Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином



Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином
Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином

 


Владельцы патента RU 2575820:

РОШЕ ГЛИКАРТ АГ (CH)

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для получения лекарственного средства для лечения рака. Для этого применяют нефукозилированное анти-CD20 антитело с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) в положении Asn297 в комбинации с бендамустином. При этом раком является рак, экспрессирующий CD20, и указанное антитело включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 20, также предложен способ лечения рака, экспрессирующего CD20. Группа изобретений обеспечивает лечение рака у пациентов за счет синергетического действия комбинации нефукозилированного анти-CD20 антитела с бендамустином. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.

 

Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии нефукозилированным антиCD20антителом с бендамустином для лечения рака.

Предпосылки создания изобретения

Нефукозилированные антитела

Опосредованные клетками эффекторные функции моноклональных антител могут быть усилены за счет конструирования их олигосахаридного компонента согласно описанию в работе Umaña Р. и др., Nature Biotechnol, 17, 1999, сс.176-180, и в патенте US 6602684. Антитела типа IgG1, которые наиболее часто применяются в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами с консервативным сайтом N-связанного гликозилирования по положению Asn297 в каждом домене CH2. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, скрыты между доменами CH2, формируя пространственные контакты с полипептидным каркасом, и их наличие важно для опосредования антителом эффекторных функций, например, антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, cc.813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, cc.59-76; Wright A., Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, cc.26-32). В публикации Umaña P. и др., Nature Biotechnol, 17, 1999, cc.176-180, и в WO 99/154342 показано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary - CHO) фермента ß(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (acetylglucosaminyltransferase III - GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей формирование раздвоенных олигосахаридов, существенно повышает in vitro ADCC-действие антител. Изменение в композиции углевода N297 или его элиминация также влияет на Fc-связывание с FcγR и C1q (Umaña Р. и др., Nature Biotechnol, 17, 1999, cc.176-180; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng., 74, 2001, cc.288-294; Mimura Y. и др., J. Biol. Chem., 276, 2001, cc.45539-45547; Radaev S. и др., J. Biol. Chem., 276, 2001, cc.16478-16483; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 276, 2001, cc.6591-6604; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 277, 2002, cc.26733-26740; Simmons L.C. и др., J. Immunol. Methods, 263, 2002, cc.133-147).

Обсуждение исследований действия нефукозилированных и фукозилированных антител, в том числе анти-СЭ20 антител, опубликовано, например, в следующих работах: Iida S. и др., Clin. Cancer Res., 12, 2006, cc.2879-2887; Natsume А. и др., J. Immunol. Methods, 306, 2005, cc.93-103; Satoh M. и др., Expert Opin. Biol. Ther., 6, 2006, cc.1161-1173; Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94, 2004, cc.680-688; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng., 74, 2001, cc.288-294.

CD20 и анти-СР20 антитела

Интенсивно исследуют молекулу CD20 (также называемую антигеном дифференциации, специфичным для В-лимфоцитов человека, или Вр35), которая является гидрофобным трансмембранным белком, локализованным на предшественниках В-лимфоцитов и на зрелых В-лимфоцитах (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem., 264, 1989, cc.11282-11287; Einfeld D.A. и др., EMBO J., 7, 1988, cc.711-717; Tedder T.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1988, cc.208-212; Stamenkovic I. И др., J. Exp. Med., 167, 1988, cc.1975-80; Tedder T.F. и др., J. Immunol. 142, 1989, cc.2560-2568). CD20 экспрессируется на более чем 90% В-клеток неходжкинской лимфомы (НХЛ) (Anderson К.С. и др., Blood 63, 1984, сс.1424-1433), но он не выявлен на кроветворных стволовых клетках, предшественниках В-клеток, нормальных плазматических клетках или на других здоровых тканях (Tedder T.F. и др., J. Immunol. 135(2), 1985, сс.973-979).

Существует два разных типа анти-CD20 антител, существенно отличающихся по способу связывания CD20 и по биологическим действиям (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2004, сс.2738-2743; Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, сс.1045-1051). Антитела I типа, например, ритуксимаб, активно действуют в комплемент-опосредованной цитотоксичности, а антитела II типа, например, тоситумомаб (B1), 11В8, АТ80 или гуманизированные антитела B-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней через каспаза-независимый апоптоз с сопутствующей экспозицией фосфатидилсерина.

Общие отличительные свойства анти-CD20 антител типа I и типа II суммированы в табл.1.

Таблица 1
Свойства анти-CD20 антител I и II типа
Анти-CD20 антитела I типа Анти-СБ20 антитела II типа
Эпитоп CD20 I типа Эпитоп CD20 II типа
Локализуют CD20 на липидных рафтах Не локализуют CD20 на липидных рафтах
Повышенная CDC (в случае изотипа IgG1) Пониженная CDC (в случае изотипа IgG1)
Действие ADCC (в случае изотипа IgG1) Действие ADCC (в случае изотипа IgG1)
В полной мере обладают связывающей способностью Пониженная связывающая способность
Гомотипическое агрегирование Усиленное гомотипическое агрегирование
Индукция апоптоза при перекрестном связывании Сильная индукция гибели клеток с перекрестным связыванием

Бендамустин

Бендамустином (торговые названия рибомустин и трианда, а также SDX-105) является азотистым ипритом, применяемым для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) (Kath R. и др., Cancer Res. Clin. Oncol., 127, 2001, сс.48-54) и В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Он принадлежит к группе лекарственных средств, называемых алкилирующими агентами. Бендамустин в настоящее время также исследуют в качестве средства лечения саркомы (Bagchi S., Lancet Oncol., 8, 2007, с.674).

Бендамустин применяют в качестве терапевтического агента вместе с другими агентами, включая ритуксимаб (Cheson B.D. и др., J Clin Oncol., 27(9), 2009, cc.1492-501; Knauf W., Expert Rev Anticancer Ther., (2)9, 2009, cc.165-174; Plosker G.L. и др., Drugs. 68(18), 2008, cc.2645-2660).

Краткое описание изобретения

Неожиданно было установлено, что комбинация бендамустина с нефукозилированным анти-CD20 антителом проявляет синергетическое (например, даже более чем аддитивные) антипролиферативные действия по сравнению с комбинацией с не являющимся нефукозилированным анти-CD20 антителом ритуксимабом.

Настоящее изобретение включает применение нефукозилированного анти-CD20 антитела с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином.

Другим объектом по настоящему изобретению является способ лечения больного раком пациента путем введения нефукозилированного анти-CD20 антитела с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 в комбинации с бендамустином пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Другим объектом по настоящему изобретению является нефукозилированное анти-CD20 антитело с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 для лечения рака в комбинации с бендамустином.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 0% от общего количества олигосахаридов по положению Asn297.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированным анти-СЭ20 антителом является антитело IgG1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное нефукозилированное анти-СВ20. антитело является гуманизированным антителом B-Ly1 и указанным раком является рак, экспрессирующий CD20, который в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения является В-клеточной неходжкинской лимфомой (НХЛ).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело B-Ly1 вводят в дозе от 800 до 1200 мг на 1, 8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки до пяти 4-недельных циклов дозирования, и бендамустин вводят в дозе от 80 мг/м2 до 110 мг/м2 на 1 и 2 сутки до шести 4-недельных циклов дозирования.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, включающая анти-CD20 нефукозилированное антитело с количеством фукозы 60% или менее и бендамустин, для лечения рака.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение включает применение нефукозилированного анти-CD20 антитела изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1) с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированное анти-CD20 антитело связывает CD20 с величиной KD от 10-9 до 10-13 молей/л.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297.

Понятие «антитело» охватывает разные формы антител, включая, но ими не ограничиваясь, целые антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генетически сконструированные антитела, например, моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител, длина которых такова, что сохраняются отличительные свойства по настоящему изобретению. Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего изобретения относятся к препарату молекул антитела единственного аминокислотного состава. Соответственно, понятие «моноклональное антитело человека» относится к антителам, проявляющим отдельную связывающую специфичность, и содержит вариабельные, и константные области, которые происходят от последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения моноклональные антитела человека вырабатываются гибридомой, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного, но не от человека, например, трансгенной мыши с геномом, включающим трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, гибридизированные с бессмертными клетками.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, включающему вариабельную область, например, область связывания, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области, производной от другого источника или вида, особенно полученную методами рекомбинации ДНК. Особенно предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела мыши/человека являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулина, включающих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулина мыши, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулина человека. К другим формам «химерных антител», охватываемых настоящим изобретением, относятся те, у которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела также называются «антителами переключенного класса». К методам получения химерных антител относятся общепринятые методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, известные в данной области. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244.

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, у которых каркасный участок или «комплементарность-детерминируемые области (complementarity determining regions - CDR)» модифицированы для включения области CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью исходного иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения CDR мыши пересаживают в каркасный участок антитела человека для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270.

В контексте настоящего изобретения понятие «антитело человека» относится к антителам, содержащим вариабельные и константные области, производные от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека известны в данной области (van Dijk М.А., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc.368-374). Основываясь на таком подходе, могут быть получены антитела человека против большого количества разнообразных мишеней. Примеры антител человека описаны, например, Kellermann S.A. и др., Curr Opin Biotechnol. 13, 2002, сс.593-597.

Понятие «рекомбинантное антитело человека» в контексте настоящего изобретения охватывает все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены методами рекомбинации, например, антитела, выделенные из клетки-хозяина, например, клетки NS0 или CHO, или от животного (например, мыши), трансгенного по генам иммуноглобулина, или антитела, экспрессированные с использованием вектора рекомбинантной экспрессии, трансфецированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, производные от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по настоящему изобретению были подвергнуты соматическому гипермутированию in vivo. Соответственно аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые хотя и происходят от последовательностей, близких к последовательностям VH и VL зародышевой линии человека, естественным образом могут отсутствовать в спектре антител зародышевой линии человека in vivo.

В контексте настоящего изобретения понятие «связывание» или «специфическое связывание» относится к специфическому связыванию антитела с эпитопом опухолевого антитела в исследовании in vitro, предпочтительно в исследовании методом плазмонного резонанса (фирма BIAcore, GE-Healthcare Упсала, Швеция) с очищенным антигеном дикого типа. Сродство связывания выражается в терминах «ka» (константа скорости ассоциации антитела из комплекса антитело/антиген), «kD» (константа диссоциации) и «KD» (kD/ka). Связывание или специфичное связывание означает связывающее сродство (KD) 10-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10-9 М до 10-13 молей/л. Соответственно нефукозилированное антитело по настоящему изобретению специфически связывается с опухолевым антигеном со связывающим сродством (KD) 10-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10-9 до 10-13 молей/л.

Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего изобретения относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Понятие «константные домены» означает, что они не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но участвуют в проявлении эффекторных функций (ADCC, связывание комплемента и CDC).

Понятие «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), применяемое в настоящем изобретении, означает каждую из пар легкой и тяжелой цепей, вовлеченную непосредственно в связывание антитела с антигеном. Домены вариабельных легкой и тяжелой цепей человека имеют одну общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных участка (framework region - FR), последовательности которых в высокой степени консервативны, соседствуют с тремя «гипервариабельными областями» (или комплементарность-детерминирующими областями - complementarity determining regions, CDR). Каркасные участки принимают конформацию бета-слоя и области CDR могут формировать петли, объединяющие структуру бета-слоя. Области CDR в каждой цепи поддерживаются в их трехмерной структуре каркасными участками и формируют вместе с областями CDR из сайта связывания антигена другой цепи.

В контексте настоящего изобретения понятие «гипервариабельная область» или «антигенсвязывающая часть антитела» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из «комплементарность-детерминирующих областей (complementarity determining regions - CDR)». Понятие «каркасный участок (framework region - FR)» относится к тем вариабельным доменным областям, которые отличны от остатков гипервариабельных областей, согласно описанному в настоящем изобретении. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела включают в направлении от N- к C-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

В особенности CDR3-тяжелой цепи является областью, которая в наибольшей степени влияет на связывание антигена. Области CDR и FR определяют по стандарту, описанному в кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5-е изд., Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд, и/или по тем остаткам, которые происходят из «гипервариабельной петли».

Бендамустин является 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил]бутановой кислотой. Торговые названия этого соединения «рибомустин» и «треанда»; бендамустин также известен под названием SDX-105. Бендамустин представляет азотистый иприт, применяемый для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) (Kath R. и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 127, 2001, сс.48-54) и В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Он принадлежит к группе лекарств, называемых алкилирующими агентами, и также исследуется для лечения саркомы (Bagchi S., Lancet Oncol., 8, 2007, с.674).

Понятие «нефукозилированное антитело» относится к антителу изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1) с измененным типом гликозилирования в области Fc в положении Asn297, обладающему пониженным уровнем остатков фукозы. Гликозилирование IgG1 или IgG3 человека локализовано в положении Asn297 в виде корового биантенного сложного олигосахаридного гликозилирования, заканчивающегося двумя остатками Gal. Эти структуры обозначают в качестве остатков гликанов G0, G1 (α1,6 или α1,3) или G2 в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int., 1 2003, сс.44-53). Тип гликозилирования СНО частей антитела Fc описан, например, в работе Routier F.H., Glycoconjugate J., 14, 1997, сс.201-207. Антитела, которые рекомбинантно экспрессируются в клетках-хозяевах СНО без гликомодификации, обычно фукозилированы по положению Asn297 в количестве по меньшей мере 85%. Следует учитывать, что в контексте настоящего изобретения понятие нефукозилированного антитела предусматривает антитело, у которого нет фукозы в присущем ему характере гликозилирования. В большинстве случаев известно, что типичное положение гликозилированного остатка в антителе занимает аспарагин по положению 297 по системе нумерации EU («Asn297»).

Понятие «система нумерации EU» или «индекс EU» обычно применяют по отношению к остатку в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU представлен в кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд).

Таким образом, нефукозилированное антитело по настоящему изобретению означает антитело изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), в котором количество фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 (это означает, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридов в области Fc по положению Asn297 фукозилировано). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% олигосахаридов в области Fc по положению Asn297. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 50% или менее, и в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 30% или менее от количества ологисахаридов в области Fc по положению Asn297. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 0% от количества ологисахаридов в области Fc по положению Asn297. В соответствии с настоящим изобретением понятие «количество фукозы» означает количество указанного олигосахарида (фукозы) в олигосахаридной цепочке (цепочке сахара) по положению Asn297 относительно суммы всех олигосахаридов (сахаров), присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных и содержащих большое количество маннозы структур), измеренное методом MALDI-TOF спектрометрии и рассчитанное в качестве средней величины (подробный метод определения количества фукозы описан, например, в WO 2008/077546). Кроме того, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения олигосахариды области Fc раздвоены. Нефукозилированное антитело по настоящему изобретению может экспрессироваться в гликомодифицированной клетке-хозяине, сконструированной для экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который обладает действием GnTIII, в количестве, достаточном для частичного фукозилирования олигосахаридов в области Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий действием GnTIII, является гибридным полипептидом. В другом варианте действие α1,6-фукозилтрансферазы клетки-хозяина может быть снижено или элиминировано согласно US 6946292 для получения гликомодифицированных клеток-хозяев. Степень фукозилирования антитела может быть предопределена, например, или условиями ферментации (например, временем ферментации), или комбинированием по меньше мере двух антител с разной степенью фукозилирования. Такие нефукозилированные антитела и соответствующие способы гликоинжениринга описаны в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс.176-180; WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Такие гликоинженерные антитела обладают повышенной величиной ADCC. Другие методы гликоинжениринга, с помощью которых получают нефукозилированные антитела по настоящему изобретению, описаны, например, в работах Niwa R. и др., J. Immunol. Methods, 306, 2005, сс.151-160; Shinkawa Т. и др., J Biol Chem, 278, 2003, сс.3466-3473; WO 03/055993 или US 2005/0249722.

Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является применение нефукозилированного анти-CD20 антитела изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), специфически связывающегося с CD20 и содержащего количество фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297, для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297.

Антиген CD20 (также называемый В-лимфоцитарным антигеном CD20, В-лимфоцитарным поверхностным антигеном Bl, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5; последовательность обозначена номером Р11836 в базе данных SwissProt) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярной массой примерно 35 кДа, расположенным на предшественниках В-лимфоцитов и на зрелых В-лимфоцитах. (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem., 264(19), 1989, сс.11282-11287; Tedder T.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1988, cc.208-212; Stamenkovic I. И др., J. Exp. Med., 167, 1988, cc.1975-80; Einfeld D.A. и др., EMBO J., 7, 1988, cc.711-717; Tedder T.F. и др., J. Immunol., 142, 1989, cc.2560-2568). Соответствующий ген человека представляет трансмембранный 4-доменный подсемейства А представитель 1, также обозначаемый MS4A1. Этот ген кодирует представителя семейства трансмембранных 4А генов. Представители этого формирующегося семейства отличаются общими структурными свойствами и сходными границами сплайсирования интрона/экзона и проявляют уникальные варианты экспрессии среди клеток кроветворения и нелимфоидных тканей. Этот ген кодирует молекулу на поверхности В-лимфоцитов, которая участвует в развитии и дифференциации В-клеток в клетки плазмы. Представитель этого семейства локализован по положению 1 lql2, среди кластера представителей семейства. Иной сплайсинг этого гена приводит к двум вариантам транскрипта, которые кодируют один и тот же белок.

Понятия «антиген CD20» и «CD20» в контексте настоящего изобретения применяют взаимозаменяемо и к ним относят какие-либо варианты, изоформы и гомологи CD20 человека других видов, которые естественным образом экспрессируются клетками или экспрессируются на поверхности клеток, трансфецированных геном CD20. Связывание антитела по настоящему изобретению с антигеном CD20 опосредует уничтожение клеток, экспрессирующих CD20 (например, клеток опухоли), путем инактивирования CD20. Уничтожение клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или нескольким из следующих механизмов: индукции гибели клеток/апоптоза, ADCC и CDC.

К синонимам CD20, применяемым в данной области, относятся В-лимфоцитный антиген CD20, В-лимфоцитный поверхностный антиген B1, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Понятие «анти-CD20 антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологического действия анти-CD20 антител по отношению к антигену CD20 могут быть выделены два типа анти-CD20 антител (анти-CD20 антитела I и II типа) согласно Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2004, сс.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, сс.1045-1051, см. табл.2.

Таблица 2
Свойства анти-CD20 антител I и II типа
Ahth-CD20 антитела I типа Ahth-CD20 антитела II типа
Эпитоп CD20 I типа Эпитоп CD20 II типа
Локализуются CD20 на липидных рафтах Не локализуются CD20 на липидных рафтах
Повышенная цитотоксичность CDC (в случае изотипа IgG1) Пониженная цитотоксичность CDC (в случае изотипа IgG1)
Действие ADCC (в случае изотипа IgG1) Действие ADCC (в случае изотипа IgG1)
В полной мере присуща способность к связыванию Пониженная способность к связыванию
Гомотипическое агрегирование Усиленное гомотипическое агрегирование
Индукция апоптоза при перекрестном связывании Индукция высокой гибели клеток без перекрестного связывания

К примерам анти-CD20 антител II типа относятся, например, гуманизированное B-Ly1 антитело IgG1 (химерное гуманизированное антитело IgG1, описанное в WO 2005/044859), 11 В8 IgG1 (описанное в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Обычно анти-CD20 антитела II типа изотипа IgG1 проявляют отличительные свойства CDC. Ahth-CD20 антитела II типа обладают пониженной цитотоксичностью CDC (в случае изотипа IgG1) по сравнению с антителами I типа изотипа IgG1.

К примерам анти-CD20 антител I типа относятся, например, ритуксимаб, HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), антитело 2С6 IgG1 (описанное в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанное в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанное в WO 2004/056312).

Нефукозилированные анти-CD20 антитела по настоящему изобретению в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения являются анти-CD20 антителами II типа, в более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анти-CD20 антитело II типа является нефукозилированным гуманизированным антителом B-Ly1.

Нефукозилированные анти-CD20 антитела по настоящему изобретению обладают повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) в отличие от анти-CD20 антител, не обладающих пониженным содержанием фукозы.

Понятие «нефукозилированное анти-CD20 антитело с повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC)» в контексте настоящего изобретения означает нефукозилированное анти-CD20 антитело, обладающее повышенной цитотоксичностью ADCC, которую определяют каким-либо приемлемым методом, известным специалистам в данной области. Одним из известных методов анализа ADCC in vitro является следующий:

1) в анализе используют клетки-мишени, о которых известно, что они экспрессируют антиген-мишень, распознаваемую антигенсвязывающей областью антитела;

2) в анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), выделенные из крови случайным образом выбранных здоровых доноров, в качестве эффекторных клеток;

3) анализ проводят по следующему протоколу:

i) МКПК выделяют, используя стандартные процедуры центрифугирования в градиенте плотности, и суспендируют до плотности 5×106 клеток/мл в культуральной среде RPMI;

ii) клетки-мишени выращивают стандартными методами работы с тканевыми культурами, собирают на экспоненциальной фазе роста при жизнеспособности более 90%, промывают в среде для культур клеток RPMI, метят 100 микрокюри 51Cr, промывают дважды средой для культур клеток и ресуспендируют в среде для культур клеток при плотности 105 клеток/мл;

iii) 100 микролитров указанной выше итоговой суспензии клеток-мишеней переносят в каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрований;

iv) антитело серийно разводят от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл в среде для культур клеток и по 50 микролитров получаемых растворов антитела вносят к клеткам-мишеням в 96-луночный планшет для микротитрований, проводя исследование антитела в трех различных концентрациях, перекрывающих указанный выше диапазон концентраций;

v) для контролей максимального высвобождения (MB) в три дополнительные лунки планшета, содержащие меченые клетки-мишени, вносят 50 мкл 2% (VN) водного раствора неионного детергента (фирма Nonidet, Sigma, Сент-Луис) вместо раствора антитела (пункт iv выше);

vi) для контролей спонтанного высвобождения (СВ) в три дополнительные лунки планшета, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл среды RPMI для культур клеток вместо раствора антитела (пункт iv выше);

vii) 96-луночный планшет для микротитрования затем центрифугируют в режиме 50×g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°C;

viii) 50 микролитров суспензии МКПК (пункт i выше) вносят в каждую лунку для получения соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням 25:1 и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу 5% CO2 при 37°C на 4 ч;

ix) супернатант без клеток из каждой лунки собирают и подсчитывают экспериментально высвобожденную радиоактивность (ЭВР), используя счетчик гамма-излучения;

x) процент специфического лизиса рассчитывают для каждой концентрации антитела по формуле (ЭВР-МВ)/(МВ-СВ)×100, где ЭВР среднюю радиоактивность подсчитывают (см. выше пункт ix) для такой концентрации антитела, MB означает среднюю радиоактивность (см. выше пункт ix), рассчитанную для контролей MB (см. выше п.V), и СВ означает среднюю радиоактивность (см. выше пункт ix), рассчитанную для контролей СВ (см. выше пункт vi);

4) «повышенная цитотоксичность ADCC» выражается или в виде повышения максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в исследованном выше диапазоне концентрации антитела, и/или снижения концентрации антитела, необходимой для достижения половины от максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в исследованном выше диапазоне концентрации антитела. Повышение величины ADCC относительно величины ADCC, измеренной с помощью указанного выше анализа, опосредованной тем же антителом, выработанным тем же типом клеток-хозяев, используя те же стандартные методы получения, очистки, переработки и хранения, которые известны специалистам в данной области, но которые не вырабатываются клетками-хозяевами, сконструированными для сверхэкспрессии GnTIII.

Указанная «повышенная цитотоксичность ADCC» может быть получена гликоинжинирингом указанных антител, что означает повышение указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител путем инжиниринга их олигосахаридного компонента согласно описанию в работах Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180, и US 6602684.

Понятие «комплементзависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC)» относится к лизису клеток-мишеней опухоли человека антителом по настоящему изобретению в присутствии комплемента. CDC измеряют предпочтительно обработкой препарата клеток, экспрессирующих CD20, анти-CD20 антителом по настоящему изобретению в присутствии комплемента. CDC выявляют, если антитело индуцирует в концентрации 100 нМ лизис (гибель клеток) 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Анализ осуществляют предпочтительно с 51Cr или Eu мечеными опухолевыми клетками и измеряют высвободившиеся 51Cr или Eu. Контроли включают инкубирование опухолевых клеток-мишеней с комплементом, но без антитела.

Антитело, называемое ритуксимабом (контрольное антитело; пример анти-CD20 антитела I типа), является генетически сконструированным химерным моноклональным антителом человека гамма 1, содержащим константный домен мыши и направленным против антигена человека CD20. Такое химерное антитело содержит константные домены гамма 1 человека и обозначается «C2B8» в US 5736137. Ритуксимаб одобрен для лечения пациентов с рецидивирующей или неподдающейся лечению злокачественной или фолликулярной CD20-положительной В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Исследования механизма действия in vitro показывают, что ритуксимаб проявляет зависимую от комплемента человека цитотоксичность (complement-dependent cytotoxicity - CDC) (Reff М.Е. и др., Blood, 83(2), 1994, cc.435-445). Кроме того, он проявляет существенное действие в исследованиях по измерению антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Ритуксимаб не относится к нефукозилированным антителам.

Антитело Количество фукозы
Ритуксимаб (не относится к нефукозилированным антителам) >85%
Дикого типа нефукозилированное гликоинженерное гуманизированное антителоВ-Ly1 (B-HH6-B-KV1) (не относится к нефукозилированным антителам) >85%
Антитело Количество фукозы
Нефукозилированное гликоинженерное гуманизированное антитело B-Ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) 45-50%

Понятие «гуманизированное антитело B-Ly1» относится к гуманизированному антителу B-Ly1, описанному в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которое получено из моноклонального анти-CD20 антитела В-Ly1 мыши (вариабельная область тяжелой цепи мыши (VH): SEQ ID NO: 1; вариабельная область легкой цепи мыши (VL): SEQ ID NO: 2 - см. Poppema S. и Visser L., Biotest Bulletin 3, 1987, c.131-139) за счет химеризации с константной областью человека из IgG1 и последующей гуманизацией (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Такие «гуманизированные антитела B-Ly1» подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения «гуманизированное антитело B-Ly1» имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы последовательностей от SEQ ID N0:3 до SEQ ID N0:20 (от В-НН2 до В-НН9 и от B-HL8 до B-HL17 в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Особенно предпочтительны Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, В-ННЗ, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875). В одном специфическом варианте осуществления настоящего изобретения «гуманизированное антитело B-Ly1» содержит вариабельную область легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID No. 20 (B-KV1 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875). В другом специфическом варианте осуществления настоящего изобретения «гуманизированное антитело B-Ly1» содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:7 (В-HH6 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875) и вариабельную область легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID No. 20 (B-KV1 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело B-Ly1 является антителом IgG1. Согласно настоящему изобретению такие нефукозилированные гуманизированные B-Ly1 антитела являются гликоинженерными (glycoengineered - GE) в области Fc в соответствии с процедурами, описанными в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180, и WO 99/154342. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используемое анти-CD20 антитело является нефукозилированным гликоинженерным гуманизированным антителом B-Ly1, обозначаемым B-HH6-B-KV1 GE. Такие гликоинженерные гуманизированные B-Ly1 антитела обладают измененным типом гликозилирования области Fc, предпочтительно имея пониженный уровень остатков фукозы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов в положении Asn297 (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60%, в другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 50% или менее, в еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 30% или менее, и в еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 0%). Кроме того, в одном из специфических вариантов осуществления настоящего изобретения олигосахариды в области Fc раздвоены. Такие гликоинженерные гуманизированные B-Ly1 антитела обладают повышенной ADCC.

Олигосахаридный компонент может существенно повлиять на свойства, значимые для эффективности терапевтического гликопротеина, в том числе на физическую стабильность, устойчивость к воздействию протеазы, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические показатели и специфическое биологическое действие. Такие свойства могут зависеть не только от наличия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Некоторые обобщения между структурой олигосахаридов и функцией гликопротеина могут быть получены. Например, определенные олигосахаридные структуры опосредуют быстрый клиренс гликопротеинов из кровяного русла через взаимодействия со специфическими связывающими белки углеводами, хотя другие могут быть связаны антителами и индуцируют иммунные реакции. (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 1996, cc.975-981).

Клетки млекопитающих являются превосходными хозяевами для выработки терапевтических гликопротеинов из-за их способности гликозилировать белки в наиболее приемлемой форме для применения людьми. (Cumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 1991, сс.115-130; Jenkins N. И др., Nature Biotechnol., 14, 1996, сс.975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки, но подобно другим типам обычных хозяев, например, клеток дрожжей, мицелиальных грибов, насекомых и растений, дают варианты гликозилирования, ассоциированные с быстрым клиренсом из кровяного русла, нежелательными иммунными реакциями и в некоторых особых случаях с пониженным биологическим действием. Среди клеток млекопитающих наиболее часто на протяжении двух последних десятилетий используют клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary - СНО). Помимо получения стабильных вариантов гликозилирования эти клетки позволяют вырабатывать устойчивое поколение генетически стабильных высоко продуктивных клональных клеточных линий. Они могут культивироваться до высоких плотностей в простых биореакторах, используя среды без сыворотки, и позволяют создавать безопасные и воспроизводимые биопроцессы. К другим обычно используемым клеткам животных относятся клетки почки детеныша хомячка (baby hamster kidney - BHK), NSO- и SP2/0-клетки миеломы мыши. Ранее исследовали продуктивность трансгенных животных. (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 1996, сс.975-981).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип располагает отличительной сборкой N-связанных углеводных структур, которые вариабельно влияют на сборку белка, секрецию или функциональное действие. (Wright A., Monison S.L., Trends Biotech., 15, 1997, сс.26-32). Структура присоединенного N-связанного углевода существенно варьирует в зависимости от степени процессинга и может включать большое количество маннозы, многократно разветвлена подобно биантенному комплексу олигосахаридов. (Wright A., Morrison S.L., Trends Biotech., 15, 1997, сс.26-32). Обычно имеется гетерогенный процессинг сердцевинных олигосахаридных структур, присоединенных к определенному сайту гликозилирования таким образом, что даже моноклональные антитела существуют в виде множества гликоформ. Кроме того, показано, что большие различия в гликозилировании антитела имеются у клеточных линий и наблюдают даже минорные различия для данной клеточной линии, выращенной в разных условиях культивирования. (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5(8), 1995, cc.813-822).

Один из способов существенного увеличения эффективности действия, сохраняя при этом простой способ получения при вероятном отсутствии существенных нежелательных побочных эффектов, заключается в повышении природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител путем инжиниринга их олигосахаридного компонента согласно описанию в работах Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180, и US 6602684. Антитела типа IgG1, которые обычно используют в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами с консервативным N-связанным сайтом гликозилирования по положению Asn297 в каждом домене CH2. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, погружены между доменами CH2, формируя пространственные контакты с полипептидным каркасом, и их наличие важно для антитела для опосредования эффекторных функций, например, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, cc.813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, cc.59-76; Wright A., Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, cc.26-32).

Ранее было показано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка СНО ß(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы 111 («GnTII17y») - гликозилтрансферазы, катализирующей формирование разветвленных олигосахаридов, существенно повышает действие ADCC in vitro антинейробластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), вырабатываемого сконструированными клетками СНО. (См. Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и WO 99/154342, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок). Антитело chCE7 принадлежит к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают повышенным сродством и специфичностью в отношении опухолей, но слишком слабы для клинического применения при получении стандартными промышленными линиями клеток, утратившими фермент GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180). Это исследование впервые показало, что значительные повышения действия ADCC могут быть получены путем инжиниринга клеток, вырабатывающих антитела, для экспрессии GnTIII, что также приводит к повышению в пропорции константная область (Fc)-ассоциированных разветвленных олигосахаридов, включая разветвленные нефукозилированные олигосахариды, выше уровней, установленных у природных антител.

Понятие «рак» в контексте настоящего изобретения включает лимфомы, лимфоцитарные лейкозы, рак легких, немелкоклеточный рак легких (поп small cell lung - NSCL), бронхоальвеолярно-клеточный рак легких, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак толстой кишки, рак груди, рак матки, рак фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидки, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак уретры, рак пениса, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному клеток почки, карциному почечной лоханки, мезотелиому, гепатоклеточный рак, рак желчного пузыря, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиомы ствола мозга, мультиформную глиобластому, астроцитому, шванному, эпендимому, медуллобластому, менингиому, плоскоклеточную карциному, аденому гипофиза, включая неподдающиеся лечению версии каких-либо из указанных выше форм рака или комбинацию одного или нескольких указанных выше форм рака. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «рак» относится к раку, экспрессирующему CD20.

Понятие «экспрессия антигена CD20» означает существенный уровень экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на поверхности Т- или В-клеток, более предпочтительно В-клеток, из опухоли или рака, соответственно, предпочтительно опухоли, не являющейся плотной. Пациенты с «раком, экспрессирующим CD20» могут быть определены с помощью стандартных методов, известных в данной области. Например, экспрессия антигена CD20 может быть измерена, используя иммуногистохимический метод определения (immunohistochemical - IHC), метод FACS или основанное на ПЦР выявлении соответствующей иРНК.

Понятие «рак, экспрессирующий CD20» в контексте настоящего изобретения относится ко всем формам рака, в которых раковые клетки демонстрируют экспрессию антигена CD20. Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, в контексте настоящего изобретения относится к лимфомам (предпочтительно к В-клеточной неходжкинской лимфоме (НХЛ)) и лимфоцитарным лейкозам. К таким лимфомам и лимфоцитарным лейкозам относятся, например, а) фолликулярная лимфома, б) мелкоклеточная неделящаяся лимфома/лимфома Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и неберкиттскую лимфому), в) лимфомы клеток маргинальной зоны (включая экстранодальную лимфому из В-клеток маргинальной зоны (ассоциированную со слизистой и лимфоидной тканью лимфому), узелковая лимфома из В-клеток маргинальной зоны маргинальной зоны селезенки), г) лимфома клеток мантии, д) крупноклеточная лимфома (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому, смешанноклеточную диффузную В-крупноклеточную лимфому, иммунобластическую лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, ангиоцентрическую лимфому - легочную В-клеточную лимфому), е) волосатоклеточный лейкоз, ж) лимфоцитарная лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема, з) острый лимфолейкоз, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ)/лимфома малых лимфоцитов, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, и) неоплазмы плазматических клеток, миелома плазматических клеток, множественная миелома, плазмацитома, к) болезнь Ходжкина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения раком, экспрессирующим CD20, является В-клеточная неходжкинская лимфома (НХЛ). В другом варианте осуществления настоящего-изобретения раком, экспрессирующим CD20, является лимфома клеток мантии, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), В-клеточная диффузная крупноклеточная лимфома, лимфома Беркитта, волосатоклеточный лейкоз, фолликулярная лимфома, множественная миелома, лимфома маргинальной зоны, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство, ВИЧ-ассоциированная лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема или первичная лимфома ЦНС.

Понятие «способ лечения» или его эквивалент применительно, например, к раку, означает процедуру или курс действий, который предназначен для снижения или элиминации числа раковых клеток у пациента или для облегчения симптомов рака. «Способ лечения рака» или другого пролиферативного расстройства не обязательно означает, что раковые клетки или другое расстройство в самом деле может быть элиминировано, что число клеток или расстройство в самом деле может быть понижено, или что симптомы рака или другого расстройства в самом деле могут быть облегчены. Часто способ лечения рака может быть осуществлен даже при низкой вероятности успеха, но который, получая историю болезни и оценку вероятности выживания пациента, тем не менее считая целесообразным индуцировать общий целебный курс лечения.

Понятия «совместное введение» и «вводимые вместе» относятся к введению указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина в виде единого состава или в виде двух разных составов. Совместное введение может быть одновременным или последовательным в том или ином порядке, причем предпочтительно имеется период времени, когда оба (или все) действующие агенты одновременно проявляют свои биологические действия. Указанное анти-CD20 нефукозилированное антитело и бендамустин вводятся совместно или одновременно, или последовательно (например, внутривенно путем непрерывной инфузии (одной для анти-CD20 антитела и со временем другой для бендамустина). Если оба терапевтических агента вводятся совместно и последовательно, дозу вводят или в те же сутки, или в виде двух отдельных введений, или один из агентов вводят в 1 сутки, а второй агент одновременно вводят на 2-7 сутки, предпочтительно на 2-4 сутки. Таким образом, понятие «последовательно» означает в течение 7 суток после дозы первого компонента (бендамустина или антитела), предпочтительно в течение 4 суток после введения дозы первого компонента; и понятие «одновременно» означает введение в одно и то же время. Понятия «совместное введение» применительно к поддерживающим дозам указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина означает, что поддерживающие дозы могут быть или совместно вводимыми одновременно, если цикл лечения соответствует обоим лекарственным средствам, например, еженедельно. Или бендамустин, например, вводят, например, каждые 1-3 суток, и указанное нефукозилированное антитело вводят еженедельно. Или поддерживающие дозы одновременно вводят одну за другой или в течение одних, или в течение нескольких суток.

Если очевидно, что антитела вводят пациенту в «терапевтически эффективном количестве» (или просто «эффективном количестве»), которое означает количество соответствующего соединения или комбинации, которая может вызвать биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, которое подобрано исследователем, ветеринаром, медиком или другим клиницистом.

Количество совместного введения указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина и расчет времени совместного введения может зависеть от типа (вида, пола, возраста, массы тела и др.) и состояния пациента, подвергаемого лечению, и тяжести заболевания или состояния, подвергаемого лечению. Указанное нефукозилированное анти-CD20 антитело и бендамустин совместно вводят соответствующим образом пациенту в одно время или на протяжении серий лечения.

Если проводят введение внутривенное, первоначальное время инфузии для указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела или бендамустина может быть больше, чем время для последовательных инфузий, например, примерно 90 мин для первоначальной инфузии и примерно 30 мин для последующих инфузий (если первоначальная инфузия хорошо переносится).

В зависимости от типа и тяжести заболевания количество примерно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела и от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) бендамустина представляет первоначальную рассматриваемую дозу для совместного введения обоих лекарственных средств пациенту. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительная доза указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела (предпочтительно нефукозилированного гуманизированного антитела B-Ly1) может находиться в диапазоне примерно от 0,05 мг/кг до примерно 30 мг/кг. Таким образом, одна или несколько доз, составляющих примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг (или какая-либо их комбинация), могут вводиться пациенту одновременно. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доза бендамустина может быть в диапазоне от 0,01 мг/кг до примерно 30 мг/кг, например, от 0,1 мг/кг до 10,0 мг/кг. В зависимости от типа (вида, пола, возраста, массы и т.д.) и состояния пациента и от типа нефукозилированного анти-CD20 антитела дозы и схемы введения указанного нефукозилированного антитела и бендамустина могут отличаться, например, указанное нефукозилированное анти-CD20 антитело может вводиться, например, каждую 1-3 недели, а бендамустин может вводиться ежедневно или каждые 2-10 суток. Также может вводиться первоначальная повышенная ударная доза с последующим введением одной или нескольких более низких доз.

В одном их предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительная доза указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела (предпочтительно нефукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1) может составлять от 800 до 1200 мг на 1, 8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки до пяти 4-недельных циклов дозирования, и предпочтительная доза бендамустин может составлять, например, от 80 мг/м до 110 мг/м2 (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 110 мг/м2, в другом варианте осуществления настоящего изобретения 90 мг/м2) на 1 и 2 сутки (введение внутривенной на протяжении 30 мин на 1 и 2 сутки) до шести 4-недельных циклов дозирования. В другом варианте доза указанного нефукозилированного анти-CD20 антитела может составлять от 800 до 1200 мг (например, 1000 мг) на 1 сутки до восьми 3-недельных циклов дозирования.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство применимо для предупреждения или понижения метастазирования или дальнейшего распространения заболевания у таких пациентов с раком, предпочтительно с раком, экспрессирующим CD20. Лекарственное средство применимо для повышения продолжительности выживания таких пациентов, повышая беспрогрессивное выживание таких пациентов, повышения длительности ответа, приводя к статистически существенному и клинически значимому улучшению состояния у подвергнутых лечению больных, которое выражается в длительности выживания, беспрогрессивного выживания, скорости ответа или длительности ответа. В одном из специфических вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство применимо для повышения скорости ответа в группе пациентов.

В контексте настоящего изобретения дополнительные другие цитотоксические, химиотерапевтические или противораковые агенты или соединения, которые повышают действие таких агентов (например, цитокины), могут применяться в лечении рака комбинацией нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина. Такие молекулы соответствующим образом содержатся в комбинации в количествах, которые эффективны для назначенной цели. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное лечение комбинацией нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина применяют без таких дополнительных цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединений, которые повышают действие таких агентов.

К таким агентам, например, относятся: алкилирующие агенты или агенты с алкилирующим действием, например, циклофосфамид (СТХ; например, продукт Cytoxan®), хлорамбуцил (CHL; например, продукт leukeran®), цисплатин (CisP; например, продукт platinol®), бусульфан (например, продукт myleran®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленмеламин (ТЕМ), митомицин С и др.; антиметаболиты, например, метотрексат (МТХ), этопозид (VP 16; например, продукт vepesid®), 6-меркаптопурин (6МР), 6-тиогуанин (6TG), цитарабин (Ara-С), 5-фторурацил (5-FU), капецитабин (например, продукт Xeloda®), дакарбазин (DTIC) и др.; антибиотики, например, актиномицин D, доксорубицин (DXR; например, продукт adriamycin®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и др.; алкалоиды, например, алкалоиды борвинка, например, винкристин (VCR), винбластин и др.; и другие противоопухолевые агенты, например, паклитаксел (например, продукт taxol®) и производные паклитаксела, цитостатики, глюкокортикоиды, например, дексаметазон (DEX; например, продукт decadron®) и кортикостероиды, например, преднизон, нуклеозиды - ингибиторы ферментов, например, гидроксимочевина, ферменты, истощающие аминокислоты, например, аспарагиназа, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты, а также сходные разнообразные противораковые агенты. Приводимые ниже агенты также могут применяться в качестве дополнительных агентов: арнифостин (например, продукт ethyol®), дактиномицин, мехлорэтамин (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), липосомный доксорубицин (например, продукт doxil®), гемцитабин (например, продукт gemzar®), липосомный даунорубицин (например, продукт daunoxome®), прокарбазин, митомицин, досетаксел (например, продукт taxotere®), алдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптотецин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси 7-этил-камптотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месна, интерферон бета, интерферон альфа, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргас, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, азотистый иприт, винорелбин, хлорамбуцил. Предпочтительно лечение комбинацией нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина применяют без таких дополнительных агентов.

Применение цитотоксических и противораковых агентов, описанных выше, а также антипролиферативных специфичных в отношении мишени противораковых лекарственных средств, например, ингибиторов протеинкиназы в химиотерапевтических режимах, обычно хорошо охарактеризовано в области противораковой терапии, и их применение в контексте настоящего изобретения подпадает под те же рассмотрения для мониторинга устойчивости и эффективности и для контроля путей введения и доз с некоторыми корректировками. Например, реальные дозировки цитотоксических агентов могут варьировать в зависимости от ответа культивируемых клеток пациента, определенного с помощью методов гистологических культур. В целом доза может быть снижена по сравнению с количеством, применяемым при отсутствии других дополнительных агентов.

Обычно дозы эффективного цитотоксического агента могут находиться в диапазонах, рекомендованных производителем, и, если это следует из ответов in vitro или из ответов, полученных на животных моделях, могут быть снижены примерно до величины одного порядка концентрации или количества. Таким образом, реальная доза может зависеть от оценки врача, состояния пациента и эффективности способа терапии, основанного на способности к ответу in vitro первично культивируемых злокачественных клеток или гистокультуры образца ткани, или ответах, наблюдаемых у соответствующих животных моделей.

В контексте настоящего изобретения может применяться эффективное количество ионизирующей радиации и/или радиофармацевтический агент может применяться дополнительно к лечению рака, экспрессирующего CD20, комбинацией нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина. Источник радиации может быть или внешним, или внутренним для пациента, подвергаемого лечению. Если источник радиации внешний для пациента, лечение проводят в качестве терапии внешним радиоактивным пучком. Если источник радиации внутренний для пациента, лечение называют брахитерапией или близкофокусной лучевой терапией. Радиоактивные атомы для применения в контексте настоящего изобретения могут быть выбраны из группы, включающей, но ими перечень не ограничивается, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111. Также возможно метить антитела такими радиоактивными изотопами. Предпочтительно лечение комбинацией нефукозилированного анти-CD20 антитела и бендамустина применяют без такой ионизирующей радиации.

Радиационная терапия является стандартным лечением для уничтожения нерезектабельных или неоперабельных опухолей и/или метастазов опухолей. Улучшенные результаты наблюдают при радиационной терапии, комбинированной с химиотерапией. Радиационная терапия основана на принципе, что радиация в высокой дозе, примененная в целевой области, может привести к гибели репродуктивных клеток и в опухолевых, и в здоровых тканях. Режим дозирования радиации обычно выражают в терминах дозы поглощенной радиации (греях, Гр), времени и фракционирования и он должен быть тщательно определен онкологом. Количество радиации, получаемой пациентом, может зависеть от разных обстоятельств, но двумя наиболее важными являются расположение опухоли и связь с другими важными структурами или органами тела и от степени распространения опухоли. Типичным курсом лечения пациента, подвергаемого радиационной терапии, может быть схема лечения на протяжении периода из 1-6 недель с общей дозой 10-80 Гр, введенных пациенту при единичной суточной степени облучения примерно 1,8-2,0 Гр, 5 суток в 1 неделю. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения имеется синергизм, если опухоли пациента обрабатывают комбинированным. лечением по настоящему изобретению и радиацией. Иначе говоря, подавление роста опухоли с помощью агентов, включающих комбинацию по настоящему изобретению, повышено при комбинировании радиации, необязательно с дополнительными химиотерапевтическими или противораковыми агентами. Параметры адъювантной радиационной терапии представлены, например, в WO 99/60023.

Нефукозилированные анти-CD20 антитела могут вводиться пациенту известными методами, например, внутривенным введением в виде болюса или непрерывной инфузии на протяжении определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутриспинномозговым, подкожным, внутрисуставным, внутрисиновиальным или подоболочечным путем. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие антитела вводят внутривенно или подкожно.

Бендамустин может вводиться пациенту известными способами, например, внутривенным введением в виде болюса или непрерывной инфузии на протяжении определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутриспинномозговым, подкожным, внутрисуставным, внутрисиновиальным или подоболочечным или пероральным путем. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения такое антитело вводят внутривенно или внутрибрюшинно.

В контексте настоящего изобретения понятие «фармацевтически приемлемый носитель» относится к какому-либо или ко всем материалам, совместимым с фармацевтическим введением, включающим растворители, диспергирующие среды, покровные материалы, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты, а также другие материалы и соединения, совместимые с фармацевтическим введением. За исключением тех случаев, когда какие-либо традиционные среды или агенты несовместимы с действующим соединением, их применение рассматривают в композициях настоящего изобретения. Дополнительные действующие соединения также могут быть включены в композиции.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут быть получены путем переработки анти-CD20 антитела и/или бендамустина по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими носителями. Лактоза, кукурузный крахмал или их производные, тальк, стеариновые кислоты или их соли и др. могут применяться, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул. Соответствующими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воска, жиры, полужидкие и жидкие полиолы и др. Однако в зависимости от природы действующего вещества не требуются носители, обычно необходимые в случае мягких желатиновых капсул. Соответствующим носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительные масла и др. Приемлемыми носителями для суппозиториев являются, например, природные или закалочные масла, воска, жиры, полужидкие и жидкие полиолы и др.

Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать консерванты, разбавители, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты. Они также могут содержать другие вещества терапевтического назначения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция включает и указанное нефукозилированное анти-CD20 антитело с содержанием фукозы 60% или менее (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело является нефукозилированным гуманизированным антителом B-Ly1), и бендамустин для применения в лечении рака, в частности, рак, экспрессирующий CD20.

Указанная фармацевтическая композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, в частности для применения в отношении рака, включающую (i) эффективное количество первого агента -нефукозилированного анти-CD20 антитела с содержанием фукозы 60% или менее (в.одном из. вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1), и (ii) эффективное количество второго агента - бендамустина. Такая композиция необязательно включает фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.

Фармацевтические композиции нефукозилированного анти-CD20 антитела, которая одна применяется в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения путем смешивания антитела требуемой степени чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences)), 1980, 16е изд., под ред. Osol А.) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и к ним относятся буферы, например, фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид, бензетоний хлорид; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; m-крезол); низкомолекулярные полипептиды (содержащие примерно менее 10 остатков); белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофобные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, EDTA; сахара, например, сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; формирующие соли противоионы, например, натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белка); и/или неионные поверхностноактивные агенты, например, TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Фармацевтические композиции бендамустина могут быть близки описанным выше композициям для нефукозилированного анти-CD20 антитела.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированное анти-CD20 антитело и бендамустин перерабатывают в два разных состава.

Действующие ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например,, методами получения, коацерватов или путем объединения, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых микрокапсул и поли(метилметакрилатных)микрокапсул, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микрокапсулы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсии. Такие методы описаны в кн.: ((Remington's Pharmaceutical Sciences», 1980, 16е изд., под ред. Osol А.

Могут быть получены препараты устойчивого высвобождения. Соответствующими примерами препаратов устойчивого высвобождения являются полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, матрицы которых представлены в виде частиц определенной формы, например, в виде пленок или микрокапсул. К примерам матриц устойчивого высвобождения относятся полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиметилметакрилат), или поливиниловый спирт), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинил ацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, например, продукт LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лепролида ацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Составы для применения введением in vivo должен быть стерильным. Это может быть легко выполнено фильтрацией через стерильную мембрану.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, (i) эффективного количества первого агента (нефукозилированного анти-СБ20 антитела, содержащего 60% фукозы или менее; в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированного гуманизированного антитела B-Ly1); и (ii) эффективного количества второго агента (бендамустина).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60%.

Предпочтительно указанный рак является раком, экспрессирующим CD20.

Предпочтительно указанный рак, экспрессирующий CD20, является B-клеточной неходжкинской лимфомой (НХЛ).

Предпочтительно указанным нефукозилированным анти-CD20 антителом является анти-CD20 антитело II типа.

Предпочтительно указанное антитело является гуманизированным антителом B-Ly1.

Предпочтительно указанное гуманизированное антитело B-Ly1 вводят в дозе от 800 до 1200 мг на 1, 8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки до пяти 4-недельных циклов дозирования, и бендамустин вводят в дозе от 80 мг/м2 до 110 мг/м2 на 1 и 2 сутки до шести 4-недельных циклов дозирования.

В контексте настоящего изобретения понятие «пациент» предпочтительно относится к человеку, нуждающемуся в лечении нефукозилированным анти-CD20 антителом (например, пациенту с раком, экспрессирующим CD20) для какой-либо цели, и более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении для лечения рака, или предракового состояния, или повреждения. Однако понятие «пациент» также может относиться к животным, но не к человеку, предпочтительно к млекопитающим, например, собакам, кошкам, лошадям, коровам, свиньям, овцам и приматам, за исключением человека, а также к другим животным.

Настоящее изобретение также предусматривает нефукозилированное анти-CD20 антитело для лечения рака в комбинации с бендамустином.

Настоящее изобретение также включает нефукозилированное анти-CD20 антитело с количеством фукозы 60% или менее и бендамустин для применения в лечении рака.

Предпочтительно указанное нефукозилированное анти-CD20 антитело является гуманизированным антителом B-Ly1.

Предпочтительно раком является рак, экспрессирующий CD20, более предпочтительно В-клеточная неходжкинская лимфома (НХЛ).

Предпочтительно указанное гуманизированное антитело B-Ly1 вводят в дозе от 800 до 1200 мг в 1,8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки до пяти 4-недельных циклов дозирования, и бендамустин вводят в дозе от 80 мг/м2 до 110 мг/м2 на 1 и 2 сутки до шести 4-недельных циклов дозирования.

Приводимые ниже примеры и фигуры предусмотрены для облегчения понимания настоящего изобретения, рамки охвата которого установлены в формуле изобретения. Очевидно, что модификации могут быть произведены в ходе описанных ниже процедур без отклонения от сути настоящего изобретения.

Перечни последовательностей

SEQ ID NO: 1 аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального анти-CD20 антитела B-Ly1 мыши.

SEQ ID NO: 2 аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального анти-CD20 антитела B-Ly1 мыши.

SEQ ID NO: 3-19 аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированных антител B-Ly1 (с В-НН2 по В-НН9, B-HL8 и с B-HL10 по B-HL17).

SEQ ID NO: 20 аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) гуманизированного B-Ly1 антитела B-KV1.

Описание фигур

Фиг.1. Противоопухолевое действие in vivo комбинированного лечения нефукозилированным анти-CD20 антителом II типа (B-HH6-B-KV1 GE) с бендамустином (в сравнении с комбинацией ритуксимаба (фукозилированного анти-CD20 антитела I типа) с бендамустином) и сравнение с соответствующими монотерапиями.

Экспериментальные методы

Противоопухолевое действие комбинированного лечения анти-СР20 антителом II типа (B-HH6-B-KV1 GE) с бендамустином

Исследуемые агенты

Нефукозилированное анти-CD20 антитело B-HH6-B-KV1 GE (нефукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1, гликоинженерное антитело B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получают в виде исходного раствора (9,4 мг/мл) от фирмы GlycArt, Schlieren, Швейцария. Буфер для антитела включает гистидин, трегалозу и полисорбат 20. Раствор антитела разводят соответствующим образом в ФСБ из исходного раствора для инъекций.

Ритуксимаб (мабтера) для клинического использования получают от фирмы Hoffmann La Roche, Базель.

Бендамустин (продукт Ribomustin®) приобретают на фирме Mundipharma GmbH, Limburg an der Lahn, Германия. Необходимые разведения производят из коммерческого исходного раствора 2,5 мг/мл.

Линии клеток и условия культивирования

Линию клеток лимфомы клеток мантии человека Z138 обычным образом культивируют в среде DMEM, обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамином, при 37°C в насыщенной влагой атмосфере с 8% CO2. Четвертый пассаж используют для трансплантации. Проводят совместную инъекцию клеток и продукта Matrigel.

Животные

Самок бежевых мышей линии SCID в возраст 3-4 недели на момент поставки (фирма Charles River, Sulzfeld, Германия) содержат в специфических условиях, исключающих патогенов, при суточном ритме 12 ч света /12 ч темноты в соответствии с одобренными правилами (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол исследования рассматривается и утверждается местной властью. Приобретенных животных выдерживают в карантинном отсеке помещения для животных в течение одной недели для привыкания к новой среде обитания и для наблюдения. Непрерывный мониторинг состояния здоровья проводят на регулярной основе. Диетическую пищу (Provimi Kliba 3337) и воду (подкисленную до pH 2,5-3) предоставляют по потребности.

Мониторинг

У животных ежедневно контролируют клинические симптомы и выявляют побочные эффекты. На протяжении всего эксперимента дважды в неделю определяют массу тела животных, и после определения стадии заболевания циркулем измеряют объем опухоли.

Лечение животных

Лечение животных начинают в день рандомизации через 19 суток после инокуляции опухолевых клеток. Гуманизированное нефукозилированное анти-CD20 антитело B-HH6-B-KV1 GE или ритуксимаб вводят внутрибрюшинно в качестве отдельных агентов раз в 7 суток на 19 и 26 сутки исследования в назначенной дозе 1 мг/кг. В те же дни вводят соответствующий растворитель. Бендамустин вводят внутрибрюшинно на 19, 20, 21 и 22 сутки в количестве 3

мг/кг. В группах комбинированной терапии химиотерапевтический агент вводят через 8 ч после введения обоих антител на 19 сутки.

Исследование подавления роста опухолей in vivo

К концу эксперимента на 33 сутки после инокуляции клеток опухоли отмечают подавление роста опухоли (ПРО), указанное в табл.1, у животных, получающих ритуксимаб, анти-CD20 антитело B-HH6-B-KV1 GE, комбинацию ритуксимаба и бендамустина или комбинацию анти-CD20 антитела и бендамустина, соответственно, по сравнению с контрольной группой. В данном эксперименте лечение только одним бендамустином не показывает какого-либо противоопухолевого действия.

Путем сравнения группы, подвергнутой лечению комбинацией анти-CD20 антителом B-HH6-B-KV1 GE/бендамустином, с группой, в которой лечат только одним анти-СВ20 антителом B-HH6-B-KV1 GE, установлено, что действие превышает аддитивный эффект.

Статистический анализ

Исследование заканчивают на 33 сутки. Статистическая оценка основана на sAUC. Рост опухоли статистически достоверно подавляется в группе 2 (В-НН6-B-KV1 GE, 1 мг/кг, раз в неделю, внутрибрюшинно), что показано величиной TCR=0,72 (ДИ 0,59-0,86), в группе 3 (ритуксимаб, 1 мг/кг, раз в неделю, внутрибрюшинно), что показано величиной TCR=0,78 (ДИ 0,65-0,93), в группе 5 (B-HH6-B-KV1 GE, 1 мг/кг, раз в неделю, внутрибрюшинно, в комбинации с бендамустином, 3 мг/кг, 19-22 сутки исследования, внутрибрюшинно), что показано величиной TCR=0,46 (ДИ 0,34-0,59) и в группе 6 (ритуксимаб, 1 мг/кг, раз в неделю, внутрибрюшинно в комбинации с бендамустином, 3 мг/кг, 19-22 сутки исследования, внутрибрюшинно), что показано величиной TCR=0,67 (ДИ 0,54-0,81) по сравнению с группой применения растворителя (группа 1). Группа 4 (бендамустин, 3 мг/кг, 19-22 сутки исследования, внутрибрюшинно) показывает рост опухолей, сопоставимый с ростом опухолей в контрольной группе к концу исследования.

Комбинация B-HH6-B-KV1 GE с бендамустином показывает действие, оцениваемое более чем аддитивное (синергетически) и статистически значимое, по подавлению роста опухолей по сравнению с отдельными обработками, исследованными в тесте Tukey-Kramer (р<0,001) (см. табл.1 и фиг.1).

Таблица 3
Параметрический показатель TCR при низком и высоком доверительном интервале (ДИ), основанный на sAUC и ПРО (%)
Группа Схема лечения TCR 95% ДИ относительно группы 1 ПРО (%)
2 B-HH6-B-KV1 GE (раз в неделю, 1 мг/кг) 0,72 [0,59-0,86] 47
3 Ритуксимаб (раз в неделю, 1 мг/кг) 0,78 [0,65-0,93] 29
4 Бендамустин (на 19-22 сутки исследования, 3 мг/кг) 0,9 [0,76-1,06] 0
5 B-HH6-B-KV1 GE (раз в неделю, 1 мг/кг)+Бендамустин (на 19-22 сутки исследования, 3 мг/кг) 0,46 [0,34-0,59] 72
6 Ритуксимаб (раз в неделю, 1 мг/кг)+Бендамустин (на 19-22 сутки исследования, 3 мг/кг) 0,67 [0,54-0,81] 42

1. Применение нефукозилированного анти-CD20 антитела с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) в положении Asn297 для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином,
отличающееся тем, что раком является рак, экспрессирующий CD20, и тем, что указанное антитело включает
аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 7
и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 20.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что количество фукозы составляет от 40 до 60%.

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что указанный рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной неходжкинской лимфомой (НХЛ).

4. Применение по одному из пп. 1-3, отличающееся тем, что вводят один или несколько дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединений или применяют ионизирующую радиацию, что повышает действие таких агентов.

5. Применение по одному из пп. 1-4, отличающееся тем, что указанное антитело вводят в дозе 800-1200 мг на 1, 8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки 4-недельного цикла, который может продолжаться до 5 раз, и бендамустин вводят в дозе от 80 мг/м2 до 110 мг/м2 на 1 и 2 сутки 4-недельного цикла, который может продолжаться до 6 раз.

6. Способ лечения рака, экспрессирующего CD20, включающий применение нефукозилированное анти-CD20 антитела с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 в комбинации с бендамустином, отличающийся тем, что указанное антитело включает
аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 7
и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 20.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что количество фукозы составляет от 40 до 60%.

8. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что указанный рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной неходжкинской лимфомой (НХЛ).

9. Способ по любому из пп. 6-8, отличающийся тем, что вводят один или несколько дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединений или применяют ионизирующую радиацию, что повышает действие таких агентов.

10. Способ по любому из пп. 6-9, отличающийся тем, что указанное антитело вводят в дозе 800-1200 мг на 1, 8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки 4-недельного цикла, который может продолжаться до 5 раз, и бендамустин вводят в дозе от 80 мг/м2 до 110 мг/м2 на 1 и 2 сутки 4-недельного цикла, который может продолжаться до 6 раз.



 

Похожие патенты:

Предложенное изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело против CXCR4 человека или его функциональный фрагмент, которые характенизуются тем, что содержат легкую и тяжелую цепи, содержащие по 3 соответствующих CDR.

Изобретение относится к области иммунологии. Представлены вариантные выделенные анти-CXCR4-антитела 414H5, 515H7 и их антигенсвязывающие фрагменты, способные ингибировать активацию CXCR4, где каждое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит набор из 6 CDR, последовательности, которых представлены в описании.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и представляет собой способ изготовления биспецифического антитела, которое содержит: а) тяжелую цепь и легкую цепь первого антитела полной длины, которое специфически связывается с первым антигеном; и б) тяжелую цепь и легкую цепь второго антитела полной длины, которое специфически связывается со вторым антигеном, где N-конец тяжелой цепи связан с С-концом легкой цепи через пептидный линкер, причем каждый из СН3-домена тяжелой цепи антитела полной длины а) и СН3-домена тяжелой цепи антитела полной длины б) встречается на контактной поверхности, которая включает изменения в исходной контактной поверхности СН3-доменов антитела; где изменения в СН3-доменах тяжелых цепей представляют собой изменения типа «ключ-замок»; где указанный способ включает этапы: а) трансформации клетки-хозяина векторами, содержащими нуклеиновокислотные молекулы, кодирующие указанную молекулу биспецифического антитела, б) культивирования клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез указанной молекулы биспецифического антитела; и в) извлечения указанной молекулы биспецифического антитела из указанной культуры.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены варианты выделенного антитела или его фрагмента, которые специфично связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека.

Изобретения относятся к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая выделенное антитело или его фрагмент, связывающееся с нейропилином 1 (варианты), способ получения антитела или его фрагмента, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело или его фрагмент, клетка-хозяин для экспрессии вышеуказанного антитела или его фрагмента, иммуноконъюгат, содержащий антитело или его фрагмент, способ обнаружения нейропилина 1.

Настоящее изобретение относится к области биохимии. Предложены способы скрининга антитела IgG, обладающего повышенной способностью элиминировать антиген в плазме, основанные на отборе IgG, антигенсвязывающая активность которого при рН от 6,7 до 10,0 выше антигенсвязывающей активности при рН от 4,0 до 6,5.

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное гуманизированное антитело, которое специфически связывается с внеклеточным доменом рецепторной тирозинкиназы AXL и которое, по меньшей мере, частично ингибирует активность AXL.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и раскрывает группу гуманизированных рекомбинантных антител, специфически связывающихся с человеческим CDCP1.

Изобретение относится к области иммунологии. Представлены вариантные выделенные антитела 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9 и 2.14H9-opti и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывается с В7-Н1, где каждое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит набор из 6 CDR, последовательности которых представлены в описании.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) человека, в том числе в форме меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конструкции с константным доменом иммуноглобулина, конъюгата с терапевтическим или цитотоксическим средством и в кристаллизованной форме.
Изобретение относится к медицине и заключается в липосоме, содержащей бислойную мембрану и внутреннюю водную фазу. Внутренняя водная фаза содержит соль сульфобутилового эфира циклодекстрина, образованную сульфобутиловым эфиром циклодекстрина с одним или более из гидроксида аммония, триэтиламина и триэтаноламина, и активное вещество, выбранное из винорелбина, винкристина, топотекана и иринотекана.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым гетероциклическим соединениям общей формулы (I) или к его фармацевтически приемлемым солям, где X является CR2; Y является CR4; Z является CR8; R2 является Н; R3 является Н, гало или R9; R4: Н, -(CR14R15)nNR11R12, -(CR14R15)nOR11, моноцикл, обладающий 4-6 кольцевыми членами, 1-2 из которых представляют собой гетероатомы, выбранные из азота и кислорода, или бицикл, обладающий 7-8 кольцевыми атомами, 1-2 из которых представляют собой гетероатомы, выбранные из азота, где указанные моноцикл и бицикл необязательно замещены одной группой R13; каждое n независимо представляет собой 0-2; R5: Н, -(CR14R15)nNR11R12, -(CR14R15)nOR11; R6: Н, CN или пиразолил, необязательно замещенный одной группой R13; R8 является Н; R9 является С1-6-алкил; R11 и R12: H, C1-6-алкил, С3-6-циклоалкил, моноцикл, обладающий 4-7 кольцевыми членами, 1 из которых представляет собой гетероатом, выбранный из азота и кислорода, или бицикл, обладающий 7-8 кольцевыми атомами, 1 из которых представляет собой гетероатом азота, где указанные алкил, циклоалкил, моноцикл и бицикл необязательно замещены от одной до двух групп R13; R11 и R12 вместе с атомом N, к которому они присоединены, необязательно образуют 4-7-членное моноциклическое или бициклическое кольцо, обладающее дополнительными 0-1 гетероатомами, выбранными из О и N, указанное кольцо может быть необязательно замещено от одной до двух групп R13; R13 представляет собой гало, оксо, -(CR14R15)nC(=Y′)R16, -(CR14R15)nNR16R17, -(CR14R15)nOR16, -(CR14R15)nNR16C(=Y′)R17 или R16; R14 и R15 являются H; R16 и R17: Н, С1-6-алкил, моноцикл, обладающий 4-6 кольцевыми членами, 1-2 из которых представляют собой гетероатомы, выбранные из азота и кислорода, или бицикл, обладающий 7-8 кольцевыми атомами, 1 из которых представляет собой гетероатом азота, где указанные алкил, моноцикл или бицикл необязательно замещены от одной до трех групп R18; R16 и R17 вместе с атомом N, к которому они присоединены, необязательно образуют 5-6-членное кольцо, обладающее дополнительными 0-1 гетероатомами, выбранными из О, указанное кольцо может быть необязательно замещено от одной до двух групп R18; R18: С1-6-алкил, С3-6-циклоалкил, моноцикл, обладающий 4-5 кольцевыми членами, 1 из которых представляет собой гетероатом, выбранный из азота и кислорода, или бицикл, обладающий 7-8 кольцевыми атомами, 1-2 из которых представляют собой гетероатомы, выбранные из азота, гало, CF3, -(CR19R20)nOR23, -(CR19R20)nS(O)2R23 или -(CR19R20)nS(O)2NR23R24, где указанный алкил необязательно замещен одной группой R21; R19 и R20 являются Н; R23 и R24: Н, С1-6-алкил; каждый R21 независимо представляет собой Н или галоген; Y′ представляет собой О.

Предложены рекомбинантный аденовирус, фармацевтическая композиция, содержащая такой вирус, и способ лечения рака с использованием такого вируса или композиции. Охарактеризованный рекомбинантный аденовирус содержит полинуклеотид, кодирующий комплекс рибозима, опосредующего транс-сплайсинг, и HSVtk (тимидинкиназы вируса простого герпеса человека), где рибозим, опосредующий транс-сплайсинг, представляет собой рибозим Rib67, и где мишенью рибозима, опосредующего транс-сплайсинг, является мРНК гена рак-специфичной TERT (обратной транскриптазы теломеразы) и противораковый терапевтический ген, кодирующий sPD-1 (растворимый белок программируемой гибели 1).

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Описан иммуноконъюгат для лечения опухолевых расстройств, связанных с мезотелином.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противоопухолевому средству. Противоопухолевое средство, представляющее собой рекомбинантный циклофилин А человека в виде раствора в фосфатном буфере, является продуцентом штамма Escherichia coli (BL21(DE3)Gold/pETCYPopti, депонированного во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика, регистрационный номер В-11983 от 18 июля 2014 г.

Изобретение относится к соединению структурной формулы I, которое может быть использовано для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности симптомов заболевания или состояния, восприимчивого к стимуляции высвобождения IL-8 кератиноцитов, восприимчивого к стимуляции окислительного взрыва нейтрофилов или восприимчивого к индуцированию некроза.

Изобретение относится к соединению структурной формулы I, которое может быть использовано для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности симптомов заболевания или состояния, восприимчивого к стимуляции окислительного взрыва нейтрофилов, восприимчивого к стимуляции высвобождения IL-8 кератиноцитов или восприимчивого к индуцированию некроза.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы (I), которые обладают Btk-селективной ингибирующей активностью (ингибиторы тирозинкиназы Брутона). При этом соединения проявляют метаболическую устойчивость и не обладают гепатотоксичностью, то есть являются безопасными терапевтическими средствами для лечения заболеваний, в которых задействованы В-клетки или мастоциты.

Изобретение относится к арил-замещенным карбоксамидным производным формулы (I) или их фармацевтически приемлемым солям, где в формуле (I) R представляет собой водород; R1 независимо выбран из группы, состоящей из: (1) водорода, (2) галогена, (3) гидроксила, (4) -On-C1-6 алкила, где алкил является незамещенным или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из R7, (5) -On-гетероциклической группы, выбранной из пиперидинила, пирролидинила, тетрагидропиранила, тетрагидрофуранила и оксетанила; n имеет значение 0 или 1, когда n имеет значение 0, вместо On присутствует химическая связь; р имеет значение 1 или 2; когда р имеет значение два, R1 могут быть одинаковыми или отличными друг от друга; R2 представляет собой C1-6 алкил, который является незамещенным или замещенным одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из R7; или R2 вместе с R1 образует С3-С6 циклоалкил; X представляет собой 1,2-С3 циклоалкилен; W, Y и Z независимо выбраны из атома азота и атома углерода; по меньшей мере, один из W, Y и Z представляет собой азот и W, Y и Z, в одно и то же время, не являются углеродом; R3, R4, R5 и R6 являются такими, как указано в формуле изобретения; Ar означает арил, который представляет собой моно- или би-карбоциклическое или моно- или би-гетероциклическое кольцо, содержащее 0-3 гетероатома, выбранных из О, N и S, включая фенил, фурил, оксазолил, тиазолил, имидозолил, пиридил, пиперидинил, пиримидинил, изооксазолил, триазолил, тетрагидронафтил, бензофуранил, бензотиофенил, индолил, бензоимидазолил, хинолил, изохинолил, хиноксалинил, пиразоло [1,5-а] пиридил, тиено [3,2-b] пирролил, где арил необязательно замещен 1-3 заместителями, указанными в формуле изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению противоопухолевых лекарственных средств для генной терапии, и может быть использовано в медицине. Получают лекарственное противоопухолевое средство, содержащее генную конструкцию в форме плазмидной ДНК, включающей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), заключенную в полимерный носитель - сополимер полиэтиленгликоль-полиэтиленимин-тat пептид (ПЭГ-ПЭИ-ТАТ).

Предложенное изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, которое специфически связывается с альфа-синуклеином человека, содержащее зрелые вариабельные области тяжелой и легкой цепей с соответствующими аминокислотными последовательностями.
Наверх