Способ идентификации соединений для лечения рака

Изобретение относится к области онкологии и касается комплекса, включающего сочетания полиинозинполицитидиловой кислоты (pIC) и полиэтиленимина (PEI), и его применения в качестве средства для лечения рака, в частности меланомы. Изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую комплекс для применения в лечении меланомы, где указанный комплекс индуцирует аутофагию в клетках меланомы или в клеточной линии, полученной из клеток меланомы, и указанный комплекс включает сочетание pIC и линейного PEI с соотношением N/P 1 к 5. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 13 пр., 15 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области онкологии, и оно главным образом направлено на идентификацию соединений, которые можно использовать для лечения различных видов рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, глиомы, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.

Кроме того, настоящее изобретение также охватывает соединения, определенные таким способом, например, соединение BO-110 (см. ниже), которое способно вызывать отчетливую гибель опухолевых клеток во всех указанных выше видах рака.

Уровень техники

Меланома остается прототипом солидных видов рака с ростом числа заболеваний и крайне неблагоприятным прогнозом на поздних стадиях (Jemal et al., 2008). Значительные усилия были посвящены идентификации молекулярных детерминант, лежащих в основе химической и иммунной резистентности меланомы. Единственными средствами, одобренными Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения метастатической меланомы, являются алкилирующий агент дакарбазин (DTIC) и иммуномодулятор IL-2 (Tawbi and Kirkwood, 2007). Тем не менее, надежный и полный ответ на лечение при метастатической меланоме редко встречается более чем у 5% пациентов, и вторичная токсичность может быть очень серьезной. В результате, в настоящее время средняя продолжительность жизни больных с метастатической меланомой составляет от 6 до 10 месяцев и, следовательно, разработка более совершенных способов лечения является приоритетной при данном заболевании (Jemal et al., 2007).

Первоначально, синтетический аналог вирусной дсРНК, называемый pIC (полиинозин-полицитидиловая кислота), соединение, которое используется уже более четырех десятилетий для стимуляции иммунной системы независимо от интерферона (IFN) (Field et al., 1967), считался перспективным терапевтическим средством против меланомы. К сожалению, клинические исследования с «голой» pIC выявили ее низкую стабильность, низкую степень индукции интерферона и отсутствие противоопухолевого эффекта при меланоме (Robinson et al., 1976). Таким образом, в качестве монотерапии pIC считается малоэффективным лекарственным средством против меланомы.

Высокопроизводительный гистогенетический анализ и систематические функциональные исследования значительно расширили наше понимание возникновения и прогрессирования меланомы и сложных механизмов, связанных с неэффективностью лечения (Fecher et al., 2007; Gray-Schopfer et al., 2007). Были идентифицированы соответствующие дефекты и изменения в сигнальных каскадах реакций BRAF/MAPK; PI3K/AKT, NF-κB или NOTCH, составившие многообещающую платформу для рациональной разработки лекарственных средств (Gray-Schopfer et al., 2007). Однако направленная терапия до сих пор не доказала свою эффективность в испытаниях на меланоме (Flaherty, 2006). Программы клеточной гибели, контролируемые митохондриями и/или эндоплазматическим ретикулумом, также проходят апробацию, хотя неизменно являются неэффективными in vivo (Hersey and Zhang, 2008). Следовательно, используемые в настоящее время противораковые лекарственные средства либо не достигают своей цели(лей) продуктивно, либо должны быть введены в дозировках, которые приводят к непереносимой токсичности для нормальных клеточных компартментов (Tawbi and Kirkwood, 2007). Важно отметить, что в процессе лечения могут активизироваться компенсаторные механизмы, приводящие к отбору клеточных популяций с еще большей устойчивостью к химическим препаратам (Lev et al., 2004; Shatton et al., 2008; Wolter et al., 2007).

В сущности, считается, что меланома обладает сильной способностью избегать апоптоза через различные пути, что дает меланоме возможность прогрессировать, образовывать метастазы и не поддаваться лечению различными терапевтическими методами (обзор Ivanov et al., 2003).

В отличие от стандартной химиотерапии, направленной на уничтожение опухолевых клеток в основном «изнутри» (то есть, путем активации внутренней программы клеточной гибели), в иммунотерапии традиционно задействованы непрямые каскады межклеточных взаимодействий. При меланоме основные усилия были сосредоточены на повышении содержания или функциональной эффективности двух составляющих: антиген-презентирующих клеток и цитотоксических Т-клеток (Wilcox and Markovic, 2007). Вакцины, а также антитела, направленные против ингибиторных иммуномодуляторов (например, CTL4), также проходят испытания, хотя и с разочаровывающими результатами в фазе IV клинических испытаний (Kirkwood et al., 2008). В последнее время проводятся исследования стимуляции иммунной системы посредством активации Toll-подобных рецепторов (TLR)-3, -4, -7 и -9 для обеспечения цитотоксического разрушения клеток меланомы при помощи натуральных киллеров (NK), дендритных клеток (DC) и Т-клеток (Kirkwood et al., 2008, и Tormo et al., 2007). Тем не менее, многочисленные исследования, включая исследования авторов изобретения, продемонстрировали присущую клеткам способность обходить иммунологическую терапию путем понижающей регуляции (корректировки) иммунореактивных поверхностных маркеров. Меланомы также могут оказывать подавляющее действие на хозяина (например, ингибирование созревания антиген-презентирующих клеток или блокада полной активации Т-клеток) (Tormo et al., 2006; Ilkovitch and Lopez, 2008; Verma et al., 2008). Таким образом, меланомы демонстрируют присущую им способность избегать противоопухолевого эффекта иммуномодуляторов.

В области иммунотерапии одной из молекул, увеличение числа которых изучается как потенциальный положительный фактор для лечения меланомы, является MDA-5 (ассоциированный с дифференциацией меланомы ген 5), продукт, изначально описанный как ген, связанный с дифференциацией меланомы (Kang et al., 2002). MDA-5 представляет собой геликазу, которая узнает и активируется длинной двухцепочечной РНК (дсРНК) (Yoneyama et al., 2005). Другими РНК геликазами являются RIG-1 (индуцируемый ретиноевой кислотой белок 1, также называемый Dsx58), который узнает голые 3-фосфаты короткой дсРНК, и LGP2 (также называемый Dhx58), являющийся отрицательным регулятором при опознавании дсРНК.

До тех пор, пока дсРНК могут создаваться в результате и в процессе вирусных инфекций, MDA-5 выступает в качестве первой линии врожденного иммунитета против вирусных патогенов (Akira et al., 2006). Кроме того, MDA-5 имеет домены рекрутинга активации каспазы (CARD). Геликаза и домены CARD совместно активируют NF-κB и другие факторы транскрипции, вовлеченные в регуляцию цитокинов (Kawai et al., 2005). Таким образом, наиболее известной функцией MDA-5 является иммунная стимуляция.

С терапевтической точки зрения известно, что как IFN-β, так и дсРНК индуцируют транскрипцию гена Mda-5. Вследствие этого, было высказано предположение, что дсРНК играет роль в увеличении экспрессии Mda-5 при индуцированном IFN ингибировании роста. Кроме того, показано (Kang et al., 2002), что индукция эндогенной MDA-5 с помощью IFN-β является цитостатической (другими словами, останавливает клеточный цикл). Таким образом, для активации гибели опухолевых клеток MDA-5 должна быть избыточно экспрессирована эктопически на высоких уровнях (Kovacsovics et al., 2002). Более того, данная проапоптотическая активность эктопической экспрессии MDA-5 не эффективна в опухолевых клетках с гиперактивным путем RAS/MEK/ERK (Lin et al., 2006), как в случае с меланомами (Chin et al., 2006). Таким образом, нерешенным вопросом в этой области было то, как активировать эндогенную MDA-5 с помощью химиотерапевтических средств исключительно применительно к области опухоли (не вызывая вторичную токсичность в нормальных клетках).

В патентной заявке US 2007/0259372 предложена идентификация агонистов или антагонистов IFN-β, IFN-α или IFN-γ с помощью соединений, способных усиливать экспрессию MDA-5. В этом патенте также высказано предположение, что индукторы экспрессии гена Mda-5 (с помощью его промотора) можно рассматривать как соединения-кандидаты для индукции терминальной дифференциации опухолевых клеток. Также там высказано предположение о возможной роли MDA-5 в генерации апоптотических сигналов через ее домен CARD. Однако до настоящего времени не было известно, какие мишени MDA-5 способны запускать апоптоз, и как активировать ее отслеживаемым и избирательным для опухолевых клеток образом. Кроме того, поскольку клетки меланомы имеют активный путь RAS/MEK/ERK (который ингибирует MDA-5), а также выраженную способность избегать апоптотической клеточной гибели, не было очевидно, что апоптотические сигналы, опосредованные MDA-5, могут быть действующим механизмом для терапии против меланомы. Вследствие этого, на основании предыдущей информации о регуляции и функции MDA-5 данный белок не считался убедительной целью для методов по идентификации кандидатов в терапевтические средства против меланомы.

Аутофагия становится альтернативной стратегией для активизации эндогенного механизма гибели раковых клеток.

Этот процесс включает сложный каскад событий, которые в конечном итоге приводят к секвестрации цитозольных компонентов для последующей деградации лизосомами (Xie and Klionsky, 2007). В зависимости от механизма поглощения и природы груза, доставляемого в аутолизосомы, описано множество механизмов аутофагии. В контексте противоракового лечения, макроаутофагия или массовая деградация клеточных органелл и белковых агрегатов, вызывает интерес из-за ее способности ставить под угрозу жизнеспособность клеток за счет дисфункции или избыточного истощения основных органелл (например, эндоплазматического ретикулума или митохондрий) (Hoyer-Hansen, 2008).

Однако неизвестно, каким образом регулируется аутофагия, и ее терапевтический потенциал не является ясным и простым (Hippert et al., 2006). С другой стороны, макроаутофагия (которая далее в данном документе будет называться просто «аутофагией») продемонстрировала значительный потенциал для защиты клеток от различных агрессивных внутриклеточных и внеклеточных сигналов, включая противораковые лекарственные средства. За счет этой активности аутофагия может стимулировать развитие опухоли (Mizushima et al., 2008; Kroemer and Levine, 2008).

Как ни парадоксально, аутофагия также связана с гибелью клеток (Kromer et al., 2009). Таким образом, чрезмерная или постоянная аутофагия может способствовать гибели клеток вследствие истощения основных органелл (то есть, эндоплазматического ретикулума или митохондрий), изменения сигналов выживания, дерегулирования лизосомальных ферментов, и/или активации зависимых от каспаз программ апоптоза (Xie and Klionsky, 2007).

Следовательно, неясно, будет ли аутофагия усиливать химическую и иммунную резистентность меланомы вместо улучшения результатов лечения. Кроме того, ни один из более чем 20 генов аутофагии, описанных в настоящее время в клетках млекопитающих, не был охарактеризован подробно в случае меланомы. Вследствие этого, неизвестно, регулируется ли аутофагия различным образом в клетках меланомы и нормальных клетках, что могло бы обеспечить возможность для терапевтического вмешательства. Аналогичная ситуация имеет место в случае агрессивных видов рака, таких как те, что затрагивают поджелудочную железу, мочевой пузырь, предстательную железу и мозг.

В данной ситуации сохраняется потребность в выявлении терапевтических средств для лечения рака, альтернативных тем, которые уже официально применяются, и, в частности тех, которые подходят для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом. Также остается необходимость в обнаружении возможных новых терапевтических мишеней для разработки методов идентификации терапевтических средств-кандидатов для лечения рака среди соединений, способных воздействовать на эти мишени.

Таким образом, настоящее изобретение предлагает решение для обеих проблем.

Описание изобретения

Как указано выше, настоящее изобретение прежде всего направлено на идентификацию терапевтических мишеней, маркеров или параметров, которые создают основу для разработки способа, полезного для идентификации соединений (среди тех, которые способны воздействовать на эти терапевтические мишени, маркеры или параметры), способных лечить рак.

Одним из маркеров, определенных в настоящем изобретении, который полезен для идентификации соединений, способных лечить рак, является уровень активации геликазы семейства MDA-5. Этот параметр можно определять, проверяя наличие протеолитического расщепления белка, которое приводит к разделению геликазных и каспазных доменов: для того, чтобы быть терапевтическим средством для лечения рака, соединение-кандидат должно приводить к протеолитическому расщеплению, что является свидетельством того, что оно может вызывать активацию аутофагии и механизмов апоптоза, приводящих к гибели раковых клеток. Возможной методикой данного теста является иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг) белковых экстрактов культуры клеток и проверка сигнальных полос, соответствующих целому белку и фрагментам, соответствующим геликазным доменам и каспазным доменам. В частности, как показано в примере 3, появление полосы 30 кДа свидетельствует о наличии протеолитического расщепления. Альтернативно, это может также указывать на активацию других геликаз семейства MDA-5, таких как RIG-I или LGP2.

Другим маркером, определенным в настоящем изобретении, также полезным для идентификации соединений, способных лечить рак, является уровень экспрессии NOXA. Обоснованием является увеличение уровней экспрессии соответствующих генов, когда механизмы аутофагии и апоптоз активированы. Определение уровней экспрессии этих белков можно проводить, например, определяя концентрацию соответствующей матричной РНК (это можно осуществлять, например, методами нозерн-блоттинга или ОТ-ПЦР) или концентрацию самого белка в белковом экстракте соответствующей культуры клеток (например, посредством переноса, подобного вестерн-блоттингу). Кроме того, NOXA можно определять in situ (в образцах тканей) иммуногистохимическими методами.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определяют и MDA-5 и NOXA, как подтверждение того, что механизмы аутофагии и апоптоза активированы, поскольку MDA-5 считается связующим звеном между ними.

Кроме того, изобретение может включать стадию определения индукции аутофагии соединением-кандидатом, предназначенным для применения против рака. Индукцию аутофагии можно определять несколькими методами, которые включают:

• Мониторинг посттрансляционной модификации белка, экспрессированного геном 8 аутофагии (называемым ATG8 или LC3). Белок LC3 процессируется и липидируется при включении в аутофагосомы, которые представляют собой мембранные структуры, в которые клеточные компоненты захватываются в процессе аутофагии. Вследствие того, что конформация и электрофоретическая подвижность этого белка меняется при липидировании, одним из возможных методов для проверки индукции аутофагии является использование метода иммуноблоттинга с антителами, направленными против этого белка. Этот метод позволяет убедиться, что после проведения электрофореза полоса, соответствующая белку, отличается в контрольных образцах по сравнению с образцами, в которых, предположительно, соединение индуцировало аутофагию. Альтернативно, если антитело специфически узнает форму аутофагосом, связывание антитела подтвердит индукцию аутофагии в образце, обработанном соединением-кандидатом.

• Мониторинг изменений во внутриклеточном распределении белка LC3, поскольку другой отличительной чертой аутофагии является перемещение LC3 из цитозоля во вновь образованные аутофагосомы (Xie and Klionsky, 2007). Таким образом, образование белковых очагов можно считать показателем образования аутофагосом, особенно на ранних стадиях. Обнаружение можно проводить, контролируя эндогенный LC3 методами иммунофлуоресценции или иммунохимии на фиксированных клетках или фиксированных тканях. Альтернативно, аутофагию можно визуализировать в живых клетках, определяя клеточную локализацию флуоресцентного производного LC3. В качестве флуоресцентного белка принято использовать GFP (зеленый флуоресцентный белок) или RFP (красный флуоресцентный белок), которые позволяют отслеживать аутофагию с помощью флуоресцентной микроскопии: изменения клеточного распределения флуоресценции от диффузной картины к очаговому окрашиванию свидетельствуют об индукции аутофагии. В настоящем изобретении данная методика предполагает использование либо клеток, которые были трансфицированы вектором, делающим возможной временную экспрессию слитого белка (таким, как плазмида или рекомбинантный вирус), либо клеток, в которые фрагмент ДНК, способный экспрессировать слитый белок, образованный репортерным белком и LC3, интегрирован в геном стабильно. Пример такой стратегии приведен ниже в примере 1, когда клетки предварительно трансфицировали рекомбинантным ретровирусом. Это привело к вставке в клеточный геном фрагмента ДНК, содержащего вместе кодирующие части белков GFP и LC3, таким образом, что это приводит к образованию слитого белка в клеточной геномной ДНК. Таким образом, можно проводить тесты на изменения внутриклеточного распределения со стабильно трансфицированными клетками.

• Использование трансмиссионной электронной микроскопии для обнаружения проникновения соединения-кандидата в клетку. Эта ситуация управляет образованием аутофагосом на более поздних стадиях процесса аутофагии. Визуализации накопления плотных структур (связанных с мембраной) считается характерной особенностью образования аутофагосом. Процесс аутофагии можно подтверждать на более поздних стадиях процесса (то есть, через 24 или 30 часов после обработки тестируемым соединением), во время которых в электронный микроскоп можно увидеть образование крупных фагоцитарных вакуолей, свидетельствующих о гибели клеток.

Учитывая изложенное выше, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу (далее в данном документе называемому способом по изобретению) идентификации соединений, используемых для лечения рака, включающему стадии:

a) приведения соединения-кандидата в контакт с культурой раковых клеток или линией раковых клеток, происходящей из раковых клеток;

b) определения, по меньшей мере, одного из следующих параметров:

i. уровня активации геликазы семейства MDA-5;

ii. уровня экспрессии NOXA;

iii. либо их сочетание;

c) сравнения данных, полученных на стадии b), с данными, наблюдаемыми в контроле из тех же клеток, обработанных аналогичным образом, но в отсутствие соединения-кандидата;

d) выбора соединений, которые привели к значительному увеличению параметра или параметров, определенных в пункте b), по сравнению с контролем.

Следует отметить, что разница между данными, полученными от клеточной культуры, обработанной соединением-кандидатом, и от необработанного контроля, будет считаться статистически значимой, если при анализе получена величина p<0,05.

В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению также определяет, индуцирует ли соединение-кандидат аутофагию в раковых клетках, в клеточной линии, происходящей из раковых клеток, или на мышиной модели рака. Как объяснялось выше, определение индукции аутофагии можно проводить путем проверки уровня экспрессии, наличия посттрансляционной модификации или внутриклеточной локализации белка аутофагии. Более конкретно, индукцию аутофагии определяют методом, выбранным из: изменения электрофоретической подвижности белка LC3 или обнаружения образования очагов белка LC3. Альтернативно, индукцию аутофагии определяют путем проверки наличия аутофагосом с помощью микроскопического исследования, например, используя трансмиссионную электронную микроскопию.

В следующем предпочтительном варианте осуществления вышеописанный способ по изобретению включает три стадии: определение уровня активации MDA-5, уровня экспрессии NOXA и индукции аутофагии.

Способ по изобретению можно использовать для идентификации соединений, используемых в качестве терапевтических средств для лечения различных видов рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.

Вследствие этого, если настоящее изобретение направлено на идентификацию соединений для применения в качестве терапевтических средств для лечения меланомы, то она будет включать следующие стадии:

a) приведение соединения-кандидата в контакт с культурой клеток меланомы или клеточной линией, полученной из клеток меланомы;

b) определение, по меньшей мере, одного из следующих параметров:

i. уровень активации геликазы семейства MDA-5;

ii. уровень экспрессии NOXA;

iii. либо их сочетание;

c) сравнение данных, полученных на стадии b), с данными, наблюдаемыми в контроле из тех же клеток, обработанных аналогичным образом, но в отсутствие соединения-кандидата;

d) выбор соединений, которые привели к значительному увеличению параметра или параметров, определенных в пункте b), по сравнению с контролем.

Что касается подходящих клеточных линий, то можно использовать любую линию клеток меланомы, предпочтительно человеческую. Примерами подходящих клеточных линий, используемых в примерах по изобретению, являются человеческие клеточные линии SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 и SK-Mel-147, а также мышиные клетки B16. Нормальными контрольными клетками являются меланоциты или другие клетки кожи, а также клетки иммунной системы, которые, как правило, представляют собой центры вторичной токсичности при лечении рака.

Альтернативно, способ по изобретению может быть направлен на идентификацию соединений для применения в качестве терапевтических средств для лечения, по меньшей мере, одного из следующих видов рака: карциномы поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника. В этом случае способ по изобретению будет включать следующие стадии:

a) приведение соединения-кандидата в контакт с культурой раковых клеток, по меньшей мере, одного из перечисленных выше видов рака, или клеточной линией, полученной из клеток, по меньшей мере, одного из перечисленных выше видов рака;

b) определение, по меньшей мере, одного из следующих параметров:

i. уровень активации геликазы семейства MDA-5;

ii. уровень экспрессии NOXA;

iii. либо их сочетание;

c) сравнение данных, полученных на стадии b), с данными, наблюдаемыми в контроле из тех же клеток, обработанных аналогичным образом, но в отсутствие соединения-кандидата;

d) выбор соединений, которые привели к значительному увеличению параметра или параметров, определенных в пункте b), по сравнению с контролем.

В этом случае клеточную линию будут выбирать из группы линий клеток рака поджелудочной железы: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 и Panc-1; или из группы линий клеток рака толстой кишки: CACO, SW480 и SW1222; или из группы линий клеток рака мочевого пузыря: RT112, MGHu4, 639V, 253J, MGHu3 и SW1170; или из группы линий клеток глиомы: U87MG, U251 и T98G; или из группы линий клеток рака молочной железы: MDA231, MCF7 и T47D; или из группы линий клеток рака предстательной железы: LNCaP, PC3 и DU145; или из группы линий клеток рака легкого: H1299 и NCI H460; или из группы линий клеток рака яичника: NCI H23, CHQK1 и SK-OV-3.

Предпочтительный вариант осуществления способа по изобретению описан ниже в примерах изобретения. В таком случае способ по изобретению осуществляют, используя сочетание определения активации MDA-5, анализа генной экспрессии (наблюдение увеличения экспрессии NOXA) и подтверждения активации аутофагии тремя возможными методами, описанными ранее: мониторингом посттрансляционных модификаций белка LC3 при помощи иммуноблоттинга, отслеживанием изменений в клеточном распределении LC3 путем детекции флуоресценции за счет флуоресцентного белка GFP (с клетками, предварительно трансфицированными рекомбинантным ретровирусом, содержащим структуру, способную экспрессировать слитый белок GFP-LC3), подтверждением образования аутофагосом методом электронной трансмиссионной микроскопии через 5 часов обработки соединением-кандидатом и подтверждением наличия фагоцитарных вакуолей через 30 часов обработки.

Следует отметить, что описанный выше способ по изобретению позволяет идентифицировать новое соединение, представляющее собой сочетание двухцепочечной РНК (дсРНК) или ее аналога и поликатиона. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное соединение представляет собой BO-110 (pIC^PEI), являющееся сочетанием полиинозин-полицитидиловой кислоты (pIC) и полиэтиленимина (PEI).

Как показано ниже в примерах и фигурах по настоящему изобретению, BO-110 можно эффективно применять для лечения различных видов рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.

Вследствие этого, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей BO-110, для применения в лечении рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника. Эта фармацевтическая композиция также полезна для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом.

Удивительно, но при функциональном взаимодействии pIC и PEI достигается синергетический технический эффект, в результате которого улучшается и изменяется сумма технических эффектов отдельных составляющих. Таким образом, BO-110 проникает в клетки и действует иным образом, чем его компоненты PEI и pIC. В частности, в то время как PEI не имеет заметного клеточного эффекта, а сигналы выделенной pIC временно вызывают иммунные ответы, которые в конечном счете не оказывают биологического воздействия in vivo, BO-110 обладает способностью избирательно уничтожать опухолевые клетки. Вследствие этого, BO-110 иллюстрирует концепцию синтетической летальности, описанной для генов или соединений, которые в виде отдельных веществ не имеют активности, однако в сочетании обладают отличающимся и терапевтически применимым противораковым эффектом.

Поэтому одним из наиболее важных пунктов настоящего изобретения является неожиданное открытие, что миметик вирусной дсРНК полиинозин-полицитидиловая кислота (pIC) меняет свой маршрут проникновения и доставки в опухолевые клетки. От стандартного узнавания TLR-3 (Toll-подобным рецептором 3), pIC может быть направлена на семейство сенсоров дсРНК (отличных от TLR3), если эта дсРНК объединена с семейством носителей, которые специфически делают возможной доставку в цитозоль. Такая активность изменяет механизм действия дсРНК от несущественного иммуномодулятора до масштабного убийцы опухолевых клеток. Противораковая активность была продемонстрирована с полиэтиленимином (PEI), а также с липофектамином, полифектом или суперфектом. Хотя эти носители сами по себе не были биологически активными в качестве терапевтических средств, в настоящем изобретении показано, что они способны защищать молекулу pIC, поддерживая ее в стабильной форме, что позволяет активировать аутофагию. Таким образом, сочетание дсРНК/поликатион, примером которого является BO-110, представляет собой новое молекулярное образование с противораковой активностью. Более того, механизм действия BO-110 оказался неожиданным. Это соединение способствует двойной индукции апоптоза и аутофагии, ведущих к скоординированному и избирательному уничтожению опухолевых клеток, в частности, но не исключительно, клеток меланомы, не влияя на жизнеспособность нормальных компартментов. Механизм апоптоза запускался при помощи белка NOXA. В отличие от других NOXA-индуцирующих химиотерапевтических средств, BO-110 не требует белка-супрессора опухолевого роста p53. Это является важным преимуществом, так как р53 мутирован, отсутствует или инактивирован в подавляющем большинстве раковых опухолей человека. Эффект явно превосходит классические ответы на «голую» вирусную РНК, что объясняет плохие результаты клинических исследований «голой» pIC в лечении меланомы.

Таким образом, BO-110, но не одиночная дсРНК, обладал способностью стимулировать саморазрушение раковых клеток и блокировать раковый метастаз in vivo, даже у мышей с ослабленным иммунитетом. Генетический, функциональный и ультраструктурный анализ, описанный далее в данном изобретении, показывает, что индукция аутофагии запускается pIC не для защиты клеток, а для избирательного уничтожения опухолевых клеток. В качестве дальнейшего подтверждения данных результатов, хотя pIC рассматривалась как индуктор иммунитета, контролируемого IFN, наблюдаемый эффект не зависит от активации пути для продукции и секреции IFN-α. В соответствии с этим наблюдением, активация пути аутофагии имеет место даже у животных с ослабленным иммунитетом. В совокупности, эти данные показывают, что BO-110 намечает и определяет новые точки приложения усилий для клинического использования собственных программ узнавания патогена, аутофагии и гибели опухолевых клеток.

Генетические и функциональные исследования определили эндогенную MDA-5 как связующее звено между путями аутофагии и апоптоза, обусловленными BO-110. Это также отличается от предыдущего раскрытия информации в отношении MDA-5, которое было ограничено апоптозной гибелью клеток, вызванной экзогенными компонентами. Также новым оказалось взаимодействие MDA-5/NOXA.

Таким образом, MDA-5 представлена в качестве подходящей терапевтической мишени для скрининга веществ для лечения рака с особенностью запуска самоуничтожения опухоли при помощи ауто/лизосомальных и характерных для апоптоза протеаз. Как упоминалось ранее, эта стратегия имеет преимущества по сравнению со стандартными терапевтическими средствами, которые задействуют любой из этих механизмов независимо.

Аналогично, образование, позволившее открыть данный путь, поскольку способно его активировать, представляет собой комплекс BO-110 или другие сочетания аналога дсРНК и катионного носителя. Вследствие этого, данные вещества являются хорошими кандидатами для применения в производстве лекарственных средств для лечения рака.

В данном изобретении термин «длинный фрагмент двухцепочечной РНК» используют в противоположность фрагментам РНК, известным как короткие РНК или интерферирующие РНК (киРНК). Вследствие этого, считается, что двухцепочечная РНК (дуплекс) является «длинной», если фрагмент двухцепочечной РНК содержит, по меньшей мере, 25 нуклеотидов в цепи. Предпочтительно, если используемый фрагмент равен по длине промежуточным продуктам двухцепочечной РНК, появляющимся в клетках в процессе клеточного цикла большинства РНК вирусов, которые, очевидно, являются естественным субстратом MDA-5 семейства геликаз, так что двухцепочечная РНК по изобретению считается «длинной», особенно, если она содержит, по меньшей мере, 100 нуклеотидов в цепи и, более конкретно, если она содержит, по меньшей мере, 1000 нуклеотидов в цепи.

Фрагменты двухцепочечной РНК, которые встречаются в природе и могут быть полезными для применения по изобретению, могут представлять собой промежуточные продукты двухцепочечной РНК, образующиеся в процессе клеточного цикла парамиксовируса (такого, как вирус болезни Ньюкасла, NDV, вирус Сендай (SDV)), рабдовируса (вирус везикулярного стоматита (VSV)); флавовируса (вирус гепатита C (HCV)), ортомиксовируса (вирус гриппа) и пикорнавируса (вирус миокардита мозга (EMCV).

Что же касается аналогов двухцепочечной РНК, помимо полиинозин-полицитидиловой кислоты (pIC), для изобретения могут быть полезными другие мимики дсРНК: a) те, скелет которых образован соединением, похожим на рибозу, например, те, которые основаны на LNA (закрытая нуклеиновая кислота: устойчивость к гидролизу), морфолино и ПНК (пептидная нуклеиновая кислота), b) те, в которых, по меньшей мере, одно из типичных азотистых оснований нуклеотидов РНК заменено аналогами, что также может приводить к отличающимся от естественных вариантам спаривания, таким как диаминопурин (который образует пару с урацилом за счет трех водородных связей), пара ксантин/диаминпиримидин (в которой форма кето/кето пурина, ксантин, образует три водородные связи с формой амин/амин пиримидина), или пара изогуанин/изоцитозин (в которой форма амин/кето пурина, изогуанин, образует три водородные связи с формой кето/амин пиримидина, изоцитозином).

Что касается поликатионного носителя, для целей изобретения подходящими являются все те, которые способны изменять проницаемость плазменной мембраны и/или индуцировать эндоцитоз, стимулируя проникновение в клетку двухцепочечной РНК или ее аналогов и высвобождая их в цитозоль, тем самым повышая активацию цитозольных сенсоров двухцепочечной РНК, таких как геликаза MDA-5. Помимо полиэтиленимина (PEI) и липофектамина, под это определение попадают поли-L-лизин, полисилазан, полидигидроимидазолиний, полиалиламин и этоксилированный полиэтиленимин (ePEI).

Далее изобретение иллюстрируется более подробно посредством примеров и фигур.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Индукция макроаутофагии с помощью BO-110 приводит к гибели клеток меланомы

На панели A представлена визуализация с помощью эпифлуоресценции аутофагосома-подобного очагового окрашивания eGFP-LC3 в клетках меланомы SK-Mel-103, обработанных в течение 12 ч 1 мкг/мл pIC в комплексе с PEI (BO-110). Клетки, обработанные только PEI, приведены в качестве контроля.

На панели B представлено зависящее от времени накопление клеток SK-Mel-103, демонстрирующих точечную флуоресцентную эмиссию eGFP-LC3 при обработке BO-110 или контрольным плацебо. Рапамицин использовали в качестве классического индуктора аутофагии.

На панели C представлены иммуноблоты суммарных клеточных экстрактов, выделенных из клеток SK-Mel-103, обработанных, как указано. Способы обработки указаны над каждой полосой: контроль (без обработки: клеточные популяции инкубировали только в присутствии растворителя), обработанные pIC или BO-110 клетки. Проанализированные белки указаны в левой части панели: немодифицированный ATG8 (LC3 I), липидированный ATG8 (LC3 II) и контроль нагрузки (β-актин). В правой стороне панели указаны молекулярные веса, в кДа.

На панели D представлены электронные микрофотографии клеток SK-Mel-103, обработанных BO-110 или контролем PEI. Стрелки указывают на связанные с мембранами аутофагосомы и аутолизосомы.

На панели E представлены микрофотографии при сильном (верх) и слабом (низ) увеличении клеток SK-Mel-103 через 5 часов после инкубации с растворителем (левая колонка) или BO-110 (правая колонка).

На панели F представлены типичные микрофотографии в светлом поле (слева и в центре) и под электронным микроскопом (справа) клеточных колоний после 30 часов обработки, как показано на снимках.

Фигура 2. Микроскопия через временные интервалы индукции аутофагии с помощью BO-110 в клетках меланомы

Последовательность микрофотографий, полученных через указанные интервалы времени после обработки PEI (контроль) или BO-110 экспрессирующих eGFP-LC3 клеток меланомы SK-Mel-103. Очаговые агрегаты свидетельствуют об образовании аутофагосом. Стрелками отмечены разрушающиеся и открепляющиеся клетки (гибнущие клетки) в процессе обработки.

Фигура 3. Доставка в цитозоль pIC благодаря присутствию PEI избирательно вызывает гибель клеток меланомы

На панели A приведена диаграмма, на которой гибель клеток в процентном выражении, определенная в тесте на исключение трипанового синего, представлена через 24 и 48 часов обработки, как указано (NT: белые столбики, обработка PEI: темно-серые столбики, обработка pIC: светло-серые столбики, BO-110: черные столбики). Данные представлены в виде средних величин ± SEM из трех независимых экспериментов с различными клеточными линиями, указанными сверху над диаграммой. Как видно, только популяции клеток меланомы, обработанные BO-110, гибнут эффективно.

Панель B: микрофотографии под электронным микроскопом клеток SK-Mel-28 и SK-Mel-103, обработанных растворителем (контр.), PEI, pIC или BO-110, и визуализированные через 12 ч после обработки. Для каждой клеточной линии приведены фотографии, полученные при двух различных увеличениях. Стрелками отмечены аутолизосомы, наблюдаемые только в клетках, обработанных BO-110.

Фигура 4. Избирательная цитотоксическая активность BO-110 в отношении опухолевых клеток

На панели A представлены типичные изображения в светлом поле меланоцитов, выделенных из крайней плоти человека (верхний ряд), клеток меланомы человека SK-Mel-103 (средний ряд) и линии мышиной меланомы B16 (нижний ряд) после обработки растворителем, PEI, pIC или BO-110, как указано.

На панели B представлены графики зависимости доза-эффект для обработок PEI и pIC в отдельности или в сочетании (BO-110) (группы столбиков справа на каждом графике) клеток FM (меланоциты крайней плоти) и SK-Mel-103. Эффект выражен в виде процента погибших клеток через 24 часа после обработки.

График на панели C представляет гибель клеток в процентном выражении, определенную в тесте на исключение трипанового синего, через 24 часа после проведения обработок (контр.: без обработки; PEI, pIC и BO-110). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов, проведенных с указанными клеточными линиями (SK-Mel-103 или фибробласты крайней плоти). Как и на панели A, только популяции клеток меланомы, обработанные BO-110, гибнут эффективно.

Фигура 5. MDA-5 является сенсором и движущей силой цитотоксичности BO-110 в клетках меланомы

На панели A представлены иммуноблоты суммарных клеточных экстрактов, выделенных из SK-Mel-28 (верхняя фотография), SK-Mel-147 (низ), необработанных (NT) или обработанных PEI, pIC, BO-110 или бортезомибом (Bor), как указано для различных линий. Звездочка соответствует неспецифической полосе. Стрелкой указано место, где должна наблюдаться полоса 30 кДа, свидетельствующая о расщеплении MDA-5.

Панель B: Процессинг MDA-5 в клетках SK-Mel-147, не инфицированных или инфицированных лентивирусом, экспрессирующим рандомизированную или соответствующую MDA-5 кшРНК, визуализированный с помощью иммуноблоттинга клеточных экстрактов после обработки pIC, BO-110 или растворителем, как указано. Как показано на панели A, звездочкой отмечена неспецифическая полоса и стрелки указывают положение полосы 30 кДа, свидетельствующей о расщеплении MDA-5.

На панели C показан ингибиторный эффект кшРНК MDA-5 на целевую токсичность, индуцированную BO-110, при определении в тесте с исключением трипанового синего через 24 часа после обработки только pIC (серые столбики, ▒), комплексом BO-110 (черные столбики, █) или без обработки клеток (незаштрихованные столбики). Также приведены результаты инфицирования контрольной кшРНК («кш контроль»). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов.

Фигура 6. Эффект фармакологических ингибиторов аутофагии на цитотоксическую активность BO-110

На панели A представлен эффект 3-метиладенина (3-MA) и хлорохина (Chlor) на перемещение EGFP-LC3 в аутофагосомы, оцененный, исходя из процента клеток SK-Mel-103, имеющих очаги флуоресценции из-за GFP-LC3 через 12 ч после обработки BO-110 (черные заштрихованные столбики) или буферным контролем (незаштрихованные столбики).

На панели B представлен ингибиторный эффект хлорохина (Chlor), пепстатина A (PEP) или E64d на гибель клеток, оцененный на основании исключения трипанового синего, через 20 часов после обработки растворителем (белые столбики) или BO-110 (черные столбики). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов.

На панели C представлены флуоресцентные конфокальные микрофотографии клеток SK-Mel-103, трансфицированных Cherry-GFP-LC3 для обнаружения образования аутофагосом (35 красных и зеленых очагов) и аутолизосом (просто красные очаги) после обработки BO-110 или 25 нМ рапамицином.

На панели D представлен ингибиторный эффект 100 мкМ 100 бафиломицина (Bafil), 20 мкМ хлорохина (Chlor) или 10 мкг/мл пепстатина (PEP) на гибель клеток, оцененную на основании исключения трипанового синего, через 20 часов после обработки растворителем (белые столбики) или BO-110 (черные столбики). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов.

На панели E представлены флуоресцентные конфокальные изображения клеток SK-Mel-103, обработанных BO-110 (верхние фото) или BO-110 в присутствии хлорохина (нижний ряд фотографий) и стабильно трансфицированных EGFP-Rab5 дикого типа (на фигуре колонка слева), либо инкубированных с BO-110, меченным красным флуоресцирующим агентом (фотографии средней колонки). Интернализацию BO-110 в клетках меланомы можно наблюдать в отсутствие или в присутствии хлорохина.

На панели F представлены флуоресцентные конфокальные изображения для просмотра зависимого от лизосом протеолиза за счет наличия расщепления и высвобождения флуоресцентного DQ-БСА (что приводит к зеленой флуоресценции в клетках SK-Mel-103, обработанных как растворителем (контроль), так и BO-110). В присутствии хлорохина (Chlor: средний ряд фотографий), не наблюдается флуоресцентный сигнал в колонке DQ-БСА (средняя колонка). Одновременное изображение клеток в присутствии Lysotracker-Red (LTR-Red: левая колонка фотографий) для демонстрации лизосомального компартмента, который создает сигнал во всех трех рядах фотографий.

На панели G приведена столбчатая диаграмма, представляющая совместную локализацию соответствующих DQ-БСА и Red-Lysotracker сигналов в тестируемых клетках панели F (контр.: контроль, черные заштрихованные столбики, █; Chl: хлорохин, незаштрихованные столбики; BO-110, серые заштрихованные столбики, ▒). Совместную локализацию оценивали, по меньшей мере, в 150 клетках в двух независимых экспериментах и выражали относительно значения, полученного в контрольных клетках (у.е.: условные единицы флуоресценции).

На панели H представлены иммунофлуоресцентные конфокальные изображения очагов флуоресценции за счет GFP-LC3 (зеленые в оригинальном сигнале, что указывает на расположение аутофагосом) и Lysotracker (красные в оригинальном сигнале, что указывает на присутствие лизосом) в клетках SK-Mel-103 после обработки BO-110 или буферным контролем, как указано на изображениях. Ядра окрашивали красителем хехст (верхние фото, с синим сигналом в оригинале). В нижнем ряду показано совмещение трех предыдущих изображений, что дает желтый или оранжевый цвет в областях, которые имели зеленый и красный сигналы изображений, соответствующие GFP-LC3 и Lysotracker, соответственно, что указывает на то, что сигналы, соответствующие GFP-LC3 и Lysotracker, расположены в одних и тех же областях.

На панели I представлены изображения с конфокального микроскопа, полученные в реальном времени от клеток SK-Mel-103, экспрессирующих EGFP-LC3 (зеленый сигнал в оригинале), обработанных либо буферным контролем с pIC («контроль») либо BO-110, и инкубированных в присутствии Lysotracker (красный сигнал в оригинале) или красителя хехст (синий сигнал в оригинале), как показано на изображениях. Совмещение трех изображений (внизу справа для каждого способа обработки, контроль или BO-110), выявило устойчивую совместную локализацию (желтый сигнал) GFP-LC3 и лизосом (как и ожидалось вследствие образования аутолизосом) после обработки BO-110, но не после обработки «голой» pIC. В третьем ряду панели, под результатами перекрывающихся изображений, показаны диаграммы, полученные путем количественного определения общей клеточной интенсивности флуоресценции в зеленом канале в данной плоскости (диаграмма, помеченная «GFP» для EGFP-LC3) и красном (диаграмма, помеченная как «LYSO» для Lysotracker). В случае диаграмм, полученных с клетками, обработанными BO-110, аналогичное распределение обоих сигналов, eGFPLC3 и Lysotracker, является указанием на совместную локализацию и, следовательно, слияние аутофагосом и лизосом.

На панели J приведено изображение популяционного анализа клеток SK-Mel-103, обработанных pIC (контроль) или BO-110, которое представляет интенсивность сигнала EGFP-LC3 (зеленая флуоресценция, ось X) и Lysotracker (красный сигнал, ось Y). В квадраты заключены клетки с двойным окрашиванием обоих маркеров.

Фигура 7. Эндосомальный трафик и образование и распад амфисом при обработке BO-110

На панели A представлены последовательные изображения клеток меланомы SK-Mel-103, экспрессирующих EGFP-Rab7, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии в реальном времени в указанные моменты времени после обработки BO-110 или контрольным растворителем. Следует отметить, что BO-110 вызывал появление большого количества везикул. Звездочками отмечены слияния эндосома-эндосома (для ясности показаны только несколько примеров).

На панели B представлены фотографии с конфокального микроскопа клеток SK-Mel-103, стабильно трансфицированных ретровирусом, что приводило к экспрессии зеленой флуоресценции за счет слитого белка EGFP-Rab7 wt (Rab7 дикого типа) (первая и третья колонки фотографий слева, во втором случае фотографии получали в присутствии Lysotracker-Red, как указано на колонке) или слитого продукта EGFP-Rab7 T22N при инкубации в присутствии Lysotracker (правая колонка фотографий). Клетки обрабатывали дополнительно BO-110 (нижний ряд панели) или контрольным растворителем (верхняя панель). Изображения получали через 10 часов после обработки BO-110. Две колонки фотографий, расположенных справа, содержат значения, соответствующие средней площади, заключенной в окрашенных Rab7 везикулах.

На панели C приведена последовательность конфокальных микрофотографий, полученных в указанные интервалы времени (в секундах), показанные на фотографиях, которые иллюстрируют слияние и включение лизосом в Rab7-положительные везикулы после обработки BO-110.

На панели D представлены полученные в реальном времени изображения с флуоресцентного микроскопа клеток SK-Mel-103, обработанных BO-110 и стабильно трансфицированных ретровирусом, что вызывает зеленую или красную флуоресценцию за счет GFP-Rab7wt (GFP-Rab7 на фотографиях), Cherry-LC3 (Ch-LC3 на фотографиях), или синюю флуоресценцию за счет Lysotracker-Blue (LTR-Blue на фигуре). Изображения получали в указанные моменты времени (минуты) через 1 час после обработки. Стрелками отмечена первая последовательность, в которой каждый указанный маркер мог быть визуализирован.

На панели E показано включение LC3 на поверхности везикул с эндосомальным Rab7 до его интернализации и последующей деградации. Эти гибридные структуры эндосомы/LC3 (амфисомы) были визуализированы флуоресцентной микроскопией в реальном времени клеток SK-Mel-103, экспрессирующих EGFP-Rab7 или Cherry-LC3 (Ch-LC3 на фотографиях).

Фигура 8. Цитотоксичность BO-110 зависит от активации эффекторной и регуляторной каспаз

На панели A показан процент клеточной гибели, вызванной обработкой клеток SK-Mel-147 с PEI в качестве буферного контроля (контр., представлено незаштрихованными столбиками), pIC (серые заштрихованные столбики) или комплексом BO-110 (черные заштрихованные столбики) в присутствии соединений, перечисленных под каждой из диаграмм: растворитель (контрольный буфер без PEI) (левая диаграмма), витамин E (+ Vite, средняя диаграмма) или ингибитор каспазы ZVAD-fmk (+ ZVAD, правая диаграмма). Процент измеряли во всех случаях методом исключения трипанового синего.

На панели B представлены результаты иммуноблоттинга экстрактов линий клеток метастатической меланомы (указаны слева). Их получали, собирая клетки в указанные моменты времени после обработки (в часах, на каждой дорожке). Способы обработки указаны над временными точками: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии буфера), PEI, pIC, комплекс BO-110 или Bor (бортезомиб 25 мМ). Рядом с каждой фотографией приведен белковый анализ: casp-9 (каспаза 9), casp-8 (каспаза 8) или тубулин (контроль нагрузки). Цифры справа показывают относительную массу в кДа, соответствующую белковой полосе, присутствующей на этой высоте.

На панели C представлены результаты иммуноблоттинга экстрактов линии клеток SK-Mel-103, полученные путем сбора клеток после обработки, указанной в часах (24 и 48 часов). Способы обработки указаны под временными точками, отделенными горизонтальной чертой: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии только буфера), PEI, pIC и комплекс BO-110. Рядом с каждой фотографией показаны проанализированные белки: casp-9 (каспаза 9), casp-8 (каспаза 8), casp-7 (каспаза 7), Casp-3 (каспаза 3) или тубулин (контроль нагрузки).

Фигура 9. BO-110 вызывает апоптоз через NOXA независимо от статуса p53 и без индукции компенсаторной активации MCL-1

На панели A представлены фотографии иммуноблотов клеток SK-Mel-28 (сверху) или SK-Mel-147 (снизу), полученные путем сбора клеток в моменты времени, указанные после обработки (в часах). Способы обработки указаны над временными точками: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии буфера), PEI, pIC, комплекс BO-110 или Bor (бортезомиб 25 мМ). Рядом с каждой фотографией показан белок, уровень которого проанализирован: NOXA, Mcl-1 или тубулин (контроль нагрузки).

На панели B приведены два отдельных графика, представляющие относительные уровни Mcl-1 (верх) и NOXA (нижний график), рассчитанные с помощью денситометрии после иммуноблоттинга, проведенного на клетках SK-Mel-28, в зависимости от указанного времени после обработки, выраженные в виде процентов относительно соответствующего значения, полученного для необработанных контрольных клеток. Рядом с каждой кривой указан соответствующий способ обработки.

На панели C представлены фотографии, полученные после иммуноблоттинга суммарных экстрактов клеток SK-Mel-103, проведенного путем сбора клеток после обработки (время указано в часах) для каждой группы обработки. Способы обработки указаны над каждой полосой: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии буфера), PEI, pIC, комплекс BO-110 или Bor (бортезомиб 25 мМ). Рядом с каждой фотографией показан белок, уровень которого проанализирован: NOXA, Bcl-xL, Bcl-2 или тубулин (контроль нагрузки). Внизу панели указан процент клеточной гибели, наблюдаемый после обработки.

На панели D представлены фотографии иммуноблотов, полученных для оценки экспрессии белка NOXA. Экстракты получали из клеток меланомы SK-Mel-103, обработанных в течение 24 ч pIC или BO-110 через два дня после инфицирования лентивирусным вектором, экспрессирующим неактивную кшРНК (кш контроль) или кшРНК, направленную против NOXA.

На панели E приведена диаграмма, представляющая степень клеточной гибели (выраженную в виде процента погибших клеток) клеток меланомы SK-Mel-103, трансдуцированных либо контрольной кшРНК (серые заштрихованные столбики, ▒), либо кшРНК, направленной против NOXA (черные заштрихованные столбики, █), и инкубированных с pIC или BO-110 в течение 24 ч (NT: без обработки, клетки инкубированы с растворителем для введения.)

На панели F показан ингибиторный эффект понижающей регуляции MDA-5 на индукцию NOXA, вызванную BO-110, представленный уровнями NOXA (выраженными в условных единицах, у.е.) в клетках SK-Mel-103,трансдуцированных контрольной кшРНК или кшРНК, направленной против MDA-5. Уровни NOXA измерены денситометрически и представлены относительно необработанных контролей (неинфицир.: без интерференции, уровни, которые соответствуют величине 1 в случае обработки «голой» pIC и 100 в случае обработки BO-110).

Фигура 10. Противомеланомная активность BO-110 у иммунокомпетентных мышей

Панель A.

Верхняя панель. Схема экспериментального подхода для получения п/к ксенотрансплантатов клеток меланомы B16 у сингенных мышей C57BL/6. Также указано время лечения для перитуморальных инъекций 50 мкг (в 100 мкл) (2 нг/кг) «голой» и в комплексе с PEI pIC. Контрольные группы получали 100 мкл 5% глюкозы или только PEI.

Нижняя панель. Представлен рост опухолей, оцененный путем измерений штангенциркулем в указанные моменты времени. Анализировали по 10 опухолей на экспериментальную группу. Как правило, мышей умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1000 мм³. Эксперимент повторяли дважды с аналогичными результатами.

На панели B показана внутривенная имплантация клеток меланомы B16-EGFP у сингенных мышей C57BL/6 для последующего внутривенного лечения с помощью 10 мкг (в 100 мкл) (1 нг/кг массы тела) pIC или BO-110 в указанные моменты времени. Контрольные группы получали PEI в 5% глюкозе. Через 14 дней после введения клеток мышей подвергали эвтаназии и легкие обрабатывали для получения флуоресцентных изображений.

На панели C приведена столбчатая диаграмма, представляющая число легочных метастазов, наблюдаемых в каждой группе лечения, полученное в результате подсчета вручную внешних метастазов (C). (P*<0,01 между NT/PEI и BO-110; n=5; обобщенный критерий Манна-Уитни).

Фигура 11. IFN-α индуцируется благодаря BO-110, но не является достаточным для способствования гибели клеток меланомы

На панели A представлены клетки меланомы B16 и макрофаги из костного мозга, обработанные pIC или BO-110; РНК выделяли и проводили количественную ПЦР для мишени IFN IFIT-1. Показаны относительные уровни мРНК IFIT-1, оцененные относительно контрольных необработанных клеток.

На панели B представлены клетки меланомы SK-Mel-103, обработанные человеческим рекомбинантным IFN-α в указанных концентрациях, начиная с 10 пг/мл, что уже выше секретируемого количества IFN-α в клетках, обработанных BO-110, по данным ELISA). Гибель клеток определяли через 24 ч после обработки. В качестве контроля, клетки параллельно обрабатывали BO-110 (24 ч). Обратите внимание, что высокие уровни IFN-α не являются цитотоксическими для клеток меланомы и не могут воспроизвести эффективный лизис в результате воздействия BO-110.

Фигура 12. Иммуносупрессия не нарушает способность BO-110 блокировать распространение метастазов меланомы

На панели A показано получение и лечение вызванных меланомой B16 легочных метастазов у мышей линии SCID Beige (тяжелый иммунодефицит в отношении NK, B и T-клеток). Изображения соответствуют фотографиям под видимым или флуоресцентным светом типичных легких мышей, инокулированных в/в клетками меланомы B16 и подвергавшихся лечению PEI, pIC или BO-110. Изображения получены через 14 после инъекции клеток.

На панели B представлено среднее число метастазов, вызванных B16, как указано на панели A (P*<0,01 между группами лечения PEI, pIC и BO-110; n=5; обобщенный критерий Манна-Уитни).

На панели C приведен гистологический анализ легких после введения клеток B16 у мышей, получавших PEI, pIC или BO-110. Показаны типичные окрашенные H&E срезы легких из указанных групп лечения, визуализированные при двух различных увеличениях (10× и 40×).

На панели D показано получение и лечение вызванных меланомой SK-Mel-103 легочных метастазов у мышей линии SCID Beige (тяжелый иммунодефицит в отношении NK, B и T-клеток). Изображения соответствуют фотографиям под флуоресцентным светом или под видимым светом окрашенных H&E (нижняя линия) типичных легких мышей, инокулированных в/в клетками меланомы SK-Mel-103 и подвергавшихся лечению PEI, pIC или BO-110.

На панели E представлено среднее число метастазов, вызванных SK-Mel-103, как указано на панели D. (P*<0,01; n=5; обобщенный критерий Манна-Уитни).

Фигура 13. Ингибирование BO-110 распространения метастазов у мышей Tyr::NRAS ^Q61K ×INK4a/ARF ^-/-

На панели A представлен график Каплана-Мейера для выживаемости без прогрессирования метастазов для мышей Tyr:: Tyr::Ras^Q16K×INK4a/ARF^-/-, на которых воздействовали ДМБА, чтобы вызвать пигментированные очаги, а затем подвергали лечению PEI в 5% глюкозе (контроль: контр.), pIC или BO-110.

На панели B представлены столбчатые диаграммы для кумулятивного среднего числа кожных меланоцитарных новообразований, появившихся в каждой из экспериментальных групп панели A. Подсчет проводили каждые 5 дней и опухоли группировали по диапазонам размеров, как указано на диаграммах.

На панели C представлены типичные изображения поперечных срезов (левая колонка) и коронарных срезов (правая колонка), полученных с помощью PET/CT с целью тестирования метаболической активности (включение 18F-FDG), типичных примеров мышей, получавших PEI в 5% глюкозе (контроль), «голую» pIC или BO-110. Опухоли окружены пунктирными белыми линиями. Звездочки указывают на положение сердца животного.

На панели D представлено окрашивание гематоксилином-эозином образцов меланоцитарных очагов, полученных от каждой группы лечения, описанной в панели A.

На панели E представлено окрашивание гематоксилином-эозином образцов тканей кожи, сердца, печени или легких (как указано в левой части фотографии) мышей, получавших растворитель из 5% глюкозы (контроль) или BO-110, что демонстрирует отсутствие токсичности, связанной с лечением BO-110, в компартментах нормальных клеток.

Фигура 14. Цитотоксическая активность BO-110 в отношении различных опухолевых клеток

На панели A представлен процент клеточной гибели в различных линиях опухолевых клеток: рак поджелудочной железы (Pa), толстой кишки (C), мочевого пузыря (Bl), глиома (G), рак молочной железы (Br), меланома (M), рак предстательной железы (Pr), легкого (L) и яичника (O), по оценке в тесте с исключением трипанового синего, проводимом через 18 часов (левый столбик) и 30 часов (правый столбик) после воздействия BO-110. Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов, проводимых на указанных линиях.

На панели B представлены типичные изображения в светлом поле следующих линий опухолевых клеток: MiaPaCa (поджелудочная железа), BT549 (молочная железа), 639V (мочевой пузырь) и T98G (глиобластома) через 24 часа обработки растворителем или BO-110, как указано. Хотя исходно линия BT549 была устойчива к BO-110, в конечном итоге она погибала в долгосрочных тестах на жизнеспособность (см. панель B). Линии 639V и T98G были очень чувствительны к цитотоксическому эффекту BO-110.

На панели C приведены тесты на жизнеспособность указанных линий опухолевых клеток через 24 ч обработки растворителем или BO-110. Для краткосрочного теста на жизнеспособность обработанные клетки фиксировали через 24 часа после обработки и окрашивали кристаллическим фиолетовым для визуализации образования клеточных колоний. Для долгосрочного теста на жизнеспособность одну десятую часть клеток, обработанных в течение 24 часов, высевали, фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым через 48 ч.

Фигура 15. Индуцированная BO-110 гибель клеток зависит от активации MDA-5, Noxa и аутофагии в линиях опухолевых клеток

На данной фигуре представлены иммуноблоты суммарных клеточных экстрактов, выделенных из следующих линий опухолевых клеток: BT549 (молочная железа), 639V (мочевой пузырь) и T98G (глиобластома) через 24 часа обработки растворителем (обозначение «-») или BO-110 (обозначение «+»). Проанализированными белками являлись: MDA-5_FL (полноразмерный MDA-5), MDA-5_C (продукт расщепления MDA-5), NOXA, каспаза-9 или тубулин (контроль нагрузки). Обратите внимание, что более высокая индукция NOXA и MDA-5_FL, а также расщепление каспазы-9 и MDA-5_c имеет место в более восприимчивых к BO-110 опухолевых клетках.

Примеры

Анализы из примеров, описанных ниже, проводили с использованием следующих материалов и методов:

Клетки и клеточные культуры

Линии клеток метастатической меланомы человека SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 и SK-Mel-147 и мышиные клетки B16 описаны ранее (Soengas et al., 2001). Эти клетки культивировали в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (Life Technologies, Rockville, MD, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Nova-Tech Inc., Grand Island, NY, USA).

Человеческие меланоциты выделяли из крайней плоти новорожденного, как описано (Fernandez et al., 2005), и культивировали в среде 254 с добавлением факторов роста меланоцитов (HMG-1), содержащей 10 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетат (Cascade Biologies, Portland, OR, USA).

Человеческие фибробласты выделяли из крайней плоти новорожденного и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

Кроме того, клетки других типов опухолей получали из панели 60 линий опухолевых клеток человека, представляющих девять типов опухолевых тканей, используемых в программе скрининга противораковых лекарственных средств Национального института рака (NCI). Для опухоли поджелудочной железы выбранными линиями клеток являлись: IMIMPC2, MiaPaCa, Aspc1, A6L, SKPC-1 и Panc-1; для рака толстой кишки: CACO, SW480 и SW1222; для рака мочевого пузыря: RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 и SW1170; для глиомы и глиобластомы: U87MG, U251 и T98G; для рака молочной железы: MDA-231, MCF7 и T47D; для рака предстательной железы: LNCaP, PC3 и DU145; для рака легкого: H1299 и NCIH460; и для рака яичника: NCI H23 и SK-OV-3.

Все клетки культивировали в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (Life Technologies, Rockville, MD, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Nova-Tech Inc., Grand Island, NY, USA).

Получение pIC в комплексе с PEI (BO-110)

Синтетический аналог дсРНК, pIC, приобретали у InvivoGen (San Diego, CA). Реактивы jetPEI™, jetPEI-Fluor™ и invivo-jetPEI™ приобретали у Polyplus-transfection (Ikirch, Francia). Данные продукты, содержащие линейное производное полиэтиленимина, использовали для образования комплекса с pIC с соотношением N/P (остатки азота JetPEI на фосфат РНК), составляющим 1 к 5 in vitro и in vivo, в соответствии с протоколом производителя.

Если не указано иное, использованные концентрации pIC составляли 1 мкг/мл в культивированных клетках и 1-2 нг/кг массы тела у мышей.

Обработки лекарственным средством и анализы клеточной гибели

Бортезомиб (Velcade, прежде PS-341) получали от Millenium Pharmaceuticals Inc. (Cambridge, MA); адриамицин (доксорубицин) от Sigma Chemical (St. Louis, MO) и этопозид от Bristol-Myers Squibb (New York, NY). Антиоксидант тирон и витамин E приобретали у Sigma (St. Louis, MO), а панкаспазный ингибитор ZVAD приобретали у R&D System (Minneapolis, MN). 3-метиладенин (3-MA) получали от Sigma Chemical (St. Louis, MO). Хлорохин получали от Sigma Chemical (St Louis, MO, USA).

Анализы жизнеспособности клеток в ответ на обработку лекарственным средством проводили после высевания меланоцитов и клеток меланомы, по меньшей мере, за 12 часов до обработки лекарственным средством. Процент гибели клеток в указанные моменты времени и концентрации, используемые для обработки, оценивали стандартными тестами на исключение трипанового синего, как описано ранее (Wolter et al., 2007; Fernandez et al., 2005).

Анализы пролиферации клеток в ответ на обработку лекарственным средством проводили после высевания опухолевых клеток, по меньшей мере, за 12 часов до обработки лекарственным средством. Рост клеток в указанные моменты времени и концентрации, используемые для обработки, оценивали в тесте на окрашивание кристаллическим фиолетовым.

Иммуноблоттинг белков

Для определения изменений в уровне белков, 2×10⁶ клеток обрабатывали, как указано, и собирали в разное время после обработки. Суммарные клеточные лизаты подвергали электрофорезу в 10, 12 или градиентном 4-15% гелях с SDS в восстанавливающих условиях, а затем переносили на мембраны Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, USA).

Белковые полосы обнаруживали с помощью системы ECL (GE Healthcare, Buckighamshire, UK).

Первичные антитела включали антитела к: casp-9 и -3 от Novus Biological (Littleton, CO, USA); casp-8 (Ab-3) от Oncogene Research Products (San Diego, CA, USA); casp-7 от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); Bcl-xL от BD Transduction Laboratories (Franklin Lakes, NJ, USA); Blc-2 от Dako Diagnostics (Glostrup, Denmark); NOXA от Calbiochem (San Diego, CA, USA); MDAp53 от Novocastra Laboratories (Newcastle, UK); и к тубулину (клон AC-74) от Sigma Chemical (St Louis, MO, USA). Антитело к MDA-5 описано ранее.

Вторичные антитела представляли собой антитела против иммуноглобулинов либо мыши, либо кролика, от GE Healthcare. Image J использовали для количественного определения изменений в уровнях белков, вызванных различными способами обработки, рассматривая необработанные контроли в качестве эталона базовой экспрессии.

РНК-интерференция

О кшРНК лентивирусном векторе, использованном для понижающей регуляции NOXA, сообщалось ранее (Fernandez et al., 2005). Лентивирусный вектор plko, использованный для понижающей регуляции MDA-5 (целевая последовательность, SEQ ID №: 1), приобретали у OpenBiosystems (Huntsville, AL). Были также разработаны рандомизированные олигонуклеотиды для создания контрольной кшРНК. Вирусы получали из клеток 293FT, как описано, и использовали в условиях, обеспечивающих >80% эффективности инфекции (Denoyelle et al., 2006). Понижающую регуляцию MDA-5 подтверждали иммуноблоттингом и ОТ-ПЦР (прямой праймер с SEQ ID №: 2 и обратный праймер с SEQ ID №: 3). Если это указано, обработку с использованием pIC или BO-110 начинали через 3 дня после инфицирования соответствующими экспрессирующими кшРНК вирусами.

Микрочипы для определения профиля экспрессии

Суммарную РНК выделяли в, по меньшей мере, двух независимых экспериментах и очищали при помощи набора RNeasy (Quiagen). Образцы, обработанные BO-110, метили 2,5 мг Cy5-UTP и использовали в качестве эталона в реакциях гибридизации с 2,5 г РНК, меченой Cy3-dUTP, получающейся в результате инкубации с PIC или PEI. Меченую РНК гибридизовали с двухцветными олигонуклеотидами из микрочипа полного человеческого генома (4×44K) от Agilent (Santa Clara, CA, USA), следуя инструкциям производителя. После промывания слайды сканировали при помощи Scanarray 105000 XL (GSI Lumonics Kanata, Ontario, Canada) и изображения анализировали, используя программу GenePix 4.0 (Axon Instruments Inc., Union City, CA), как описано ранее (Alonso et al., 2007). При измерениях интенсивности флуоресценции автоматически вычитали фоновые значения. Отношения Cy3:Cy5 нормировали к величине срединного соотношения всех точек. После нормирования точки со значениями интенсивности для обоих каналов (сумма средних), более низкими, чем местный фон, отбрасывали. Отношения остальных точек подвергали логарифмическому преобразованию (основание 2), и массивы повторяющихся точек корректировали к среднему. Группировку не существенных пар (UPGMA: группа несущественных пар) генов, экспрессированных по-разному в контрольных и тестируемых образцах, проводили при помощи набора для анализа паттерна экспрессии генов (Gene Expression Pattern Analysis Suite) (GEPAS).

Реакция на лечение in vivo

Самок мышей C57BL/6 приобретали у NIH (Bethesda, MA). Самок мышей SCID Beige с нарушенной функцией NK, T и B-лимфоцитов приобретали у Charles Rivers (Wilmington, MA). Все животные в начале экспериментов были в возрасте 6-12 недель. Уход за животными осуществляли в соответствии с утвержденными методами университета Мичиганского ракового центра.

Приживление трансплантатов в коже проводили путем внутрикожной инъекции 10⁵ клеток меланомы B16. 2 нг/кг массы тела pIC самостоятельно или в комплексе с invivoJetPEI вводили перитуморальными инъекциями в дни 7, 11, 15 и 21 после имплантации опухоли. Дополнительные группы лечения включали введение JetPEI в качестве отдельного вещества и плацебо контроли. Объем опухоли оценивали по результатам измерений штангенциркулем и рассчитывали как V=L×W ² /2, где L и W соответствуют длине и ширине опухоли, соответственно.

Суррогатные модели метастазов в легких получали путем в/в инъекции клеток меланомы 4×10⁵ B16-eGFP или 5×10⁵ SK-Mel-103-eGFP. Лечение проводили в дни 3, 6 и 9 путем в/в инъекции 1 нг/кг массы тела pIC отдельно или в комплексе с invivoJetPEI. Легкие извлекали через 14 дней после заражения, и внешние метастазы подсчитывали вручную и классифицировали по количеству и размеру. Альтернативно, использовали систему флуоресцентного света Illumatool TLS LT-9500 (Lightools Research, Encinitas, CA, USA) и флуоресценцию, исходящую от опухолевых клеток, снимали на камеру Hamamatsu Orca 100 CCD. Метастатическое поражение контролировали независимо путем анализа окрашенных гематоксилином-эозином парафиновых срезов. Эксперименты проводили на группах из пяти мышей и повторяли от двух до четырех раз. Мышей подвергали эвтаназии, когда животные в контрольных группах проявляли признаки дискомфорта и проблем с дыханием.

Аутохтонные меланомы получали путем скрещивания мышей Tyr:: N-RasQ61K с нокаутными мышами Ink4a/Arf на генетической основе C57BL/6 (Ackermann et al., 2005). Для индукции меланомы в коже мышам на кожу наносили один раз в возрасте 8-10 недель 220 мг 7,12-диметилбенз[а]антрацена (ДМБА). После развития ранних меланоцитарных новообразований (очагов, имеющих, по меньшей мере, 1 мм в диаметре), мышам вводили дважды в неделю внутрибрюшинными инъекциями 1 нг/кг массы тела pIC в виде отдельного вещества или в комплексе с invivoJetPEI. Меланому и родинки (невусы) подсчитывали, и ее размеры измеряли в двух диаметрах с помощью штангенциркуля, выражая средний объем опухоли в мм³.

Размер опухолей также оценивали с помощью PET-CT (Позитронно-эмиссионной томографии - компьютерной томографии). Обследование и получение изображений PET-CT проводили, используя систему PET-CT для мелких животных View Explore General Electrics (Fairfield, CT, USA). 15 мБк 18F-FDG (2-фтор-2-дезокси-D-глюкозы) вводили инъекцией для визуализации и получения изображений PET и реконструировали с помощью алгоритма 3DOSEM. Изображения CT получали в 16 кадрах с энергией 35 кэВ и 200 мкА, и изображения реконструировали при помощи алгоритма FDK. Меланомы, метастазы и другие органы проверяли независимо, анализируя парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином-эозином.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Для трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) указанные клеточные популяции промывали 0,1 М буфером Соренсена, pH 7,5 и фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде в течение 1,5 ч, а затем обезвоживали и помещали в смолу Спурра. Затем блок нарезали на 60-100 нм ультратонкие срезы и монтировали на медные сетки. Для рутинного анализа ультратонкие срезы окрашивали 2% уранилацетатом и цитратом свинца. Электронные микрофотографии получали на трансмиссионном электронном микроскопе Philips CM-100 (FEI, Hillsbrough, OR) с помощью цифровой камеры Kodak 1.6 Megaplus.

Конфокальная и флуоресцентная микроскопия: количественная оценка точечных пятен GFP-LC3

Слитый продукт eGFP-LC3, клонированный в pCNA экспрессионный вектор, был предоставлен Gabriel Nunez (University of Michigan Cancer Center). eGFP-LC3 и фрагменты eGFP-Rab7wt, eGFP-Rab7T22N, eGFP-Rab5wt, eGFP-Cherry-LC3 и Cherry-LC3 клонировали в лентивирусный вектор pLVO-puro для стабильного переноса генов. Клетки, происходящие из меланомы (то есть, SK-Mel-103), инфицировали pLVO-eGFP-LC3 и отбирали с помощью пуромицина. Связанную с GFP-LC3 эмиссию флуоресценции визуализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica AF6000 и изображения анализировали, используя LAS AF V1.9 (Leica, Solms, Germany). Для конфокальной микроскопии в реальном времени авторы изобретения использовали ультра-спектральный микроскоп Leica TCS-SP2-AOBS-UV, совмещенный с инкубационной камерой с контролируемым содержанием CO₂ и температурой. Изображения анализировали при помощи LCS (Leica, Solms, Germany). Для экспериментов по совместной локализации Lysotracker™ красный или синий (Invitrogen, Carlsbrad, CA) в концентрации 50 нМ или 200 нМ и краситель хехст 33342 (Invitrogen, Carlsbrad, CA) добавляли за 10 минут до визуализации в концентрации 5 мкг/мл. Изображения совместной локализации анализировали при помощи LAS AF V1.9 (Leica, Solms, Germany).

Экспрессия цитокинов

Человеческий интерферон альфа измеряли в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа (ELISA). Набор для ELISA человеческого IFN-α и рекомбинантный hIFN-α приобретали у PBL Interferon Source (Piscataway, NY) и использовали в соответствии с протоколом производителя. Уровень экспрессии IFN-α измеряли для макрофагов из костного мозга (BMDM) и клеток меланомы B16 методом ПЦР в реальном времени. Клетки BMDM получали, высевали и обрабатывали, как описано ранее (Celada et al., 1984). Количественный ПЦР-анализ в реальном времени транскриптов РНК IFIT-1 проводили, используя праймер TaqMan и зонды, полученные от Applied Biosystems, на детекторе последовательности Applied Biosystems 7700 после нормирования по β-актину.

Статистический анализ

Данные по жизнеспособности выражали в виде средних величин ±SEM, и статистический анализ различий проводили при помощи двустороннего критерия Стьюдента. Величину P<0,05 считали значимой. Для статистической оценки роста опухоли и метастазов in vivo, обобщенный критерий Манна-Уитни-Уилкоксона использовали при сравнении значений непрерывных переменных между двумя группами. Величины P<0,05 считали значимыми.

Пример 1. Идентификация индукторов аутофагии в клетках меланомы с помощью дискриминационного анализа, основанного на флуоресценции LC3. Подтверждение аутофагической гибели клеток, индуцированной BO-110, методом ультраструктурного анализа

Как обсуждалось ранее, отличительной чертой аутофагии (как для индукции клеточной гибели, так и для выживания) является перемещение гена 8 белка аутофагии (ATG8)/LC3 из цитозоля в новообразованные аутофагосомы. Основываясь на этом наблюдении, изменения в клеточном распределении слитого белка GFP-LC3 (то есть, от диффузной картины к очаговому окрашиванию) используют в качестве маркера для ранних стадий аутофагии. Наличие аутофагосом также может быть подтверждено с помощью электронной микроскопии или световой микроскопии.

1.1. Флуоресцентный анализ, основанный на LC3

Чтобы изучить роль аутофагии в ответной реакции меланомы на лекарственные средства, дискриминационный анализ, основанный на GFP-LC3, использовали для проведения скрининга коммерчески доступных химиотерапевтических препаратов и иммуномодуляторов. Клетки меланомы стабильно трансфицировали лентивирусными векторами, экспрессирующими производные аутофагосомального маркера LC3 с GFP, такие как pLVO-eGFP-LC3.

Человеческую линию клеток SK-Mel-103 выбрали в качестве модельной системы для первичного скрининга на основании ее высокометастатического и химиорезистентного фенотипа (Soengas et al., 2001). Последующие валидационные исследования проводили на панели человеческих клеточных линий различного генетического фона (см. ниже).

Было установлено, что различные противораковые лекарственные средства индуцируют очаговую эмиссию флуоресценции GFP-LC3 без существенного влияния на жизнеспособность клеток. Однако было обнаружено, что среди индукторов клеточной гибели комплекс PEI и миметика дсРНК полиинозин-полицитидиловой кислоты (BO-110) является особенно эффективным для образования очагов GFP-LC3. Примерно в 50% клеток наблюдали заметное точечное окрашивание GFP-LC3 в течение 4-6 ч инкубации при низких дозах (0,5-1 мкг/мл) BO-110 (см. репрезентативные микрофотографии и количественные данные на фигуре 1A и фигуре 1B). Действительно, кинетический анализ свидетельствовал о более быстром образовании очагов GFP-LC3 при использовании BO-110, чем при использовании рапамицина (фигура 1B), классическом положительном контроле индукции аутофагии (Klionsky et al., 2008).

Интересно, что в более поздние моменты времени обработка BO-110 была способна вызывать гибель клеток, даже в линиях клеток меланомы, которые по своей природе устойчивы к стандартным повреждающим ДНК агентам, таким как доксорубицин или этопозид, как в случае с SK-Mel-103.

Анализ эндогенного LC3 показал изменения в электрофоретической подвижности (фигура 1C), соответствующие характерному липидированию этого белка в процессе образования аутофагосом, и необходимость ATG5 для генерации образования очагов GFL-LC3.

Авторам изобретения не известно ни о каких предыдущих сообщениях, которые связывали бы pIC с аутофагией в раковых клетках. Вследствие этого, следующие тесты были сфокусированы на данном соединении, поскольку оно может выявить новые элементы, позволяющие лучше понять потенциальные внутриклеточные сенсоры дсРНК для индукции аутофагии и гибели опухолевых клеток.

1.2. Ультраструктурный анализ эффекта BO-110 на клетки

Очаговое окрашивание GFP-LC3 в клетках, обработанных BO-110, описанное в предыдущем параграфе, согласуется с образованием аутофагосом. Тем не менее, чтобы исключить возможные неспецифические агрегаты эктопически экспрессированного GFP-LC3 (Klionsky et al., 2008), ответную реакцию независимо анализировали с помощью электронной микроскопии (фигура 1D).

Ранние ответные реакции (5 ч) на BO-110 включали заметное накопление связанных с мембраной электронно-плотных структур, изолирующих продукты распада клеток (фигура 1D), отличительную особенность аутофагосом. Размеры и количество этих структур можно было видеть как внутриклеточные гранулы даже под оптическим микроскопом (фигура 1E).

В более поздние моменты времени обработка BO-110 вызывала клеточную гибель (фигура 1F, средняя панель), что, как обнаружено при помощи электронной микроскопии, было связано с образованием крупных фагоцитарных вакуолей диаметром более чем 500 нм (фигура 1F, правая панель).

На фигуре 2 посредством избранных фотографий флуоресценции, полученных в различные моменты времени, представлены обобщенные результаты развития во времени индукции аутофагии, о чем можно судить по микрофотографиям перераспределения EGFP с течением времени: от диффузного окрашивания до очаговых агрегатов, указывающих на образование аутофагосом, процесс, который завершается полным разрушением клеток. В контрольных клетках наблюдали диффузное окрашивание на протяжении всего периода тестирования, являющееся признаком базальных уровней аккумуляции LC3.

Интересно, что целостность плазматической и ядерной мембран сохранялась, и клетки, обработанные BO-110, демонстрировали конденсацию хроматина, характерную для программ апоптоза. Индукция аутофагии была зависимой от BO-110, поскольку PEI (контроль) оказывал минимальное влияние на количество или размер аутофагосом (фигура 1D-F). В совокупности эти данные подтверждают цитотоксический эффект BO-110, предполагающий образование аутофагосом, за которым следует гибель клеток с характерными для апоптоза особенностями.

Пример 2. Анализ чувствительности различных человеческих и мышиных линий клеток меланомы с использованием pIC, конъюгированной с катионными молекулами, и избирательность в отношении меланоцитов

Для определения того, является ли про-аутофагическая активность BO-110, обнаруженная в первоначальном исследовании, проводимом с клетками SK-Mel-103, отражением более широкой противомеланомной активности, тестировали дополнительный набор клеточных линий.

Клетки меланомы выбирали по принципу корреляции с частыми связанными с меланомой событиями, такими как мутации в BRAF или NRAS, делеция локусов INK4a/ARF или PTEN или повышенная регуляция различных антиапоптотических членов семейства Bcl-2, которые, как известно, вносят вклад в прогрессирование и химиорезистентность меланомы.

При меланоме мутации P53 являются редкими (Soengas and Lowe, 2003). Однако, поскольку p53 может играть ключевую роль в активации программ апоптоза и аутофагии, авторы изобретения также проводили тесты на клеточной линии SK-Mel-28, которая экспрессирует мутантный p53, чтобы определить, является ли этот опухолевый супрессор крайне необходимым для противомеланомной активности BO-110. Кроме того, клетки линии B16 мышиной метастатической меланомы также были включены в анализ в качестве примера модели, широко используемой в иммунотерапии меланомы (Wenzel et al., 2008), для оценки различий в ответной реакции на лечение, предположительно связанной с различиями между видами. Параллельно с этим авторы изобретения также проанализировали меланоциты, выделенные из крайней плоти человека.

В таблице 1 приведен генетический фон линий клеток человеческой метастатической меланомы:

Мутационный статус p53 определяли прямым секвенированием экзонов 2-10 методом ОТ-ПЦР.

Образцы с полиморфизмом P72R обозначены как R. Индуцируемость p53 определяли иммуноблоттингом экстрактов, обработанных доксорубицином (0,5 мг/мл, 12 ч). Линии с высокими эндогенными уровнями p53 отмечены звездочкой. Уровни PTEN, Apaf-1, Casp-8, Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1 определяли иммуноблоттингом и нормировали к контрольным меланоцитам. Мутационный статус BRAF и NRAS определяли прямым секвенированием ПЦР-амплифицированных геномных фрагментов экзонов 15 и 3, соответственно. Ответные реакции на доксорубицин (DOX; 0,5 мкг/мл, 30 ч) относили к категориям ++, +, -/+, -, соответствующим процентам клеточной гибели, равным 100-70, 70-50, 50-30 и <30%, соответственно. Ответные реакции на BO-110 (1 мкг/мл, 30 ч) относили к категориям +++, ++, +, соответствующим процентам клеточной гибели, равным 100-90, 90-60 и 60-40%, соответственно. Линии с высокими эндогенными уровнями p53 отмечены звездочкой.

С данными клеточными линиями проводили тесты, аналогичные тем, которые описаны в примере 1 для линии клеток SK-Mel-103, чтобы проверить чувствительность каждой из этих линий клеток к pIC и PEI в виде отдельных веществ, либо используемым в сочетании. Результаты приведены на фигуре 3.

Пять протестированных линий клеток меланомы (SK-Mel-19, -28, -103, -147 и B16) были уничтожены со сходной кинетикой и эффективностью после обработки BO-110 (фигура 3A). Важно отметить, что во всех тестируемых линиях клеток меланомы ранняя активация аутофагии с помощью BO-110 неизбежно сопровождалась гибелью клеток.

Электронная микроскопия четко показала аутофагосомы также и в случае линии с мутантным p53, SK-Mel-28 (фигура 3B). Как показано на фигуре 3A и кривых доза-эффект, приведенных на фигуре 4B (которые представляют репрезентативные данные для линий, соответствующие четырем независимым изолятам), важно отметить, что в условиях, которые приводили к гибели 70% клеток меланомы SK-Mel-103 через 24 часа после обработки, нормальные меланоциты оставались жизнеспособными и не демонстрировали признаков аутофагии.

Более того, как показано на фигуре 4A, не наблюдали никаких значительных изменений в морфологии, грануляции или цитозольном распределении GFP-LC3 в меланоцитах в пределах широкого диапазона концентраций BO-110. Фигура 4C также демонстрирует, что нормальные фибробласты кожи человека тоже были более устойчивы к BO-110, чем клетки меланомы.

Интересно, что PEI имеет решающее значение в избирательности для опухолевых клеток. Так, антимеланомная активность pIC снижалась на 70-80%, если обработку проводили без PEI (фигура 3A). В отсутствии PEI, «голая» pIC была почти такой же неэффективной в клетках меланомы, как и в меланоцитах, и демонстрировала минимальную активность в качестве индуктора аутофагии (фигура 3B).

PEI является классическим растворителем в генной терапии из-за его способности стимулировать поглощение молекул ДНК и РНК посредством эндоцитоза (обзор в Payne, 2007). Многослойные структуры, обнаруженные в клетках меланомы, обработанных BO-110 (см. фотографии ниже на фигуре 2B), действительно согласуются со множественными событиями слияния, включающими поступление гибридов эндосома-лизосома (амфисом) в аутофагосомы (Maiuri et al., 2007).

Пример 3. Количественно различающаяся активация MDA-5 под воздействием pIC в отсутствие и в присутствии PEI

В дополнение к содействию эндоцитозу молекул ДНК или РНК, PEI может способствовать набуханию эндосом и делать возможной эффективную доставку генетического материала в цитозоль (обзор в Payne, 2007). Вследствие этого, PEI может способствовать доступу pIC к внутрицитозольным сенсорам. Ассоциированный с дифференциацией меланомы ген-5 (MDA-5) является одним из таких сенсоров (Akira, 2006), и вследствие этого, авторы изобретения протестировали, является ли этот белок движущей силой опосредованного BO-110 уничтожения клеток меланомы.

Активацию MDA-5 анализировали, контролируя протеолитическое расщепление, которое приводит к разъединению его доменов рекрутинга активации геликазы и каспазы (CARD) в процессе клеточной гибели, как описано (Kovasovics et al., 2002; Barral et al., 2007).

Данный анализ проводили методом иммуноблоттинга экстрактов из клеток SK-Mel-28 и SK-Mel-147, обработанных PEI, pIC или BO-110, после электрофореза этих экстрактов. В качестве положительного контроля для эффективной индукции клеточной гибели использовали бортезомиб. Результаты представлены на фигуре 5.

Интересно, что иммуноблоттинг белков продемонстрировал сильную и устойчивую способность комплекса PEI-pIC, BO-110, индуцировать процессинг MDA-5 (фигура 3A). «Голая» pIC была способна индуцировать такой процессинг, хотя и на значительно более низком уровне и не во всех тестируемых клетках (ни одна из дорожек, соответствующих клеткам SK-Mel-28, не содержала полосы 30 кДа, характерной для наличия протеолитического расщепления, которая должна появляться на высоте, отмеченной стрелкой, на панелях A и B фигуры 5) или не постоянно (см. фигуру 5A, на которой интенсивность полосы 30 кДа уменьшается с течением времени при обработке pIC в клетках SK-Mel-147).

Для определения вклада MDA-5 в цитотоксическую активность BO-110, короткие шпилечные РНК (кшРНК), комплементарные MDA-5, трансдуцировали в клетки меланомы при помощи лентивирусных векторов для стабильного нокдауна MDA-5 (см. иммуноблоты белков на фигуре 3B). кшРНК к MDA-5 значительно снижала обусловленную BO-110 гибель клеток меланомы без какого-либо обнаруживаемого неспецифического воздействия на контрольные клетки (фигура 3C, p<0,05).

Важно отметить, что индукция и процессинг MDA-5 являлись не просто следствием активации механизма гибели в клетках меланомы. Обработка бортезомибом, ингибитором протеасом, способным активировать как естественный, так и опосредованный рецептором смерти пути апоптоза в меланоме, не оказывала влияния на уровни или процессинг MDA-5 (фигура 5A). Эти результаты иллюстрируют основные различия в механизмах осуществления программ клеточной гибели в случае BO-110 и других проапоптотических индукторов.

Пример 4. Фармакологические ингибиторы аутофагии препятствуют цитотоксической активности BO-110

Следующие эксперименты были сфокусированы на механизмах, лежащих в основе приведения в действие индуцированной BO-110 гибели клеток. 3-метиладенин (3-MA) и хлорохин часто используют для независимой проверки механизмов аутофагии из-за их способности препятствовать образованию аутофагосом или аутолизосомальной активности, соответственно (Maiuri et al., 2007; Klionsky et al., 2008).

Для проверки того, существовало ли это препятствование в клетках меланомы, обработанных BO-110, клетки меланомы SK-Mel-103 обрабатывали 3-метиладенином или хлорохином через 12 часов после обработки BO-110 или буферным контролем (растворителем). Результаты представлены на фигуре 6.

Как было показано с помощью флуоресцентной микроскопии (фигура 6A и фигура 6B), 3-MA блокировал образование очагов GFP-LC3, вызванное BO-110. В присутствии хлорохина аутофагосомы накапливались, но, что интересно, эта индукция не была продуктивной в качестве индуктора гибели клеток (фигура 6C, было обнаружено, что процент погибших клеток, наблюдаемый в присутствии хлорохина, ниже, чем таковой, наблюдаемый с пепстатином A, E64d, или сочетанием обоих). Таким образом, эти результаты подтверждают сценарий, при котором цитотоксическая активность BO-110 не является пассивным побочным продуктом образования аутофагосом: литическая активность лизосом является важным медиатором уничтожения BO-110 клеток меланомы.

Пример 5. BO-110 приводит в действие слияние аутофагосом/лизосом для последующего запуска программ уничтожения

Если аутолизосомы являются ключевым фактором BO-110, блокирование лизосомальных гидролаз должно защищать клетки меланомы при обработке BO-110. Невозможно блокировать всю зависимую от лизосом активность, поскольку в этой органелле могут локализоваться множество ферментов с перекрывающимися мишенями (Fehrenbacher and Jaattella, 2005). Тем не менее, полезную информацию о лизосомальной активности можно получать благодаря ингибиторам широкого спектра протеаз E64d и пепстатину A, поскольку эти соединения эффективно блокируют различные катепсины (B, D и L) в аутолизосомах (Klionsky et al., 2008). Вследствие этого, проводили испытание для сравнения эффекта хлорохина, пепстатина A или E64d на гибель клеток через 20 часов после обработки буферным контролем или BO-110. Результаты представлены на фигуре 6C, упомянутой ранее. Примечательно, что пепстатин и E64d уменьшали на 50% степень гибели клеток из-за BO-110.

Для подтверждения того, что везикулы соответствовали прежде идентифицированным крупным мультивезикулярным структурам, которые включали большие эндосомы, которые, в свою очередь, рекрутировали множественные аутофагосомы (для создания гибридных структур, известных как амфисомы), и эти везикулы не происходили из недействующих аутофагосом, в которых лизосомы были либо не рекрутированы, либо дисфункциональны, или аутофагосомы являлись результатом накопления неполноценного разлагающегося материала, клетки меланомы трансфицировали продуктами слияния GFP и Cherry-LC3. Сигналы Cherry-GFP-LC3 приводили к красной и зеленой флуоресценции у аутофагосом из-за двух флуоресцентных белков (Cherry и GFP), однако они теряли сигнал GFP (зеленый) в кислой среде аутолизосом.

Использование такой стратегии позволило установить, что, действительно, BO-110, подобно рапамицину, индуцировал образование аутолизосом в клетках меланомы, о чем свидетельствовало наличие только красных очагов LC3 на фигуре 6C. Хлорохин, в соответствии с предыдущими испытаниями, блокировал гибель клеток меланомы, вызываемую BO-110 (фигура 6D), не затрагивая эндосомальное поглощение этого мимика дсРНК (что определяли по совместной локализации меченого Fluo Red BO-110 и слитого с GFP раннего эндосомального белка Rab5 (фигура 6E). Сходные ингибиторные эффекты наблюдали при использовании ингибиторов широкого спектра протеаз E64d и пепстатина A, а также блокатора вакуолярной АТФазы бафиломицина (фигура 6D), что свидетельствовало в пользу нового механизма действия BO-110, зависимого от лизосом.

Чтобы независимо контролировать лизосомальную активность в процессе обработки BO-110, клетки тестировали на способность процессировать DQ-БСА (производное БСА, зеленая флуоресценция которого гасится, если он не расщеплен протеолитическими ферментами). Как показано на фигуре 6F, DQ-БСА эффективно расщеплялся в присутствии BO-110. Обратите внимание, что эмиссия DQ-БСА была обнаружена в лизосомах, на что указывает совместная локализация с помощью Lysotracker red, красителя, способность проникать в клетку которого зависит от pH, и который испускает красную флуоресценцию при попадании в кислотную среду функциональных лизосом). Результат резко отличается от минимальной эмиссии флуоресценции, вызванной DQ-БСА, которая наблюдается в клетках SK-Mel-103, обработанных BO-110, когда лизосомальная активность блокирована хлорохином (фигура 6F и фигура 6G).

Чтобы далее охарактеризовать способность BO-110 вызывать начало и полное развитие процесса аутофагии, слияние аутофагосом и лизосом визуализировали при помощи конфокальной микроскопии. Для этого клетки SK-Mel-103, стабильно экспрессирующие GFP-LC3, обрабатывали BO-110 или соответствующим буфером в качестве контроля и инкубировали в присутствии Lysotracker-Red. Анализ двойной эмиссии зеленой и красной флуоресценции (для слитого продукта GFP-LC3 и Lysotracker, соответственно), на основе отдельных клеток и клеточных популяций показал четкую совместную локализацию аутофагосом и лизосом (см. репрезентативные микрофотографии флуоресценции на фигуре 6H и 6I, а также соответствующие количественные данные на фигуре 6J). Важно, что эта совместная локализация являлась ранним событием в ответных реакциях, вызванных BO-110 (уже обнаруживаемым через 4-8 часов после обработки), и предшествовала организованной гибели клеток.

Определив, что аутофагосомы сливаются с активными лизосомами в ответ на BO-110, авторы изобретения оценили, взаимодействовали ли эти органеллы с эндосомами и были ли ректурированы в эндосомы. Во-первых, была оценена эндосомальная динамика в клетках меланомы, экспрессирующих GFP, слитый с поздним эндосомальным маркером Rab7 (Luzio et al., 2007). Базальное создание и разрушение эндосом (то есть, постепенное сокращение размеров) определяли в необработанных клетках меланомы (левая панель на фигуре 7A). Однако обработка BO-110 заметно усиливала эндосомальную активность, индуцируя устойчивое и многоволновое образование эндосом (средняя и правая панели фигуры 7A). Эти эндосомы оказались заполнены лизосомами, что определяли по двойной визуализации GFP-Rab7 и Lysotracker red (фигура 7B). Кроме того, микроскопия с замедленной съемкой выявила быструю кинетику множественного рекрутинга лизосом в меченые GFP-Rab7 эндосомы, что также продемонстрировано в последовательной серии событий слияния на фигуре 7C. Важно отметить, что, как показано на фигуре 7B (правые панели), слияние эндосом-лизосом значительно ингибировалось, если клетки избыточно экспрессировали Rab7-T22N, известный доминантно-негативный мутант этого белка. В целом, эти результаты демонстрируют динамическую мобилизацию эндо/лизосомальных компартментов в опухолевых клетках, обработанных BO-110.

Пример 6. BO-110 связывает аутофагию с апоптотическими каспазами

Лизосомальные протеазы могут влиять на программы клеточной гибели на различных уровнях (Maiuri et al., 2007; Hoyer-Hansen and Jaatella, 2008). В случае митохондрий, они могут нарушать регуляцию продукции активных форм кислорода (ROS) и/или вовлекать классические апоптотические каспазы (регуляторную casp-9 и эффекторные casp-3 и -7). Внешние пути, зависящие от casp-8, также могут отвечать на лизосомальную активацию (Fehrenbacher and Jaattella, 2005). Для выяснения участия ROS в механизме действия BO-110, проводили обработку в присутствии витамина E, тролокса или тирона, акцепторов радикалов с различной антиоксидантной активностью, и панкаспазного ингибитора z-VAD-fmk. Данные анализа результатов по клеточной гибели в каждом из этих случаев представлены на фигуре 8A, при этом данные, полученные с витамином E, приведены в качестве репрезентативного случая результатов, полученных с упомянутыми химическими антиоксидантами при дозах данных реагентов, которые блокируют апоптоз в меланоме, контролируемый ROS (Fernandez, 2006). Как показано на фигуре, в присутствии данных антиоксидантов не было обнаружено существенного влияния на гибель клеток из-за BO-110. Напротив, панкаспазный ингибитор z-VAD-fmk ингибировал гибельное воздействие BO-110 на 70%. В совокупности эти результаты подтверждают зависимый от каспаз механизм, активируемый после программы аутофагии.

Каспазный процессинг, действительно, был эффективно стимулирован BO-110, что определяли иммуноблоттингом клеточных экстрактов, собранных через различные периоды времени либо после отсутствия обработки (NT), за исключением буферного контроля без PEI, либо после обработки PEI, pIC, комплексом BO-110 или известным индуктором каспазного расщепления, бортезомибом (фигура 8B и фигура 8C). На фигуре 8B приведено сравнение способности PEI, pIC и BO-110 индуцировать апоптотический процессинг каспаз 8 и 9 в различных линиях метастатической меланомы: эффективная активация каспаз 9 и 8 была отчетливо заметна через 20 ч после обработки BO-110 во всех протестированных линиях клеток меланомы человека; аналогично тому, что наблюдали при использовании бортезомиба. Более того, кинетика и степень каспазного процессинга при помощи BO-110 в высокой степени совпадали (фигура 5B), независимо от мутационного статуса BRAF (например, SK-Mel-19), NRAS (SK-Mel-103, -147), или p53 (SK-Mel-28).

На фигуре 8C представлены результаты аналогичного теста, проведенного с линией SK-Mel-103, в котором был проделан более полный анализ, включающий, в дополнение к апоптотическим каспазам 9 и 8, эффекторные каспазы 3 и 7. Аналогичный тест проводили с линией SK-Mel-147, который дал сходные результаты. Эффективный процессинг casp-9, -3 и -7 в клетках SK-Mel-103 и -147 был особенно важен. Эти линии имеют низкие уровни Apaf-1 и очень неэффективны в вовлечении casp-9/Apaf-1 апоптосом (Fernandez et al., 2005; Soengas et al., 2006) в ответ на классические противораковые лекарственные средства, такие как доксорубицин, этопозид и цисплатин (см. график на фигуре 1C). Таким образом, данные результаты свидетельствуют о превосходной способности BO-110 активировать апоптотические программы и обходить внутренние механизмы резистентности к стандартным химиотерапевтическим лекарственным средствам.

Пример 7. Активация гибели клеток посредством BO-110 при отсутствии компенсаторных эффектов на антиапоптотические члены семейства Bcl-2

Для более подробного анализа механизма действия BO-110 и для определения событий, которые могут быть уникальным образом активированы данным агентом, реакцию на лекарственное средство сравнивали с эффектами бортезомиба. Это вещество было выбрано, поскольку оно также является сильным активатором механизма апоптоза в клетках меланомы (Wolter et al., 2007; Fernandez et al., 2006).

Однако авторы изобретения ожидали, что бортезомиб и BO-110 будут различаться по механизму действия. Мишенью бортезомиба являются протеосомы, а не лизосомы (Qin et al., 2005). Кроме того, как показано на фигуре 5A, бортезомиб убивает клетки меланомы без индукции или процессинга MDA-5. Бортезомиб также интересен, поскольку он может способствовать массированному накоплению проапоптотического NOXA, но также индуцирует быструю и сильную повышенную регуляцию его антиапоптотического антагониста фактора MCL-1 (Fernandez et al., 2005), члена семейства Bcl-2. Важно отметить, что MCL-1 действует как внутренний компенсаторный механизм протеасомного ингибирования и блокирует противоопухолевый эффект бортезомиба in vitro и in vivo (Wolter et al., 2007; Qin et al., 2006).

Для оценки сходства и различия между бортезомибом и pIC («голой» или в комплексе с PEI), клетки меланомы инкубировали с каждым из этих соединений, и экстракты собирали в различные моменты времени после обработки для оценки уровней NOXA, MCL-1 и других членов семейства Bcl-2 (Bcl-xL или Bcl-2). Результаты представлены на фигуре 9.

Как показано на панелях A и B фигуры 9, «голая» pIC не была способна индуцировать NOXA систематически или постоянно в клетках меланомы SK-Mel-28 или SK-Mel-147 (клетки, экспрессирующие p53 с мутацией L145R или p53 дикого типа, соответственно). С другой стороны, BO-110 индуцировал NOXA на уровнях, превышающих в 35, 10 и 5 раз базальные уровни в клетках SK-Mel-28, SK-Mel-147 и SK-Mel-103, соответственно (см. иммуноблоты на панелях A и C фигуры 9, и репрезентативные количественные данные на фигуре 9B из результатов, полученных в клетках SK-Mel-28), что еще раз подчеркивает различную активность «голой» и в комплексе с PEI pIC.

Что касается ингибиторных регуляторов NOXA, уровни MCL-1 были минимально индуцированы BO-110 (фигура 9A и первый график из фигуры 9B). Это отличается от ситуации с бортезомибом, который сильно активирует NOXA, однако индуцирует одновременное накопление MCL-1, как описано ранее (Fernandez et al., 2005). Другие антиапоптотические члены семейства Bcl-2, такие как Bcl-2 и Bcl-xL, также не подвергались влиянию BO-110 (см. иммуноблоты для SK-Mel-103 на фигуре 9C).

При отсутствии компенсаторных механизмов относительно более низкие уровни NOXA, индуцированного BO-110, могут быть достаточными, чтобы способствовать гибели клеток. Для проверки этой гипотезы клетки меланомы трансдуцировали кшРНК, которая, как показано ранее, специфически ингибирует мРНК и белок NOXA (Fernandez et al., 2005), и использовали в качестве контроля клетки, инфицированные лентивирусным вектором, экспрессирующим неактивную контрольную кшРНК. Как показано на фигуре 9D, 50% снижение экспрессии белка NOXA из-за кшРНК ингибировало повышенную регуляцию NOXA, вызванную BO-110, также примерно на 50% и ингибировало токсичность BO-110 (фигура 9E).

Далее авторы изобретения использовали кшРНК против MDA-5 для определения потребности в данном белке для регуляции NOXA посредством BO-110 и провели такой же тест, как и ранее, но с количественным определением уровней NOXA. Результаты приведены на графике фигуры 9F. Интересно, что кшРНК для MDA-5 ингибировала уровни белка NOXA на 70% (фигура 9F) без побочных эффектов на другие члены семейства Bcl-2.

В совокупности данные результаты позволили выявить новый аспект действия MDA-5 в механизме апоптоза, обусловленном индукцией NOXA.

Пример 8. Различная эффективность «голой» pIC и BO-110 у иммунокомпетентных мышей

Затем антимеланомную активность pIC и BO-110 оценивали in vivo. В моделях меланомы «голую» pIC следовало вводить либо в высоких дозах, либо в сочетании с другими веществами (например, ингибиторами белкового синтеза) для эффективной активации программ врожденного иммунитета. Данные, полученные в предыдущих экспериментах, указывали на то, что pIC будет гораздо более эффективной в присутствии PEI. Эффект лечения сначала анализировали на иммунокомпетентном генетическом фоне. Клетки B16 мышиной меланомы, либо не трансдуцированные, либо трансдуцированные GFP (для облегчения обнаружения флуоресценции), имплантировали в сингенных нормальных мышей. Использовали две стратегии: инъекцию опухолевых клеток (i) подкожно (п/к) или (ii) внутривенно для оценки прогрессирования опухоли в локализованных участках или в виде отдаленных метастазов, соответственно. Мыши получали PEI, pIC или BO-110, или 100 мкл 5% глюкозы (группа NT).

На фигуре 10A вкратце приведена стратегия экспериментов с п/к ксенотрансплантатами, приводящими к образованию B16, а также дозировка и схема лечения. Во время лечения перитуморальными инъекциями вводили 2 нг/кг массы тела «голой» pIC или pIC в комплексе с PEI.

Примечательно, что BO-110, как оказалось, превосходил pIC во всех изученных случаях. Так, мыши с растущими подкожно меланомами B16, которые получали растворитель, отдельно PEI или pIC, должны были быть умерщвлены через 15-25 дней после имплантации из-за чрезмерного роста опухоли (фигура 10A). При тех же условиях подкожные меланомы в группе лечения BO-110 либо не обнаруживались, либо были значительно меньшего размера (фигура 10A).

На фигуре 10B вкратце приведена стратегия экспериментов с внутривенной имплантацией клеток меланомы B16-eGFP и последующим лечением pIC, PEI, BO-110 или 5% глюкозой (группа NT). На этой фигуре также приведены флуоресцентные изображения легких умерщвленных животных (фигура 10B) и количественные данные о легочных метастазах (фигура 10C). В этом эксперименте BO-110 оказался в 5 раз более эффективным, чем «голая» pIC также в суррогатных моделях легочных метастазов меланомы, как определяли по визуализации флуоресценции.

Пример 9. IFN не воспроизводит вызывающие гибель клеток особенности BO-110

pIC является классическим индуктором управляемого IFN клеточного иммунитета (Wenzel et al., 2008). Однако данные, приведенные в предыдущих примерах, свидетельствуют о том, что pIC, будучи в комплексе с PEI, может также действовать в клетке автономно, что может отличаться от опосредованных IFN ответов в «профессиональных» иммунных клетках. Для оценки такой возможности, клетки B16 меланомы и макрофаги тестировали на их способность секретировать и отвечать на IFN-α. Результаты ОТ-ПЦР показали, что клетки обоих типов активировали классические мишени IFN-α, такие как IFIT-1 (IFN-индуцируемый белок с тетратрикопептидными повторами), после обработки BO-110 (фигура 11A). PEI был необязательным для pIC-опосредованной индукции мишеней IFN в макрофагах (фигура 11A). Это ожидалось, поскольку эти клетки могут эффективно воспринимать вирусную дсРНК. Однако клетки меланомы были неспособны индуцировать IFIT-1 при использовании только «голой» pIC (фигура 11A).

Для прямой оценки продукции IFN-α клетками меланомы проводили анализ Elispot, используя рекомбинантный человеческий IFN-α в качестве эталонного контроля. Уровни IFN-α, секретируемого клетками меланомы после обработки BO-110, были ниже, чем 10 пг/мл. Для определения того, может ли IFN-α заменять BO-110 (то есть, является ли секреция IFN-α основным индуктором гибели клеток меланомы), возрастающие количества этого цитокина добавляли к клеткам меланомы. Интересно, что высокие дозы IFN-α (в 10 выше уровней, секретируемых после обработки BO-110) были не способны влиять на жизнеспособность клеток меланомы (фигура 11B).

Интересно также отметить, что тесты с микрочипами показали, что в ответе на pIC, помимо того, что он являлся очень преходящим, все вовлеченные гены были ожидаемыми для ответа на интерферон, как показано на фигуре 11C). Напротив, эффект BO-110, помимо его продолжительности, распространялся на дополнительные транскрипты.

Таким образом, данные результаты демонстрируют внутренние различия в узнавании и восприятии мимиков дсРНК в макрофагах и клетках меланомы.

Пример 10. BO-110 может ингибировать метастатический рост на фоне сильно ослабленного иммунитета

Поскольку клетки меланомы часто являются иммунорезистентными, было протестировано, является ли прямая токсичность BO-110 в отношении клеток меланомы также эффективной на фоне сильно ослабленного иммунитета. Наиболее часто эффекторными механизмами, связанными с иммунотолерантностью меланомы, являются дефекты сигнализации в NK, T и B-клетках (Kirkwood et al., 2008). Вследствие этого, способность pIC (в виде отдельного вещества или в комплексе с PEI) блокировать рост меланомы тестировали на мышах линии SCID Beige с нарушенной функцией NK, T и B-лимфоцитов.

Для отслеживания эффективности лечения в контроле с легочными метастазами клетки меланомы метили GFP и вводили внутривенной инъекцией, следуя схеме лечения, описанной на фигуре 10. Меланому B16 (фигура 12 панели A, B и C) и SK-Mel-103 (фигура 12, панели D и E) анализировали в качестве репрезентативных примеров мышиной и человеческой меланом, соответственно.

В обеих клеточных моделях BO-110 проявлял способность ингибировать рост меланом в легких. На фигуре 12A показано поразительное различие в количестве метастазов B16, видимых на поверхности легких после обработки BO-110 (см. количественные данные на фигуре 12B). Гистологический анализ также подтвердил уменьшенное число и размеры вызванных B16 легочных узелков в группе BO-110 (фигура 12C). Аналогичные анализы показали четкий противоопухолевый эффект BO-110 (но не «голой» pIC) в контроле диссеминированного роста SK-Mel-103 (фигура 12 панели D и E). Таким образом, данные авторов изобретения подтверждают новый механизм действия мимика дсРНК, индуцирующего сильную противомеланомную активность in vivo у мышей линии SCID beige, у которых отсутствует компетентная иммунная система (Cray and Chapeau, 1990).

Пример 11. Ингибирование BO-110 метастатического роста в животных моделях меланомы человека

Для сравнения различий между pIC и BO-110 использовали более адекватный дизайн эксперимента. У мышей Tyr::NRAS^Q61K×INK4a/ARF^-/- развиваются меланомы с характеристиками, аналогичными болезни человека (Ackermann et al., 2005). Мышам один раз местно наносили ДМБА (7,12-диметилбенз[а]антрацен, приобретенный у Sigma). Когда пигментированные очаги достигали 1 мм в диаметре, контрольный PEI, «голую» pIC или pIC, конъюгированную с PEI, в виде препаратов для доставки in vivo вводили внутрибрюшинными инъекциями (в/б) два раза в неделю.

И вновь было отмечено, что противоопухолевая активность BO-110 была значительно выше, чем у pIC, на что указывали прямые измерения размеров опухолей (фигуры 13A и 13B), метаболическая активность опухолей, определенная при помощи PET-CT (фигура 13C), и гистологический анализ (фигура 13A).

Интересно, что BO-110 удваивал сроки жизни без каких-либо прогрессирующих поражений (фигура 13A) при лечебных дозах, используемых без признаков вторичной токсичности (см. анализ на фигуре 13D).

Данные результаты подтверждают целесообразность способов лечения, основанных на введении аналогов дсРНК, в целях борьбы с агрессивным поведением клеток меланомы.

Пример 12. Цитотоксическое действие BO-110 на различные опухолевые клетки

Поскольку генетические и эпигенетические изменения, имеющие место в меланоме и влияющие на восприятие дмРНК и аутофагию, могут не сохраняться в различных видах рака, не было очевидно, может ли BO-110 иметь терапевтический эффект при других злокачественных новообразованиях. В частности, опухоли поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника являются агрессивными и резистентными к различным методам лечения, отчасти из-за плейотропной инактивации программ клеточной гибели.

Чтобы определить, может ли BO-110 представлять собой новую противоопухолевую стратегию широкого спектра действия, серия независимо выделенных линий клеток, относящихся к приведенным выше видам рака, была выбрана из хорошо известной панели NCI-60 (фигура 14). Таким образом, в совокупности, данные клеточные линии охватывают множество опухолей (то есть, поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника) различного генетического фона. Как показано на фигуре 14, анализируемые клеточные линии имели такую же чувствительность к BO-110, что и эталонный контроль из клеток меланомы. Из этих данных следует, что BO-110 способен запускать двойную индукцию апоптоза и аутофагии, приводящую к координированному и избирательному уничтожению (без влияния на жизнеспособность нормальных компартментов) не только меланом, но также и клеток, относящихся к различным другим видам опухолей, например: поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.

Пример 13. Индуцированная BO-110 гибель клеток зависит от активации MDA-5, Noxa и аутофагии в линиях опухолевых клеток

Поскольку чувствительность к BO-110 невозможно предсказать заранее (то есть, на основании типа опухолевых клеток), было необходимо определить сигнальные каскады, опосредующие ответ на BO-110. Высокопроизводительные генетические анализы (на базе матриц кДНК) в клетках меланомы указывали на то, что BO-110 способен вызывать сильную повышенную регуляцию сенсора дсРНК MDA-5, а также проапоптотического фактора NOXA. Интересно, что при помощи анализов иммуноблоттингом авторы изобретения продемонстрировали, что в действительности чувствительность и устойчивость к BO-110 (например, в линиях HCT116 или MiaPaCa2) коррелирует со способностью клеток индуцировать MDA-5 и NOXA (фигура 15). В соответствии с проапоптотической ролью BO-110, указанной выше, в чувствительных клеточных линиях наблюдали отчетливый процессинг каспазы-9, который можно визуализировать в виде изменений в электрофоретической подвижности (фигура 15).

Список литературы

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Fundación Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III.

<120> СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

<130> PCT-03837

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Целевая последовательность кшРНК, используемая для понижающей

регуляции MDA-5

<400> 1

cgcaaggagt tccaaccatt t

21

<210> 2

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер ОТ-ПЦР для обнаружения экспрессии MDA-5

<400> 2

ggcaccatgg gaagtgatt

19

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер ОТ-ПЦР для обнаружения экспрессии MDA-5

<400> 3

atttggtaag gcctgagctg

20

1. Комплекс, включающий сочетание полиинозинполицитидиловой кислоты (pIC) и полиэтиленимина (PEI), где указанный комплекс индуцирует аутофагию в клетках меланомы или в клеточной линии, полученной из клеток меланомы, и где указанный комплекс включает сочетание pIC и линейного PEI с соотношением N/P 1 к 5.

2. Комплекс по п. 1, который индуцирует аутофагию в клеточной линии, выбранной из:
(i) группы линий клеток рака поджелудочной железы: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 и Panc-1;
(ii) группы линий клеток рака толстой кишки: САСО, SW480 и SW1222;
(iii) группы линий клеток рака мочевого пузыря: RT112, MGHu4, 639V, 253J, MGHu3 и SW1170;
(iv) группы линий клеток глиомы: U87MG, U251 и T98G;
(v) группы линий клеток рака молочной железы: MDA231, MCF7 и T47D;
(vi) группы линий клеток рака предстательной железы: LNCaP, РС3 и DU145;
(vii) группы линий клеток рака легкого: Н1299 и NCIH460; и
(viii) группы линий клеток рака яичника: NCI Н23, CHQK1 и SK-OV-3.

3. Комплекс по п. 1 или 2, который не влияет на нормальные меланоциты.

4. Комплекс по п. 1 или 2, состоящий из сочетания pIC, имеющей длину цепи, по меньшей мере, 1000 нуклеотидов, и PEI.

5. Комплекс по п. 1 или 2, который способствует двойной индукции апоптоза и аутофагии.

6. Фармацевтическая композиция для применения в лечении меланомы, содержащая эффективное количество комплекса по любому из пп. 1-5.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6 для применения в лечении одного из следующих видов рака: поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого, яичника и глиомы.

8. Фармацевтическая композиция по п. 6 для применения в лечении меланомы у пациентов с ослабленным иммунитетом.

9. Применение комплекса по любому из пп. 1-5 в качестве средства для лечения меланомы.

10. Применение комплекса по любому из пп. 1-5 в качестве средства для лечения, по меньшей мере, одного из следующих видов рака: поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого, яичника и глиомы.