Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы. Заявленный способ включает изменение структуры пенициллинацилазы из Escherichia coli путем замены аминокислотного остатка 145 альфа-цепи на лейцин или аминокислотного остатка 71 бета-цепи на лейцин или аргинин. Способ приводит к улучшению каталитической активности пенициллинацилазы в реакциях стереоселективного ацилирования первичных аминогрупп химических соединений и стереоселективного гидролиза N-ацильных производных первичных аминосоединений. 6 табл., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу улучшения каталитических свойств ферментов.

Уровень техники

В настоящее время биокатализаторы широко используются в промышленности для проведения в мягких условиях химических превращений с высокой хемо-, регио- и стереоизбирательностью [Industrial enzymes. Eds. J. Polaina and A.P. MacCabe. Springer: Dordrecht, The Netherlands, 2007.]. Пенициллинацилаза из разных источников используется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков [A. Bruggink et al. Org. Process Res. Dev. 1998, 2, P.128.]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность могут дать возможность применения пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров α-, β-, γ-аминокислот и их элементоорганических аналогов [Svedas V.K. et al. Annal N.Y. Acad. Sci. 1996, 799, P.659.] для высокоэффективного стереоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомерно чистых соединений [WO 02/20820, 14-03-2002; WO 02/20821, 14-03-2002; D.T. Guranda et al. Tetrahedron: Asymm. 2004, 15, P.2901.]. Однако каталитические свойства природных ферментов ограничены.

Принимая во внимание высокий биокаталитический потенциал, пенициллинацилаза является объектом биоинженерии с целью создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Для улучшения каталитических свойств фермента используют методы, основанные на изменении его первичной структуры посредством введения мутаций или рекомбинации генов. В ряде работ было показано, что методами генной инженерии можно изменить субстратную специфичность и каталитические свойства пенициллинацилазы. В частности, в результате многоточечных мутаций была изменена архитектура участка связывания ацильной группы субстрата в активном центре фермента и таким образом впервые был получен рекомбинантный препарат пенициллинацилазы активный по отношению к цефалоспорину С [В. Oh et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 319, P.486]. Принципиальным достижением последних лет, открывающим новые возможности улучшения каталитических свойств фермента, является конструирование пермутированной одноцепочечной пенициллинацилазы, экспрессия которой не зависит от автокаталитического расщепления [G. Flores et al. J. Protein Science. 2006, 13, P.1677.].

В то время как большинство случайных мутаций практически не сказываются на каталитических свойствах пенициллинацилазы, отдельные мутации аминокислотных остатков могут существенно повлиять на субстратную специфичность и каталитические свойства фермента. Показательными являются примеры, когда методом направленной эволюции были получены мутантные варианты пенициллинацилазы из E.coli и K.Citrophila по положению Pheβ71, с измененной специфичностью по отношению к ацильной части субстратов, впервые способные катализировать гидролиз адипил- и глутарил-L-лейцина [L.J. Forney et al. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55(10), P.2550.; A. Roa et al. Biochem. J. 1994, 303, P.869.]. Результаты этих работ свидетельствуют о том, что «оборотной стороной» такой мутации в пенициллинацилазе является драматическое снижение активности по отношению к природным субстратам пенициллину G и V по сравнению с диким типом фермента.

В литературе большее число работ направлено на получение вариантов фермента с большей каталитической активностью в реакции гидролиза по отношению к ограниченному кругу природных и цветных высокоспецифических субстратов, которые традиционно используются для слежения за ферментативной активностью. Между тем пенициллинацилаза является высоко активным и стабильным ферментом в водной среде [V.K. Svedas et al. FEBS Lett. 1997, 417, P.414.; Д.Ф. Гуранда и др. Биохимия. 2004, 69(12), С.1700.], поэтому задача увеличения гидролитической активности фермента по отношению к природным и цветным высокоспецифическим субстратам, на наш взгляд, не является принципиальной. Более ценным считаем биоинженерию пенициллинацилазы с целью увеличения активности по отношению к неприродным и неспецифическим субстратам, увеличения стереоселективности, а также увеличения способности фермента катализировать ацилирование различных аминосоединений.

Несмотря на высокий синтетический потенциал пенициллинацилазы, известно всего несколько научных трудов по получению вариантов фермента с увеличенной способностью катализировать реакции ацилирования, где показано, что варианты пенициллинацилазы из E.coli по положениям Argα145 и Pheα146 в 2-4 раза эффективнее катализируют синтез пенициллина и ампициллина методом ацильного переноса по сравнению с диким типом. [W.B.L. Alkema et al. Protein Engineering. 2000, 13(12), P.857.; W.B.L. Alkema et al. Biochem. J. 2002, 365, Р.303.].

В научной литературе нет сведений относительно влияния мутаций на стереоселективность пенициллинацилазы.

Патентная литература по вопросам биоинженерии пенициллинацилазы ограничивается несколькими патентами одной группы авторов. В заявке [WO 9605318, 22-02-1996] заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа- цепи (α139-152) и бета- цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патент основан на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям Metα143, Pheα147, Leuβ56, Alaβ67, Ileβ177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина. В следующих патентных документах [WO 9820120, 14-05-1998; US 6403356, 11-06-2002] круг вариантов пенициллинацилазы существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам Metα142, Pheα146, Pheβ24, Valβ56, Ileβ177. Приоритетные права данных заявок ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамов ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетцефалоспорановой кислот.

Таким образом, за исключением случая улучшения каталитической активности по отношению к природным субстратам, ранее заявленные способы не затрагивают такие ключевые свойства пенициллинацилазы, как стереоселективность и способность ацилирования различных классов аминосоединений, а также способов применения таких препаратов с целью получения энантиомерно чистых соединений.

Раскрытие изобретения

Технической задачей настоящего изобретения является создание пенициллинацилазы с повышенной каталитической активностью и стереоселективностью в реакциях ацилирования широкого круга аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных, а также их применение для проведения биокаталитических превращений, в частности, с целью получения энантиомерно чистых соединений. Зачастую, настоящее изобретение не имеет отношение к способам получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способы получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетцефалоспорановой кислот.

Техническим результатом заявленного способа является создание препаратов пенициллинацилазы с увеличенной каталитической эффективностью и стереоизбирательностью в реакциях ацилирования широкого круга аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных, а также их применения для проведения биокаталитических превращений, в том числе для получения функционализированных и энантиомерно чистых соединений.

Поставленная задача решается путем изменения структуры пенициллинацилазы заменой одного или нескольких остатков альфа и бета-цепи фермента, которые соответствуют сайгам α138-151 и β67-73 пенициллинацилазы из E.coli. Здесь имеется в виду нумерация аминокислотных остатков согласно общепринятым методам выравнивания аминокислотной последовательности пенициллинацилаз из разных источников, например [R.M.D. Verhaert et al. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63(9), P.3412.]

Наиболее близкими к заявленному решению является способ улучшения свойств пенициллинацилазы, описанный в рассмотренных выше патентных документах [WO 9605318, 22-02-1996; WO 9820120, 14-05-1998; US 6403356, 11-06-2002].

В научной и патентной литературе не известны примеры повышения каталитических свойств пенициллинацилазы по отношению к неприродным субстратам, в частности, каталитической эффективности и стереоизбирательности в реакциях ацилирования широкого круга аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных, включающие изменение структуры фермента путем замены одного или нескольких остатков альфа и бета-цепи фермента в положении 138-151 и 67-73, а новая функция и предлагаемое назначение не вытекают с очевидностью из его известной структуры, принятого назначения или, как следствие, ранее известных свойств.

Таким образом, настоящее изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к получению и применению вариантов пенициллинацилазы из разных источников, полученных из предшественника фермента посредством замены одного или нескольких остатков альфа и бета-цепи фермента, соответствующие сайгам α138-151 и β67-73 пенициллинацилазы из E.coli, любыми доступными методами генной инженерии, направленной эволюции или селекции.

Предпочтительным является получение и применение вариантов пенициллинацилазы, содержащих замены по сайгам, соответствующих α145, α146 и β71 пенициллинацилазы из E.coli. Наиболее предпочтительным является получение и применение варианта пенициллинацилазы β71.

В качестве источника пенициллинацилазы могут быть использованы бактерии, в частности, из A.faecalis, B.megaterium, K.Citrophila, P.rettgeri, A.viscosus и др.

Субстратами в ферментативных реакциях гидролиза могут быть соответствующие эфиры и амиды карбоновых кислот, в частности фенилуксусной и феноксиуксусной кислоты и их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце. Предпочтительным является использование амидов и эфиров фенилуксусной, п-гидрокси-фенилуксусной, феноксиуксусной, R- и S-миндальной кислоты, R- и S-фенилглицина.

В качестве ацильных доноров могут быть использованы карбоновые кислоты, в частности фенилуксусная и феноксиуксусная кислота и их замещенные производные в α-положении и в ароматическом кольце, а также их амиды и эфиры. Предпочтительным является использование амидов и эфиров фенилуксусной, п-гидрокси-фенилуксусной, феноксиуксусной, R- и S-миндальной кислоты, R- и S-фенилглицина.

Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов или иммобилизованных в геле, на различных подложках и носителях препаратах, или применяется в виде культуры клеток.

Препараты биокатализаторов на основе пенициллинацилазы по изобретению могут применяться с целью:

- проведения биокаталитических превращений, в том числе протекающих хемо-, регио- и стереоизбирательно;

- проведения ацилирования первичных аминосоединений, в частности, для ацилирования аминов, аминоспиртов, аминокислот, их амидов и эфиров, пептидов и пептидомиметиков, а также их элементоорганических аналогов;

- проведения гидролиза амидной и эфирной связи, в частности, для гидролиза амидов и эфиров. О- или N-ацилированных производных спиртов, аминов, аминоспиртов, аминокислот, их амидов и эфиров, пептидов и пептидомиметиков, а также их элементоорганических аналогов;

- получения химических соединений, в том числе энантиомерно чистых соединений, в частности спиртов, аминов, аминоспиртов, аминокислот, их амидов, эфиров и ацильных производных, пептидов и пептидомиметиков, а также их элементоорганических аналогов.

Способ применения реализуется приведением в контакт препарата пенициллинацилазы и реакционной смеси. В качестве реакционной среды может быть использована вода, однофазные и многофазные водно-органические смеси, растворы с содержанием органических и неорганических соединений, в частности солей, кислот, оснований. В качестве реакционной среды более предпочтительным является использование воды или водных растворов с содержанием не более 40% (по объему) органических растворителей.

Способ применения препарата пенициллинацилазы по изобретению может быть как независимым, так и в комбинации с другими катализаторами и биокатализаторами.

Некоторые примеры реализации способа улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы и способа их применения по изобретению приведены ниже. Варианты пенициллинацилазы из E.coli получали путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в статьях [V. Picard et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, P.2587.; W.B.L. Alkema et al. Protein Eng. 2000, 13, P.857]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены гомогенные препараты мутантов пенициллинацилазы.

Осуществление изобретения

Пример 1. Увеличение каталитической активности пенициллинацилазы.

Каталитическую активность пенициллинацилазы измеряли с использованием удобного для регистрации цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамид)бензойной кислоты. Количественной мерой каталитической активности являются каталитическая константа (kkат) и константа специфичности (kkат/KM), значения которых в случае варианта βPhe71Leu в 2 и в 6 раз выше соответствующих значений для пенициллинацилазы дикого типа (табл.1).

Таблица 1
Каталитическая активность вариантов пенициллинацилазы (pH 7,5, 0,1 М KCl, 25°C)
Фермент kkат, c-1 (kkат/KM)·10-3, M-1·c-1
Дикий тип 26 867
Pheβ71Leu 53 5242

Пример 2. Увеличение стереоселективности пенициллинацилазы по отношению к N-ацильным производным аминосоединений.

Сравнение стереоизбирательности пенициллинацилаз по отношению к N-ацильным производным аминосоединений проводили на основании значений стереоселективности (Е) ферментативного гидролиза ряда N-ацильных производных аминосоединений. В случае варианта Pheβ71Leu значение стереоселективности гидролиза производных фенилуксусной и миндальной кислот примерно в 2-4 раза выше, чем в случае пенициллинацилазы дикого типа (табл.2 и 3). В случае варианта Argα145Leu наблюдается увеличение стереоселективности примерно в 1,5 раза относительно пенициллинацилазы дикого типа (табл.3). Следует отметить значительное влияние структуры ацильной части субстрата на стереоселективность ферментативной реакции.

Таблица 2
Стереоселективность пенициллинацилазы по отношению к N-фенилацетильным производным аминосоединений (pH 7,5, 25°C)
Субстрат Препарат фермента
дикий тип Pheβ71Leu
N-Phac-(±)-2-аминобутанол 4 15
N-Phac-(±)-2-амино-4-метилпентанол 36 60
N-Phac-(±)-фенилаланинол 2 7
Таблица 3
Стереоселективность пенициллинацилазы по отношению к N-(R)-манделил-производным аминосоединений (pH 7,5, 25°C)
Субстрат Препарат фермента
дикий тип Pheβ71Leu Pheβ71Arg Argα145Leu
N-(R)-Манделил-(±)-2-аминобутанол 25 100 120 37
N-(R)-Манделил-(±)-фенилаланинол 4,2 39 120 7,4

Пример 3. Изменение стереоселективности и синтетической способности пенициллинацилазы в реакциях ацильного переноса.

Сравнение стереоизбирательности и синтетической способности вариантов пенициллинацилазы проводили на примере ацилирования рацемата 2-аминобутанола амидом (R)-миндальной кислоты. В рассмотренном ряду варианты пенициллинацилазы по положению Pheβ71 характеризуются предельными значениями скорости синтеза, соотношением начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза (С/Г)0 и стереоселективности (Е). С одной стороны, в случае вариантов Pheβ71Leu и Pheβ71Arg наблюдаемое увеличение по каждому из показателей составляет примерно 5-30 раз в сравнении с диким типом (табл.4). И напротив, в случае варианта Pheβ71Trp происходит обратный эффект.

Таблица 4
Кинетические параметры ферментативного стереоселективного ацилирования рацемата 2-аминобутанола амидом R-миндальной кислоты (pH 9,5, 25°C)
Фермент VC/[E]0, у.е. (С/Г)0, у.е. Е
Дикий тип 1 1 26
Pheβ71Trp 0,31 0,13 2,9
Pheβ71Leu 22 8,5 95
Pheβ71Arg 31 10 120
Argα145Leu 6,3 3,8 35

Пример 4. Получение энантиомеров соединений при использовании вариантов пенициллинацилазы методом ферментативного гидролиза.

Энантиомеры аминосоединений получали в результате ферментативного гидролиза рацемата N-ацильного производного до 50% конверсии как описано в экспериментальной части. Продукты наиболее высокой энантиомерной чистоты (S)-аминобутанола и (R)-фенилаланинола были получены в случае применения вариантов пенициллинацилазы по положению Pheβ71.

Таблица 5
Энантиомерный избыток продукта ферментативного гидролиза рацемата (R)-манделил-производного аминосоединения
Продукт гидролиза Препарат фермента
Дикий тип Pheβ71Leu Pheβ71Arg Argαl45Leu
(S)-аминобутанол 87% 93% 95% 86%
(R)-фенилаланинол 46% 89% 45% 60%

Пример 5. Получение энантиомерно чистых соединений при использовании вариантов пенициллинацилазы методом ацильного переноса.

Энантиомерно чистые амиды (диастереомеры) получали в результате ферментативного ацилирования рацемата аминосоединения при использовании амида (R)-миндальной кислоты в качестве ацильной донора, как описано в экспериментальной части. Наибольшие значения энантиомерного избытка продукта синтеза наблюдаются в случае применения вариантов пенициллинацилазы Pheβ71.

Таблица 6
Энантиомерный избыток продукта стереоселективного ацилирования рацемата аминосоединения амидом (R)-миндальной кислоты
Продукт синтеза Препарат фермента
Дикий тип Pheβ71Leu Pheβ71Arg Argα145Leu
N-(R)-манделил-(S)-аминобутанол 89% 98% 99% 93%
N-(R)-манделил-(R)-фенилаланинол 61% 95% 30% 76%

Описание экспериментальной части

Определение ферментативной активности

Активность мутантных форм пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамид)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5,0,1 М KCl.

Определение концентрации активных центров

Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [В.К. Швядас и др. Биоорг. химия. 1977, 3, С.546.]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.

Определение кинетических параметров

Кинетические параметры ферментативного превращения (KM и kкат) определяли общепринятым методом путем анализа зависимости начальных скоростей гидролиза от концентрации субстрата. Реакции проводили в рамках схемы Михаэлиса-Ментен (S0>>E0) в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,5, 0,1 М KCl) при 25°C.

ВЭЖХ анализ. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Luna C18 (Phenomenex, США), 250×4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH3CN/вода 40:60, 0,78 г/л KH3PO4, 0,5 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,8 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.

Определение энантиомерного избытка первичных аминосоединений определяли методом предколоночной модификации о-фталевым альдегидом и хиральным тиолом по методике [D.T. Guranda et al J. Chromatogr. A. 2005, 1095. P.89.].

Проведение стереоселективного гидролиза

Реакцию стереоселективного ферментативного гидролиза рацемата N-ацильного производного аминосоединения проводили в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 7,5 при постоянном перемешивании до достижения 50% степени конверсии. Начальные концентрации реагентов: 10 мМ субстрата, активных центров пенициллинацилазы 0,1 мкМ, объем реакционной смеси 5 мл. Время проведения эксперимента не превышала 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их мобильной фазой и анализировали методом ВЭЖХ. Затем реакционную смесь подкисляли до pH 1,5 6н. HCl и экстрагировали этилацетатом (3×5 мл). Аминосоединение, высвободившееся в ходе ферментативного гидролиза, распределялось в водном слое. Для определения энантиомерного избытка аминосоединения аликвоту полученного водного раствора анализировали методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией. Стереоселективность ферментативного гидролиза определяли по значению энантиомерного избытка образующегося аминосоединения при 50% степени конверсии.

Проведение стереоселективного ацильного переноса

Реакцию стереоселективного ферментативного ацилирования рацемата первичного аминосоединения, катализируемого пенициллинацилазой, проводили в водной среде методом ацильного переноса от амида (R)-миндальной кислоты. Начальные концентрации реагентов: 100 мМ ацильного донора, 100 мМ рацемата аминосоединения, концентрация активных центров пенициллинацилазы 10 мкМ. Реакцию проводили в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 9,5 при постоянном перемешивании. Время проведения эксперимента составляло от 30 мин. Затем реакционную смесь подкисляли до pH 3,06 н. HCl и экстрагировали этилацетатом (3×5 мл). Продукт синтеза распределялся в органическом слое. Органический слой выпаривали, а остаток растворяли в 5 мл водно-этанольного раствора. Для определения энантиомерного избытка продукта синтеза аликвоту полученного раствора анализировали методом ВЭЖХ. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их мобильной фазой и анализировали методом ВЭЖХ. Эффективность ацильного переноса определяли как соотношение начальных скоростей накопления продуктов синтеза (С) и гидролиза (Г). Стереоселективность ацильного переноса определяли как соотношение начальных скоростей накопления продуктов ацилирования двух энантиомеров аминосоединения.

Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Escherichia coli в реакциях стереоселективного ацилирования первичной аминогруппы аминоспиртов и гидролиза N-ацильных производных первичных аминоспиртов, включающий изменение структуры пенициллинацилазы путем замены аминокислотного остатка 71 бета-цепи на лейцин или аргинин или путем замены аминокислотного остатка 145 альфа-цепи.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий дельта-9-элонгазной активностью, а также к очищенному полипептиду, обладающему дельта-9-элонгазной активностью, кодируемому вышеуказанной изолированной молекулой нуклеиновой кислоты.

Изобретение относится к области автоматизации биотехнологических процессов. Предложен способ управления процессом получения капсулированных ферментных препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментационной среде и способу получения рекомбинатных белков с использованием данной среды. Ферментационная среда для получения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей Г-КСФ, стрептокиназу и липазу, с использованием микроорганизмов, выбранных из группы, включающей: E.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и представляет собой способ получения комплексных мультиферментных препаратов с целлобиогидролазной, эндоглюканазной, β-глюкозидазной (целлобиазной) активностями путем культивирования рекомбинантных штаммов мицелиальных грибов рода Penicillium verruculosum, трансформированных линейной фьюжн-конструкцией, представляющей собой последовательно соединенные через линкер гомологичные и гетерологичный гены карбогидраз, таких как целлобиогидролаза I, эндоглюканаза и бета-глюкозидаза.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к биосинтезу гидролазы пептидогликана, и представляет собой белок с активностью гидролазы пептидогликана, плазмиду, содержащую фрагмент, кодирующий гидролазу пептидогликана, бактерию-продуцент, способ микробиологического синтеза гидролазы пептидогликана, а также фармацевтическую композицию, содержащую полученную гидролазу пептидогликана, для терапии заболеваний, вызванных грамотрицательной микрофлорой.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вектора, клетки-хозяина, содержащего вектор, генетически модифицированного микроорганизма Clostridium thermocellum, способа получения такого микроорганизма и способа преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ получения лизогликолипида, включающий обработку субстрата, содержащего гликолипид, по меньшей мере одним липолитическим ферментом для получения указанного лизогликолипида, где указанный липолитический фермент обладает гликолипазной активностью и где указанный липолитический фермент получают из рода Thermobifida, где липолитический фермент содержит любую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:5, 7 или 16 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична им, или кодируется любой нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:6 или 17 или нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 70% идентична им.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к использованию бета-галактозидазы AsBgl_1390 из археи Acidilobus saccharovorans в качестве бета-глюкозидазы, бета-ксилозидазы и бета-маннозидазы.

Изобретение относится к медицине и заключается в безводной композиции для обработки ран, композиция содержит гидрофильную дисперсную фазу, включающую ПЭГ 400 и коллагеназу; и гидрофобную непрерывную фазу, включающую гидрофобную основу; при этом гидрофильная дисперсная фаза диспергирована в гидрофобной непрерывной фазе; количество ПЭГ 400 составляет 13-27% масс. В вариантах осуществления изобретения используется также ПЭГ 600 или Полоксамер 124 в количестве 20-40% масс. Технический результат заключается в улучшении ферментативной активности композиции. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 пр., 13 табл., 10 ил.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа активации теломеразы, удлинения теломер и увеличения потенциала клеточного деления, включающего введение композиции, содержащей соединение, такое как циклоастрагенол, и, по меньшей мере, один пептид тимуса, выбранный из группы дипептида, трипептида, тетрапептида или пентапептида, и/или пептид эпифиза, выбранный из группы дипептида, трипептида, тетрапептида или пентапептида. Группа изобретений также касается композиции, предназначенной для активации теломеразы, удлинения теломер и увеличения потенциала клеточного деления; применения указанной композиции для производства средства, предназначенного для профилактики и/или лечения состояний, для которого является полезной активация теломеразы, удлинение теломер и увеличение потенциала клеточного деления. Группа изобретений обеспечивает активацию теломеразы, удлинение теломер и увеличение потенциала клеточного деления. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 9 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения усеченной формы тритикаина-альфа пшеницы, имеющей последовательность SEQ ID NO: 2 (shortTRIT-α), рекомбинантно экспрессирующейся в бактериальной системе, заключающийся в том, что проводят культивирование клеток E. coli JM109, трансформированных плазмидой pQE80L_shortTRIT-α, содержащей последовательность ДНК, кодирующей белок shortTRIT-α, в среде LB с добавлением ампициллина при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом и растят еще 2.5-3 часа; очистку целевого белка shortTRIT-α проводят методом аффинной металл-хелатной хроматографии: осажденную центрифугированием клеточную биомассу экспрессионной культуры ресуспендируют в буфере, содержащем 0.01 М Трис-HCl, рН 8.0 и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученный после центрифугирования лизата осадок промывают исходным буфером и растворяют в буфере А, состоящем из 6 М гуанидин-хлорида и 0.05 М Трис-HCl, рН 7.8, раствор осветляют центрифугированием и наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А и тем же буфером с содержанием 8 М мочевины и 0.005 М имидазола, белок элюируют буфером А с содержанием 8 М мочевины и 0.25 М имидазола, затем элюат добавляют в охлажденный буфер 0.05 М Трис-HCl, 0.5 М аргинин-хлорид, 2 М мочевина, рН 7.8 в соотношении 1:5 и перемешивают 1 ч при 4°С, раствор диализуют против 0.05 М Трис-HCl, рН 7.8 при 4°С, супернатант, полученный после центрифугирования диализата, концентрируют на ячейке Amicon с мембраной РМ-10 (Millipore), с последующим диализом против фосфатно-солевого буфера PBS, рН 7.4, при 4°С, определяют концентрацию белка shortTRIT-α, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. Изобретение позволяет получить чистый белковый препарат с активностью тритикаина-альфа пшеницы с высокой степенью эффективности. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ снижения количества CO2 в потоке газообразных веществ, а также аппарат для удаления CO2 из потока газообразных веществ. Способ включает контактирование газообразных веществ, содержащих CO2, с первым потоком водной поглощающей жидкости, содержащей карбонат ангидразу, поглощение CO2 указанной жидкостью и превращение его в более растворимый неорганический углерод. Осуществление разделения первого потока жидкости на второй и третий потоки жидкости, где второй поток содержит более высокую концентрацию карбонат ангидразы относительно третьего потока. Осуществление контактирования третьего потока жидкости с микроорганизмом, способным превращать растворенный в жидкости неорганический углерод в кислород и/или биомассу. Аппарат содержит первую и вторую системы циркуляции текучего вещества. Первая система содержит поглощающий блок с внутренним пространством, ниже по потоку от поглощающего блока - фильтровальный блок с фильтром. Вторая система содержит биореактор или водоем для культивирования микроорганизмов. Изобретения обеспечивают повышение эффективности захвата CO2, снижение удельной площади поверхности водоема, а также снижение потребляемой энергии при регенерации поглощающей жидкости. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретения касаются способа приготовления экспрессионного вектора, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая способна к рекомбинации асимметричных последовательностей-мишеней в пределах длинного концевого повтора (LTR) провирусной ДНК множества штаммов ВИЧ-1, встроенных в геном клетки-хозяина, а также к полученному экспрессионному вектору, клетке, трансфецированной этим вектором, экспрессированной рекомбиназе и фармацевтической композиции, включающей экспрессионный вектор, клетку и/или рекомбиназу. Представленные изобретения могут быть использованы при лечении или профилактике инфекции ВИЧ-1 у субъекта. 6 н и 22 з.п.ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Изобретение относится к медицине и представляет собой безводную композицию для обработки ран, включающую (a) гидрофильную дисперсную фазу, содержащую PEG 400 и термолизин, и (b) гидрофобную непрерывную фазу, содержащую гидрофобную основу. Гидрофильная дисперсная фаза диспергирована в гидрофобной непрерывной фазе. В вариантах осуществления композиция включает трипсин, папаин или пепсин. Технический результат – повышенная ферментативная активность. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 пр., 13 табл., 10 ил.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к применению штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов. Настоящее изобретение позволяет конструировать продуцентов рекомбинантных целевых ферментов, в том числе продуцентов ксиланаз и маннаназ. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к полипептиду, обладающему активностью цитохрома P450. Указанный полипептид способен окислять такие соединения терпена, как моно- или полициклические монотерпены и сесквитерпены. Настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид, вектор экспрессии, включающий указанную нуклеиновую кислоту, а также различные организмы-хозяины и клетки-хозяины, не относящиеся к человеку, и способ окисления терпенов с использованием указанного полипептида, обладающего активностью цитохрома P450. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для окисления различных соединений терпена. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 11 пр.

Изобретение относится к применению функциональных пищевых продуктов, содержащих диаминоксидазу, для предотвращения мигрени, хронической усталости, фибромиалгии, спондилита и боли, вызванной мышечными контрактурами. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 пр.

Группа изобретений относится к области ветеринарии, в частности к способу получения препарата для профилактики инфекций пищеварительного тракта у сельскохозяйственной птицы. В предлагаемом способе, включающем предварительное смешивание дрожжевой биомассы Saccharomyces cerevisiae с ферментными препаратами ЦеллоЛюкс-F или ЦеллоЛюкс-А, Протосубтилин и водой, механическую активацию смеси, согласно изобретению механическую активацию смеси проводят в активаторах центробежно-роликового, кольцевого, виброцентробежного, вибрационного типа, при смешении дополнительно вводят неорганический абразивный материал или неорганические абразивные материалы с получением препарата, при следующем соотношении компонентов в смеси, мас. %: ферментный препарат ЦеллоЛюкс-F или ЦеллоЛюкс-А - 0,1-8; ферментный препарат Протосубтилин - 0,1-8; неорганический абразивный материал - 0,3-11 или неорганические абразивные материалы -0,1-11; вода - 0,5-5; биомасса дрожжей - остальное. Заявленный препарат получается заявляемым способом. Группа изобретений обеспечивает создание препарата, обладающего воздействием на микрофлору ЖКТ сельскохозяйственной птицы и проявляющего свойства сорбента за счет наличия маннопротеинов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 табл., 10 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы. Заявленный способ включает изменение структуры пенициллинацилазы из Escherichia coli путем замены аминокислотного остатка 145 альфа-цепи на лейцин или аминокислотного остатка 71 бета-цепи на лейцин или аргинин. Способ приводит к улучшению каталитической активности пенициллинацилазы в реакциях стереоселективного ацилирования первичных аминогрупп химических соединений и стереоселективного гидролиза N-ацильных производных первичных аминосоединений. 6 табл., 5 пр.

Наверх