Способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергических препаратов

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбору противоаллергических препаратов. Для этого формируют образцы, содержащие 0,95-1,05×10⁶ лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови. Тестируемый препарат добавляют в количестве 0,01 мл в полученные пробы крови, и их инкубируют при постоянном перемешивании в течение 45 минут при 37°C. При тестировании смеси препарата псевдоаллергена с противоаллергическим препаратом сначала в пробы крови вводят противоаллергический препарат, после чего инкубируют в течение 10 минут при 37°C при постоянном перемешивании. Одну часть полученных проб используют в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат псевдоаллергена, а другую часть - в качестве контрольных, вводя разводящую жидкость для псевдоаллергена, и осуществляют повторное инкубирование в течение 45 минут при 37°C. В инкубированные пробы раздельно вводят активаторы люминол и люцегинин в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанных активаторов, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл, и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанных активаторов. Далее рассчитывают показатели для спонтанной и стимулированной люминол-зависимой и люцигенин-зависимой ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов по формуле ИП=Sпa/Sк, где: Sпa; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов, соответственно. При этом повышенную чувствительность к псевдоаллергену диагностируют при значениях индекса ИП для люминол-зависимой и люцигенин-зависимой ХЛ ниже аналогичных значений ИП у здоровых доноров. Для подбора противоаллергических препаратов из перечня тавегил, зантак и интал рассчитывают индекс ИП*=Sxл опыт/Sхл контр; где: Sxл опыт - площадь под кривой временной зависимости уровня люминол-зависимой ХЛ пробы смеси псевдоаллергена с противоаллергическим препаратом; Sxл контр - то же, для контрольной пробы с противоаллергическим препаратом. Возможность назначения в качестве противоаллергического диагностируют для препарата тавегил при показателе ИП* выше 1,09 в пробах с метамизолом натрия; ИП* выше 1,0 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,57 в пробах с диклофенаком. Для препарата зантак - при показателе ИП* выше 1,04 в пробах с метамизолом натрия, ИП* выше 0,99 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,38 в пробах с диклофенаком. Для препарата интал - при показателе ИП* выше 1,08 в пробах с метамизолом натрия, ИП* выше 0,98 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,51 в пробах с диклофенаком. Использование данного способа позволяет проводить индивидуальный подбор противоаллергических препаратов для лечения непереносимости НПВП. 6 з.п. ф-лы, 1 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения непереносимости лекарственных препаратов и пищевых добавок.

Последние годы стремительно растет количество больных, страдающих непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), в связи с этим имеется острая необходимость в диагностических лабораторных методиках. Как правило, реакции непереносимости НПВП относятся к псевдоаллергическим, что не позволяет использовать обычные аллерго-тесты для их своевременного выявления и диагностики до развития осложнений. Между тем, реакции непереносимости НПВП могут включать в себя такие жизнеугрожающие состояния, как бронхиальная астма, отек Квинке, анафилактоидный шок. Поэтому до начала применения НПВП необходима дешевая методика быстрого скринингового выявления пациентов с непереносимостью НПВП, что позволит снизить побочные эффекты лекарственной терапии.

Известен микропровокационный тест торможения естественной миграции лейкоцитов in vivo в полости рта по А.Д. Адо (ТТЕМЛ in vivo). (см. Адо А.Д., и др. // Клиническая медицина. - 1980. - №3. - С. 37-41). Однако данное исследование представляет трудности у пациентов с острыми воспалительными и дегенеративными заболеваниями полости рта, верхних и нижних дыхательных путей в связи с наличием значительного количества полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ) в смывах с полости рта.

В клинической практике диагноз непереносимости НПВП основывается, главным образом, на рискованных провокационных тестах. Так, подъязычный провокационный тест с аспирином и другими НПВП до сих пор остается стандартом в диагностике непереносимости данных препаратов, однако у ряда больных при проведении теста могут развиться жизнеугрожающие состояния (см. Kowalski М. L., Makowska J. S. Allergy Clin. Immunol. Int.- J. World Allergy Org. Russ. Ed.-2007. - V.2. - №1. - P. 12-22).

Помимо лекарственных препаратов, негативные реакции у людей нередко вызывают пищевые добавки. Так, например пищевой краситель желтого цвета тартразин (Е102), широко используемый в России в пищевой и фармакологической промышленности, часто вызывает побочные эффекты, такие как бронхоспазм, крапивница, отек Квинке, ринит, дерматит, мигрень, нарушение зрения и др. В одних случаях, являясь гаптеном, тартразин образует комплексы с белком, например, с сывороточным альбумином, и становится полноценным антигеном, на который в организме вырабатываются антитела. В этом случае развиваются истинные аллергические реакции на тартразин. В других случаях, тартразин может выступать в качестве псевдоаллергена и индуцировать развитие псевдоаллергических реакций, как в результате прямого действия красителя на чувствительные клетки-мишени аллергии с последующей неспецифической либерацией медиаторов, так и в результате нарушения метаболизма арахидоновой кислоты за счет угнетения циклооксигеназы и сдвига баланса в сторону преимущественного образования лейкотриенов, которые оказывают выраженное биологическое влияние на различные ткани и системы (см. Клиническая аллергология: Рук-во для практических врачей / под ред. акад. РАМН, проф. P.M. Хаитова- М.: МЕДпресс-информ, 2002. - 624 с). Не исключено, что у одного пациента могут развиваться реакции на пищевой краситель, обусловленные участием как специфических иммунных реакций, так и псевдоаллергических.

В литературе показано, что наиболее часто побочные реакции на тартразин возникают у людей с непереносимостью НПВП (см. Пыцкий В.И. и др. Аллергические заболевания. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Издательство «Триада-Х».-1999.-470 с).

Для диагностики повышенной чувствительности к пищевым красителям, в том числе к тартразину, используют кожные скарификационные тесты, прик-тесты, определение IgE-антител методом иммуноферментного анализа, аллергенспецифический тест по реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами и другие методы (см. Новиков П.Д., Новикова Н.Д. Выявление IgE- и IgG-антител к пищевому красителю тартразину в сыворотке крови больных // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2006. - №1. - С. 36-41; Титова Н.Д. Выявление аллергических реакций in vitro к пищевым красителям у детей с бронхиальной астмой и атопическим дерматитом // Педиатрия. - 2011.Том 90. - №3. - С. 38-43). Однако кожные prick-тесты и аппликационные тесты к пищевым добавкам, в том числе тартразину, редко оказываются положительными и не совпадают с данными анамнеза и перорального тестирования (см. Титова Н.Д. Аллергия на пищу и добавки // Неотложная помощь и профилактика аллергических заболеваний: сб. научн. тр.. Витебск: ВГМУ, 2008, С. 108-156.; Dipalma JR. Tartrazine sensitivity. Am. Fam. Physician. 1990; 42 (5): 1347-1350.; Wilson, B.G. Adverse reactions to food additives / B.G. Wilson, S.L. Bahna // Ann. Allergy Asthma Immunol.. 2005. Vol.95, N 6. P. 499-507). В клинической практике диагноз повышенной чувствительности к тартразину основывается, главным образом, на рискованных провокационных тестах. Так, пероральный провокационный тест с тартразином до сих пор остается стандартом в диагностике повышенной чувствительности к данному красителю (см. Metcalfe, D. D. Food allergy: adverse reactions to foods and food additives/ D. D. Metcalfe, H. A. Sampson, R. A. Simon. Blackwell Pub, 2008. P. 310-370).

Основными методами иммунодиагностики гиперчувствительности к тартразину служат тесты выявления в крови свободных IgE- и реже IgG-антител и аллерген-специфический тест по реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами (см. Новиков П.Д., Новикова Н.Д. Выявление IgE- и IgG-антител к пищевому красителю тартразину в сыворотке крови больных//Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2006. - №1. - С. 36-41; Титова Н.Д. Выявление аллергических реакций in vitro к пищевым красителям у детей с бронхиальной астмой и атопическим дерматитом // Педиатрия. - 2011. Том 90. - №3. - С. 38-43). Однако вышеупомянутые лабораторные методики не позволяют диагностировать непереносимость пищевых добавок, в том числе тартразина, при псевдоаллергии.

Существует универсальный метод исследования биологических жидкостей, в котором используется хемилюминесценция, сопровождающая реакции с участием радикалов. Хемилюминесцентный метод позволяет изучать патологические процессы, в патогенезе которых играет важную роль оксидативный стресс (Владимиров Ю.А., Проскурина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии, - т. 49, - 2009, - с. 341-388).

Описан способ (RU 2295726 С2, Васнева, 20.03.2007) определения специфической гиперчувствительности и ее характера in vitro по динамике удельной (УИФ) и средней интенсивности флюоресценции (СрИФ) меченных ФИТЦ CD45+-клеток после инкубации периферической крови пациента с физиологическим раствором (контрольная проба) и водным раствором исследуемого вещества (опытная проба) с использованием прямо меченных флюороизотиацианатом (ФИТЦ) моноклональных антител (МКАТ) к общелейкоцитарному антигену CD45 и лазерной проточной иммуноцитофлюориметрии. Недостатки способа - трудоемкость, использование дорогостоящих реактивов и сложность используемой аппаратуры.

Описан способ выбора антибиотика при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний (RU 2495422C2. Савченко и др., 10.10.2013 - прототип). Для этого проводят измерение спонтанной и модифицированной антибиотиками люцигенин-зависимой хемилюминесценции цельной крови пациента. Затем рассчитывают коэффициент антибиотической модификации (КАМ), представляющий собой отношение разности площадей под кривой хемилюминесценции с антибиотиком (S_AHT) и под кривой спонтанной хемилюминесценции (S_СП) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции (S_СП), выраженный в процентах. Для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний отбирают антибиотики, у которых положительные или отрицательные значения КАМ по модулю не превышают 10%.

Недостаток способа состоит в недостаточной точности диагностики, поскольку регистрируют только люцигенин-зависимую хемилюминесценцию. Кроме того, определяется индивидуальная чувствительность к антибактериальным препаратам, которые могут выступать в роли аллергенов для лиц, сенсибилизированных к данным антигенам.

Описан способ аллегодиагностики по показателям хемилюминесценции (RU 2289138 С2, НИИ микробиологии, Грачева и др., 10.12.2006). Выделяют нейтрофильные лейкоциты, проводят формирование иммунных комплексов, измеряют фоновую люминесценцию среды инкубации (А), добавляют нейтрофилы, измеряют уровень спонтанной хемилюминесценции (Б), затем вносят иммунный комплекс и определяют значение стимулированной хемилюминесценции (В), а затем вычисляют коэффициент стимуляции (КС), по которому диагностируют аллергическую реакцию.

Однако способ сложен в техническом отношении и длителен по времени, кроме того, не позволяет определять повышенную чувствительность к псевдоаллергенам (НПВП), так как при псевдоаллергии отсутствуют иммунные механизмы.

Наиболее близким к патентуемому является способ (RU 2320991 С2, Матела и др., 27.03.2008 - прототип), который позволяет выбрать иммунокоррегирующий препарат с оптимальным влиянием на клетки иммунной системы и исключить применение препаратов, вызывающих индивидуальные реакции подавления функциональной активности нейтрофилов. У больного производят забор периферической крови, получают лейкоцитарную суспензию, инкубируют с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37°C. В качестве индуктора ХЛ используется РМА (форбол-12-миристат-13 ацетат). Затем производят запись кривых люминол-зависимой хемилюминесцентной реакции (ХЛ) и рассчитывают индекс стимуляции препарата (ИС).

Недостаток способа - недостаточная точность диагностики, поскольку регистрируют только параметры люминол-зависимой хемилюминесценции, большой расход крови и реактивов, длительное время исследования.

Задачей настоящего изобретения является создание объективного, быстрого in vitro способа диагностики повышенной чувствительности к псевдоаллергенам, в частности к НПВП, пищевому красителю тартразину и другим пищевым добавкам. При этом для 5

исследования чувствительности пациента сразу к 3-м препаратам из группы НПВП и тартразину используются небольшие (до 1,2 мл) количества крови. Способ позволяет подбирать препараты для коррекции непереносимости НПВП и пищевых красителей.

Патентуемый способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергических препаратов заключается в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата и анализе люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ).

Отличие состоит в том, что параллельно с люминол-зависимой ХЛ проводят анализ люцегинин-зависимой ХЛ, для чего в отобранную кровь вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие 0,95-1,05×10⁶ лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови.

Тестируемый препарат псевдоаллергена или тестируемый препарат псевдоаллергена в смеси с противоаллергическим препаратом, и контрольный препарат в виде разводящей жидкости для псевдоаллергена или разводящей жидкости для псевдоаллергена в смеси с противоаллергическим препаратом, соответственно, в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови, и их инкубируют при постоянном перемешивании в течение 45 минут при 37°C. При тестировании смеси препарата псевдоаллергена с противоаллергическим препаратом сначала в пробы крови вводят противоаллергический препарат, после чего инкубируют в течение 10 минут при 37°C при постоянном перемешивании, затем одну часть полученных проб используют в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат псевдоаллергена, а другую часть - в качестве контрольных, вводя разводящую жидкость для псевдоаллергена, и осуществляют повторное инкубирование в течение 45 минут при 37°C.

В инкубированные пробы раздельно вводят активаторы люминол и люцегинин в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанных активаторов, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл, и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанных активаторов, причем измерения ХЛ проводят в режиме постоянного перемешивания в течение 45 минут при 37°C с получением временных зависимостей уровня ХЛ.

Далее рассчитывают показатели для спонтанной и стимулированной люминол-зависимой и люцигенин-зависимой ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов по формуле ИП=Sпa/Sк, где: Sпa; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов соответственно, при этом повышенную чувствительность к псевдоаллергену диагностируют при значениях индекса ИП для люминол-зависимой и люцигенин-зависимой ХЛ ниже аналогичных значений ИП у здоровых доноров.

Для подбора противоаллергических препаратов из перечня тавегил, зантак и интал рассчитывают индекс ИП*=Sхл опыт/Sхл контр; где: Sхл опыт - площадь под кривой временной зависимости уровня люминол-зависимой ХЛ пробы смеси псевдоаллергена с противоаллергическим препаратом; Sxл контр - то же, для контрольной пробы с противоаллергическим препаратом.

Возможность назначения в качестве противоаллергического диагностируют для препарата тавегил при показателе ИП* выше 1,09 в пробах с метамизолом натрия; ИП* выше 1,0 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,57 в пробах с диклофенаком;

для препарата зантак - при показателе ИП* выше 1,04 в пробах с метамизолом натрия, ИП* выше 0,99 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,38 в пробах с диклофенаком;

для препарата интал - при показателе ИП* выше 1,08 в пробах с метамизолом натрия, ИП* выше 0,98 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,51 в пробах с диклофенаком.

Способ может характеризоваться следующим. Тестируемый препарат салицилат натрия разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в концентрации 3 мМ, при этом при индексе ИП ниже 0,60 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 1,25 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют непереносимость салицилата натрия.

Тестируемый препарат метамизол натрия разводят в физиологическом растворе и в пробы крови вводят в концентрации 6 мкМ, при этом при индексе ИП ниже 0,80 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 0,9 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют непереносимость метамизола натрия.

Тестируемый препарат диклофенак натрия разводят в воде для инъекций и вводят в пробы крови в концентрации 6 мкМ, при этом при индексе ИП ниже 1,0 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 0,75 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде воды для инъекций диагностируют непереносимость диклофенака натрия.

Тестируемый препарат тартразин разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в концентрации 4 мкМ, при этом при индексе ИП ниже 0,60 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 0,70 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют непереносимость тартразина.

Препараты тавегил, зантак и интал вводят растворенными в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10^-4, 1,6×10^-4 М, 9,8×10^-5 М соответственно.

В качестве хемилюминометра может быть использован биохемилюминесцентный автоматический анализатор БЛМ 3606М-01 с компьютерной программой BLM - Obrab, производства СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия.

Технический результат - повышение точности тестирования и выявления псевдоаллергенов за счет параллельной регистрации люминол- и люцигенин-зависимой ХЛ в малых объемах крови (до 100 мкл крови на 1 пробу) и возможность индивидуального подбора препаратов для лечения непереносимости НПВП.

Способ осуществляют следующим образом. Диагностику повышенной чувствительности к псевдоаллергенам проводят, параллельно исследуя люминол-зависимую и люцегинин-зависимую хемилюминесценцию цельной крови. Исследование проводят в приборе - биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606 - 01 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия), объем кювет которого составляет 2 мл. В каждую кювету добавляют около 100 мкл крови, 10 мкл растворенного тестируемого препарата (опытные пробы) или разводящей жидкости (контрольные пробы), после чего доводят объем содержимого кюветы до 700 мкл средой Хенкса. Достаточно примерно 100 мкл крови. После инкубации в течение 45 минут при 37°C проводят измерение спонтанной и стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой и люцегенин-зависимой хемилюминесценции в пробах крови с тестируемым агентом (опытные пробы) и в пробах крови с равным объемом разводящей жидкости (контрольные пробы). С помощью компьютерной программы BLM - Obrab определяют площадь под кривой ХЛ (Sхл), отражающую светосумму ХЛ. Проведенные нами контрольные исследования показывают, что ошибка определения параметров кривой ХЛ не превышает 0,5%.

При оценке влияния тестируемого агента на ХЛ крови рассчитывают индекс соотношения площадей (ИП), представляющий собой отношение Sхл опытной пробы (с тестируемым агентом) к Sxл контрольной пробы (Sхл опыт/Sхл контр.). По величине ИП люминол- и люцигенин-зависимой ХЛ судят о повышенной чувствительности к тестируемому агенту.

В таблице 1 представлены индексы ИП для исследуемых НПВП и пищевого красителя тартразина для больных с непереносимостью НПВП и/или тартразина и здоровых доноров. Видно, что при предынкубации крови с исследуемыми НПВП, тартразином индексы ИП у больных с непереносимостью НПВП и/или тартразина достоверно ниже таковых здоровых доноров как для люминол-зависимой ХЛ, так и для люцигенин-зависимой ХЛ. В табл. 2 представлены критерии непереносимости псевдоаллергенов (НПВП, тартразина), в табл. 3 - критерии эффективности применения противоаллергических препаратов у больных с непереносимостью НПВП. Следует отметить, что при отсутствии повышенной чувствительности к какому-либо из исследуемых НПВП (например, диклофенаку) у больного с непереносимостью других НПВП (например, аспирина и анальгина), ИП для диклофенака у данного больного не будет иметь достоверных отличий от ИП здоровых доноров.

Способ позволяет определять не только повышенную чувствительность к псевдоаллергенам (НПВП), но и подбирать оптимальные препараты по степени возрастания Sxл опытных проб (с псевдоаллергеном в смеси с противоаллергическим препаратом) больных, приближающейся к значениям Sxл опытных проб с псевдоаллергеном здоровых доноров. Для этого в каждую кювету добавляют около 100 мкл крови, 10 мкл растворенного в среде Хенкса противоаллергического препарата (например, блокаторы разных типов гистаминовых рецепторов, стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток (интал) и др.) в терапевтической концентрации, после чего доводят объем содержимого кюветы до 690 мкл средой Хенкса. Далее инкубируют в течение 10 минут при 37°C при постоянном перемешивании. Затем в полученные пробы добавляют препарат псевдоаллергена (опытные пробы) или разводящую жидкость - физиологический раствор, воду для инъекций (контрольные пробы) в количестве 10 мкл и осуществляют повторное инкубирование в течение 45 минут в тех же условиях. После инкубации проводят измерение спонтанной и стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции в пробах крови с псевдоаллергеном в смеси с противоаллергическим препаратом (опытные пробы) и в пробах крови с противоаллергическим препаратом (контрольные пробы). С помощью компьютерной программы BLM - Obrab определяют площадь под кривой ХЛ (Sхл), отражающую светосумму ХЛ.

При оценке влияния указанных агентов на ХЛ крови рассчитывают индекс соотношения площадей ИП*=Sxл опыт/Sхл контр, представляющий собой отношение Sхл опытной пробы (с псевдоаллергеном в смеси с противоаллергическим препаратом) к Sxл контрольной пробы (с противоаллергическим препаратом). По величине ИП* люминол-зависимой ХЛ судят о возможности назначения противоаллергического препарата.

Противоаллергический препарат тавегил вводят растворенным в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10^-4 М, а возможность назначения упомянутого препарата в качестве противоаллергического диагностируют при индексе ИП выше 1,09 в пробах с метамизолом натрия; ИП выше 1,0 в пробах с салицилатом натрия и ИП выше 1,57 в пробах с диклофенаком для люминол-зависимой ХЛ.

Противоаллергический препарат зантак вводят растворенным в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,6×10^-4 М, а возможность назначения упомянутого препарата в качестве противоаллергического диагностируют при индексе ИП выше 1,04 в пробах с метамизолом натрия, ИП выше 0,99 в пробах с салицилатом натрия и ИП выше 1,38 в пробах с диклофенаком для люминол-зависимой ХЛ.

Противоаллергический препарат интал вводят в конечной концентрации 9,8×10^-5 М, а возможность назначения упомянутого препарата в качестве противоаллергического диагностируют при индексе ИП выше 1,08 в пробах с метамизолом натрия, ИП выше 0,98 в пробах с салицилатом натрия и ИП выше 1,51 в пробах с диклофенаком для люминол-зависимой ХЛ.

Патентуемый способ апробирован на 116 пациентах с непереносимостью НПВП и/или тартразина, находившихся на лечении в ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, г. Москва. Критерии включения пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП (аспирина, и/или анальгина, и/или диклофенака) и/или употреблении продуктовых изделий, напитков, окрашенных тартразином в желтый цвет. Противопоказания к включению пациентов в исследование: проявления острой или обострение хронической инфекции, прием антигистаминных препаратов, системных глюкокортикостероидов, НПВП, а также окрашенных тартразином продуктовых изделий, напитков, лекарственных препаратов за 2 недели и менее до исследования.

В качестве метода сравнения использовали ТТЕМЛ. Установлена положительная корреляция между ТТЕМЛ in vivo и хемилюминесцентным тестом in vitro в группе пациентов с непереносимостью НПВП.

Пример. Больная А., 63 года (история болезни №1050/11-5970/04). Клинический диагноз: Бронхиальная астма, инфекционно-аллергическая форма, средней тяжести течения, фаза обострения при поступлении, фаза ремиссии при выписке. Хронический бронхит, фаза обострения при поступлении, фаза ремиссии при выписке. Хронический полипозный риносинусит. Непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов.

Исследование проводилось в биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606 - 01 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия) в фазу ремиссии основного заболевания.

Подготовка проб проводилась по описанной выше методике. Получены следующие индексы ИП люминол (Л-ХЛ) - и люцигенин-зависимой (Лц-ХЛ) хемилюминесценции для исследуемых НПВП и тартразина.

Как видно из данных, у этой пациентки показатели ИП в пробах с салицилатом и метамизолом натрия соответствуют критериям непереносимости соответствующих псевдоаллергенов как для Л-ХЛ, так и для Лц-ХЛ, поскольку показатели ИП больной ниже таковых здоровых доноров. Показатели ИП в пробах с диклофенаком натрия и тартразином не соответствуют критериям непереносимости данных псевдоаллергенов, поскольку указанные показатели ИП приближаются к таковым здоровых доноров. Диагноз: выявлена непереносимость салицилата натрия, метамизола натрия, а непереносимости диклофенака натрия и тартразина не выявлено.

Пример подбора противоаллергических препаратов у данной больной.

Как видно из данных, предынкубация проб крови этой пациентки с тавегилом и инталом с последующим внесением в пробы салицилата и метамизола натрия сопровождается существенным увеличением показателей ИП Л-ХЛ, что соответствует критериям эффективности применения указанных противоаллергических препаратов. Предынкубация образцов крови с зантаком приводит к незначительному увеличению показателей ИП, что не соответствует критериям эффективности применения данного противоаллергического препарата. Поэтому для лечения непереносимости НПВП у данной больной рекомендуется применение блокаторов гистаминовых рецепторов 1-го типа (например, тавегила), а также стабилизатора мембран чувствительных клеток аллергии - интала. Блокаторы гистаминовых рецепторов 2-го типа (например, зантак) у данной больной не рекомендуется использовать для лечения вследствие их недостаточной эффективности.

1. Способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергических препаратов, заключающийся в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата и анализе люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ),
отличающийся тем, что
параллельно с люминол-зависимой ХЛ проводят анализ люцегинин-зависимой ХЛ, для чего в отобранную кровь вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие 0,95-1,05×10⁶ лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови,
тестируемый препарат псевдоаллергена или тестируемый препарат псевдоаллергена в смеси с противоаллергическим препаратом, и контрольный препарат в виде разводящей жидкости для псевдоаллергена или разводящей жидкости для псевдоаллергена в смеси с противоаллергическим препаратом, соответственно, в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови, и их инкубируют при постоянном перемешивании в течение 45 минут при 37°C,
при тестировании смеси препарата псевдоаллергена с противоаллергическим препаратом сначала в пробы крови вводят противоаллергический препарат, после чего инкубируют в течение 10 минут при 37°C при постоянном перемешивании, затем
одну часть полученных проб используют в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат псевдоаллергена, а другую часть - в качестве контрольных, вводя разводящую жидкость для псевдоаллергена, и осуществляют повторное инкубирование в течение 45 минут при 37°C;
в инкубированные пробы раздельно вводят активаторы люминол и люцегинин в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанных активаторов, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл, и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанных активаторов, причем
измерения ХЛ проводят в режиме постоянного перемешивания в течение 45 минут при 37°C с получением временных зависимостей уровня ХЛ,
далее рассчитывают показатели для спонтанной и стимулированной люминол-зависимой и люцигенин-зависимой ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов по формуле ИП=Sпa/Sк, где: Sпa; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов соответственно, при этом повышенную чувствительность к псевдоаллергену диагностируют при значениях индекса ИП для люминол-зависимой и люцигенин-зависимой ХЛ ниже аналогичных значений ИП у здоровых доноров;
для подбора противоаллергических препаратов из перечня тавегил, зантак и интал рассчитывают индекс ИП*=Sxл опыт/Sхл контр; где: Sxл опыт - площадь под кривой временной зависимости уровня люминол-зависимой ХЛ пробы смеси псевдоаллергена с противоаллергическим препаратом; Sxл контр - то же, для контрольной пробы с противоаллергическим препаратом; а
возможность назначения в качестве противоаллергического диагностируют для препарата тавегил при показателе ИП* выше 1,09 в пробах с метамизолом натрия; ИП* выше 1,0 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,57 в пробах с диклофенаком;
для препарата зантак - при показателе ИП* выше 1,04 в пробах с метамизолом натрия, ИП* выше 0,99 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,38 в пробах с диклофенаком;
для препарата интал - при показателе ИП* выше 1,08 в пробах с метамизолом натрия, ИП* выше 0,98 в пробах с салицилатом натрия и ИП* выше 1,51 в пробах с диклофенаком.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат салицилат натрия разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в концентрации 3 мМ, при этом при индексе ИП ниже 0,60 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 1,25 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют непереносимость салицилата натрия.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат метамизол натрия разводят в физиологическом растворе и в пробы крови вводят в концентрации 6 мкМ, при этом при индексе ИП ниже 0,80 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 0,9 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют непереносимость метамизола натрия.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат диклофенак натрия разводят в воде для инъекций и вводят в пробы крови в концентрации 6 мкМ, при этом при индексе ИП ниже 1,0 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 0,75 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде воды для инъекций диагностируют непереносимость диклофенака натрия.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат тартразин разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в концентрации 4 мкМ, при этом при индексе ИП ниже 0,60 для люминол-зависимой ХЛ и индексе ИП ниже 0,70 для люцигенин-зависимой ХЛ относительно показателей для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют непереносимость тартразина.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что препараты тавегил, зантак и интал вводят растворенными в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10^-4 М, 1,6×10^-4 М, 9,8×10^-5 М соответственно.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хемилюминометра использован биохемилюминесцентный автоматический анализатор БЛМ 3606М-01 с компьютерной программой BLM - Obrab, производства СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия.