Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов



Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов
Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов

 


Владельцы патента RU 2575797:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов, представляющая собой экстракт из кабачков и мышц щуки. Указанный экстракт получают экстрагированием измельченных гомогенизатором тканей кабачков и мышц щуки раствором Хэнкса в соотношении 1:3 при температуре 1-2°С в течение 24 ч, центрифугированием и сбором супернатантов. Осуществляют замораживание супернатантов при температуре -20°С в течение 5-7 суток, оттаивание при температуре 4-20°С, очистку. Смешивают полученные экстракты растительного и животного происхождения в соотношении 1:1 и стерилизуют фильтрацией. Полученный экстракт характеризуется следующими показателями: оптической плотностью 0,081±0,004 ед. опт. пл., рН 7,26±0,04, содержанием общего белка 9,1±0,04 г/л, свободного гемоглобина 0 г/л, общих липидов 0,15±0,07 г/л, общего холестерина 0,02±0,01 ммоль/л. Изобретение обеспечивает повышение роста клеток животных и репродукции на них вирусов. 6 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования линий клеток животных тканей и репродукции на них вирусов.

Из практики культивирования клеток известно, что для этой цели используют сыворотку крови разных видов животных (крупного рогатого скота, лошадей, кроликов, свиней, кур и др.). Известно, что сыворотка крови плодов коров и сыворотка молодых животных обладает более высокой ростостимулирующей активностью, чем сыворотка взрослых животных (Дьяконов Л.П., 2009 // Животная клетка в культуре / Методы применения в биотехнологии. - Изд-во «Спутник», М, 2009. - 656 с. ), но чаще всего клетки выращиваются на среде с сывороткой крови взрослого крупного рогатого скота. Оптимальная концентрация сыворотки в культуральной питательной среде составляет 10% (Голубев Д.Б. и др., 1976 // Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976 с. 222).

Кроме сывороток крови в состав культуральных питательных сред включают гидролизаты как растительного, так и животного происхождения: ферментативные гидролизаты белков гороха и сои (Гизитдинов Н.Н. и др. // Разработка паточного способа изготовления сухих белковых гидролизатов гороха и сои / Н.Н. Гизитдинов, Ю.Х. Бахтахунов, М.Т. Велямов / Вестник с/х. науки Казахстана. - №1. - 1984. - С. 62-64.; Патент 2103360 РФ, МКИ6 C12N 5/09, 1998, Бюл. №3; Онищенко Г.Г. и др., 2007); предложено значительное число белковых гидролизатов животного происхождения (казеина, молока, цельной крови, сыворотки крови, эмбрионов, внутренних органов, мышечной ткани), а также пептон Витте, бактопептон. Наибольшее распространение в практике культур клеток получила среда с гидролизатом лактальбумина - ГЛА (Melnik J., Riordan J., 1952).

Из всех аналогов, применяемых в качестве биодобавок в культуральные среды при выращивании клеток животных и репродукции на них вирусов, в качестве прототипа мы использовали сыворотку крови плодов коров, так как она оказывает минимальное негативное воздействие, как на рост клеток, так и на накопление в них вирусной массы (Патент RU №2455015 С1, 2012). Но данная биодобавка имеет ряд недостатков:

1. По некоторым оценкам, 55% общей стоимости работ на культурах клеток приходится на сывороточный компонент, хотя он составляет всего 10% от общего объема питательной среды.

2. В связи с резким снижением поголовья КРС возникли большой дефицит в данной сыворотке крови и дороговизна. Поиск замены сыворотки крови животных в культуральной среде более дешевыми биологически активными веществами является перспективным направлением.

Цель предлагаемого изобретения - возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующего фактора в питательные среды биодобавки, состоящей из экстрактов кабачков и мышц щуки. Основополагающей позитивной стороной использования данного комбинированного экстракта, является то обстоятельство, что он заведомо не может содержать антител и вирусов против инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, а также содержит в себе биологически активные вещества как животного, так и растительного происхождения.

Химический состав полученного продукта характеризуется следующими показателями (табл. 1) www.mosbiotehworld.ru.

Схема получения фито-зооэкстратов из кабачков и мышц щуки:

1. Мацерация тканей гомогенизатором;

2. Экстрагирование измельченных тканей раствором Хэнкса в соотношении 1:3 в полиэтиленовые канистры при температуре +1-2ºC в течение 24 часов;

3. Центрифугирование и сбор супернатантов;

4. Замораживание экстрактов при температуре -20ºC в течение 5-7 суток;

5. Оттаивание экстрактов при температуре +4-20ºC;

6. Предварительная очистка экстрактов через марлю, а затем глубинный фильтр EKS;

7. Смешивание экстрактов растительного и животного происхождения в соотношении 1:1;

8. Стерилизующая фильтрация комбинированного экстракта мембранными фильтрами фирм «Millipore», «Владисарт»;

9. Контроль профильтрованных экстрактов на возможное присутствие в них контаминантов путем посева их на бактериологические среды: МПА, МПБ, Китт-Тароцци, ТПС-агар, ТПС-бульон, Сабуро, Чапека.

Пример 1. Изучение состава сыворотки крови плодов коров и комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки (ЭК+ЭМЩ).

Для опытов было приготовлено по 3 серии сыворотки крови плодов коров и комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки, результаты приведены в табл. 2.

Из таблицы 1 следует, что сыворотка крови плодов коров по физико-химическим показателям соответствует требованиям, предъявляемым к ним Минздравом РФ. Что касается фито-зооэкстракта, то он имеет сравнительно низкие оптическую плотность, концентрации общего белка, общих липидов, в том числе холестерина, а свободный гемоглобин в нем отсутствует. Несмотря на низкое содержание общего белка в экстракте, как показано в дальнейших исследованиях, он является хорошей биодобавкой в питательные среды при культивировании клеток и репродукции на них вирусов, так как лишь небольшая часть биологически активных веществ используется клетками.

Пример 2. Рост культур клеток LEK, MDBK, РК-15, Vero на среде Игла MEM с 10% сыворотки крови плодов коров и фито-зооэкстрактом при посевной концентрации 40 тыс кл/мл.

В качестве контроля в опытах использовали сыворотку крови плодов коров. Монослой маточной культуры снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), далее получали клеточную суспензию и в концентрации 40 тысяч кл/мл рассевали по 2 см3 во флаконы емкостью 10 см3 с посевной площадью 3 см3.

Пролиферативная активность культур клеток MDBK, LEK, РК-15 и Vero исследовалась после 72-часовой инкубации в средах с фито-зооэкстрактом, а также с сывороткой крови плодов коров. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), наливая в каждый флакон по 3 см3, и подсчитывали в камере Горяева. Для дифференциации живых и мертвых клеток использовали 1%-ный раствор метиленового синего. Количество живых клеток подсчитывали в 4-х камерах. Определяли среднее значение и рассчитывали концентрацию клеток в 1 мл по формуле:

где 1000 - количество кубических миллиметров в 1 см3;

а - количество клеток в камере;

н - разведение клеточной суспензии;

0,9 - объем камеры Горяева в мм3.

С сывороткой крови плодов коров и комбинированным экстрактом из кабачков и мышц щуки было проведено по 5 серий опытов. Индекс пролиферации клеток, как показатель ростстимулирующей активности, рассчитывали общепринятым методом по Антонову Б.И. (1986).

Более детально ростстимулирующую активность биодобавок на перечисленных выше перевиваемых культурах клеток приведена в табл. 3.

Из таблицы 2 следует, при культивировании перевиваемых клеток LEK, MDBK, РК-15, Vero, что лучшую пролиферацию их обеспечивает сыворотка крови плодов коров как контрольная (ИП 6,06-7,02), хотя комбинированная биодобавка из экстрактов кабачков и мышц щуки обеспечивает рост клеток почти на том же уровне (ИП 5,65-6,85).

Пример 3. Рост культур клеток РК-15 и Vero при плотности посева 20 тыс кл/см2 на среде Игла MEM с 10% сыворотки крови плодов коров и фито-зооэкстрактом. Результаты исследований отражены в табл. 4.

Из таблицы 3 видно, что комбинированный экстракт из кабачков и мышц щуки хорошо стимулирует рост клеток РК-15 и Vero даже при сравнительно низкой плотности их посева (20 тыс. кл/см2).

Пример 4. Изучение репродукции вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3) на перевиваемых культурах клеток MDBK, LEK, соответственно.

В ходе эксперимента было проведено 5 последовательных пассажей каждого вируса. Результаты исследований приведены в табл. 5.

Из таблицы 4 следует, что репродукция вируса инфекционного ринотрахеита в культуре клеток MDBK выше, когда в ростовой среде находилась сыворотка крови плодов коров (титр = 7,1º0,2 lg ТЦД50/см3), но на 0,5 lg ТЦД50/мл меньше в случае использования комбинированной биодобавки из кабачков и мышц щуки (6,6º0,2 lg ТЦД50/см3). Титр вируса парагриппа-3 в культуре клеток LEK, выращенной на среде с фито-зооэкстрактом, был незначительно ниже (6,4º0,3 lg ТЦД50/см3), по сравнению с тем, когда в ростовой среде находилась сыворотка крови плодов коров (6,8º0,3 lg ТЦД50/см3).

Пример 5. Изучение репродукции реовируса тип I штамм «Lang» на перевиваемой культуре клеток Vero. Результаты исследований отражены в табл. 6.

Как видно из таблицы 5, репродукция реовируса на культуре клеток Vero, с добавлением в культуральную среду комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки совпадала по значению, когда клетки культивировались в среде с сывороткой крови плодов коров (1:64 в РГА, 1 n ). Полученные результаты свидетельствуют о беспрепятственном накоплении массы реовируса в культуре клеток Vero, выращиваемой на среде Игла MEM с 10% фито-зооэкстракта.

Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов, представляющая собой экстракт из кабачков и мышц щуки, полученный путем экстрагирования измельченных гомогенизатором тканей кабачков и мышц щуки раствором Хэнкса в соотношении 1:3 при температуре 1-2°C в течение 24 ч, центрифугирования и сбора, полученных супернатантов, замораживания при температуре -20°C в течение 5-7 суток, оттаивания при температуре 4-20°C, очистки, смешивания экстрактов растительного и животного происхождения в соотношении 1:1, стерилизующей фильтрации полученного экстракта, характеризующегося следующими показателями: оптической плотностью 0,081±0,004 ед. опт. пл., pH 7,26±0,04, содержанием общего белка 9,1±0,04 г/л, свободного гемоглобина 0 г/л, общих липидов 0,15±0,07 г/л, общего холестерина 0,02±0,01 ммоль/л.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Представленный штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейства Asfarviridae, род Asfivirus, адаптирован к перевиваемой культуре клеток COS-1 и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, санитарии и предназначено для дезодорации помещений. Дезодорирующее средство для помещений содержит концентрат селекционированных высокоспецифичных бактериофагов видов Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa.

Группа изобретений относится к способу определения штамма бактериофага, вариантам штамма бактериофага и их применению. Способ предусматривает получение коллекции штаммов бактериофагов, культивирование штамма Salmonella spp на стерильной культуральной среде, нанесение образцов культур на планшет, добавление суспензии испытываемого штамма бактериофага в концентрации 6,5 х 109 БОЕ при соотношении бактериальной суспензии к суспензии с фагом 1:1, 1:1,5 или 1:3 и инкубирование при 37°C в течение 4 ч.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены применение живого метапневмовируса птиц (AMPV) и фармацевтической композиции, содержащей цитотоксическое количество такого вируса, в терапии злокачественных опухолей, а также способ терапии злокачественных опухолей с использованием указанной фармацевтической композиции.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP).

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложены способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса и применение этого способа в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген.

Изобретение относится к микробиологии и касается штамма бактериофага Staphylococcus aureus. Предложенный штамм обеспечивает разрушение биопленок, образуемых бактериями рода Staphylococcus, и содержит ген, кодирующий альфа-субъединицу рибонуклеотидредуктазы 1b.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы. Способ включает введение в организм инбредных разнополых 18-21-суточных мышей иммунодефицитной линии SCID массой 12-14 г контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата.

Предложен штамм энтеровируса человека А71 типа субгенотипа С4. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-670.

Изобретение относится к микробиологии и касается штамма бактериофага Citrobacter freundii, способного лизировать патогенные штаммы Citrobacter freundii и содержащего ген, кодирующий рибонуклеотидредуктазу III.
Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия рака почки человека IBGVAT R 6 обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.
Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия рака почки человека IBGVAT R 27 обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантной экспрессии иммуномодуляторных белков. Конструируют вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, при этом указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность фактора транскрипции, которая функционально связана с промотором, при этом указанная по меньшей мере одна последовательность фактора транскрипции кодирует лиганд-зависимый фактор транскрипции, и (2) полинуклеотид, кодирующий полипептид IL-12 и один или более иммуномодуляторных полипептидов, выбранных из IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (лимфотактин), CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine) или TNF-альфа.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены стволовые клетки, полученные культивированием моноцитов человека в присутствии (i) M-CSF с концентрацией от 5 до 100 нг/мл и (ii) по меньшей мере одного представителя, выбранного из группы, состоящей из ганглиозида с концентрацией от 1 до 100 мкг/мл и растворимого в воде растительного экстракта, экстрагированного методом экстракции Folch, с концентрацией от 0,1 до 100 мкг/мл, посредством этого дедифференцируя моноциты, где экспрессия гена CSCR4 указанных стволовых клеток более чем в три или четыре раза больше по сравнению с экспрессией стволовыми клетками, полученными путем культивирования моноцитов человека в присутствии M-CSF и IL-3, и экспрессия гена CSCR4 указанных стволовых клеток более чем в два или три раза больше по сравнению с экспрессией мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга, для лечения заболеваний, связанных с клеточными повреждениями, повреждениями тканей или органов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу криоконсервации клеток животных. Способ основан на применении коллагенового клеточного носителя, имеющего особый состав, а также специфическую толщину и соответствующие механические свойства, которые сохраняются после размораживания.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается создания подкожных ксенографтов меланомы кожи человека для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств.

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается способов сбора функциональных клеток (варианты). Охарактеризованные решения заключаются в имплантации имплантируемой медицинской емкости под кожу на срок не более двух недель, где популяция клеток мобилизована в емкость с помощью любого из белков HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8, S100A9 или гиалуроновой кислоты или смеси любых двух или более из указанных.

Изобретение относится к биотехнологии, регенеративной медицине и может быть использовано в цитологии, гистологии, трансплантологии, микробиологии, биомедицинских исследованиях.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделенному пептиду, который имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), а также к его применению. Предложенный пептид может использоваться в противораковой иммунотерапии, более конкретно, в противораковых вакцинах.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложено применение терапевтически эффективного количества плацентарных стволовых клеток в получении фармацевтической композиции для использования в лечении индивидуума, имеющего заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, причем терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для того, чтобы вызвать детектируемое улучшение одного или нескольких симптомов указанного заболевания, расстройства или патологического состояния; где указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние легкого представляет собой легочный саркоидоз, астму, бронхит или острый респираторный дистресс-синдром, и при этом плацентарные стволовые клетки являются CD10+, CD34-, CD105+ и CD200+, что определяется с помощью проточной цитометрии.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии, а именно к вирусоподобной частице (VLP) для применения в вакцинах или антигенных композициях для лечения или профилактики инфекции вируса бешенства (RV), а также способам их получения и применения. Вирусоподобная частица содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, где G-белки находятся в форме мицеллы и формируют триммер и где указанная мицелла содержит детергент нонилфенол этоксилат 9 (NP-9). Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью лечить или профилактировать инфекции вируса бешенства. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 5 пр.
Наверх