известно, что среди членов подкласса IgG человека эффекторная функция подклассов IgG2 и IgG4 ниже, чем для подклассов IgG1 и IgG3. Следовательно, можно получить антитело, обладающее более низкой эффекторной функцией, замещением Fc-области на другую, имеющуюся в подклассе антител с более низкой эффекторной функцией.

Что касается стабилизации антитела подклассов IgG2 и IgG4, то можно получить стабильное IgG2 и IgG4 антитело, в котором эффекторная функция контролируется, с использованием способов, описанных в международных заявках WO 2006/075668, WO 2006/035586 и тому подобное.

Кроме того, возможно получить антитело, в котором эффекторная активность антитела регулируется с использованием комбинации вышеуказанных способов для одного антитела.

4. Способ лечения с использованием антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению

Было высказано предположение, что снижение памяти при болезни Альцгеймера возникает за счет дисфункции синапсов, вызванной растворимыми Аβ-олигомерами [Klein W.L., 2001. Trends Neuroscience; Selkoe D.J., 2002, Science]. Следовательно, имеется вероятность того, что избыточное накопление Аβ-олигомеров запускает сложный каскад слева, который и приводит к развитию AD.

В настоящем изобретении лечение не обязательно оказывает полные терапевтические эффекты или профилактические эффекты на орган или ткань, где имеются симптомы расстройства или заболевания, но оно может быть частью данных эффектов.

Лечение AD по настоящему изобретению означает устранение по меньшей мере одного симптома, который может появиться в результате AD. Примеры включают устранение или подавление когнитивной дисфункции, устранение или подавление образования сенильных бляшек, устранение или подавление дисфункции синапсов и снижение или подавление аккумуляции Аβ в мозговой ткани, крови или тому подобное.

В данном случае когнитивная дисфункция включает, например, нарушенную долгосрочную/краткосрочную память, нарушенную память узнавания объекта, нарушенную пространственную память и нарушенную эмоциональную память.

Кроме того, что касается терапевтического способа с использованием гуманизированного антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению, то его примеры включают способ подавления когнитивной дисфункции, способ подавления AD, способ подавления прогрессирования AD, способ подавления образования сенильных бляшек, способ подавления аккумуляции Аβ, способ нейтрализации (подавления) нейротоксичности, способ подавления образования Аβ-амилоидных волокон и способ нейтрализации (подавления) токсической активности синапсов.

Кроме того, примеры других конфигураций включают способ по меньшей мере одного из профилактики и лечения когнитивной дисфункции, и способ по меньшей мере одного из профилактики и лечения AD.

Лекарственное средство, содержащее моноклональное антитело или фрагмент антитела, или его производное, может состоять только из антитела или фрагмента антитела, или его производного в качестве активного ингредиента, и предпочтительно его формулируют в виде фармацевтической композиции, полученной соответствующим способом, хорошо известным в области фармации, смешением его с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями.

Примеры пути введения включают пероральное введение и парентеральное введение, такое как буккальное, трахеальное, ректальное, подкожное, внутримышечное или внутривенное введение.

Примеры лекарственной формы включают спреи, капсулы, таблетки, порошок, гранулы, сиропы, эмульсии, суппозитории, инъекции, мази, клейкие ленты и тому подобное.

Фармацевтический препарат, подходящий для перорального введения, включает эмульсии, сиропы, капсулы, таблетки, порошки, гранулы и тому подобное.

Жидкие препараты, такие как эмульсии и сиропы, можно получить, используя в качестве вспомогательных веществ, воду; сахара, такие как сахароза, сорбит и фруктоза; гликоли, такие как полиэтиленгликоль и пропиленгликоль; масла, такие как кунжутное масло, оливковое масло и соевое масло; антисептики, такие как эфиры п-гидроксибензойной кислоты; вкусовые вещества, такие как вкусовое вещество с ароматом и вкусом земляники и перечной мяты и тому подобное.

Капсулы, таблетки, порошки, гранулы и тому подобное можно приготовить, используя в качестве вспомогательных веществ, наполнители, такие как лактоза, глюкоза, сахароза и маннит; разрыхлители, такие как крахмал и альгинат натрия; смазочные вещества, такие как стеарат магния и тальк; связующие вещества, такие как поливиниловый спирт, гидроксипропилцеллюлоза и желатин; поверхностно-активные вещества, такие как эфиры жирных кислот; пластификаторы, такие как глицерин и тому подобное.

Фармацевтический препарат, подходящий для парентерального введения, включает инъекционные препараты, суппозитории, спреи и тому подобное.

Инъекционные препараты можно приготовить, используя носитель, такой как солевой раствор, раствор глюкозы и их смеси.

Суппозитории можно получить, используя носитель, такой как какао-масло, гидрогенизированный жир или карбоновую кислоту.

Спреи можно приготовить, используя антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению как таковые или используя вместе с носителем, который не раздражает слизистые ротовой полости или дыхательных путей пациента и может облегчать всасывание соединения, диспергируя его в виде мелких частиц.

Носитель включает лактозу, глицерин и тому подобное. Можно приготовить фармацевтические препараты, такие как аэрозоли и сухие порошки.

Кроме того, компоненты, приведенные в качестве примера вспомогательных веществ для препаратов, которые вводят перорально, также можно добавить к препаратам для парентерального введения.

Пример 1

Получение гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

(1) Конструирование аминокислотных последовательностей VH и VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4

Аминокислотную последовательность VH гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4 конструировали следующим образом.

Вначале, определяли CDR-последовательность аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:8) в качестве VH в моноклональном антителе мыши против Аβ-олигомера 6Е4, которое получили в ссылочном примере, основываясь на сообщении Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. В результате аминокислотные последовательности CDR 1-3 VH были установлены на последовательностях SEQ ID NO:1-3.

Затем конструировали аминокислотную последовательность гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4 следующим образом. Для трансплантации аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:1-3) CDR 1-3 VH выбирали аминокислотную последовательность FR VH в гуманизированном антителе.

Kabat et al. систематизировали VH различных известных антител человека в подгруппы (HSG I-III), основываясь на гомологии их аминокислотных последовательностей, и вывели общие последовательности для каждой из подгрупп [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].

Таким образом, проводили поиск по гомологии аминокислотных последовательностей FR в общих последовательностях подгрупп I-III VH антитела человека и аминокислотных последовательностей FR 6У4VH. В результате поиска гомология HSGI, HSGII и HSGIII составила 75,9; 54,0 и 57,5%, соответственно. Следовательно, аминокислотная последовательность FR 6E4VH имела наиболее высокую гомологию в подгруппе I.

Основываясь на этом результате, каждую из аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:1-3) CDR 6E4VH пересаживали в соответствующие положения в аминокислотной последовательности FR общей последовательности подгруппы I VH антитела человека. Таким образом, сконструировали аминокислотную последовательность 6E4VH (SEQ ID NO:12) VH гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4.

Затем аналогично, как это выполняли для Н-цепи, определяли последовательности CDR 1-3 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:10) VL в виде аминокислотных последовательностей соответственно SEQ ID NO:4-6 и конструировали аминокислотную последовательность VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4 следующим образом.

Для трансплантации аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:4-6) CDR 1-3 VL антитела 6Е4 соответственно выбирали аминокислотную последовательность FR VL в антителе человека.

Kabat et al. систематизировали VL различных известных антител человека в подгруппы (HSG I-IV), основываясь на гомологии их аминокислотных последовательностей, и вывели общие последовательности для каждой из подгрупп [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].

Таким образом, проводили поиск по гомологии аминокислотных последовательностей FR в общих последовательностях подгрупп I-IV VL антитела человека и аминокислотных последовательностей FR 6У4VH. В результате поиска гомология HSGI, HSGII, HSGIII и HSG IV составила 67,5; 86,3; 68,8 и 76,5%, соответственно. Следовательно, аминокислотная последовательность FR 6E4VH имела наиболее высокую гомологию в подгруппе II.

Основываясь на этом результате, каждую из аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:4-6) CDR 6E4VL пересаживали в соответствующие положения в аминокислотной последовательности FR общей последовательности подгруппы II VL антитела человека.

Однако Leu в положении 110 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:10) 6E4VL не является аминокислотным остатком, который используется наиболее часто, но аминокислотный остаток, который используется с относительно более высокой частотой в соответствующих сайтах в аминокислотных последовательностях FR антител человека, приводится в качестве примера Kabat et al.

Следовательно, использовали аминокислотный остаток, наблюдаемый в аминокислотной последовательности вышеприведенного антитела 6Е4. Как описано выше, сконструировали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:14) VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4, 6E4LV0.

Сконструированные аминокислотная последовательность 6E4LV0 VH и аминокислотная последовательность 6E4LV0 VL в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера 6Е4 представляют последовательности, полученные пересадкой только аминокислотных последовательностей CDR мышиного моноклонального анти-Аβ-олигомер-антитела 6Е4 на аминокислотную последовательность выбранного FR антитела человека.

Однако в целом при конструировании гуманизированного антитела во многих случаях связывающая активность становится ниже, когда аминокислотные последовательности CDR антитела мыши просто трансплантируют на FR антитела человека.

По этой причине для предупреждения снижения связывающей активности проводят модификацию аминокислотных остатков, которые как полагают, оказывают влияние на связывающую активность среди аминокислотных остатков, расположенных в FR антитела человека и отличных от таковых в антителе мыши, вместе с трансплантатом аминокислотных последовательностей CDR.

Таким образом, в данном примере идентифицировали аминокислотные остатки FR, которые как полагают, оказывают влияние на связывающую активность, следующим образом.

Вначале, с помощью компьютерного моделирования строили трехмерную структуру V-области антитела (далее обозначено как «HV0LV0»), содержащую аминокислотную последовательность 6E4HV0 VH и аминокислотную последовательность 6E4LV0 VL в полученном гуманизированном антителе против Аβ-олигомера 6Е4, как описано выше.

Определение координат трехмерной структуры и расположение трехмерной структуры проводили с использованием Discovery Studio (Accelrys, Inc.) с инструкциям, прилагаемым к программе. Также строили компьютерную модель трехмерной структуры V-области моноклонального антитела мыши к Аβ-олигомеру 6Е4 аналогичным образом.

Кроме того, отбирали аминокислотные остатки, которые отличаются от остатков в антителе 6Е4 среди аминокислотных последовательностей FR в VH и VL HV0LV0, получали аминокислотную последовательность 6Е4 с модификацией аминокислотных остатков и аналогично конструировали модель трехмерной структуры.

Проводили сравнительный анализ полученных трехмерных структур V-областей в 6Е4, HV0LV0 и модифицированных формах, и идентифицировали аминокислотные остатки, которые как полагали, оказывают влияние на связывающую активность антитела.

В результате в качестве аминокислотных остатков, которые как полагают, модифицируют трехмерную структуру антигенсвязывающих сайтов и оказывают влияние на связывающую активность антитела среди аминокислотных остатков FR в HV0LV0, выбрали Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в 6E4HV0 и Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в 6E4LV0 соответственно.

По меньшей мере, одну аминокислотную последовательность среди данных выбранных аминокислотных остатков модифицировали в аминокислотные остатки, присутствующие в том же сайте в антителе 6Е4, и тем самым конструировали VH и VL гуманизированного антитела, которое содержит аминокислотную последовательность, включающую различные модификации.

Конкретнее, в VH вводили по меньшей мере одну модификацию из аминокислотных модификаций, в которых Lys в положении 12 замещали на Val, Val в положении 20 замещали на Leu, Arg в положении 38 замещали на Lys, Gln в положении 39 замещали на Leu, Leu в положении 45 замещали на Phe, Met в положении 48 замещали на Ile, Arg в положении 67 замещали на Lys, Val в положении 68 замещали на Ala, Ile в положении 70 замещали на Leu, Ala в положении 72 замещали на Val, Thr в положении 74 замещали на Lys и Ala в положении 97 замещали на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

В дополнении в VL вводили по меньшей мере одну модификацию из аминокислотных модификаций, в которых Ile в положении 2 замещали на Val, Pro в положении 15 замещали на Leu, Gln в положении 50 замещали на Lys и Tyr в положении 92 замещали на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

В качестве V-области гуманизированного анти-Аβ-олигомер- антитела 6Е4, в котором по меньшей мере один аминокислотный остаток в FR в HV0LV0 модифицирован, конструировали HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV2b, HV0LV2c, HV0LV2d, HV0LV3, HV0LV4, HV2LV0, HV2LV2a, HV2LV2b, HV2LV2c, HV2LV2d, HV2LV3, HV2LV4, HV3LV0, HV3LV2a, HV3LV2b, HV3LV2c, HV3LV2d, HV3LV3, HV3LV4, HV4LV0, HV4LV2a, HV4LV2b, HV4LV2c, HV4LV2d, HV4LV3, HV4LV4, HV5LV0, HV5LV2a, HV5LV2b, HV5LV2c, HV5LV2d, HV5LV3, HV5LV4, HV7aLV0, HV7aLV2a, HV7aLV2b, HV7aLV2c, HV7aLV2d, HV7aLV3, HV7aLV4, HV7bLV0, HV7bLV2a, HV7bLV2b, HV7bLV2c, HV7bLV2d, HV7bLV3, HV7bLV4, HV9LV0, HV9LV2a, HV9LV2b, HV9LV2c, HV9LV2d, HV9LV3, HV9LV4, HV12LV0, HV12LV2a, HV12LV2b, HV12LV2c, HV12LV2d, HV12LV3 и HV12LV4.

На фиг.1 и 2 приведены аминокислотные последовательности вариабельных областей Н-цепи соответственно HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 и HV12 и аминокислотные последовательности вариабельных областей L-цепи соответственно LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV2d, LV3 и LV4.

(2) Получение гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

Конструировали ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области гуманизированного антитела против Аβ-олигомера с кодонами, используемыми в ДНК (SEQ ID NO:7 и 9), кодирующих аминокислотные последовательности 6E4VH и 6E4VL. При модификации аминокислот ДНК конструировали с кодонами, часто используемыми в клетках млекопитающих.

ДНК-последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности 6E4HV0 и 6E4LV0 в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера, приведены соответственно как SEQ ID NO:11 и 13. Кроме того, использовали кодоны в ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности 6E4VH и 6E4VL для конструирования вариабельной области с аминокислотной модификацией.

Используя данные ДНК-последовательности, конструировали вектор экспрессии гуманизированного антитела и экспрессировали гуманизированное антитело.

(3) Конструирование кДНК, кодирующей VH гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

Общим химическим синтезом получали кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность 6E4HV0 VH в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера, приведенную как SEQ ID NO:12, которую конструировали, как описано выше на стадии (1), и HV12, приведенную на фиг.1, конструировали, как описано выше на стадии (2).

(4) Конструирование кДНК, кодирующей VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

Общим химическим синтезом получали кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность 6E4LV0 VL в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера, приведенную как SEQ ID NO:14, которую конструировали, как описано выше на стадии (1), и LV2a и LV4, приведенные на фиг.2, конструировали, как описано выше на стадии (2).

(5) Конструирование векторов экспрессии гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

кДНК, кодирующую 6E4LV0 или HV12 и кДНК, кодирующую одно из 6E4LV0, LV2a и LV4, полученные выше на стадиях (3) и (4), вставляли в соответствующие положения в вектор экспрессии гуманизированного антитела pKANTEX93, раскрытый в международной заявке WO 97/10354, для конструирования различных векторов экспрессии гуманизированного антитела против Аβ-олигомера.

(6) Экспрессия гуманизированного антитела против Аβ-олигомера с использованием животных клеток

Экспрессию гуманизированного антитела против Аβ-олигомера проводили в животных клетках с использованием обычного способа [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)], используя векторы экспрессии гуманизированного антитела против Аβ-олигомера, полученные выше на стадии (5), с получением трансформанта для продукции гуманизированного антитела против Аβ-олигомера (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4).

В качестве линии клеток животных использовали клеточную линию CHO/DG44, полученную двойным нокаутом гена α1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) (далее обозначено как «клетки СНО с нокаутом FUT8»). Известно, что фукозу не добавляли к кор- части N-связанной сахарной цепи сложного типа антитела, экспрессированного с данным штаммом клеток-хозяев (WO 2002/31140).

(7) Получение очищенного гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

После культивирования трансформанта, полученного на стадии (6) с использованием обычного метода культивирования, собирали клеточную суспензию. Затем проводили центрифугирование в течение 20 мин при 3000 об/мин при 4°С. После сбора культуральный супернатант стерилизовали пропусканием через фильтр Millex GV с размером пор 0,22 мкм.

После нанесения 0,5 мл Prosep vA High Capacity (производства Millipore Corporation) на колонку с диаметром 0,8 см, последовательно пропускали 5,0 мл очищенной воды и 5,0 мл буфера PBS (рН 7,4) для уравновешивания носителя.

Затем после пропускания культурального супернатанта колонку промывали 5,0 мл буфера PBS (рН 7,4). После промывания антитело, адсорбированное на носителе, элюировали 2,0 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 5,0), 2,0 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,5) и 2,0 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0) в указанном порядке.

Элюирование давало 500 мкл в 4 фракциях. Затем проводили SDS-PAGE с данными полученными очищенными фракциями. Собирали фракции, в которых детектировали белок-мишень, и диализовали в течение целого дня и ночи при 4°С с использованием 150 ммоль/л NaCl и 10 ммоль/л цитрата Na (рН 6,0).

После диализа собирали раствор гуманизированного антитела против Аβ-олигомера и подвергали стерилизации пропусканием через фильтр Millex GV (Millipore Corporation) с размером пор 0,22 мкм. Определяли поглощение при 280 нм (OD280 нм) с использованием прибора, измеряющего поглощение (SHIMADZU UV-1700) для расчета плотности соответствующих очищенных гуманизированных антител против Аβ-олигомера.

В результате получали 4 типа гуманизированных антител против Аβ-олигомера, соответственно включающих HV0LV0, содержащего 6E4HV0 в качестве VH и 6E4LV0 в качестве VL антитела, HV0LV2a, содержащего 6E4HV0 в качестве VH и LV2 в качестве VL антитела, HV0LV4, содержащего 6E4HV0 в качестве VH и LV4 в качестве VL антитела и HV12LV4, содержащего HV12 в качестве VH и LV4 в качестве VL антитела.

Пример 2

Получение антигена

(1) Получение Аβ-олигомеров

β-Амилоидный белок, человеческий 1-42 пептид (производства Peptide Institute, Inc.) растворяли в 1 ммоль/л гексафторизопропанола. После обработки ультразвуком в течение 10 мин полученный раствор высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение ночи.

Затем добавляли 4 мкл диметилсульфоксида и в течение 3 мин обрабатывали ультразвуком. В полученный раствор добавляли 200 мкл уксусной кислоты (рН 4,5) и полученное вещество хранили в течение ночи стационарно при 4°С с получением Аβ-олигомеров.

(2) Получение Аβ-мономеров

Биотин-бета-амилоид, человеческий 1-40 (производства AnaSpec, Inc.) растворяли в 250 мкмоль/л с использованием 0,1% аммиачной воды. После обработки полученного раствора ультразвуком в течение 5 мин, полученный продукт центрифугировали при 16000 об/мин и 4°С в течение 60 мин. Таким образом, собрав супернатант, получали Аβ-мономеры.

Пример 3

Оценка активности гуманизированного антитела против Аβ-олигомера

(1) Оценка связывающей активности гуманизированного анти-Аβ-олигомер-антитела для Аβ-олигомеров с использованием Biacore

Для анализа связывающей активности каждого из гуманизированных антител к Аβ-олигомеру (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) для Аβ-олигомеров по химической кинетике, связывающую активность определяли с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (метод SPR).

Все последующие операции проводили с использованием системы Biacore T100 (производства GE Healthcare Bio-sciences). Аβ-олигомеры, полученные на стадии (1) в примере 2, иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare Bio-sciences), используя реакцию сочетания аминов.

В чип с иммобилизованнами Аβ-олигомерами вводили пробы с 8 уровнями плотности, полученными последовательным разведением от 30 мкг/мл каждый раз в два раза (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4), и анализировали, начиная от самой низкой плотности, основываясь на автоматической программе по мультикинетике.

С использованием программного обеспечения, присоединенного к устройству, Biacore T100 Evaluation (производства GE Healthcare Bio-sciences), проводили анализ с модулем Bivalent Analyte для расчета константы скорости ассоциации ka, константы скорости диссоциации kd1 и константы диссоциации KD (kd1/kd1) для каждого антитела для Аβ-олигомеров.

Значения полученных таким образом константы скорости ассоциации ka1, константы скорости диссоциации kd1 и константы диссоциации KD (ka1/kd1) для каждого из антител приведены соответственно в таблице 1.

Таблица 1
Связывающая активность гуманизированного анти-Аβ-олигомер-антитела для Аβ-олигомеров
Антитело	ka (1/мсек)	kd (1/сек)	KD (моль/л)
HV0LV0	1,7×104	6,9×10-4	4,0×10-8
HV0LV2a	6,4×103	3,9×10-4	6,1×10-8
HV0LV4	7,0×103	5,0×10-4	7,1×10-8
HV12LV4	2,7×103	8,1×10-4	3,0×10-7

Как показано в таблице 1, все гуманизированные антитела против Аβ-олигомера (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) проявляли способность к связыванию с Аβ-олигомерами с аффинностью в пределах от 3×19^-7 до 4×10^-8 моль/л.

(2) Оценка связывающей активности гуманизированного анти-Аβ-олигомер-антитела для Аβ-мономеров с использованием Biacore

Для анализа связывающей активности соответствующих гуманизированных антител к Аβ-олигомеру (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) для Аβ-мономеров связывающую активность определяли, как описано на стадии (1) в данном примере.

Аβ-мономеры, полученные на стадии (2) в примере 2, иммобилизовали на сенсорном чипе SA (производства GE Healthcare Bio-sciences), используя реакцию захвата биотина. В чип с иммобилизованнами Аβ-мономерами вводили пробы с 5 уровнями плотности, полученными последовательным разведением от 30 мкг/мл каждый раз в два раза (6Е10, HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4), и анализировали, начиная от самой низкой плотности, основываясь на автоматической программе по мультикинетике. Сенсограммы приведены на фиг.3.

Как свидетельствуют данные фиг.3, было установлено, что все 4 вида гуманизированных антител против Аβ-олигомеров (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) не проявляли связывающей активности для Аβ-мономеров.

Ссылочный пример

1. Получение антигена

Синтезировали Аβ1-40-пептид для получения соединения, в котором флуоресцентный изотиоцианат 6-карбокситетраметилродамина (6-TAMRA) (SIGMA) химически соединяли с его N-концом. Проводили полимеризацию Аβ1-40-пептида (Peptide Institute, Inc.) и тем самым получали препарат (Аβ1-40-олигомеры), содержащий большое количество олигомеров.

2. Получение гибридомы, продуцирующей антитело

Мышей Balb-c иммунизировали антигеном, полученным, как описано выше, в подушечку лапы, и затем проводили еще шесть дополнительных иммунизаций. Гибридому получали слиянием клеток Sp2/0-Ag14 с использованием паховых лимфатических узлов с использованием полиэтиленгликоля 1500.

3. Дот-блоттинг

Первоначальный скрининг проводили дот-блоттингом, в котором 2,5 мкл Аβ1-42 (2,5 мкг/дот), который предварительно инкубировали в течение 18 ч, иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране. После блокирования неспецифического связывания на мембране раствором фосфатного буфера, содержащим 5% обезжиренного молока, 1% BSA и 0,05% твина-20, сайт неспецифического связывания инкубировали с культуральным супернатантом.

Антитело, связанное с Aβ-олигомером из культурального супернатанта, детектировали с помощью меченного пероксидазой из хрена овечьего антимышиного F(ab')₂ (1:3000; Amersham) и визуализировали с использованием набора для активированной хемилюминесценции (ECL) и LAS3000mini (Fujitsu, Токио, Япония) (WO 2009/051220). С помощью такой процедуры устанавливали моноклональное антитело мыши против Аβ-олигомеров 6Е4.

Приведенный выше ссылочный пример описан в PCT/JP 2009/52039 (WO 2009/099176).

Несмотря на то, что изобретение описано подробно и при обращении к конкретным примерам, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что можно сделать различные изменения и модификации, не отступая от сущности и объема изобретения. Данная заявка основана на предварительной заявке, поданной 7 августа 2009 (№ 61/232038), полное содержание которой включено в данный документ для сведения и все источники, цитированные в данном документе, включены в полном объеме.

Свободный текст в списке последовательностей:

SEQ ID NO:1 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность HCDR1

SEQ ID NO:2 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность HCDR2

SEQ ID NO:3 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность HCDR3

SEQ ID NO:4 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность LCDR1

SEQ ID NO:5 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность LCDR2

SEQ ID NO:6 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность LCDR3

SEQ ID NO:11 - Описание искусственной последовательности; ДНК-последовательность, кодирующая 6E4HV0

SEQ ID NO:12 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области 6E4HV0

SEQ ID NO:13 - Описание искусственной последовательности; ДНК-последовательность, кодирующая вариабельную область 6E4LV0

SEQ ID NO:14 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области 6E4HV0

SEQ ID NO:15 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области HV12

SEQ ID NO:16 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области LV2a

SEQ ID NO:17 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области LV4.

1. Гуманизированное антитело, которое не связывается с мономером β-амилоидного белка и связывается с олигомером β-амилоидного белка, где антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
(b) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(c) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; и
(d) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

2. Средство против когнитивной дисфункции, содержащее гуманизированное антитело по п. 1 в качестве активного ингредиента.

3. Лекарственный препарат для лечения болезни Альцгеймера, содержащий гуманизированное антитело по п. 1 в качестве активного ингредиента.

4. Средство для подавления образования сенильных бляшек, содержащее гуманизированное антитело по п. 1 в качестве активного ингредиента.

5. Ингибитор образования β-амилоидных волокон, содержащий гуманизированное антитело по п. 1 в качестве активного ингредиента.

6. Способ профилактики и лечения когнитивной дисфункции, включающий введение гуманизированного антитела по п. 1.

7. Способ профилактики и лечения болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по п. 1.

8. Способ подавления прогрессирования болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по п. 1.

9. Способ получения гуманизированного антитела по п. 1, включающий
культивирование трансформанта в среде с образованием и накоплением указанного гуманизированного антитела в культуре, и
сбор указанного гуманизированного антитела из культуры,
где трансформант содержит рекомбинантный вектор, содержащий ДНК, кодирующую указанное гуманизированное антитело, в клетке-хозяине.