Липотрипептиды на основе диэфиров l-глутаминовой кислоты и способ их получения



Липотрипептиды на основе диэфиров l-глутаминовой кислоты и способ их получения
Липотрипептиды на основе диэфиров l-глутаминовой кислоты и способ их получения
Липотрипептиды на основе диэфиров l-глутаминовой кислоты и способ их получения

 


Владельцы патента RU 2575851:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова" (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) (RU)

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к алифатическим производным трипептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей OrnOrnGlu, LysLysGlu, OrnLysGlu, LysOrnGlu, а гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи C8-C16, и способу их получения. Изобретение обеспечивает эффективное встраивание и перенос биологически активных веществ. 2 н.п. ф-лы, 3 пр.

 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к производным аминокислот и пептидов, принадлежащих к классу алифатических диэфиров, содержащих три аминокислотных остатка.

Липосомы активно привлекаются для доставки в клетки биологически активных соединений, диагностических веществ и генетического материала, не способных самостоятельно преодолевать клеточную мембрану (белки, нуклеиновые кислоты, противоопухолевые препараты и многие другие). Отличительными особенностями таких систем являются неиммуногенность, биодеградируемость и биосовместимость. Сконструированные на данный момент липосомальные формы лекарственных препаратов содержат в качестве основного компонента фосфатидилхолин - природный липид. Однако каждый клеточный тип отличается по мембранному составу, поэтому для разных клеточных линий в опытах in vitro необходимы различные липидные агрегаты, способные контактировать и сливаться непосредственно с плазматической клеточной мембраной или взаимодействовать с внутриклеточными мембранами. Использование алифатических производных аминокислот и пептидов может послужить альтернативой применения «традиционных» фосфатидилхолиновых липосом.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является ряд катионных липидов, содержащих тетрапептиды. Наличие четырех аминокислотных остатков в полярной части амфифила позволяет липотетрапептидам формировать в водной среде частицы с небольшим диаметром, эффективно компактезировать нуклеиновые кислоты и с высокой эффективностью трансфицировать эукариотические клетки [Себякин Ю.Л., Буданова У.А., Колоскова О.О. Заявка на патент РФ №2013116689, дата публ. 20.10.2014].

Данный вид полярной части молекулы приводит к тому, что наиболее вероятной формой структурной организации дисперсий на основе этих соединений являются не только мелкие липосомы, но и мицеллы, а также возможен смешанный состав. Подобные дисперсии не подходят для использования в качестве переносчиков биологически активных веществ, таких как, например, противоопухолевые препараты, ввиду невозможности достижения эффективной нагрузки транспортного средства.

Снижение количества аминокислотных остатков в полярном блоке амфифила по сравнению с липотетрапептидами позволяет увеличить диаметр формируемых в водной среде липосом и более эффективно встраивать в их внутренний объем биологически активные вещества, а также получать более устойчивые во времени дисперсии.

Предлагаемые в настоящем изобретении соединения ранее в литературе не описаны и аналогов не имеют.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является синтез ряда новых алифатических производных трипептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей OrnOrnGlu, LysLysGlu, OrnLysGlu, LysOrnGlu, а гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи С8, С10, С16:

Для достижения указанного технического результата разработана схема получения липотрипептидов, включающая следующие этапы: синтез этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты, активация карбоксильных групп Fmoc-Lys(Boc) или Fmoc-Orn(Boc) и образование пептидной связи между этими компонентами, удаление Fmoc защитных групп с полученного дипептидного производного, активация карбоксильных групп Boc-Lys(Boc) или Вос(Orn)Вос и образование пептидной связи с получением производных трипептидов, удаление Boc защитных групп с получением липотрипептидов.

Реализация данного изобретения подтверждается примерами.

Пример 1.

Синтез дигексадецил-N-(N-L-лизил)-L-лизил-L-глутамата.

Смесь 2,0 г (0,0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 7,0 г (0,0292 моль) гексадецилового спирта и 3,1 г (0,0163 моль) n-толуолсульфокислоты нагревали на масляной бане при 130°C в течение 4 ч. После окончания реакции реакционную массу охлаждали до комнатной температуры и перекристаллизовывали из ацетона.

Для удаления тозильной группы 1,5 г соли растворяли в 50 мл хлороформа, промывали 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия (2×80 мл), водой до pH 7, сушили сульфатом натрия. Растворитель отгоняли в вакууме. Получали 1,1 г (73%) аморфного вещества, Rf=0,47 (толуол-ацетонитрил, 3:1).

ИК-спектр (в пленке, νmax, см-1): 3395 (NH2), 2945 (C-H), 1725 (C=O), 1632 (NH2), 1482 (CH2), 1381 (CN), 1281 (CH3), 1202 (C-O-C), 1126 (O-C-C), 753 (NH2).

К раствору Fmoc-Lys(Boc) 0,941 г (2 ммоль) в 4 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) добавляли 0,271 г (2 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл ДМФА и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,412 г (2 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 4 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали.

К полученному раствору добавляли 0,795 г (1,3 ммоль) дигексадецил-L-глутамата в 4 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 5 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт очищали препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1 с предварительной отмывкой непрореагировавшего избытка Fmoc-Lys-(Boc) переосаждением из хлороформа. Выход дигексадецил-N-(Fmoc-L-лизил-Boc)-L-глутамата составил 0,965 г (71%), Rf=0,8 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

1H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0,88 (6Н, т, CH3), 1,24 (~56H, м, CH2), 1,57 (4Н, м, СООСН2СН2), 4,06 (2Н, т, CH2 (Fmoc)), 4,11 (4Н, м, COOCH2), 4,57 (1Н, м, СН (Glu)), 5,72 (1H, д, NH), 7,62 (8Н, м, CH (Fmoc)).

Растворяли 0,965 г (1,3 ммоль) полученного соединения в 2 мл 20% раствора пиперидина в ДМФА. Раствор выдерживали при комнатной температуре 20 мин. Продукт NH2Lys(Boc)Glu(C16)2 выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). Rf=0,2 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

Масс-спектр [M]+: 824.

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-лизина 0,265 г (0,728 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0,96 г (0,728 ммоль) оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,150 г (0,728 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 4 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0.300 г (0.364 ммоль) NH2Lys(Boc)Glu(C16)2 в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 10 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Полученное соединение 0,2 г растворяли в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт дигексадецил-N-L-лизил-N-L-лизил-L-глутамат тристрифторацетат LysLysGlu(C16)2 выделяли переосаждением из эфира. Выход 143 мг (46%), Rf=0,2 (хлороформ-метанол, 1:2).

1H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0,89 (6 Н, т, 2 СН3), 1,27 (~48 Н, с, 24 СН2), 1,37 (2 Н, м, γСН2), 1,55 (2 Н, м, δСН2), 1,59 (4 Н, м, 2 СООСН2СН2), 1,6 (2 Н, м, δСН2), 1,64 (2 Н, м, γСН2), 1,73-1,76 (4 Н, м, 2 βСН2), 1,95 (2 Н, м, СНСН2), 2,46 (2 Н, м, СН2СОО), 2,91-3,05 (4 Н, м, 2CH2NH2), 4,05-4,10 (4 Н, м, 2 СООСН2), 4,29-4,41 (3 Н, м, СН), 4,76 (2Н, д, 2NH), 7,35 (6 Н, с, 3NH3+).

Масс-спектр [М]+: 852.

Пример 2.

Синтез дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-лизил-L-глутамата.

Аналогично из 2,0 г (0.0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 7,0 г (0.0292 моль) гексадецилового спирта и 0.941 г (2 ммоль) Fmoc-Lys(Boc) получали NH2Lys(Boc)Glu(C16)2. Масс-спектр [М]+: 824.

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина 0,216 г (0,68 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0,92 г (0,68 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,140 г (0,68 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 4 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0,280 г (0,34 ммоль) NH2Lys(Boc)Glu(C16)2 в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 10 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Полученное соединение 0,2 г растворяли в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-лизил-L-глутамат тристрифторацетат OrnLysGlu(C16)2 выделяли переосаждением из эфира. Выход 151 мг (53%), Rf=0,18 (хлороформ-метанол, 1:2).

1Н-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м. д.): 0,89 (6 Н, т, 2 СН3), 1,27 (~48 Н, с, 24 СН2), 1,33 (2 Н, м, γСН2 (Lys)), 1,50 (2 Н, м, βCH2 (Orn)), 1,55 (2 Н, м, δСН2 (Lys)), 1,57 (2 Н, м, γСН2 (Orn)), 1,76 (2 Н, м, βCH2 (Lys)), 2,15 (2 Н, м, СНСН2), 2,46 (2 Н, м, СН2СОО), 2,92 (4 Н, м, 2CH2NH2), 4,05-4,10 (4 Н, м, 2 СООСН2), 4,3-4,4 (3 Н, м, СН), 4,46 (2Н, д, 2NH), 7,58 (6 Н, с, 3NH3+).

Масс-спектр [М]+: 838.

Пример 3.

Синтез дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-орнитил-L-глутамата.

Аналогично из 2,0 г (0,0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 7,0 г (0,0292 моль) гексадецилового спирта получали Glu(C16)2. ИК-спектр (в пленке, νmax, см-1): 3395 (NH2), 2945 (С-Н), 1725 (С=O), 1632 (NH2), 1482 (СН2), 1381 (CN), 1281 (СН3), 1202 (С-О-С), 1126 (О-С-С), 753 (NH2).

К раствору Fmoc-Orn(Boc) 0,534 г (1,174 ммоль) в 5 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) добавляли 0,159 г (1.174 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл ДМФА и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,242 г (1,174 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 2 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1,5 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали.

К полученному раствору добавляли 0,350 г (0,587 ммоль) дигексадецил-L-глутамата в 5 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 7 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт очищали препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Выход дигексадецил-N-(Fmoc-L-орнитил-Boc)-L-глутамата составил 0,465 г (77%), Rf=0.7 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

1H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0,9 (6Н, т, CH3), 1,25 (~48Н, м, CH2), 1,5 (2H, м, δCH2), 1,6 (4Н, м, COOCH2CH2), 1,76 (2H, м, βCH2), 2,0 (1Н, с, СН (Fmoc)), 2,15 (2H, м, CHCH2), 2,46 (2H, м, CH2COO), 3,06 (2H, м, CH2NH2), 3,9 (2Н, т, CH2 (Fmoc)), 4,10 (4Н, м, СООСН2), 4,41 (1Н, м, СН (Glu)), 5,95 (1H, д, NH), 7,5-7,8 (8Н, м, 8CH (Fmoc)).

Растворяли 0,465 г (0,587 ммоль) полученного соединения в 1 мл 20% раствора пиперидина в ДМФА. Раствор выдерживали при комнатной температуре 20 мин. Продукт NH2Orn(Boc)Glu(C16)2 выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). Rf=0,23 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1)

Масс-спектр [M]+: 810.

Аналогично к раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина 0,159 г (0,501 ммоль) в 2 мл хлороформа добавляли 0,68 г (0,501 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,103 г (0,501 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 2 мл хлороформа. Смесь выдерживали 2 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0,133 г (0,167 ммоль) NH2Orn(Boc)Glu(C16)2 в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 7 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Полученное соединение 0,2 г растворяли в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 5 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-орнитил-L-глутамат тристрифторацетат OrnOrnGlu(C16)2 выделяли переосаждением из эфира. Выход 72 мг (52%), Rf=0,2 (хлороформ-метанол, 1:2).

Масс-спектр [М]+: 824.

Синтезированные соединения могут быть использованы для получения липосомальных водных дисперсий.

По данным фотонно-коррелляционной спектроскопии размер частиц на основе липотрипептидов (анализатор размера частиц серии LSTM 13320 (Beckman Coulter, USA)) составляет от 80 нм (в случае OrnOrnGlu(C8)2) до 100 нм (в случае LysLysGlu(C16)2).

Липосомы на основе синтезированных липотрипептидов проявляют высокую устойчивость при хранении. Стабильность липосомальных растворов во времени исследовали спектрофотометрически. Показано, что липосомы стабильны в течение 8 месяцев, при этом не наблюдалось заметных отклонений оптических свойств дисперсий.

Форма, размер и устойчивость частиц, формируемых липотрипептидами в водной среде, позволяют эффективно встраивать в них различные биологически активные вещества. Например, в липосомы на основе полученных амфифилов возможно введение противоопухолевого препарата доксорубицина в количестве 40% от массы липотрипептида, при этом процент включения активного компонента во внутренний объем составляет более 90%.

1. Алифатические производные трипептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей OrnOrnGlu, LysLysGlu, OrnLysGlu, LysOrnGlu, гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи С8, С10, C16.

2. Способ получения липотрипептидов, охарактеризованных в п. 1, включающий следующие этапы: синтез этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты, активация карбоксильных групп Fmoc-Lys(Boc) или Fmoc-Orn(Boc) и образование пептидной связи между этими компонентами, удаление Fmoc защитных групп с полученного дипептидного производного, активация карбоксильных групп Boc-Lys(Boc) или Вос(Orn)Вос и образование пептидной связи с получением производных трипептидов, удаление Boc защитных групп с получением липотрипептидов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области пептидной и фармацевтической химии, конкретно к способу получения HPyr-His-TrpOH (I), используемого в качестве ключевого полупродукта (1-3 фрагмента) при синтезе синтетических агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона, LH-RH (ЛГ-РГ).

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности, производным аминокислот и пептидов, принадлежащих к классу алифатических диэфиров, содержащих четыре аминокислотных остатка.

Изобретение относится к новым биологически активным производным 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина), представляющим собой адамантил-пептиды, обладающие противовирусным действием.

Изобретение относится к равномерномеченному тритием пиро-Glu-His-Pro-NH2, который может найти применение в аналитической химии и биологических исследованиях. 1 пр. .

Изобретение относится к медицине, а именно к пептидам, которые могут найти применение для коррекции метаболического синдрома. .

Изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей стресс-протекторным действием, которая включает пептид R1-Lys1-Arg2-Pro3 -R2 [SEQ ID NO:1] или R1-Lys1 -Arg2-Arg3-Pro4-R2 [SEQ ID NO:2], где R1=NH2 или СН3 СО и R2=ОН или NH2, и к способу профилактики и/или лечения функциональных или стресс-индуцированных нарушений, возникающих при экстремальных воздействиях.

Изобретение относится к производным 2-гидрокситетрагидрофурана общей формулы (I), которые обладают способностью ингибировать калпаины и/или способностью захватывать активные формы кислорода и могут быть использованы для получения лекарственного средства, предназначенного для ингибирования калпаинов и/или пероксидирования липидов.

Изобретение относится к косметически активным соединениям, а также к их дерматологически совместимым солям, которые соответствуют общей формуле I, в которой R1 означает водород, -С(O)-R6 или -C(O)-XR 6; R2 и R4 независимо друг от друга означают (CH2) n-NH2 или CH2 )3-NHC(NH)NH2; n=1-4, R3 означает, при необходимости, замещенный гидрокси линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода; R5 и R6 независимо друг от друга означают водород, алкил с 8-24 атомами углерода, алкенил с 8-24 атомами углерода; X означает кислород (-O-) или -NH-; при условии, что одновременно R1 и R5 не могут означать водород, а X - кислород.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложена система доставки для замедленного высвобождения агента, блокирующего кальциевые каналы, содержащая твердый дисперсный продукт агента, блокирующего кальциевые каналы, в смеси с поли(лактид-ко-гликолидами), где массовое соотношение первого поли(лактид-ко-гликолида) и второго поли(лактид-ко-гликолида) составляет от 10:1 до 1:1,5.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию для лечения грибка ногтей, состоящую по существу из от 5 до 15 масс. % лимонной кислоты в качестве источника протонов, от 15 до 40 масс.

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Описан иммуноконъюгат для лечения опухолевых расстройств, связанных с мезотелином.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к комплексу, для применения в способе адъювантной терапии у нуждающегося в таком лечении пациента, а также к вакцине, которая включает данный комплекс.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению противоопухолевых лекарственных средств для генной терапии, и может быть использовано в медицине. Получают лекарственное противоопухолевое средство, содержащее генную конструкцию в форме плазмидной ДНК, включающей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), заключенную в полимерный носитель - сополимер полиэтиленгликоль-полиэтиленимин-тat пептид (ПЭГ-ПЭИ-ТАТ).

Группа изобретений относится к конъюгату инсулин-линкер D-L или его фармацевтически приемлемой соли, где D представляет собой фрагмент инсулина и -L является биологически неактивным линкерным фрагментом -L1, представленным формулой (I), где пунктирная линия указывает на место присоединения к одной из аминогрупп инсулина путем образования амидной связи.

Изобретение относится к конъюгатам, в частности представлен никотиновый гаптен-носитель формулы (III): W представляет собой -О- и находится в положении 5 пиридинового кольца; -(спейсер)- представляет собой С1-С8алкиленовую группу, С3-С10циклоалкиленовую группу или С1-С12алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-; X* представляет собой -NH- или -S-; m означает 1; n означает целое число от 1 до 1000; и Y представляет собой возможно модифицированный белок-носитель, выбранный из бактериальных анатоксинов, иммуногенных веществ, вирусов, вирусоподобных частиц, белковых комплексов, белков, полипептидов, липосом и иммуностимулирующих комплексов, которые могут быть использованы для приготовления вакцин для лечения и/или предупреждения никотиновой зависимости.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению натрийуретического пептида C-типа (CNP), и может быть использовано в медицине. Получают пептид структуры PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37), который используют для лечения дегенеративных костных патологий, отвечающих на CNP.

Изобретение относится к пролекарствам метилфенидата, в которых метилфенидат конъюгирован по меньшей мере с одним третичным амином и оксокислотой. Пролекарства обладают повышенной водорастворимостью и биодоступностью по сравнению с немодифицированным метилфенидатом.
Пептид // 2572623
Изобретение относится к пептидам, выбранным из FSY или FTY, для лечения или профилактики состояния, при котором полезно ингибирование АПФ, и их фармацевтическим композициям.
Наверх