Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси



Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси
Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси
Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси
Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси
Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси
Процесс выделения целевого олигонуклеотида из смеси

 


Владельцы патента RU 2575628:

ГЛЭКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения целевого олигонуклеотида из смеси целевого олигонуклеотида и одной или более примесей. Способ включает выделение олигонуклеотида из смеси с применением двухфазной жидкость-жидкостной хроматографической системы подвижная фаза/неподвижная фаза. Подвижная фаза содержит олигонуклеотид, а неподвижная фаза содержит вещество-обменник, которое устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом. Осуществляют контакт подвижной фазы с неподвижной фазой в приборе для жидкость-жидкостной хроматографии, так что олигонуклеотид становится связанным с веществом-обменником в жидкой неподвижной фазе. Олигонуклеотид вытесняют из жидкой неподвижной фазы во вторую жидкую подвижную фазу посредством вещества-вытеснителя, способного к вытеснению олигонуклеотида из неподвижной фазы во вторую подвижную фазу. Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью выделить целевой олигонуклеотид из смеси целевого олигонуклеотида и одной или более примесей. 19 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Данное изобретение относится к новому процессу, в частности к процессу отделения олигонуклеотидов от химических примесей с применением жидкостно-жидкостной хроматографии без подложки.

Олигонуклеотиды содержат относительно короткие последовательности полимерных нуклеиновых кислот, которые могут являться ДНК или РНК, как правило, с пятьюдесятью или меньшим количеством оснований, хотя в настоящее время могут быть синтезированы олигонуклеотиды с вплоть до приблизительно 200 оснований. Олигонуклеотиды применяются в терапии. Синтетический РНК олигонуклеотид, обозначенный компанией Prosensa их обозначением PR0051 и авторами данного изобретения обозначением GSK2402968, имеет последовательность 5'-uca agg aag aug gca uuu ca-3'. Этот олигонуклеотид является антисмысловым олигонуклеотидом, т.е. одиночной нитью ДНК или РНК, которая является комплементарной выбранной последовательности. Считается, что он индуцирует перескакивание экзона 51, и он проходит рассмотрение в Фазе III клинического исследования для лечения в амбулаторных условиях мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна (МДД).

Проблемой для таких олигонуклеотидов является их очистка от примесей. Например, вышеупомянутый GSK2402968 является 20-мером, и в течение его синтеза он может стать загрязненным примесями, включая другие олигонуклеотиды, включая короткомерные и длинномерные, например, содержащие 17, 18, 19 и 21 оснований. Другие примеси также могут присутствовать.

Желательно предоставить процесс выделения таких олигонуклеотидов, который эффективен и применим в промышленном масштабе производства. В "Therapeutic oligonucleotides: The state of the art in purification technologies". Sanghvi et. al. Current Opinion in Drug Discovery (2004), Vol. 7, No. 8 рассматриваются процессы, применяемые для очистки олигонуклеотидов. В литературе раскрыты другие процессы. Для очистки последовательностей ДНК и РНК применялись различные процессы. В WO-A-01/55160 раскрывается очистка олигонуклеотидов образованием иминовых связей с загрязняющим веществами с последующим удалением имин-связанных примесей посредством хроматографии или других технологий. "Size Fractionation of DNA Fragments Ranging from 20 to 30000 Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography". Muller et al. Eur. J. Biochem (1982), 128-238 раскрывает применение твердой колонки из микрокристаллической целлюлозы, на которую была нанесена фаза ПЭГ/декстран для отделения нуклеотидных последовательностей. "Separation and identification oligonucleotides by hydrophilic interaction chromatography". Easter et. al. The Analyst (2010); 135(10) раскрывает выделение олигонуклеотидов с использованием варианта ВЭЖХ с применением фазы подложки из твердого силикагеля. "Fractionation of oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrent distribution". Doctor et al. Biochemistry (1965), 4(1), 49-54 раскрывает применение сухой твердой колонки, наполненной сухой ДЭАЭ-целлюлозой. "Oligonucleotide composition of a yeast lysine transfer ribonucleic acids". Madison et al; Biochemistry, 1974, 13(3) раскрывает применение твердофазной хроматографии для выделения нуклеотидных последовательностей. Статья в Википедии http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrophilic interaction chromatography раскрывает применение хроматографии гидрофильных взаимодействий для выделения биомолекул с применением твердой силикагелевой подложки.

Жидкость-жидкостная хроматография является известным способом выделения. Жидкость-жидкостная хроматография использует двухфазную жидкостную систему, содержащую неподвижную жидкую фазу, удерживаемую в удлиненной колонке (аналогично твердой фазе, размещенной в трубчатой колонке в обычно применяемой хроматографии), и подвижную жидкую фазу, которую пропускают через колонку в контакте с неподвижной фазой. Во время такого протекания вещества будут распределяться между подвижной и неподвижной фазами образом, аналогичным обычно применяемому в твердофазной хроматографии. В технологиях жидкость-жидкостной хроматографии подвижная фаза элюирует вещества, которые нужно разделить, во фракциях аналогично обычно применяемой жидко-твердофазной хроматографии. В жидкостно-жидкостной хроматографии процесс обычно функционирует без подложки, т.е. не требуется твердая несущая матрица для поддержки жидких фаз, которые поддерживаются в контакте с другом во время процесса посредством центробежной силы внутри вращающейся колонки. "Countercurrent Chromatography - The Support-Free Liquid Stationary Phase". Billardello, В.; Berthod, A; Wilson & Wilson's Comprehensive Analytical Chemistry 38; Berthod, A., Ed.; Elsevier Science B.V.: Amsterdam (2002), pp. 177-200 предоставляет пригодное общее описание жидкость-жидкостной хроматографии.

Известны различные технологии жидкость-жидкостной хроматографии.

Одной из технологий является жидкость-жидкостная противоточная хроматография (обозначенная в данном документе "ПТХ"). В приборе для ПТХ кольцевая, например винтовая или спиральная, трубчатая колонка, как правило, постоянного диаметра вращается как вокруг ее центра вращения, так и вокруг оси вращения, перемещенной от ее центра, т.е. так называемое планетарное вращение. Это комбинированное движение создает осциллирующие поля центробежной силы в колонке, что приводит к смешанным и несмешанным зонам вдоль колонки. Типичный прибор для ПТХ раскрыт в WO-A-03/086639 (Brunei University).

Другой известной технологией является центробежная распределительная хроматография (обозначенная в данном документе "ЦРХ"). В US-A-6537452 и WO-A-2010/059715 предлагается возможность применения ЦРХ для отделения биологических молекул. "High Performance Centrifugal Partition Chromatography", 2005 (online: http://web.archive.Org/web/20050208201013/http://everseko.co.ip/p02.html) и "Applications of Liquid-Liquid Chromatography Instrumentation for Laboratory Preparative & Process Chemistry". Brown et al. Chromatography Today (Nov-Dec 2009), 16-19 являются обзорными статьями о ЦРХ. "Anion-Exchange Displacement Centrifugal Partition Chromatography". Maciuk et al., Anal. Chem. (2004) 76, 6179-6186 раскрывает процесс вытеснительной хроматографии, в котором изомеры гидроксикоричной кислоты разделяются посредством обеспечения вещества-обменника (удерживателя) в неподвижной фазе для устраняемого удерживания гидроксикоричной кислоты на неподвижной фазе, с вытеснением затем ее из неподвижной фазы с применением вещества-вытеснителя.

Коммерчески доступны многочисленные типы приборов для ЦРХ, например у Kromaton, участника Rousselet Robatel Group. Как правило, прибор для ЦРХ содержит колонку, содержащую многочисленные (иногда вплоть до 1000) маленькие полости, иногда называемые "распределительные ячейки", которые упорядочены по окружности в одну или более окружностей для вращения вокруг оси вращения, при этом эти распределительные ячейки взаимосвязаны каналами потока, так что можно вызвать протекание жидкости через них последовательно. В одном известном расположении множественные распределительные ячейки вытравлены или обработаны вокруг диска, например, изготовленного из металла, такого как нержавеющая сталь, и множественные диски уложены вдоль их центральной оси вращения для образования ротора, который может вращаться вокруг оси вращения. Такие формы прибора ЦРХ, имеющие относительно немного уложенных дисков и относительно больший объем распределительных ячеек, иногда называются центробежные распределительные экстракторы ("ЦРЭ"). Типичные приборы для ЦРХ, например, раскрыты в US-A-6537452 (Kromaton), WO-A-2004/079363 (Partus) и в другой научной и технической литературе.

В процессе ЦРХ жидкая фаза вводится в ряд распределительных ячеек и каналов, в то время как кольцо(а) распределительных ячеек вращается вокруг оси вращения. Это вращение является причиной центробежной силы, которая удерживает эту фазу, неподвижную фазу, на месте. Затем вторую жидкую фазу, подвижную фазу, можно привести к протеканию через распределительные ячейки, и вещество, растворенное в подвижной фазе, посредством этого можно привести к распределению между подвижной и неподвижной фазами образом, аналогичным способу, в котором вещество распределяется между подвижным элюентом и неподвижной твердой фазой в колоночной хроматографии.

Прибор для жидкость-жидкостной хроматографии может быть использован или в так называемом "нисходящем" или "восходящем" режиме. Когда колонка вращается, если подвижная и неподвижная фазы имеют различные плотности, центробежная сила, генерируемая вращением, вызывает то, что более плотная фаза становится радиально более наружной от оси вращения колонки, чем менее плотная фаза. Если в таком приборе подвижная фаза является более плотной, радиально более наружной фазой, то это обозначается как "нисходящий режим" функционирования. В противном случае, т.е. подвижная фаза является менее плотной, радиально более внутренней фазой, это обозначается "восходящий режим".

ЦРХ была использована для отделения различных типов веществ. Например, разделение глюкозинолатов (органические соединения, получаемые из глюкозы и аминокислоты) описано в Toribio A, Nuzillard J-M, Renault J-H; Journal of Chromatography A. 1170 (2007), 44-51. Например, очистка пептидов с применением ЦРХ раскрыта в WO-A-2011/157803.

Задача данного изобретения заключается в предоставлении процесса с применением жидкость-жидкостной хроматографии для отделения олигонуклеотидов от примесей, который как эффективен в выделении, так и пригоден для применения в масштабе промышленного производства.

В соответствии с данным изобретением способ для выделения целевого олигонуклеотида из смеси целевого олигонуклеотида и одной или более примесей содержит:

предоставление двухфазной жидкость-жидкостной хроматографической системы подвижная фаза - неподвижная фаза, содержащей первую жидкую подвижную фазу и жидкую неподвижную фазу, содержащую по меньшей мере одно вещество-обменник, которое устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом;

вызывание переноса первой жидкой подвижной фазой целевого олигонуклеотида в потоке относительно и в контакте с жидкой неподвижной фазой в колонке прибора для жидкость-жидкостной хроматографии, так что целевой олигонуклеотид становится связанным с веществом-обменником в жидкой неподвижной фазе;

далее вытеснение целевого олигонуклеотида из жидкой неподвижной фазы во вторую жидкую подвижную фазу, протекающую относительно и в контакте с неподвижной фазой через колонку посредством вещества-вытеснителя, способного вытеснить целевой олигонуклеотид из жидкой неподвижной фазы во вторую подвижную фазу.

Впоследствии целевой олигонуклеотид может быть выделен из второй подвижной фазы.

В одном варианте осуществления способа вызывание переноса первой жидкой подвижной фазой целевого олигонуклеотида в потоке может быть достигнуто предоставлением первой жидкой подвижной фазы, содержащей целевой олигонуклеотид, например, с целевым олигонуклеотидом, растворенным в ней.

В одном варианте осуществления способа, подходящем для ЦРХ, способ содержит этапы:

(1) предоставление первой жидкой фазы, содержащей целевой олигонуклеотид и одну или более примесей в растворе, и второй жидкой фазы, содержащей вещество-обменник, которое устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом, при этом первая и вторая жидкие фазы образуют две отдельные фазы при контакте друг с другом;

(2) введение второй жидкой фазы в прибор для центробежной распределительной хроматографии с неподвижной жидкой фазой в нем;

(3) введение первой жидкой фазы, содержащей целевой олигонуклеотид и одну или более примесей в растворе, в прибор для центробежной распределительной хроматографии в качестве первой подвижной фазы и вызывание протекания этой первой жидкой фазы через прибор для центробежной распределительной хроматографии в контакте со второй жидкой фазой, так что целевой олигонуклеотид становится устраняемо связанным с веществом-обменником во второй жидкости, неподвижной жидкой фазе;

(4) введение жидкой фазы, которая образует отдельную фазу при контакте со второй жидкой фазой и которая содержит в растворе по меньшей мере одно вещество-вытеснитель, способное к вытеснению целевого олигонуклеотида из второй жидкой фазы, в прибор для центробежной распределительной хроматографии в виде второй подвижной фазы и вызывание протекания этой второй подвижной фазы через прибор для центробежной распределительной хроматографии в контакте с неподвижной жидкой фазой, так что целевой олигонуклеотид становится вытесненным из неподвижной фазы и поступает в раствор во второй подвижной фазе;

(5) выделение вытесненного целевого олигонуклеотида из второй подвижной фазы.

Олигонуклеотиды, как правило, содержат 50 или менее оснований, и, как упомянуто выше, олигонуклеотиды вплоть до 200 оснований могут быть легко синтезированы. Способ по данному изобретению, как оказывается, подходит для всех таких олигонуклеотидов, как для встречающихся в природе, так и для синтетических олигонуклеотидов, например олигонуклеотиды, имеющие основные модификации или модифицированные основания. Термин "олигонуклеотид" в используемом в данном документе значении содержит как ДНК (DNA), так и РНК (RNA), ЗНК (LNA) (Запертая нуклеиновая кислота, т.е. в которой группа рибозы нуклеотида ЗНК модифицирована дополнительным мостиком, соединяющим 2' атом кислорода - 4' атом углерода) последовательности, олигонуклеотиды с 2' модификациями (миРНК, siRNA), фосфодиэфиры и фосфотиоаты и содержит защищенные и незащищенные последовательности.

Данное изобретение облегчает отделение целевого олигонуклеотида от примесей, которые, например, возникают в результате синтеза или экстракции олигонуклеотида. Может происходить отделение, например, от примесей, не становящихся связанными с веществом-обменником в неподвижной фазе, так что примесь протекает через и вытекает из прибора для ЦРХ все еще растворенной в подвижной фазе. Иначе такие примеси могут стать связанными с веществом-обменником в неподвижной фазе, но в другой степени, чем целевой олигонуклеотид, и/или могут быть вытеснены из неподвижной фазы, но в другой степени, чем целевой олигонуклеотид, так что по мере того как вторая подвижная фаза протекает через ЦРХ, целевой олигонуклеотид и примесь(и) разделяется на фракции в потоке второй подвижной фазы, аналогично обычно применяемой хроматографии. Могут иметь место оба таких процесса разделения.

Процесс по изобретению, как оказывается, подходит для олигонуклеотидов типичной длины, применяемых в терапии, например 5-50 оснований, например 10-30 оснований, например 15-25 оснований. Доступные в настоящее время данные предполагают, что процесс по изобретению может быть применен к олигонуклеотидам любой последовательности оснований. Целевой олигонуклеотид может, например, быть олигонуклеотидом из 20 оснований РНК, обозначенным GSK2402968, который имеет последовательность 5'-uca agg aag aug gca uuu ca-3'. Примером олигонуклеотида из 10 оснований ДНК является 5' GGC CAA ACC T 3'. Другим примером олигонуклеотида из 20 оснований ДНК является 5' GGC CAA TCG GCT TAC CT 3'. Примером олигонуклеотида из 30 оснований ДНК является 5' GGC CAA TCG GCT TCA CTC GGC CAA ACC 3'. Примером олигонуклеотида ЗНК является 5' TTT ACG ACG ACG TTT 3'. Примером олигонуклеотида миРНК является 5'-gca cga uuc uca aga ugc cg-3'.

Олигонуклеотиды, применяемые в процессе по данному изобретению, могут также содержать пептидную нуклеиновую кислоту или ее производное.

Термин "основная модификация" или "модифицированное основание", как идентифицировано в данном документе, относится к модификации существующего основания (т.е. пиримидинового или пуринового основания) или к синтезу основания de novo. Это синтезированное de novo основание может быть квалифицировано как "модифицированное" по сравнению с существующим основанием.

Другие химические структуры и модификации олигонуклеотидов, охватываемые в данном изобретении, определены далее. Эти дополнительные химические структуры и модификации могут быть представлены в комбинации с химическими структурами уже описанных олигонуклеотидов, например наличие 5-метилциторзина, 5-метилурацила и/или 2,6-диаминопурина и олигонуклеотидов, содержащих 2'-O-метилфосфотиоат РНК.

Вдобавок к модификациям, описанным выше, олигонуклеотиды при применении в процессе по изобретению могут содержать дополнительные модификации, такие как различные типы мономеров нуклеиновой кислоты или нуклеотиды, как описано ниже. Например, олигонуклеотид может иметь по меньшей мере одну модификацию остова и/или сахара и/или по меньшей мере модификацию одного основания по сравнению с олигонуклеотидом на основе РНК.

Термин основная модификация также содержит модифицированные версии природных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, аденин, урацил, гуанин, циторзин и тимин), такие как гипоксантин, оротовая кислота, агматидин, лизидин, 2-тиопиримидин (например, 2-тиоурацил, 2-тиотимин), G-clamp и его производные, 5-пиримидин (например, 5-метилциторзин, 5-метилурацил, 5-галоурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинилциторзин, 5-аминометилурацил, 5-гидроксиметилурацил, 5-аминометилциторзин, 5-гидроксиметилциторзин, Super T), 2,6-диаминопурин, 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 7-аза-2,6-диаминопурин, 8-аза-7-деазагуанин, 8-аза-7-деазааденин, 8-аза-7-деаза-2,6-диаминопурин, Super G, Super A и N4-этилциторзин или их производные; N2-циклопентилгуанин (cPent-G), N2-циклопентил-2-аминопурин (cPent-AP) и N2-пропил-2-аминопурин (Pr-AP) или их производные; и вырожденные или универсальные основания, такие как 2,6-дифтортолуол, или отсутствующие основания, такие как абазические сайты (например, 1-дезоксирибоза, 1,2-дидезоксирибоза, 1-дезокси-2-О-метилрибоза; или пирролидиновые производные, в которых атом кислорода кольца был замещен на атом азота (азарибоза)). Примеры производных Super A, Super G и Super T приведены в US-A-6683173, который полностью включен в данный документ посредством ссылки. Было продемонстрировано, что cPent-G, cPent-AP и Pr-AP снижают иммуностимулирующие эффекты при включении в миРНК (Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. (2011), 133, 9200).

Олигонуклеотиды, применяемые в данном изобретении, могут содержать абазический сайт или абазический мономер. Абазический сайт или мономер представляет собой мономер или структурный элемент, у которого отсутствует нуклеооснование, по сравнению с соответствующим мономером, содержащим нуклеооснование. Абазический мономер таким образом является частью структурного элемента олигонуклеотида, но с отсутствующим нуклеооснованием. Такой абазический мономер может являться представленным, или связанным, или прикрепленным, или конъюгированным со свободным концом олигонуклеотида. Абазический мономер может быть любого типа, известного и понятного специалисту, неограничивающие примеры которого изображены ниже:

,

где R1 и R2 представляют собой независимо H, олигонуклеотид или другой(ие) абазический(ие) сайт(ы), при условии что не оба R1 и R2 представляют собой H и не оба R1 и R2 представляют собой олигонуклеотид. Абазический(ие) мономер(ы) может быть прикреплен к любому или обоим концам олигонуклеотида, как указано выше. Необходимо отметить, что олигонуклеотид, прикрепленный к одному или двум абазическим сайтам или абазическому(им) мономеру(ам,) может содержать менее чем 10 нуклеотидов.

Олигонуклеотиды, применяемые в процессе по данному изобретению, могут содержать сахарные модификации, т.е. модифицированный вариант рибозильной группы, такой как 2'-O-модифицированная РНК, такая как 2'-O-алкил или 2'-O-(замещенный)алкил, например 2'-O-метил, 2'-O-(2-цианоэтил), 2'-O-(2-метокси)этил(2'-MOE), 2'-O-(2-тиометил)этил, 2'-O-бутирил, 2'-O-пропаргил, 2'-O-аллил, 2'-O-(3-амино)пропил, 2'-O-(3-(диметиламино)пропил), 2'-O-(2-амино)этил, 2'-O-(2-(диметиламино)этил); 2'-дезокси (ДНК); 2'-O-(галоалкокси)метил (Arai K. et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285), например 2'-O-(2-хлорэтокси)метил (MCEM), 2'-O-(2,2-дихлорэтокси)метил (DCEM); 2'-O-алкоксикарбонил, например 2'-O-[2-(метоксикарбонил)этил] (MOCE), 2'-O-[2-(N-метилкарбамоил)этил] (MCE), 2'-O-[2-(N,N-диметилкарбамоил)этил] (DCME); 2'-гало, например 2'-F, FANA (2'-F арабинозил нуклеиновая кислота); карбосахарные и азасахарные модификации; 3'-O-алкил, например 3'-O-метил, 3'-O-бутирил, 3'-O-пропаргил и их производные.

Другие сахарные модификации содержат "соединенную мостиком" или "бициклическую" нуклеиновую кислоту (BNA), например запертая нуклеиновая кислота (LNA), ксило-LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-O, 4'-C затрудненная этил) LNA, cMOEt (2'-O, 4' затрудненная метоксиэтил) LNA, соединенная этиленовым мостиком нуклеиновая кислота (ЭНК, ENA), трицикло ДНК; незапертая нуклеиновая кислота (ННК, UNA); циклогексенил нуклеиновая кислота (цГНК, CeNA), алтриол нуклеиновая кислота (АНК, ANA), гексит нуклеиновая кислота (ГНК, HNA), фторированная ГНК (Ф-ГНК, F-HNA), пиранозил-РНК (п-РНК, p-RNA), 3'-дезоксипиранозил-ДНК (п-ДНК, p-DNA); морфолино (как, например, в PMO, PPMO, PMOPlus, PMO-X) и их производные.

Олигонуклеотиды, применяемые в процессе по данному изобретению, могут содержать модификацию остова, например модифицированный вариант фосфодиэфира, представленного в РНК, такого как фосфотиоат (PS), хирально чистый фосфотиоат, фосфородитиоат (PS2), фосфоноацетат (PACE), фосфоноацетамид (РАСА), тиофосфоноацетат, тиофосфоноацетамид, предшественник фосфотиоата, H-фосфонат, метилфосфонат, метилфосфонотиоат, метилфосфат, метилфосфотиоат, этилфосфат, этилфосфотиоат, боранофосфат, боранофосфотиоат, метилборанофосфат, метилборанофосфотиоат, метилборанофосфонат, метилборанофосфонотиоат и их производные. Другая модификация содержит фосфорамидит, фосфорамидат, N3'→P5' фосфорамидат, фосфородиамидат, фосфоротиодиамидат, сульфамат, диметиленсульфоксид, сульфонат, триазол, оксалил, карбамат, метиленимино (MMI) и тиоацетамидонуклеиновую кислоту (TANA) и их производные.

Олигонуклеотиды, применяемые в процессе по данному изобретению, могут содержать другие модификации, такие как нуклеиновая кислота на пептидной основе (ПНК), модифицированная кластером бора ПНК, оксипептидная нуклеиновая кислота на основе пирролидина (POPNA), нуклеиновая кислота на основе гликоля или глицерина (GNA), основанная на треозе нуклеиновая кислота (TNA), основанная на ациклическом треониноле нуклеиновая кислота (aTNA), основанный на морфолине олигонуклеотид (PMO, PPMO, PMO-X), катионные основанные на морфолине олигомеры (PMOPlus), олигонуклеотиды с интегрированными основаниями и остовами (ONIB), пирролидинамидные олигонуклеотиды (POM) и их производные. Специалист в данной области также примет во внимание, что также существует множество синтетических производных олигонуклеотидов. Модификация остова содержит модифицированный вариант фосфодиэфира, представленного в РНК, такой как фосфотиоат (PS), хирально чистый фосфотиоат, фосфородитиоат (PS2), фосфоноацетат (PACE), фосфоноацетамид (РАСА), тиофосфоноацетат, тиофосфоноацетамид, предшественник фосфотиоата, H-фосфонат, метилфосфонат, метилфосфонотиоат, метилфосфат, метилфосфотиоат, этилфосфат, этилфосфотиоат, боранофосфат, боранофосфотиоат, метилборанофосфат, метилборанофосфотиоат, метилборанофосфонат, метилборанофосфонотиоат и их производные. Другая модификация содержит фосфорамидит, фосфорамидат, N3'→P5' фосфорамидат, фосфородиамидат, фосфоротиодиамидат, сульфамат, диметиленсульфоксид, сульфонат и тиоацетамидонуклеиновую кислоту (TANA) и их производные.

Необходимо, чтобы каждый сахар, основание и/или остов не были модифицированы одинаковым образом. Несколько отдельных модифицированных сахаров, оснований и/или остовов могут быть комбинированы в одном отдельном олигонуклеотиде в олигонуклеотидах, применяемых в процессе по данному изобретению. Олигонуклеотиды, применяемые в процессе по данному изобретению, могут содержать более чем одну модификацию отдельного основания, и/или более чем одну модификацию отдельного сахара, и/или одну или более модификаций отдельного остова в указанном олигонуклеотиде.

Процесс по изобретению, как оказывается, подходит для отделения олигонуклеотида от примесей, которые не являются олигонуклеотидами.

Процесс также, как оказывается, подходит для отделения целевого олигонуклеотида от одной или более примесей, которая также является олигонуклеотидом. Например, процессом по изобретению, как оказывается, возможно отделять олигонуклеотидную примесь, которая отличается от целевого олигонуклеотида только на одно или два основания. Например, процесс по изобретению, как оказывается, подходит для отделения целевого олигонуклеотида, имеющего 20 оснований, от примесей, являющихся длиномерными и короткомерными олигонуклеотидами, имеющими 17, 18, 19 или 21 основание. Считается, что такие олигонуклеотидные примеси становятся связанными с веществом-обменником в неподвижной фазе в отличающейся от целевого олигонуклеотида степени и/или могут быть вытеснены из неподвижной фазы, но с отличающейся от целевого олигонуклеотида степенью, так что по мере того как вторая подвижная фаза протекает через ЦРХ, целевой олигонуклеотид и олигонуклеотидные примеси разделяются на фракции в потоке второй подвижной фазы.

В процессе по данному изобретению целевой олигонуклеотид может быть в виде свободного олигонуклеотида или в виде формы производного целевого олигонуклеотида, такой как форма, защищенная защитной группой. Известны многочисленные защитные группы для олигонуклеотидов. Подходящей защитной группой является диметокситритильная, и считается, что другие известные защитные группы также являются подходящими.

Первая подвижная фаза и неподвижная фаза могут содержать любые жидкости, которые образуют две отдельные фазы при контакте друг с другом и которые содержат одну подвижную фазу, которая растворяет целевой олигонуклеотид, и одну неподвижную фазу, которая растворяет вещество-обменник и целевой олигонуклеотид, при связывании с веществом-обменником. Другие желательные свойства таких жидкостей включают образование двух фаз с такой разницей в плотности, что они легко образуют две отдельные фазы и демонстрируют небольшую склонность к образованию эмульсии.

Например, такие две фазы могут содержать комбинации растворителей или воды и один или более растворителей, которые при смешивании образуют двухфазную систему, в которой вещество-обменник растворимо только или, по существу, растворимо только в одной из фаз (подвижной или неподвижной) и вещество-вытеснитель растворимо только или, по существу, растворимо только в другой (неподвижной или подвижной) фазе.

Например, неподвижная фаза может содержать смесь одной или более органических жидкостей, которые являются несмешиваемыми или частично смешиваемыми с водой, таких как C1-6 алкил C1-6 алканоатный сложный эфир, ди-C1-6 алкиловый эфир, С4-10 циклический эфир, жидкий галогенированный C1-6 алкан или жидкий C5-10 алкан; и одну или более органических жидкостей, которые являются по меньшей мере частично смешиваемыми с водой, таких как C1-8 алканол или ди-(C1-8 алкил)кетон.

Под термином "частично смешиваемый" подразумевается, что двухфазная система может быть образована на по меньшей мере части композиционного диапазона алканол-вода. Каждая из таких двух фаз содержит и алканол, и воду, но в одной фазе будет преобладать алканол и в другой фазе будет преобладать вода. Низшие, например, C1-3 алканолы обычно являются смешиваемыми с водой на всем композиционном диапазоне вода-алканол, но высшие, например, C4-8 алканолы обычно являются несмешиваемыми или только частично смешиваемыми с водой. Например, первая и вторая подвижные фазы могут содержать смесь одной или более органических жидкостей, которые являются смешиваемыми с водой, такие как C1-8 алканол или ди-(C1-8 алкил)кетон; и воду. Примеры таких органических жидкостей содержат этилацетат, метил-третбутиловый эфир, алкил-замещенные тетрагидрофураны, такие как 2-метилтетрагидрофуран, хлороформ, гексан, 1-бутанол, этанол, метанол, и высокополярные апротонные растворители, такие как диметилсульфоксид и диметилформамид.

Без сомнения, будет учтено, что в любой такой уравновешенной системе, в которой такие две фазы находятся в контакте друг с другом, может происходить некоторое взаимное перемешивание минорных долей жидких компонентов, так что жидкость неподвижной фазы может содержать минорную долю воды, растворенной из жидкости подвижной фазы, и жидкость подвижной фазы может содержать минорную долю жидкости, которая является, по существу, несмешиваемой с водой, растворенную из жидкости неподвижной фазы.

Соответствующие фазы могут быть образованы пригодным образом смешиванием двух или более таких жидкостей и позволением системе стабилизироваться в две равновесные фазы, при этом верхняя - менее плотная и нижняя - более плотная фаза, каждая из которых может быть использована в качестве неподвижной или подвижной фазы. Неподвижная и подвижная фазы могут, следовательно, содержать соответствующие две равновесные фазы жидкостной системы, содержащие такие жидкости. Следует иметь в виду, что каждая из таких фаз может содержать все из жидкостей, содержащихся в системе, но каждая такая фаза будет содержать преимущественно одну или более из жидкостей в качестве главного компонента и одну или более из жидкостей в качестве минорного компонента.

Примеры таких фаз содержат двухфазные системы (a)-(e), приведенные ниже. Относительные соотношения, в которых такие жидкости могут быть смешаны для обеспечения таких фаз, будут зависеть от жидкостей, но могут легко быть определены экспериментально. Типичные соотношения представлены.

(a) C1-6 алкил C1-6 алканоатный сложный эфир - С1-8 алканол - вода. Менее плотная фаза содержит главный компонент сложный эфир + алканол. Более плотная фаза содержит главный компонент воду + алканол. Например, этилацетат - 1-бутанол - вода (3:2:5).

(b) C4-8 алканол - вода. Менее плотная фаза содержит главный компонент алканол. Более плотная фаза содержит главный компонент воду. Например, 1-пентанол или 1-бутанол - вода.

(c) C1-8 алканол - ди-(C1-8 алкил) кетон - вода. Менее плотная фаза содержит главный компонент алканол + кетон. Более плотная фаза содержит главный компонент воду + алканол. Например, 1-бутанол - метилизобутилкетон - вода (1:3:4).

(d) ди-(C1-8 алкил) кетон - вода. Менее плотная фаза содержит главный компонент кетон. Более плотная фаза содержит главный компонент воду. Например, метилизобутилкетон - вода.

(e) ди-C1-6 алкиловый эфир или C4-10 циклический эфир - C1-8 алканол - вода. Менее плотная фаза содержит главный компонент эфир и алканол. Более плотная фаза содержит главный компонент воду. Например, метил-трет-бутиловый эфир - 1-пентанол - вода (3:1:4) или 2-метилтетрагидрофуран - 1-бутанол - вода (3:1:4).

Необходимо будет понимать, что в добавок к своим главным компонентам каждая из таких фаз в паре будет содержать минорный(ые) компонент(ы), являющийся главным компонентом других фаз в паре. В процессе по данному изобретению неподвижная фаза может быть менее плотной из таких пар фаз.

Предпочтительная первая подвижная фаза содержит смесь воды и 1-бутанола в качестве главных компонентов с неподвижной фазой, которая содержит смесь этилацетата и 1-бутанола в качестве главных компонентов. Другие предпочтительные первые подвижные фазы содержат смесь воды и 1-бутанола в качестве главных компонентов с неподвижной фазой, которая содержит смесь 2-метилтетрагидрофурана и 1-бутанола в качестве главных компонентов. Такие смеси образуют две отдельные фазы при контакте друг с другом.

Первая подвижная фаза подходящим образом может быть приведена к подходящему pH для облегчения растворения и стабилизации целевого олигонуклеотида, например присоединением основания, например неорганического основания, такого как гидроксид щелочного металла, такой как гидроксид натрия, или аммиак. Подходящее pH зависит, среди прочего, от олигонуклеотида и может зависеть от того, является ли он защищенным. Подходящий диапазон pH для первой подвижной фазы, по-видимому, составляет pH 7-14, хотя полагается, что кислотный pH <7 может являться допустимым для некоторых приложений. Подходящий диапазон pH для вышеупомянутого 20-мерного олигонуклеотида в или диметокситритил-защищенной форме, или незащищенного составляет приблизительно pH 7-12. Подходящий диапазон pH для этого олигонуклеотида в диметокситритил-защищенной форме составляет, например, pH 10-12, соответственно около pH 11. Доступные в настоящее время данные предполагают, что такие диапазоны pH могут являться подходящими для других олигонуклеотидов. Подходящая концентрация для такого основания в первой подвижной фазе для достижения такого pH может быть определена экспериментально. В экспериментах, описанных в данном документе, было обнаружено, что подходящая концентрация составляет 10 +/-5 мМ, например 10 мМ гидроксида натрия.

Подходящая концентрация целевого олигонуклеотида, такого как 20-мерный, который указан выше, может быть определена экспериментально. Концентрация в колонке 200 мг - 100 г на л, например 200 мг - 80 г на л, например 20 - 60 г на л, по-видимому, является подходящей.

Вещество-обменник (иногда в данной области альтернативно называемое "удерживатель") устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом в неподвижной фазе. Подходящее вещество-обменник является анионобменным веществом.

Подходящее вещество-обменник, которое связывается с целевым олигонуклеотидом, является солью органического амина с противоанионом, соответственно вторичной, третичной или четвертичной аммониевой солью. Пример такой аммониевой соли имеет общую формулу

R1R2R3R4N+X-.

В которой во вторичной, третичной и четвертичной последовательности соответственно две, три или четыре из групп R1, R2, R3 и R4 представляют собой независимо C1-20 алкил или замещенный алкил, такой как фторо- или трифторметилзамещенный алкил, или бензил, и остающиеся являются водородом, и X- представляет собой галогенид-анион, подходящим является хлорид. Подходящее вещество-обменник представляет собой смесь хлорида три-(н-октил)метиламмония и хлорида три-(н-децил)метиламмония соответственно, в которой н-октильное соединение является преобладающим. Такая смесь коммерчески доступна под названием Aliquat 336™. Другие вещества-обменники, считающиеся подходящими, содержат бромид цетилтриметиламмония, хлорид метилтриоктиламмония, хлорид бензалкония (также известный как хлорид алкилдиметилбензиламмония и ADBAC, являющийся смесью хлоридов алкилбензилдиметиламмония с различными длинами алкильных цепей), хлорид бензилтриметиламмония, хлорид тетрабутиламмония и Амберлит LA2 (высокомолекулярный жирорастворимый вторичный амин, поставляемый в виде жидкости в основной форме) в протонированной форме.

Концентрация вещества-обменника в неподвижной фазе будет зависеть среди прочего от используемого вещества, самого целевого олигонуклеотида и скорости потока подвижной фазы. Расчет может быть осуществлен на основе молярных соотношений целевого олигонуклеотида и вещества-обменника. Предполагается, что для от 10- до 30-мерного олигонуклеотида подходящий диапазон молярного соотношения вещества-обменника составляет 0,5-15, предпочтительно приблизительно 5, эквивалентов на ионный сайт, приводя к молярному соотношению вещество-обменник:целевой олигонуклеотид в диапазоне 1:5-500, предпочтительно 1:10-300, более предпочтительно 1:20-150. Концентрация вещества-обменника 5-500, например 5-100, как правило, 8-50 мМ, как оказывается, является подходящей, по меньшей мере для Aliquat 336™, и возможно для других веществ-обменников.

Подразумевается, что можно применять любой коммерчески доступный прибор для жидкость-жидкостной хроматографии, в котором используются системы неподвижной и подвижной фазы жидкость-жидкость, для выполнения способа по данному изобретению.

Примером подходящего прибора для ЦРХ является прибор для ЦРХ FCPC200™ от Kromaton. Подходящая аппаратура для ЦРХ также доступна у Armen Instrument. Нормальные условия функционирования по спецификации для такого прибора, как оказывается, являются подходящими для выполнения процесса по данному изобретению. Неподвижная фаза подходящим образом вносится в колонку в соответствии с инструкцией для нормального рабочего режима для прибора.

При типичном функционировании колонка может быть наполнена неподвижной фазой накачиванием жидкой неподвижной фазы, например второй жидкой фазы, с высокой скоростью потока в колонку с последующим началом вращения колонки при подходящей для прибора рабочей скорости.

Возможно вызвать перенос первой подвижной фазой целевого олигонуклеотида (вместе с примесями) в ее потоке различными путями.

В одном из путей, к примеру, первая подвижная фаза, содержащая растворенный целевой олигонуклеотид, может затем быть введена в колонку и может быть вызвано ее протекание через колонку относительно и в контакте с неподвижной фазой.

В другом пути, к примеру, целевой олигонуклеотид может быть растворен в жидкости, которая является смешиваемой с подвижной фазой, например, которая является жидким компонентом первой жидкой подвижной фазы или содержит один или более жидких компонентов подвижной фазы, и введен в этой форме в поток первой подвижной фазы. Если первая жидкость подвижной фазы содержит воду, целевой олигонуклеотид может, например, быть введен таким образом в виде водного раствора. Соответственно целевой олигонуклеотид, как правило, в неочищенном состоянии в сочетании с загрязняющими примесями может быть смешан с содержащей воду первой подвижной фазой в виде водного раствора, например в водном аммиаке, с содержащей воду первой подвижной фазой. В некоторых синтезах олигонуклеотидов вырабатывается олигонуклеотид в растворе в смеси воды, растворенного аммиака и растворителей, таких как ацетонитрил и этанол, и в некоторых приложениях целевой олигонуклеотид может быть введен в колонку в виде такого раствора. В этом пути введения целевого олигонуклеотида жидкость, которая является смешиваемой с подвижной фазой, может стать смешанной с подвижной фазой во время ее протекания или может остаться, по существу, отдельной фазой и проталкиваться по колонке подвижной фазой.

В необязательном этапе перед введением первой подвижной фазы, содержащей растворенный целевой олигонуклеотид, в колонку можно вызвать протекание первой подвижной фазы, свободной от целевого олигонуклеотида, через колонку, наполненную неподвижной фазой. Такой начальный поток подвижной фазы может элюировать некоторое количество неподвижной фазы, что продолжается до достижения гидродинамического равновесия, и подвижная фаза, покидающая выходную сторону колонки, не содержит или содержит минимальное количество неподвижной фазы. Такое состояние может быть определено отбором образцов потока из выходной стороны колонки.

По желанию первая подвижная фаза, содержащая растворенный целевой олигонуклеотид, может быть введена в колонку в виде смеси с жидкостью неподвижной фазы. Введение подвижной фазы в виде такой смеси с жидкостью неподвижной фазы может способствовать обеспечению того, что подвижная фаза остается насыщенной неподвижной фазой и может предотвращать выдавливание неподвижной фазы из колонки подвижной фазой по мере того, как она протекает через колонку. Если это осуществлено, необходимое количество неподвижной фазы может быть определено экспериментально, и может быть необходимо, чтобы оно составляло несколько процентов.

Подходящие скорости потока для неподвижной и подвижной фазы могут определяться инструкцией для нормального режима для прибора для жидкость-жидкостной хроматографии, такого как Armen или Kromaton, например Kromaton FCPC200™. Введение первой подвижной фазы может иметь эффект при коротком времени вытеснения количества неподвижной фазы, которое может быть детектировано. Так как объем неподвижной фазы и объем колонки известны, возможно рассчитать Sf, коэффициент удержания неподвижной фазы, являющийся мерой доли неподвижной фазы, остающейся в колонке.

Поток подвижной фазы, содержащей целевой олигонуклеотид, через колонку, содержащую неподвижную фазу, содержащую вещество-обменник, вызывает то, что целевой олигонуклеотид, растворенный в первой подвижной фазе, становится связанным с веществом-обменником в неподвижной фазе. Способность целевого олигонуклеотида удерживаться в неподвижной фазе зависит, среди прочего, от времени, предоставленного для уравновешивания, и концентрации вещества-обменника в неподвижной фазе. Подходящие скорости потока, например подходящая скорость потока первой подвижной фазы, содержащей растворенный целевой олигонуклеотид, в колонке для достижения равновесия, при котором весь или подходящая доля целевого олигонуклеотида удерживается в неподвижной фазе, могут быть определены экспериментально на основании условий функционирования прибора. Подходящая скорость потока, по меньшей мере для Kromaton FCPC200™ и, возможно, в большинстве случаев, по-видимому, составляет 2-6 мл в минуту, но предполагается, что такие приборы могут работать быстрее. Различные скорости потока могут быть обоснованными для других приборов, особенно для крупномасштабных приборов. Подходящие условия могут быть определены экспериментально, например, наблюдением за концентрацией целевого олигонуклеотида и/или других веществ в потоке первой подвижной фазы, выходящей из прибора для ЦРХ. Подходящие технологии наблюдения будут очевидны для специалиста в данной области, например применение спектроскопии или ВЭЖХ и т.д.

Вторая жидкая подвижная фаза может иметь ту же композицию жидкостей, например один или более растворителей или смесь одного или более растворителей и воды в качестве первой подвижной фазы, например, как описано выше. Например, как описано выше в комбинации с неподвижной фазой, содержащей смесь преимущественно C1-8 алканола, такого как 1-бутанол, и C1-6 алкил C1-6 алканоатного сложного эфира, такого как этилацетат, вторая подвижная фаза может содержать смесь воды и C1-8 алканола, такого как 1-бутанол, которая при обеспечении образом, описанным выше, может также содержать минорную долю C1-6 алкил C1-6 алканоатного сложного эфира. Альтернативно, например, как описано выше в комбинации с неподвижной фазой, содержащей с преимущественно смесь C1-6 циклического эфира, такого как метилтетрагидрофуран, и C1-8 алканола, вторая подвижная фаза может содержать преимущественно смесь воды и C1-8 алканола.

Соответственно pH второй подвижной фазы может также быть доведен до подходящего значения для облегчения растворения и стабилизации целевого олигонуклеотида. Подходящий pH зависит, среди прочего, от олигонуклеотида и может зависеть от того, защищен ли он. Подходящий диапазон pH для вышеупомянутого 20-мерного олигонуклеотида в диметокситритил-защищенной форме или в незащищенной форме составляет приблизительно pH 7-12. Подходящий диапазон pH для этого олигонуклеотида в диметокситритил-защищенной форме составляет, например, pH 10-12, подходящим является pH около 11. Такие диапазоны pH, например pH 7-14, могут являться подходящими для других олигонуклеотидов, и считается, что для некоторых приложений могут быть допустимы кислотные pH <7. Корректировка pH, например, может быть осуществлена добавлением основания, такого как гидроксид натрия. Подходящая концентрация для такого основания во второй подвижной фазе для достижения такого pH составляет 10±5 мМ, например 10 мМ гидроксида натрия.

Подходящие вещества-вытеснители представляют собой вещества, которые имеют большую константу связывания, например способность образовывать электростатическую связь, с веществом-обменником, чем целевой олигонуклеотид. Подходящие вещества-вытеснители содержат анионную группу, которая может иметь одиночный или множественный заряд. Подходящие вещества-вытеснители содержат соли, в частности соли неорганических кислот, такие как галогениды, сульфаты и т.д. или оксалаты, с металлами, в особенности с щелочными металлами. Подходящим веществом-вытеснителем является йодид натрия или калия. Другие подходящие вещества-вытеснители содержат сахарин в его депротонированной форме, такой как соли щелочных металлов и сахарина, такие как натриевая соль сахарина, желтый солнечного заката (динатрий-6-гидрокси-5-[(4-сульфофенил)азо]-2-нафталинсульфонат) и амарант (тринатрий-(4E)-3-оксо-4-[(4-сульфонато-1-нафтил)гидразоно]нафталин-2,7-дисульфонат). Следует иметь в виду, что последние два содержат двух- и трехосновные анионные группы.

Расчет может быть осуществлен на основе молярных соотношений вещество-обменник:вещество-вытеснитель, которые предпочтительно лежат в диапазоне от 1:1 до 5:1. Исходя из этого максимальная концентрация для вещества-вытеснителя, как оказывается, составляет приблизительно 500 мМ. Подходящая концентрация для вещества-вытеснителя во второй подвижной фазе, как оказывается, составляет 2-500 мМ, например 5-30 мМ.

Подходящая скорость потока второй подвижной фазы, содержащей вещество-вытеснитель для достижения вытеснения целевого олигонуклеотида из неподвижной фазы со скоростью, такой что целевой олигонуклеотид оказывается в удобном виде как дискретная фракция в потоке второй подвижной фазы, выходящей из прибора для ЦРХ, может быть определена экспериментально. Подходящая скорость потока, по меньшей мере для Kromaton FCPC200™, как было обнаружено в экспериментах, описанных в данном документе, составляла 2-6 мл в минуту, при которой, как оказывается, возможно достигнуть полное вытеснение целевого олигонуклеотида, но полагается, что можно осуществить более быстрое функционирование такого прибора, например, вплоть до 20 мл в минуту в 200 мл колонке. Подходящие условия для достижения такого вытеснения могут быть определены экспериментально, например, контролем концентрации целевого олигонуклеотида в потоке второй подвижной фазы, покидающей прибор для ЦРХ. Подходящие технологии контроля будут очевидны специалисту в данной области, например применение спектроскопии или ВЭЖХ и т.д.

Целевой олигонуклеотид может затем быть выделен из второй подвижной фазы обычно применяемым процессом, по желанию содержащим удаление любой защитной группы или групп, следовых количеств вещества-обменника и/или вытеснителя и т.д., если необходимо. Типичные технологии выделения содержат снятие защиты (если олигонуклеотид является защищенным), обессоливание (ультрафильтрация) и лиофилизацию. Выделенный целевой олигонуклеотид может быть подвержен любым дополнительным этапам очистки, например ионообменной хроматографии, которую могут посчитать необходимой.

Данное изобретение далее будет описано только посредством примеров со ссылкой на следующие чертежи.

Фиг. 1 демонстрирует УФ-хроматограмму второй подвижной фазы, выходящей из колонки в эксперименте 8.

Фиг. 2 демонстрирует реконструкцию хроматограммы после фракционного анализа в эксперименте 8.

Фиг. 3 демонстрирует реконструкцию хроматограммы после фракционного анализа в эксперименте 21.

Фиг. 4 демонстрирует УФ-хроматограмму второй подвижной фазы, выходящей из колонки в эксперименте 4.

Фиг. 5 демонстрирует реконструкцию хроматограммы после фракционного анализа в эксперименте 18.

Выполняли ряд экспериментов, как приведено в таблице далее. Два эксперимента, представленные в таблице как эксперименты 8 и 21, подробно описаны далее.

Эксперимент 8

Жидкие фазы готовили в соответствии со следующей методикой. Этилацетат, 1-бутанол и воду смешивали в объемных соотношениях 3:2:5. Двухфазную систему оставляли отстаиваться до получения двух раздельных фаз, затем эти фазы разделяли.

К слою верхней фазы (этилацетат/бутанол с минорным содержанием воды) добавляли Aliquat 336™ (вещество-обменник) до получения концентрации 40 мМ и емкость помечали как "неподвижная фаза", т.е. вторая жидкая фаза.

Нижнюю фазу (вода/бутанол с минорным содержанием этилацетата) разделяли на две одинаковые части. К первой части добавляли гидроксид натрия до получения концентрации 10 мМ и емкость помечали как "первая подвижная фаза", т.е. первая жидкая фаза.

Ко второй части нижней фазы добавляли гидроксид натрия до получения концентрации 10 мМ и йодид калия (вещество-вытеснитель) до достижения концентрации 13,3 мМ и емкость помечали "вторая подвижная фаза", т.е. третья жидкая фаза.

Применяемый прибор для Центробежной распределительной хроматографии (ЦРХ) является коммерчески доступным 200 мл инструментом для ЦРХ от Armen instrument. Как правило, такой прибор содержит ротор, изготовленный из приблизительно 20 циркулярных распределительных дисков. Как правило, такой прибор может быть отрегулирован на 200-2000 об/мин, генерируя центробежную силу приблизительно 120g при 1000 об/мин и 480g при 2000 об/мин). Прибор Kromaton FCPC200 устанавливали в нисходящий режим. Колонка вращалась при 1200 об/мин. Колонку наполняли раствором из емкости с "неподвижной фазой" (вторая жидкая фаза плюс Aliquat 336™) при скорости потока 10 мл/мин в соответствии с условиями функционирования по инструкции для прибора. Как правило, коммерчески доступные 4-канальные бинарные градиентные насосы высокого давления Dionex P580HPG (Sunnyvale, CA, USA) могут быть использованы для введения неподвижной и подвижной фазы в прибор, как правило, посредством инжекционных клапанов низкого давления (таких как Upchurch, CIL, Cluxeau, Saint-Foy-La-Grande, FR), как правило, оборудованных 21 мл пробоотборной петлей.

Образец защищенного целевого олигонуклеотида, являющегося 20-мерным РНК олигонуклеотидом 5'-uca agg aag aug gca uuu ca-3', о котором известно, что он загрязнен примесями, возможно, включая 17-, 18-, 19- и/или 21-мерные примеси (400 мг), растворяли в первой подвижной фазе (10 мл). После растворения к этому раствору олигонуклеотида в подвижной фазе добавляли 10 мл жидкой неподвижной фазы (но не содержащей вещество-обменник) для образования двухфазной смеси.

Смесь раствора целевого олигонуклеотида, растворенного в первой подвижной фазе, и жидкой неподвижной фазы вводили в колонку и эту смесь прокачивали через колонку со скоростью потока 5 мл/мин в течение 20 мин. В это время было достигнуто уравновешивание, т.е. неподвижная фаза больше не выдавливалась из колонки протекающей подвижной фазой, и целевой олигонуклеотид не выходил из колонки, как это определено анализом элюента, выходящего из колонки, с использованием ВЭЖХ.

Затем вторую подвижную фазу (третья жидкая фаза) прокачивали с подобной скоростью потока в течение 100 мин. Фракции выходящей второй подвижной фазы собирали каждую минуту и анализировали автономно.

Что касается Фиг. 1, это соответствует введению первой и второй подвижной фазы в колонку, начиная с времени = ноль. Во время первых приблизительно 17 минут маленькое количество неподвижной фазы было вытеснено из колонки. В приблизительно 20 минут было достигнуто равновесие и очень маленькое количество неподвижной фазы было вытеснено протекающей первой подвижной фазой. Вторую подвижную жидкую фазу, содержащую вещество-вытеснитель, вводили после 20 минут. Согласно этому пик представляет элюцию вещества, вытесненного второй подвижной фазой из неподвижной фазы. Анализ фракции из этого пика указывал на то, что примеси, представленные во введенном олигонуклеотиде, накапливались в начале и конце этого пика. Фиг. 2 демонстрирует реконструкцию хроматограммы после фракционного анализа в эксперименте 8.

Эксперимент 21

Систему растворителей составляли из Me-ТГФ/н-BuOH/Вода в объемных соотношениях 3:1:4 соответственно. Эти три жидкости смешивали и позволяли отстаиваться с образованием двух фаз, которые разделяли.

К верхней органической фазе добавляли Aliquat 336 (вещество-обменник) до получения концентрации 40 мМ и эту органическую фазу обозначали для применения в качестве неподвижной фазы.

Нижнюю водную фазу разделяли на две части. К одной части добавляли гидроксид натрия до получения концентрации 10 мМ и эту часть обозначали как первую подвижную фазу. Ко второй части нижней фазы добавляли гидроксид натрия до получения концентрации 10 мМ и амарант (вещество-вытеснитель) до получения концентрации 4,4 мМ. Эту часть обозначали вторая подвижная фаза.

Необработанный образец олигонуклеотида (400 мг, содержащий приблизительно 88% целевого олигонуклеотида в 35 мл водного аммиака) комбинировали с 5 мл части верхней фазы системы растворителей, обозначенной как неподвижная фаза (не содержащая вещество-обменник).

Колонку вращали при 1200 об/мин и заполняли с неподвижной фазой в нисходящем режиме. Затем образец, приготовленный ранее, загружали в колонку с прокачиванием подвижной фазы 1 при 5 мл/мин. Первую подвижную фазу прокачивали 10 минут с последующим прокачиванием также второй подвижной фазы со скоростью 5 мл/мин в течение 120 мин. Фракции собирали каждую минуту.

Фиг. 3 демонстрирует пики ВЭЖХ элюата из эксперимента 21, при этом "N DMT-off" указан в качестве целевого нуклеотида без его защитной группы DMT, "N+1" и "N-1" в качестве целевого нуклеотида ± одно основание также без защитной группы DMT и imp 1-10 в качестве следовых количеств, соответствующих соответственно десяти примесям. Видно, что элюция примесей imp 1-10 и N-1 происходит практически совместно и является почти завершенной перед тем, как очищенный целевой олигонуклеотид элюируется второй подвижной фазой, и во время промежутка времени от приблизительно 81 до 95 минут после введения второй подвижной фазы элюируется >95% чистый целевой олигонуклеотид. Примесь N+1 элюируется преимущественно в конце целевого пика.

Дополнительные эксперименты.

Подробности экспериментов 1-31 представлены в табличной форме далее. Эксперимент 1 являлся контролем, в котором не использовалось вещество-обменник или вещество-удерживатель. В эксперименте 12 предполагается, что неподвижная фаза не удерживалась из-за того, что двухкомпонентная система 2-бутанол - вода не формировала две фазы с различием в плотности таким, что они легко образовывали две отдельные фазы с маленькой склонностью к эмульгированию.

Колонка "тип олиго" P=O относится к фосфодиэфирным формам олигонуклеотида и P=S относится к фосфотиоатным формам олигонуклеотида. Al336 обозначает Aliquat 336 и BACl обозначает хлорид бензалкония. В представлении данных таких экспериментов была установлена целевая чистота и рассчитывалось количество целевого материала, извлеченного с такой чистотой. Isotachic train относится к времени в минутах, в течение которого целевой олигонуклеотид элюируется второй подвижной фазой с установленной чистотой. "MIBK" является аббревиатурой для метилизобутилкетона. "MtBE" является аббревиатурой для метилтрет-бутилового эфира. "MeTHF" является аббревиатурой для 2-метилтетрагидрофурана.

Фиг. 4 демонстрирует УФ-хроматограмму второй подвижной фазы, выходящей из колонки в эксперименте 3, и фиг. 5 демонстрирует реконструкцию хроматограммы после фракционного анализа в эксперименте 18. В каждой из таких конфигураций, представляющих целевой олигонуклеотид, показано, что в течение существенных периодов протекания второй подвижной фазы элюируется в значительной степени очищенный целевой олигонуклеотид и он может быть выделен из второй подвижной фазы с использованием обычно применяемых технологий.

Номер эксп. Тип олиго Чистота % целевого олиго по площади пика в ВЭЖХ в необработанном материале Число оснований Загрузка (мг) Объем загрузки (мл) Прибор Колонка Система растворителей Удерживатель Вытеснитель Основание Скорость потока подвижной фазы (мл/мин) Скорость вращения Isotachic train (мин) 1Выделенный целевой материал
Название Конц. (мМ) Название Конц. (мМ) Название Конц. (мМ) Длительность Чистота отобранных фракций Выход с установленной чистотой
1 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 100 13,7 FCPC200 Me·ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 0 Сахарин 0 NaOH 10 5 1200 Нет разделения
2 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 200 10 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 20 KI 20 - 5 1200 5 >94% 0%
3 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 40 KI 20 - 5 1200 9 >94% 0%
4 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 40 KI 20 NaOH 10 5 1200 9 >94% 34%
5 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 40 KI 13,3 NaOH 10 5 1200 13 >94% 59%
6 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 40 KI 10 NaOH 10 5 1200 9 Не определено
7 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 24 KI 8 NaOH 10 5 1200 36 Не определено
8 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 40 KI 13,3 NaOH 10 5 1200 13 >94% 70%
9 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 20 KI 6,7 NaOH 10 5 1200 30 Не определено
10 Защищенная
2'OMe-РНК
89% 20 400 20 Armen CPC EtOAc:n-BuOH: вода Al336 20 KI 6,7 NaOH 10 5 1200 30 Не определено
11 Защищенная
2'OMe-РНК
88% 20 400 40 FCPC200 1-пентанол/вода Al336 40 KI 13,3 NaOH 10 5 1200 20 >94% 43%
12 Защищенная
2'OMe-РНК
88% 20 400 40 FCPC200 2-бутанол/вода Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 Нет удерживания неподвижной фазы
13 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 1-BuOH/ MIBK/вода 1:3:4 Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 20 >94% 52%
14 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 Me·ТГФ:n-BuOH:вода 3:1:4 Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 17 >94% 74%
15 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 MIBK/вода Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 17 >93% 30%
16 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 1-пентанол MtBE/вода 1:3:4 Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 23 >92% 49%
17 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 1-бутанол/вода Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 18 >92% 43%
18 Защищенная
ДНК
Р=О
81% 20 прибл.
400
10 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 40 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 10 >94% 68%
19 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 40 Сахарин 13,3 NaOH 20 5 1200 18 >94% 88%
20 Незащищенная
РНК
P=S
89% 20 прибл.
400
10 FCPC200 EtOAc: n-BuOH: вода 3:2:5 Al336 40 KI 13,3 - - 5 1200 10 >93% 60%
21 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 40 Амарант 4,4 NaOH 10 5 1200 17 >94% 88%
22 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 СТАВ 40 Сахарин 13,3 NaOH 10 5 1200 8 >93% 54%
23 Защищенная
ДНК
92% 10 200 32 FCPC200 EtOAc: n-BuOH: вода Al336 20 NaI 3,3 NaOH 10 5 1200 20 >94% 86%
24 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 400 40 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 BACl 40 Желтый солнечного заката 13,3 NaOH 10 5 1200 15 >94% 28%
25 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 100 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 8 Сахарин 4 NaOH 10 5 1500 13 >94% 76%
26 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 1000 100 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 50 Сахарин 25 NaOH 20 5 1500 22 >94% 84%
27 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 550 30 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 29 Сахарин 13,3 NaOH 20 3,5 1200 30 >94% 72%
28 Защищенная
2'OMe-РНК
P=S
88% 20 550 30 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 29 Сахарин 13,3 NaOH 20 3,5 1200 30 >94% 71%
29 Защищенная
ЗНК гэмпер
Р=О
39% 15 100 34 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода 3:1:4 Al336 10,4 Амарант 13,3 NaOH 10 5 1200 9 >80% 90%
30 Защищенная
ДНК
63% 30 100 25 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода Al336 13 Амарант 13,3 NaOH 10 5 1200 13 >90% 68%
31 Защищенная
siРНК
84% 20 100 25 FCPC200 Ме-ТГФ: n-BuOH: вода Al336 15 NaI 13,3 NaOH 10 5 1200 19 >90% 72%

1. Способ выделения целевого олигонуклеотида из смеси целевого олигонуклеотида и одной или более примесей, содержащий:
предоставление двухфазной жидкость-жидкостной хроматографической системы подвижная фаза - неподвижная фаза, содержащей первую жидкую подвижную фазу и жидкую неподвижную фазу,
где жидкая неподвижная фаза содержит по меньшей мере одно вещество-обменник, которое устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом;
вызывание переноса первой жидкой подвижной фазой целевого олигонуклеотида в потоке относительно и в контакте с жидкой неподвижной фазой в колонке прибора для жидкость-жидкостной хроматографии, так что целевой олигонуклеотид становится связанным с веществом-обменником в жидкой неподвижной фазе;
затем вытеснение целевого олигонуклеотида из жидкой неподвижной фазы во вторую жидкую подвижную фазу, протекающую относительно и в контакте с неподвижной фазой через колонку, посредством вещества-вытеснителя, способного к вытеснению целевого олигонуклеотида из жидкой неподвижной фазы во вторую подвижную фазу,
где соответствующие первая и вторая жидкие подвижные фазы и жидкая неподвижная фаза соответственно содержат соответствующие равновесные фазы, образованные смешиванием любых из: (a) C1-6 алкил C1-6 алканоатный сложный эфир, C1-8 алканол и вода; (b) С4-8 алканол и вода; (с) C1-8 алканол, ди-(С1-8алкил)кетон и вода; (d) ди-(С1-8алкил)кетон и вода; (е) ди-С1-6алкил простой эфир или С4-10 циклический простой эфир -C1-8 алканол и вода;
где жидкие подвижные фазы имеют pH 7-14;
где вещество-обменник является солью органического вторичного, третичного или четвертичного амина с противоанионом общей формулы
R1R2R3R4N+X-,
где во вторичной, третичной и четвертичной последовательности соответственно две, три или четыре из групп R1, R2, R3 и R4 представляют собой независимо С1-20 алкил или замещенный алкил, такой как фторо- или трифторметилзамещенный алкил, или бензил, и остальные являются водородом, и X- представляет собой галогенид-анион,
где вещество-вытеснитель выбирают из солей неорганических кислот с металлами, в особенности с щелочными металлами, солей щелочных металлов и сахарина, динатрий-6-гидрокси-5-[(4-сульфофенил)азо]-2-нафталинсульфоната и тринатрий-(4Е)-3-оксо-4-[(4-сульфонато-1-нафтил)гидразоно]нафталин-2,7-дисульфоната.

2. Способ по п. 1, содержащий этапы:
(1) предоставление первой жидкой фазы, содержащей целевой олигонуклеотид и одну или более примесей в растворе, и второй жидкой фазы, содержащей вещество-обменник, при этом первая и вторая жидкие фазы образуют две отдельные фазы при контакте друг с другом;
(2) введение второй жидкой фазы в прибор для центробежной распределительной хроматографии в качестве неподвижной жидкой фазы;
(3) введение первой жидкой фазы, содержащей целевой олигонуклеотид и одну или более примесей, в растворе в прибор для центробежной распределительной хроматографии в качестве первой подвижной фазы и вызывание протекания этой первой жидкой фазы через прибор для центробежной распределительной хроматографии в контакте со второй жидкой неподвижной фазой, так что целевой олигонуклеотид становится устраняемо связанным с веществом-обменником во второй жидкой неподвижной фазе;
(4) введение третьей жидкой фазы, которая образует отдельную фазу при контакте со второй жидкой фазой и которая содержит в растворе по меньшей мере одно вещество-вытеснитель, в прибор для центробежной распределительной хроматографии в качестве второй подвижной фазы и вызывание протекания этой второй подвижной фазы через прибор для центробежной распределительной хроматографии в контакте со второй жидкой фазой, так что целевой олигонуклеотид становится вытесненным из неподвижной фазы и поступает в раствор во второй подвижной фазе;
(5) выделение вытесненного целевого олигонуклеотида из второй подвижной фазы.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором целевой олигонуклеотид содержит 10-30 оснований.

4. Способ по п. 3, в котором целевой олигонуклеотид является 20-основным олигонуклеотидом, который имеет последовательность 5′-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCA-3′.

5. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4, в котором целевой олигонуклеотид отделяется от одной или более примесей, которые также являются олигонуклеотидом.

6. Способ по п. 1, в котором в (a) C1-6 алкил C1-6 алканоатный сложный эфир является этилацетатом и C1-8 алканол является 1-бутанолом.

7. Способ по п. 1, в котором в (b) С1-8 алканол является 1-пентанолом или 1-бутанолом.

8. Способ по п. 1, в котором в (с) C1-8 алканол является 1-бутанолом и ди-(C1-8 алкил)кетон является метилизобутилкетоном.

9. Способ по п. 1, в котором в (d) ди-(C1-8 алкил)кетон является метилизобутилкетоном.

10. Способ по п. 1, в котором в (d) C1-6 алкил C1-6 алкиловый эфир и С4-10 циклический эфир выбраны из метил-трет-бутилового эфира и 2-метилтетрагидрофурана и C1-8 алканол выбран из 1-пентанола и 1-бутанола.

11. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 или 10, в котором концентрация целевого олигонуклеотида в колонке составляет 200 мг-80 г на л.

12. Способ по любому из пп.1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 или 10, в котором вещество-обменник выбрано из смеси хлорида три-(н-октил)метиламмония и хлорида три-(н-децил)метиламмония, бромида цетилтриметиламмония, хлорида метилтриоктиламмония, хлорида бензалкония (также известного как хлорид алкилдиметилбензиламмония и ADBAC, являющегося смесью хлоридов алкилбензилдиметиламмония различных длин алкильной цепи), хлорида бензилтриметиламмония, хлорида тетрабутиламмония и Амберлита LA2 (высокомолекулярный, жирорастворимый вторичный амин, поставляемый в виде жидкости в основной форме) в протонированной форме.

13. Способ по п. 12, в котором вещество-обменник выбрано из смеси хлорида три-(н-октил)метиламмония и хлорида три-(н-децил)метиламмония и хлорида бензалкония.

14. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16 или 17, в котором концентрация вещества-обменника в неподвижной фазе составляет 5-500 мМ.

15. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16 или 17, в котором вторая жидкая подвижная фаза имеет такую же композицию жидкостей, как первая подвижная фаза.

16. Способ по п. 15, в котором неподвижная фаза содержит преимущественно смесь C1-8 алканола и С1-6 алкил C1-6 алканоатного сложного эфира и вторая подвижная фаза содержит смесь воды и С1-8 алканола.

17. Способ по п. 15, в котором неподвижная фаза содержит преимущественно смесь C1-6 циклического эфира и C1-8 алканола и вторая подвижная фаза содержит преимущественно смесь воды и С1-8 алканола.

18. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16 или 17, в котором вещество-вытеснитель выбрано из йодида натрия или калия.

19. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16 или 17, в котором концентрация вещества-вытеснителя во второй подвижной фазе составляет 5-30 мМ.

20. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16 или 17, в котором целевой олигонуклеотид затем выделяется из второй подвижной фазы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен способ молекулярно-генетического внутривидового типирования Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения по меньшей мере одного варианта протеазы с улучшенной моющей эффективностью в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей pH между 5 и 12,0, в сравнении с исходной протеазой.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ специфического выделения полного ДНК-содержимого бактериальных возбудителей инфекции.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для хранения препаратов ДНК в жидком виде. Получают композицию, содержащую буферный раствор, включающий 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и воду - остальное.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения ДНК.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и иммунологии. Предложены способы получения библиотек последовательностей ДНК, кодирующих гомологичные полипептиды, и к применению таких библиотек для идентификации естественно диверсифицированных полипептидных вариантов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным вакцинам против Candida albicans, и может быть использовано в медицине. Вакцина для лечения или предупреждения кандидозной инфекции содержит выделенный полипептид с SEQ ID NO: 2 в эффективном количестве, который может быть слит с партнером слияния.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pET40CmAP/CGL, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/CGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (СmАР) и галактозоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus (CGL).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым гетеромультимерным белкам, полученным из модифицированного убиквитина, и может быть использовано в медицине для лечения или диагностики заболеваний, ассоциированных с гиперпродукцией экстрадомена В фибронектина (ED-B).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины. Предложен способ выделения микроРНК из биологических жидкостей. Способ включает обработку образца биологической жидкости равным объемом денатурирующего буферного раствора, содержащего 0.3÷1.35 М гуанидин изотиоцианат, 1% 2-меркаптоэтанол, осаждение нецелевых биополимеров добавлением равного объема буферного раствора, содержащего 0.8 М натрия ацетат, рН 4.0-6.0 и 0.5-2.5% октановую кислоту и центрифугированием. К полученному супернатанту добавляют равный объема 96% этанола, отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют сначала буферным раствором, содержащим 0.5 М гуанидин изотиоцианат, 10 мМ Трис-ацетат рН 6.5, 50% этанол, 1% 2-меркаптоэтанол, затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl рН 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол. Изобретение обеспечивает повышение выхода микроРНК. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике. Способ предусматривает картирование положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК. Способ включает выделение высокоочищенной геномной ДНК, которую гидролизуют в реакционном буфере метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой GlaI в течение времени и при температуре, достаточных для полного гидролиза продукта с получением смеси фрагментов геномной ДНК. Выделяют указанную смесь фрагментов ДНК из раствора осаждением, а для дальнейшего анализа отбирают GlaI-фрагменты ДНК размером 150-500 п.н., наиболее оптимально подходящие для NGS-секвенирования. Определяют нуклеотидный состав концов образовавшихся коротких GlaI фрагментов геномной ДНК методами NGS-секвенирования, программно фильтруют полученные данные для исключения фрагментов с низким качеством чтения, с концами, неспецифичными для GlaI-фрагментов, и по признаку присутствия динуклеотида GPy на 5′-концах последовательностей и определяют положения в референсном геноме нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy отфильтрованных GlaI-фрагментов с использованием любого программного обеспечения класса «геномный ассемблер». Применение данного способа позволяет упростить, повысить надежность и достоверность способа определения позиций (картирования) большого числа метилированных сайтов PuCGPy в геноме. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.
Наверх