Композиция микобактериальных антигенов



Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов
Композиция микобактериальных антигенов

 


Владельцы патента RU 2576007:

ДЗЕ СЕКРЕТЭРИ ОФ СТЕЙТ ФОР ХЕЛТ, (GB)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антигенной композиции, способной стимулировать специфичный иммунный ответ против микобактерий, содержащей: первый микобактериальный антигенный полипептид и второй микобактериальный антигенный полипептид, а также к способу ее получения. Также раскрыто применение первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена для получения лекарственного средства для стимуляции специфичного иммунного ответа против микобактерий у индивидуума. Также изобретение относится к способу диагностики микобактериальной инфекции с использованием вышеуказанной композиции или с использованием первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена. Изобретение позволяет эффективно лечить или предотвращать микобактериальные инфекции. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 14 пр.

 

Настоящее изобретение относится к микобактериальным полинуклеотидам и полипептидам, к их фрагментам или вариантам, к их ингибиторам, к антителам, связывающимся с ними, к векторам и микробным носителям, к терапевтическим композициям, таким как вакцины против микобактериальных инфекций, и к композициям и способам для детекции наличия микобактериальной инфекции.

Микроорганизмы, такие как виды Salmonella, Yersinia, Shigella, Campylobacter, Chlamydia и Mycobacteria, способны к формированию внутриклеточных инфекций. Эти инфекции могут являться исключительно внутриклеточными или могут содержать и внутриклеточный, и внеклеточный компоненты. Как правило, эти микроорганизмы в организме свободно, например, в кровотоке, не циркулируют, и в силу этого часто не поддаются схемам лекарственной терапии.

Трудности, связанные с лечением внутриклеточной инфекции, увеличены развитием микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью. Вследствие аккумуляции с течением времени мутаций и последующего горизонтального и вертикального переноса мутантных генов другим организмам, неактивными становились целые классы антибиотиков. По подобным причинам не доказана эффективность вакцинотерапии против внутриклеточных микроорганизмов.

Mycobacterium tuberculosis (MTB) и близкородственные виды составляют небольшую группу микобактерии известных как микобактерии туберкулезного комплекса (MTC). Эта группа содержит пять отдельных видов: M. tuberculosis, M. microti, M. bovis, M. caneti и M. africanum.

Патогенными у человека и животных также являются другие микобактерии, например, подвиды M. Avium paratuberculosis, вызывающие болезнь Джона у жвачных животных, M. bovis, вызывающие туберкулез у крупного рогатого скота, M. avium и M. intracellulare, вызывающие туберкулез у пациентов с иммунной недостаточностью (например, пациенты со СПИД и пациенты с трансплантацией костного мозга), и M. leprae, вызывающие лепру у людей. Другим важным видом микобактерий является M. vaccae.

В качестве этиологического агента инфекции туберкулеза (TB) Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) является основной причиной гибели от заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями по всему миру - латентная инфекция поражает до одной трети населения мира. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно происходят приблизительно девять миллионов новых случаев TB и приблизительно два миллиона случаев гибели. Наибольшее количество новых случаев TB произошло в 2005 году в Юго-Восточной Азии (34% от случаев заболевания по всему миру), а расчетная заболеваемость в Африке к югу от Сахары составляет приблизительно 350 случаев на 100000 населения. Однако инфекция TB не ограничена развивающимися странами: в Великобритании с поздних 1980 годов наблюдался всплеск туберкулеза и в настоящее время каждый год регистрируют более 8000 новых случаев - скорость 14,0 на 100000 населения. Приблизительно 40% этих новых случаев происходит в районе Лондона, где скорость возникновения инфекции составляет 44,8 на 100000 населения.

Оптимальное ведение пациентов требует раннего начала лечения лекарственными средствами и как можно более быстрой изоляции индивидуумов с инфекцией. При отсутствии лечения каждый индивидуум с активным заболеванием TB заражает в среднем от 10 до 15 человек каждый год. Инфекцию TB в норме можно лечить посредством 6-месячного курса антибиотиков; однако соблюдение пациентом схемы лечения при длительном лечении лекарственными средствами варьирует с наличием пациентов, часто прекращающих лечение при стихании у них симптомов. Отсутствие полного лечения может способствовать развитию микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью.

Термин "латентность" является синонимом с "персистенцией" и описывает обратимое состояние низкой метаболической активности, в котором микобактериальные клетки могут существовать в течение длительных периодов с ограниченным или отсутствующим делением клеток. При латентности (т.е. при латентной инфекции) клинические симптомы, ассоциированные с микобактериальной инфекцией, не проявляются.

Однако повторную активацию латентных микобактерий могут индуцировать стимулы из окружающей среды - например, увеличение доступности питательных веществ и/или концентрации локально растворенного кислорода. При активной инфекции микобактерии (например, M. tuberculosis) демонстрируют высокую метаболическую активность и быстро размножаются, что приводит к развитию активной микобактериальной инфекции с ассоциированными клиническими симптомами.

Исследования in vitro продемонстрировали, что микобактерии, такие как M. tuberculosis, способны к адаптации и к выживанию в условиях недостаточности питательных веществ и кислорода и могут расти в пределах определенного диапазона доступности питательных веществ и напряжения кислорода. Адаптация к недостаточности углерода и/или к низкому напряжению растворенного кислорода in vitro запускает переход в неразмножающееся персистирующее состояние, которое может являться аналогом латентности in vivo.

Считается, что внутриклеточное выживание и размножение микобактерий является основным поддерживающим фактором прогрессирования микобактериального заболевания. Наличие большой группы бессимптомных индивидуумов, латентно инфицированных микобактериями, является основной проблемой контроля микобактериальных инфекций, особенно инфекций M. tuberculosis. Кроме того, вследствие вакцинации BCG и воздействия микобактерий окружающей среды сомнению можно подвергать общепринятые способы детекции латентной микобактериальной инфекции посредством кожной пробы.

Эффективность вакцинопрофилактики M. tuberculosis колебалась в широких пределах. Современная вакцина против M. tuberculosis, BCG, представляет собой аттенуированный штамм M. bovis. Он эффективен против тяжелых осложнений TB у детей, но его эффективность у взрослых очень варьирует, особенно в этнических группах. Вакцинацию BCG использовали для предотвращения туберкулезного менингита, и она помогает предотвращать распространение M. tuberculosis во внелегочные участки, но не предотвращает инфекции. Ограниченная эффективность BCG и всемирная распространенность TB привела к международным усилиям в разработке новых, более эффективных вакцин.

В WO 03/004520 (на имя настоящего заявителя, включенной в настоящее описание в качестве ссылки) описана идентификация определенного подмножества генов микобактерий, экспрессия которых индуцирована и повышена при латентности микобактерий. В частности, экспрессия этой определенной подгруппы генов микобактерий индуцирована и повышена при культивировании микобактерий в условиях культивирования с недостатком питательных веществ, по сравнению с условиями культивирования без недостатка питательных веществ и в которых поддерживается экспоненциальный рост указанных микобактерий.

В WO 03/035681 (на имя настоящего заявителя, включенной в настоящее описание в качестве ссылки) описана идентификация определенного подмножества генов микобактерий, экспрессия которых подавлена при латентности микобактерий. В частности, экспрессия этой определенной подгруппы генов микобактерий подавлена в условиях культивирования с недостатком питательных веществ, по сравнению с условиями культивирования без недостатка питательных веществ и в которых поддерживается экспоненциальный рост указанных микобактерий.

В WO 03/000721 (на имя настоящего заявителя, включенной в настоящее описание в качестве ссылки) описана идентификация определенного подмножества генов микобактерий, экспрессия которых индуцирована или повышена при непрерывном культивировании микобактерий в условиях роста, определяемых низким напряжением растворенного кислорода (до 10% от насыщения воздуха, измеряемого при 37°C) по сравнению с напряжением растворенного кислорода по меньшей мере 40% от насыщения воздуха, измеряемого при 37°C.

Ввиду возрастающей опасности и всемирной распространенности микобактериальной инфекции необходимы новые стратегии для более эффективных предотвращения, лечения и диагностики микобактериальной инфекции.

Изобретение относится к антигенной композиции, содержащей первый микобактериальный антиген и второй микобактериальный антиген;

где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В рамках изобретения термин "микобактериальный" или "микобактерия" относится к видам M. phlei, M. smegmatis, M. africanum, M. caneti, M. fortuitum, M. marinum, M. ulcerans, M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. avium, M. paratuberculosis, M. leprae, M. lepraemurium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. genavense, M. kansasii, M. simiae, M. szulgai, M. haemophilum, M. asiaticum, M. malmoense, M. vaccae, M. caneti и M. shimoidei. Особый интерес вызывают представители MTC, такие как M. tuberculosis.

Термин антиген означает любое вещество, которое может распознавать иммунная система и/или которое стимулирует иммунный ответ. Например, антиген может стимулировать клеточный иммунный ответ и/или может стимулировать синтез антител.

В одном из вариантов осуществления микобактериальный антиген по изобретению относится к клеточному ответу на инфекцию, включающему иммунные клетки, такие как T-клетки (CD4+ и/или CD8+ T-клетки) и/или способность отвечать цитокинами Th1-типа, такими как IFN-γ. В одном из вариантов осуществления микобактериальный антиген индуцирует секретирующие IFN-γ клетки (например, преимущественно CD4+ T-клетки). В этом отношении недавние исследования позволяют предположить, что иммунный клеточный ответ (в частности, T-клеточный иммунный ответ, например, в слизистой легких) может быть критичным для защиты от легочного микобактериального заболевания.

В одном из вариантов осуществления микобактериальный антиген по изобретению относится к защите (такой как длительная защита) от заражения микобактериями, такими как M. tuberculosis.

В качестве примера микобактериальный антиген по изобретению может индуцировать "T-клетки памяти", которые могут продолжать стимулировать защитный иммунитет в течение длительного периода (например, в течение десятилетий). Иммунологическая память относится к реактивации долгоживущих, специфичных к антигенам T-лимфоцитов, которые непосредственно происходят от дифференцированных эффекторных T-клеток и сохраняются в покоящемся состоянии. T-клетки памяти являются гетерогенными; идентифицированы по меньшей мере два подкласса с различными способностью к миграции и эффекторными функциями. T-клетки памяти первого подкласса известны как "эффекторные T-клетки памяти" (TEM), так как они похожи на эффекторные T-клетки, образующиеся при первичном ответе тем, что у них отсутствуют рецепторы хоминга в лимфоузлы для миграции в воспаленные ткани. При повторной встрече с антигеном TEM быстро продуцируют IFN-γ или IL-4 или высвобождают предварительно накопленный перфорин. T-клетки памяти второго класса (известные как "центральные клетки памяти" (TCM)) экспрессируют L-селектин и CCR7 и у них отсутствует непосредственная эффекторная функция. TCM обладают низким порогом активации и пролиферируют и дифференцируются в эффекторы при повторной стимуляции во вторичных лимфоидных органах.

В одном из вариантов осуществления микобактериальный антиген относится к ответу на микобактериальную (например, M. tuberculosis) инфекцию нейтрализующими антителами.

В одном из вариантов осуществления каждый антиген в антигенной композиции по настоящему изобретению независимо индуцирует эффективный иммунный ответ (например, клеточный иммунный ответ или ответ антителами). Таким образом, по этому варианту осуществления после введения антигенной композиции индивидууму иммунный ответ у индивидуума индуцируется к каждому антигену в антигенной композиции.

В этом отношении, авторы настоящего изобретения определили, что (в одном из вариантов осуществления) антигенная композиция по настоящему изобретению преимущественно не допускает "конкуренции антигенов" или ассоциирована с низкими уровнями "конкуренции антигенов" по сравнению с конкурирующим действием, которое можно бы было ожидать с учетом известных поливалентных вакцинных композиций.

"Конкуренция антигенов" представляет собой явление, при котором иммунный ответ на один антиген подавляет иммунный ответ на второй, независимый антиген (см. Eidinger, D. et al., J .Exp. Med., 1968. 128(5): pages 1183-1200). Например, иммунные клетки (например, T-клетки), отвечающие на один антиген могут активно препятствовать другим иммунным клеткам (например, T-клеткам) отвечать на другой антиген (см. Kerbel, R.S. and Eidinger, D., Nat. New. Biol., 1971. 232(27): pages 26-28).

В WO 00/47227 описана (в примере 2) иммунизация морских свинок только ДНК, кодирующей микобактериальный антиген 85A (группа A); или ДНК, кодирующей микобактериальный антиген 85A и микобактериальный антиген MPT32 (группа B). После заражения M. tuberculosis оценивали эффективность вакцины, определяя микобактериальную нагрузку в легких и селезенке. Фигуры 11A и 11B иллюстрируют, что комбинация антигенов 85A и MPT32 (группа B) была менее эффективной против M. tuberculosis, чем антиген 85A отдельно (группа A).

Таким образом, известно, что объединение эффективных кандидатов для вакцин в поливалентную вакцину подавляет или даже полностью уничтожает эффективность вакцины. Конкуренция антигенов такова, что поливалентную вакцину, достигающую улучшенной эффективности, выше ее самого эффективного компонента, считают выгодной.

Таким образом, то, что антигенная композиция по настоящему изобретению комбинирует антигены, которые индивидуально способны инициировать иммунный ответ, и, кроме того, приводит к улучшенному/усиленному иммунному ответу по сравнению c иммунным ответом на каждый из индивидуальных антигенов, оказалось неожиданным.

В одном из вариантов осуществления микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность. Микобактериальный антиген может представлять собой полипептид. Альтернативно, или кроме того, микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность. Например, микобактериальный антиген может представлять собой полинуклеотид, такой как ДНК или РНК.

Первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

Указанное подмножество микобактериальных полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56, представляет собой "регулируемые латентностью полипептиды". Указанное подмножество микобактериальных полинуклеотидов, представленных в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57, представляет собой "регулируемые латентностью полинуклеотиды".

В одном из вариантов осуществления "регулируемый латентностью полипептид" кодируется "регулируемым латентностью полинуклеотидом". В качестве примера регулируемый латентностью полипептид SEQ ID NO: 1 кодируется регулируемым латентностью полинуклеотидом SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 кодируется SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 кодируется SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7 кодируется SEQ ID NO: 8; и SEQ ID NO: 56 кодируется SEQ ID NO: 57.

Экспрессия или активность регулируемого латентностью полипептида или полинуклеотида модулируется в ответ на латентность микобактерий - например, в ответ на культивирование микобактерий (например, M. tuberculosis) в условиях культивирования, индуцирующих или поддерживающих латентность микобактерий.

В одном из вариантов осуществления "модуляция" экспрессии или активности регулируемых латентностью полипептида или полинуклеотида в ответ на условия латентности микобактерий означает, что экспрессия или активность в ответ на латентность индуцированы или повышены. Таким образом, регулируемые латентностью полипептид или полинуклеотид могут представлять собой "индуцированные латентностью" или "активированные латентностью" полипептид или полинуклеотид.

Например, экспрессия или активность активированных латентностью полипептида или полинуклеотида в условиях латентности по сравнению с нелатентными условиями могут быть повышены по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз или 50 раз.

Экспрессия или активность индуцированных латентностью и активированных латентностью полипептидов и полинуклеотидов может быть индуцирована или повышена in vivo при латентности в естественной среде микобактерий. Поэтому индуцированные латентностью или активированные латентностью микобактериальные полипептиды и полинуклеотиды представляют собой хорошие кандидаты для вакцин и хорошие терапевтические мишени для предотвращения возникновения, распространения и возобновления заболевания и/или получения хороших диагностических средств для латентной инфекции.

В одном из вариантов осуществления "модуляция" экспрессии или активности регулируемого латентностью полипептида в ответ на условия латентности микобактерий означает, что экспрессия или активность в ответ на латентность репрессированы или подавлены. Таким образом, в одном из вариантов осуществления регулируемые латентностью полипептид или полинуклеотид представляют собой "репрессированные латентностью" или "подавленные латентностью" полипептид или полинуклеотид.

Экспрессия или активность подавленных латентностью полипептида или полинуклеотида в условиях латентности по сравнению с нелатентными условиями могут быть подавлены по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз или 50 раз. Указание на "подавленность" включает "выключение", которое означает, что детектируемой активности и/или экспрессии полипептида или полинуклеотида не выявляют.

Экспрессия или активность репрессированных латентностью или подавленных латентностью полипептидов и полинуклеотидов могут быть индуцированы или подавлены in vivo при активной микобактериальной инфекции или при/после реактивации микобактерий после латентного состояния. Репрессированные латентностью и подавленные латентностью микобактериальные полипептиды и полинуклеотиды могут играть раннюю роль в развитии эффективного иммунного ответа против размножающихся бацилл в течение активных стадий заболевания, и, таким образом, они представляют собой хорошие кандидаты для вакцин и хорошие терапевтические мишени для предотвращения возникновения, распространения и возобновления заболевания.

Экспрессия или активность регулируемых латентностью полипептида или полинуклеотида в условиях культивирования с недостатком питательных веществ по сравнению с условиями культивирования без недостатка питательных веществ могут быть изменены (например, индуцированы, повышены, репрессированы или подавлены). В условиях культивирования с недостатком питательных веществ концентрация первичного источника энергии (например, углерода) является недостаточной для поддержания экспоненциального роста микобактерий, что приводит к метаболическому стрессу микобактерий и их вступлению в латентное состояние.

Экспрессия или активность регулируемых латентностью полипептида или полинуклеотида альтернативно (или дополнительно) может быть изменена (например, индуцирована, повышена, репрессирована или подавлена) в условиях ограничения кислорода (низкого напряжения растворенного кислорода) по сравнению с условиями культивирования без ограничения кислорода.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген состоит из полипептидной последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген представляет собой "первый микобактериальный полипептид" (или фрагмент), как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 определены в таблице 1, ниже:

Таблица 1
SEQ ID NO: Название полипептида
1 Rv0111
3 Rv1806
5 Rv0198
7 Rv3812
56 Rv1807

Таким образом, в контексте настоящей заявки "полипептидный антиген Rv0111" содержит или состоит из SEQ ID NO: 1 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); "полипептидный антиген Rv1806" содержит или состоит из SEQ ID NO: 3 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); "полипептидный антиген Rv0198" содержит или состоит из SEQ ID NO: 5 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); "полипептидный антиген Rv3812" содержит или состоит из SEQ ID NO: 7 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); и "полипептидный антиген Rv1807" содержит или состоит из SEQ ID NO: 56 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей имеет место в областях полипептидных последовательностей, составляющих по меньшей мере 7 последовательных аминокислотных остатков (например, по меньшей мере 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или 650 последовательных аминокислотных остатков в длину).

Обычные способы определения идентичности аминокислотных последовательностей более подробно описаны ниже в настоящем описании.

В случае первого микобактериального антигена, фрагмент полипептида содержит (или состоит из) по меньшей мере 7 последовательных аминокислотных остатков указанного полипептида (например, по меньшей мере 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 или 675 последовательных аминокислотных остатков указанного полипептида).

В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида имеет длину последовательности, которая составляет по меньшей мере 5%, 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, или 90% от длины последовательности полноразмерного полипептида.

Фрагмент полипептида может содержать по меньшей мере один эпитоп полипептида.

В одном из вариантов осуществления, в случае первого микобактериального антигена, фрагмент полипептида содержит (или состоит из) укороченную форму указанного полипептида. Например, фрагмент полипептида может быть укорочен на N-конце (по сравнению с полипептидом) или фрагмент полипептида может быть укорочен на C-конце (по сравнению с полипептидом).

В одном из вариантов осуществления, в случае первого микобактериального антигена, фрагмент полипептида содержит (или состоит из) зрелую форму полипептида. Например, полипептид может содержать сигнальную последовательность (т.е. последовательность секреции/направления) (например, на N-конце), а во фрагменте полипептида эта сигнальная последовательность может отсутствовать. В одном из вариантов осуществления фрагмент получают посредством отщепления от полипептида сигнальной последовательности.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 1 представляет собой укороченную на N-конце форму SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 1 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 укорочен на N-конце по меньшей мере на 50, 100, 150, 200, 250, 300 или 350 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 1 содержит C-концевую последовательность по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот SEQ ID NO: 1.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 7 представляет собой укороченную на N-конце форму SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 7 представляет собой зрелую полипептидную последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 7 удалением N-концевой сигнальной последовательности. В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 7 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 укорочен на N-конце по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 7 содержит C-концевую последовательность по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот SEQ ID NO: 7.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит полипептид или его фрагмент с общей перекрестной антигенной реактивностью и/или по существу c одинаковой биологической активностью in vivo с регулируемым латентностью полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56.

В рамках изобретения "общая перекрестная антигенная реактивность" означает, что первый микобактериальный полипептид или его фрагмент и регулируемый латентностью полипептид, выбранный из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56, обладают общей способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит (например, CD4+, CD8+, эффекторная T-клетка или T-клетка памяти, такая как TEM или TCM), которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции.

В течение последних 10 лет разработаны новые иммунологические анализы для измерения и количественной оценки клеточного иммунного ответа (например, T-клеточного ответа). Например, в качестве иммунологического показателя пригоден анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISPOT, так как секреция IFN-γ антиген-специфическими иммунными клетками, такими как T-клетки, хорошо коррелирует с защитой от M. tuberculosis. Кроме того, анализ ELISPOT является хорошо воспроизводимым и очень чувствительным способом количественного определения секретирующих IFN-γ антиген-специфических иммунных клеток, таких как T-клетки.

Альтернативно, или кроме того, "общая перекрестная антигенная реактивность" означает, что антитело, способное к связыванию с первым микобактериальным полипептидом или его фрагментом, также способно к связыванию с регулируемым латентностью полипептидом.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит или состоит из полинуклеотидной последовательности, кодирующей первый микобактериальный полипептид, как определено выше.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий (или состоящий из) аминокислотную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот (например, как определено выше).

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген состоит из полинуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген представляет собой "первый микобактериальный полинуклеотид" (или фрагмент), как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид по изобретению, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 определены в таблице 2, ниже:

Таблица 2
SEQ ID NO: Название полинуклеотида
2 Rv0111
4 Rv1806
6 Rv0198
8 Rv3812
57 Rv1807

Таким образом, в отношении настоящей заявки, "полинуклеотидный антиген Rv0111" содержит или состоит из SEQ ID NO: 2 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); "полинуклеотидный антиген Rv1806" содержит или состоит из SEQ ID NO: 4 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); "полинуклеотидный антиген Rv0198" содержит или состоит из SEQ ID NO: 6 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании); "полинуклеотидный антиген Rv3812" содержит или состоит из SEQ ID NO: 8 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и "полинуклеотидный антиген Rv1807" содержит или состоит из SEQ ID NO: 57 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления идентичность нуклеотидных последовательностей имеет место в областях полинуклеотидных последовательностей, составляющих по меньшей мере 21 последовательный нуклеотидный остаток в длину (например, по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 или 1000 последовательных нуклеотидных остатков в длину).

Обычные способы определения идентичности нуклеотидных последовательностей более подробно описаны ниже в настоящем описании.

В случае первого микобактериального антигена, фрагмент указанного полинуклеотида содержит (или состоит из) по меньшей мере 21 последовательный нуклеотидный остаток указанного полинуклеотида (например, по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 или 2000 последовательных нуклеотидных остатков указанного полинуклеотида).

В одном из вариантов осуществления длина последовательности полинуклеотидного фрагмента составляет по меньшей мере 5%, 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% длины полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления, в случае первого микобактериального антигена, фрагмент полинуклеотида содержит (или состоит из) укороченную форму указанного полинуклеотида. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида по сравнению с полноразмерной полинуклеотидной последовательностью укорочен на 5'-конце и/или на 3'-конце. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида кодирует укороченную форму указанного полипептида. Например, фрагмент полинуклеотида может кодировать полипептид, укороченный на N-конце, и/или полипептид, укороченный на C-конце (по сравнению с полипептидом, кодируемым полноразмерным полинуклеотидом).

В одном из вариантов осуществления, в случае первого микобактериального антигена, фрагмент полинуклеотида кодирует полипептид, содержащий (или состоит из) зрелый полипептид. Например, полноразмерный полипептид содержит сигнальную последовательность (т.е. последовательность секреции/направления) (например, на N-конце), а полинуклеотидный фрагмент кодирует зрелый полипептид, в котором эта сигнальная последовательность отсутствует.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 2 представляет собой укороченную на 5'-конце форму SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов фрагмента полинуклеотида SEQ ID NO: 2 укорочение на 5'-конце составляет по меньшей мере 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидных остатков по сравнению с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 2 кодирует укороченную на N-конце форму SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 2 кодирует полипептид с укорочением на N-конце по меньшей мере на 50, 100, 150, 200, 250, 300, или 350 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 2 содержит 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 3'-концевых нуклеотидных остатков по сравнению с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 2 кодирует полипептид, содержащий C-концевую последовательность по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот SEQ ID NO: 1.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 8 представляет собой укороченную на 5'-конце форму SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов фрагмента полинуклеотида SEQ ID NO: 8 укорочение на 5'-конце составляет по меньшей мере 25, 50, 75, 100 или 125 нуклеотидных остатков по сравнению с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 8 кодирует укороченную на N-конце форму SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 8 кодирует зрелую полипептидную последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 7 удалением N-концевой сигнальной последовательности. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 8 кодирует полипептид, укороченный на N-конце по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 аминокислотных остатки по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 8 содержит 150, 300, 450, 600, 750, 900, 1050, 1200 или 1350 3'-концевых нуклеотидных остатков по сравнению с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 8 кодирует полипептид, содержащий C-концевую последовательность 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот SEQ ID NO: 7.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид или его фрагмент, кодирует полипептид с общей перекрестной антигенной реактивностью и/или по существу c одинаковой биологической активностью in vivo с регулируемым латентностью полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56.

Например, указанный первый микобактериальный антиген может содержать (или состоять из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, способную вызывать защитный клеточный иммунный ответ (например, T-клеточный ответ) против микобактериальной инфекции.

В качестве примера полипептид, кодируемый первым микобактериальным полинуклеотидом, или его фрагмент обладают общей с регулируемым латентностью полипептидом способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит (например, CD4+, CD8+, эффекторная T-клетка или T-клетка памяти, такая как TEM или TCM), которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции. В этом отношении, секреция IFN-γ антиген-специфическими иммунными клетками, такими как T-клетки, хорошо коррелирует с защитой от M. tuberculosis. Таким образом, анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISPOT является подходящим иммунологическим показателем, и обеспечивает воспроизводительное и чувствительное количественное определение секретирующих IFN-γ антиген-специфических иммунных клеток, таких как T-клетки.

Альтернативно, или кроме того, антитело, способное к связыванию с полипептидом, кодируемым первым микобактериальным полинуклеотидом, или его фрагментом, также способно к связыванию с регулируемым латентностью полипептидом.

Антигенная композиция в дополнение к первому микобактериальному антигену по изобретению содержит по меньшей мере второй микобактериальный антиген.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген способен вызывать защитный иммунный ответ (например, T-клеточный ответ) против микобактериальной инфекции.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (например, состоит из) полипептидную последовательность. В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (например, состоит из) полинуклеотидную последовательность, такую как последовательность ДНК или РНК.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (например, состоит из) микобактериальный гликолипид, такой как микобактериальный сульфогликолипид.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (например, состоит из) микобактериальный углеводный антиген, такой как микобактериальный сахарид или полисахарид. Необязательно, сахарид для увеличения иммуногенности может быть связан (например, химически конъюгирован) c носителем (например, полипептидом).

Второй микобактериальный антиген отличается от первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления "различие" между вторым микобактериальным антигеном и первым микобактериальным антигеном определяется специфичностью иммунного ответа на первый и второй микобактериальные антигены. Например, в одном из вариантов осуществления каждый из первого и второго антигенов индуцирует иммунный ответ, который по существу специфичен для этого антигена.

"Различие" между вторым микобактериальным антигеном и первым микобактериальным антигеном может определяться в отношении существенной недостаточности (например, отсутствия) общей перекрестной антигенной реактивности между первым и вторым микобактериальными антигенами.

Альтернативно "различие" между вторым микобактериальным антиген и первым микобактериальным антигеном (или кроме того) может определяться как существенная недостаточность (например, отсутствие) у первого и второго микобактериальных антигенов общей биологической активности in vivo.

Например, в одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены могут демонстрировать (по существу) полное отсутствие общей перекрестной антигенной реактивности. В одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены могут демонстрировать (по существу) полное отсутствие общей биологической активности in vivo. Например, первый и второй микобактериальные антигены индуцируют различные виды иммунного ответа и/или обладают различными видами биологической активности in vivo.

В одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены содержат полипептиды (как определено в настоящем описании), и у второго микобактериального антигена по существу отсутствует общая перекрестная антигенная реактивность с первым микобактериальным антигеном, и/или он обладает по существу отличной от первого микобактериального антигена биологической активностью in vivo.

В одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены содержат полинуклеотиды (как определено в настоящем описании), и второй микобактериальный антиген кодирует полипептид, у которого по существу отсутствует общая перекрестная антигенная реактивность с полипептидом, кодируемым первым микобактериальным антигеном.

В одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены содержат полинуклеотиды (как определено в настоящем описании), и второй микобактериальный антиген обладает по существу отличной от первого микобактериального антигена биологической активностью in vivo и/или кодирует полипептид, обладающий по существу отличной от полипептида, кодируемого первым микобактериальным антигеном, биологической активностью in vivo.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит полипептид, а второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотид (как определено в настоящем описании), и второй микобактериальный антиген или полипептид, кодируемый им, по существу не обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с первым микобактериальным антигеном и/или обладает по существу отличной от первого микобактериального антигена биологической активностью in vivo.

В одном из вариантов осуществления первый микобактериальный антиген содержит полинуклеотид, а второй микобактериальный антиген содержит полипептид (как определено в настоящем описании), и второй микобактериальный антиген по существу не обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с первым микобактериальным антигеном или кодируемым им полипептидом и/или обладает по существу отличной от первого микобактериального антигена или кодируемого им полипептида биологической активностью in vivo.

В качестве примера в одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены (или кодируемые ими полипептиды) не обладают общей способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит (например, CD4+, CD8+, эффекторная T-клетка или T-клетка памяти, такая как TEM или TCM), которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции.

Другими словами, в одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены (или кодируемые ими полипептиды) "различны", так как они индуцируют вторичный ответ в различных иммунных клетках (например, в различных T-клетках).

В одном из вариантов осуществления первый и второй микобактериальные антигены микобактерии экспрессируются в различных условиях культивирования и/или состояний инфекции. Заявитель настоящей заявки установил, что антигенная композиция, содержащая первый и второй антигены по изобретению, представляющие различные состояния микобактериальной инфекции, эффективно вызывают иммунный ответ против различных состояний микобактериальной инфекции и, таким образом, защищают против различных стадий микобактериального заболевания. Это особенно предпочтительно, так как микобактериальная инфекция происходит в различных фазах - острой фазе, латентной фазе и фазе реактивации.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления экспрессия или активность первого микобактериального антигена повышены при состоянии латентности микобактерий, тогда как экспрессия или активность второго микобактериального антигена повышены при активной микобактериальной инфекции или при реактивации из латентного состояния (и/или подавлены при состоянии латентности микобактерий).

В альтернативном варианте осуществления экспрессия или активность первого микобактериального антигена подавлены при состоянии латентности микобактерий, тогда как экспрессия или активность второго микобактериального антигена подавлены при активной микобактериальной инфекции или при реактивации из латентного состояния (и/или повышены при состоянии латентности микобактерий).

Второй микобактериальный антиген может содержать полипептидную последовательность. Например, второй микобактериальный антиген может содержать или состоять из полипептида.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный полипептид содержит (или состоит из) антигенный микобактериальный полипептид - т.е. микобактериальный полипептид, способный вызывать защитный T-клеточный ответ против микобактериальной инфекции.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген представляет собой "второй микобактериальный полипептид" (или фрагмент).

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полипептид, выбранный из той же группы полипептидов, как указано выше в отношении первого микобактериального антигена (при условии, что второй микобактериальный полипептид отличается от первого микобактериального полипептида, как указано выше).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот (например, по меньшей мере 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 или 675 ее последовательных аминокислотных остатков.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления ограничения, описываемые выше в отношении первого микобактериального полипептида, равным образом применимы к этому варианту осуществления второго микобактериального полипептида.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полипептид, который не выбран из той же группы полипептидов, как указано выше в отношении первого микобактериального антигена.

Например, в одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген состоит из полипептидной последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот.

SEQ ID NO: 9-20 и 34-44 проиллюстрированы в таблице 3, ниже:

Таблица 3
SEQ ID NO: Название полипептида:
9 Ag85A/Rv3804c
10 Ag85B/Rv1886c
11 ESAT-6/Rv3875
12 TB10.4/Rv0288
13 Rv0125
14 PPE18/Rv1196
15 P27/Rv1411c
16 Hsp65/Rv0440
17 HBHA/Rv0475
18 Rv2659c
19 Rv2660c
20 HspX/Rv2031c
34 RPFA/Rv0867c
35 RPFB/Rv1009
36 RPFC/Rv1884c
37 RPFD/Rv2389c
38 RPFE/Rv2450c
39 Rv1733
40 Rv2029c
41 Rv2032
42 Rv2626c
43 Rv2627c
44 Rv2628

Полипептид "Ag85A", представленный SEQ ID NO: 9 по настоящей заявке (номера доступа CAA17868 и BX842584), является представителем семейства белков ("комплекса Ag85"), которое также включает Ag85B (SEQ ID NO: 10 по настоящей заявке) и Ag85C. Это семейство белков секретируют M. tuberculosis, BCG и многие другие виды микобактерий. Ag85A является высококонсервативным во всех видах микобактерий и является иммунодоминантным во всех исследованиях у животных и человека.

Полипептиды, представленные SEQ ID NO: 20 и 39-44, содержатся в области DosR (также известной как регулон DevR), включающей полипептиды, представленные Rv2623-2631 и Rv3126-3134. Экспрессия этих полипептидов регулируется DosR (DevR).

Полипептиды, представленные SEQ ID NO: 34-38, являются представителями семейства полипептидов RPF (RPFA, RPFB, RPFC, RPFD и RPFE, соответственно).

В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей имеет место в областях полипептидных последовательностей, составляющих по меньшей мере 7 последовательных аминокислотных остатков в длину (например, по меньшей мере 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или 525 последовательных аминокислотных остатков в длину).

Обычные способы определения идентичности аминокислотных последовательностей более подробно описаны ниже в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент указанного полипептида содержит по меньшей мере 7 последовательных аминокислотных остатков указанной полипептидной последовательности. В одном из вариантов осуществления фрагмент содержит (или состоит из) по меньшей мере 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или 525 последовательных аминокислотных остатков указанной полипептидной последовательности.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида составляет по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% длины микобактериального полипептида.

Фрагмент полипептида может содержать по меньшей мере один эпитоп полипептида.

В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент полипептида содержит (или состоит из) укороченную форму указанного полипептида. Например, фрагмент полипептида может быть укорочен на N-конце (по сравнению с полипептидом) или фрагмент полипептида может быть укорочен на C-конце (по сравнению с полипептидом).

В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент полипептида содержит (или состоит из) зрелую форму полипептида. Например, полипептид может содержать сигнальную последовательность (т.е. последовательность секреции/направления) (например, на N-конце), а во фрагменте полипептида эта сигнальная последовательность может отсутствовать. В одном из вариантов осуществления фрагмент получают отщеплением от полипептида сигнальной последовательности.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 9 представляет собой укороченную на N-конце форму SEQ ID NO: 9. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 9 представляет собой зрелую полипептидную последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 9 удалением N-концевой сигнальной последовательности. В одном из вариантов осуществления фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 9 укорочен на N-конце по меньшей мере на 10, 20, 30 или 40 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9. В одном из вариантов осуществления фрагмент SEQ ID NO: 9 содержит последовательность по меньшей мере из 50, 100, 150, 200 или 250 C-концевых аминокислот SEQ ID NO: 9.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный полипептид или его фрагмент обладает общей перекрестной антигенной реактивностью и/или по существу той же биологической активностью in vivo с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44.

В одном из вариантов осуществления "общая перекрестная антигенная реактивность" означает, что второй микобактериальный полипептид или его фрагмент, обладают общей с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44, способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит, которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции. Например, в качестве иммунологического показателя пригоден анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISPOT, так как секреция IFN-γ антиген-специфическими иммунными клетками, такими как T-клетки, хорошо коррелирует с защитой от M. tuberculosis. Кроме того, анализ ELISPOT является хорошо воспроизводимым и очень чувствительным способом количественного определения секретирующих IFN-γ антиген-специфических иммунных клеток, таких как T-клетки.

Альтернативно, или кроме того, "общая перекрестная антигенная реактивность" означает, что антитело, способное к связыванию со вторым микобактериальным полипептидом или его фрагментом, также способно к связыванию с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44.

Второй микобактериальный антиген может содержать полинуклеотидную последовательность. Например, второй микобактериальный антиген может содержать или состоять из полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) антигенный микобактериальный полинуклеотид - т.е. полинуклеотид, способный вызывать защитный клеточный иммунный ответ (например, T-клеточный ответ) против микобактериальной инфекции. В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный полинуклеотид кодирует антигенный микобактериальный полипептид - т.е. микобактериальный полипептид, способный вызывать защитный клеточный иммунный ответ (например, T-клеточный ответ) против микобактериальной инфекции.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген представляет собой "второй микобактериальный полинуклеотид" (или фрагмент), как определено выше.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотид, выбранный из той же группы полинуклеотидов, как указано выше в отношении первого микобактериального антигена (при условии, что второй микобактериальный полинуклеотид отличен от первого микобактериального полинуклеотида).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, выбранный из той же группы полипептидов, как указано выше в отношении первого микобактериального антигена (при условии, что второй микобактериальный полинуклеотид отличен от первого микобактериального полинуклеотида, и при условии, что полипептид, кодируемый вторым микобактериальным полинуклеотидом, отличен от полипептида, кодируемого первым микобактериальным полинуклеотидом).

Таким образом, указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный полипептид по изобретению, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанный кодируемый второй микобактериальный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид (например, по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 или 2000 ее последовательных аминокислотных остатков).

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный полипептид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления ограничения, описываемые выше в отношении первого микобактериального полипептида, равным образом применимы к этому варианту осуществления второго микобактериального полипептида.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотид, не выбранный из той же группы полинуклеотидов, как указано выше в отношении первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, который не выбран из той же группы полипептидов, как указано выше в отношении первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный полипептид, как определено выше.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, где указанная полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, содержащий (или состоящий из) аминокислотную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислотных остатков.

В одном из вариантов осуществления второй микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной (например, с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичной) последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 21-32 и 45-55 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид.

SEQ ID NO: 21-32 и 45-55 проиллюстрированы в таблице 4, ниже:

Таблица 4
SEQ ID NO: Название полинуклеотида:
21 Ag85A/Rv3804c
22 Ag85B/Rv1886c
23 ESAT-6/Rv3875
24 TB10.4/Rv0288
25 Rv0125
26 PPE18/Rv1196
27 P27/Rv1411c
28 Hsp65/Rv0440
29 HBHA/Rv0475
30 Rv2659c
31 Rv2660c
32 HspX/Rv2031c
45 RPFA/Rv0867c
46 RPFB/Rv1009
47 RPFC/Rv1884c
48 RPFD/Rv2389c
49 RPFE/Rv2450c
50 Rv1733
51 Rv2029c
52 Rv2032
53 Rv2626c
54 Rv2627c
55 Rv2628

Полинуклеотид "Ag85A", представленный SEQ ID NO: 21 по настоящей заявке (номера доступа CAA17868 и BX842584), является представителем семейства генов ("комплекса Ag85"), которое также содержит Ag85B (SEQ ID NO: 22 по настоящей заявке) и Ag85C. Это семейство генов кодирует белки, секретируемые M. tuberculosis, BCG и многими другими видами микобактерий. Ag85A является высококонсервативным у всех видом микобактерий и является иммунодоминантным во всех исследованиях у животных и человека.

Полинуклеотиды, представленные SEQ ID NO: 32 и 50-55, содержатся в регулоне DosR (также известном как регулон DevR), включающем полинуклеотиды, представленные Rv2623-2631 и Rv3126-3134. Экспрессия этих полинуклеотидов регулируется DosR (DevR).

Полинуклеотиды, представленные SEQ ID NO: 45-49, являются представителями семейства полинуклеотидов RPF (RPFA, RPFB, RPFC, RPFD и RPFE, соответственно).

В одном из вариантов осуществления идентичность нуклеотидных последовательностей имеет место в областях полинуклеотидных последовательностей, составляющих по меньшей мере 21 последовательный нуклеотидный остаток в длину (например, по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или 1600 последовательных нуклеотидных остатков в длину).

Обычные способы определения идентичности нуклеотидных последовательностей более подробно описаны ниже в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент полинуклеотида содержит по меньшей мере 21 последовательный нуклеотидный остаток указанной полинуклеотидной последовательности. В одном из вариантов осуществления фрагмент содержит (или состоит из) по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или 1600 последовательных нуклеотидных остатков указанной полинуклеотидной последовательности.

В одном из вариантов осуществления фрагмент указанного полинуклеотида составляет по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% длины полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент полинуклеотида содержит (или состоит из) укороченную форму указанного полинуклеотида. Например, фрагмент полинуклеотида по сравнению с полинуклеотидом может быть укорочен на 5'-конце и/или на 3'-конце. В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент полинуклеотида кодирует укороченный по сравнению с полипептидной последовательностью, кодируемой полноразмерным полинуклеотидом, полипептид. Например, полинуклеотидный фрагмент может кодировать полипептид, укороченный на N-конце и/или укороченный на C-конце по сравнению с полипептидом, кодируемым полноразмерным полинуклеотидом.

В одном из вариантов осуществления, в случае второго микобактериального антигена, фрагмент полинуклеотида кодирует зрелый полипептид. Например, полипептид может содержать сигнальную последовательность (т.е. последовательность секреции/направления) (например, на N-конце), а полинуклеотидный фрагмент может кодировать полипептидный фрагмент, в котором эта сигнальная последовательность отсутствует.

В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 представляет собой укороченную на 5'-конце форму SEQ ID NO: 21. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 по сравнению с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 21 укорочен на N-конце по меньшей мере на 25, 50, 75, 100 или 125 нуклеотидных остатков. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 содержит по меньшей мере 150, 300, 450, 600, 750 или 850 C-концевых нуклеотидных остатков SEQ ID NO: 21. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 кодирует укороченную на N-конце форму SEQ ID NO: 9. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 кодирует зрелую полипептидную последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 9 удалением N-концевой сигнальной последовательности. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 кодирует полипептидный фрагмент SEQ ID NO: 9, укороченный на N-конце по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 10, 20, 30 или 40 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления фрагмент полинуклеотида SEQ ID NO: 21 кодирует полипептидный фрагмент SEQ ID NO: 9, содержащий по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250 или 275 C-концевых остатков SEQ ID NO: 9.

В одном из вариантов осуществления полипептид, кодируемый вторым микобактериальным полинуклеотидом, или его фрагмент обладает общей перекрестной антигенной реактивностью и/или по существу одинаковой биологической активностью in vivo с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44.

В качестве примера полипептид, кодируемый вторым микобактериальным полинуклеотидом, или его фрагмент обладает общей с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44, способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит, которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции. Например, в качестве иммунологического показателя пригоден анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISPOT, так как секреция IFN-γ антиген-специфическими иммунными клетками, такими как T-клетки, хорошо коррелирует с защитой от M. tuberculosis. Кроме того, анализ ELISPOT является хорошо воспроизводимым и очень чувствительным способом количественного определения секретирующих IFN-γ антиген-специфических иммунных клеток, таких как T-клетки.

Альтернативно, или кроме того, антитело, способное к связыванию с полипептидом, кодируемым вторым микобактериальным полинуклеотидом, или его фрагментом, также способно к связыванию с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит антиген Rv0111 (антигенные полипептид или полинуклеотид) и антиген Rv0198 (антигенные полипептид или полинуклеотид).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

и дополнительно содержит:

(iii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

В качестве примера антигенная композиция Rv0111/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Альтернативно антигенная композиция Rv0111/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Альтернативно антигенная композиция Rv0111/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Альтернативно антигенная композиция Rv0111/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

По этому варианту осуществления в антигенной композиции Rv0111/Rv0198 по изобретению первый микобактериальный полинуклеотид может содержать (или состоять из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

По этому варианту осуществления в антигенной композиции Rv0111/Rv0198 по изобретению второй микобактериальный полинуклеотид может содержать (или состоять из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит ни антиген Rv1806, ни антиген Rv1807.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1806, второй микобактериальный антиген не является полипептидным антигеном Rv1807. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1806, второй микобактериальный антиген не является полинуклеотидным антигеном Rv1807. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1806, второй микобактериальный антиген не является полинуклеотидным антигеном Rv1807. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1806, второй микобактериальный антиген не является полипептидным антигеном Rv1807.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1807, второй микобактериальный антиген не является полипептидным антигеном Rv1806. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1807, второй микобактериальный антиген не является полинуклеотидным антигеном Rv1806. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1807, второй микобактериальный антиген не является полинуклеотидным антигеном Rv1806. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1807, второй микобактериальный антиген не является полинуклеотидным антигеном Rv1806.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот;

второй микобактериальный антиген не содержит:

(ii) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид;

второй микобактериальный антиген не содержит:

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 57 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид;

второй микобактериальный антиген не содержит:

(iii) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (iii); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 57 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот;

второй микобактериальный антиген не содержит:

(ii) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 57 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид;

второй микобактериальный антиген не содержит:

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 57 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид;

второй микобактериальный антиген не содержит:

(iii) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (iii); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит антиген Rv3812 (антигенные полипептид или полинуклеотид) и антиген Rv0198 (антигенные полипептид или полинуклеотид).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

и дополнительно содержит:

(iii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

В качестве примера антигенная композиция Rv3812/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Альтернативно антигенная композиция Rv3812/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Альтернативно антигенная композиция Rv3812/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Альтернативно антигенная композиция Rv3812/Rv0198 может содержать:

(i) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Антигенная композиция по изобретению в дополнение к первому и второму микобактериальным антигенам, описанным выше, может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген, отличный от первого и/или второго микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген отличен и от первого микобактериального антигена, и от второго микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция по изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид, отличный от указанного первого микобактериального антигенного полипептида и/или указанного второго микобактериального антигенного полипептида. В одном из вариантов осуществления антигенная композиция по изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид, отличный от указанного первого микобактериального полинуклеотида и/или указанного второго микобактериального полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления, если присутствует несколько дополнительных микобактериальных антигенов (например, 2 или более дополнительных микобактериальных антигенов, а также первый и второй микобактериальные антигены), каждый из указанных дополнительных микобактериальных антигенов отличен друг от друга.

В одном из вариантов осуществления "различие" между дополнительным микобактериальным антигеном(ами) и первым и вторым микобактериальными антигенами определяется специфичностью иммунного ответа на микобактериальные антигены. Например, в одном из вариантов осуществления каждый из первого, второго и дополнительных антигенов индуцирует иммунный ответ, который по существу специфичен для этого антигена.

"Различие" между первым, вторым и дополнительными микобактериальными антигенами может определяться в отношении существенной недостаточности (например, отсутствия) общей перекрестной антигенной реактивности между микобактериальными антигенами.

Альтернативно (или дополнительно) "различие" между первым, вторым и дополнительными микобактериальными антигенами может определяться как существенная недостаточность (например, отсутствие) у микобактериальных антигенов общей биологической активности in vivo.

Например, в одном из вариантов осуществления первый, второй и дополнительные микобактериальные антигены (например, первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полипептиды или первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полинуклеотиды или полипептиды, кодируемые ими) могут демонстрировать (по существу) отсутствие общей перекрестной антигенной реактивности.

В одном из вариантов осуществления первый, второй и дополнительные микобактериальные антигены (например, первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полипептиды или первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полинуклеотиды или полипептиды, кодируемые ими) демонстрируют (по существу) отсутствие общей биологической активности in vivo.

Например, каждый из первого, второго и дополнительных микобактериальных антигенов (например, первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полипептиды или первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полинуклеотиды или полипептиды, кодируемые ими) может индуцировать отличающийся иммунный ответ, и/или каждый обладает отличающимся видом биологической активности in vivo.

В качестве примера в одном из вариантов осуществления первый, второй и дополнительные микобактериальные антигены (например, первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полипептиды или первый, второй и дополнительные микобактериальные антигенные полинуклеотиды или полипептиды, кодируемые ими) не обладают общей способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит (например, CD4+, CD8+, эффекторная T-клетка или T-клетка памяти, такая как TEM или TCM), которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции.

Другими словами, в одном из вариантов осуществления первый, второй и дополнительные микобактериальные антигены "различны", так как они индуцируют вторичный ответ в различных иммунных клетках (например, в различных T-клетках).

В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов экспрессированы или активированы в отличающихся по сравнению с первым и/или вторым микобактериальными антигенами условиях культивирования и/или состояниях микобактериальной инфекции. В одном из вариантов осуществления активность одного или нескольких дополнительных микобактериальных антигенов повышена в отличающихся по сравнению с первым и/или вторым микобактериальными антигенами условиях культивирования и/или состояниях микобактериальной инфекции.

В отношении этого заявитель настоящей заявки установил, что антигенная композиция, содержащая первый и второй и дополнительные микобактериальные антигены по изобретению, представляющие различные состояния микобактериальной инфекции, эффективно вызывают иммунный ответ против различных состояний микобактериальной инфекции и, таким образом, защищают против различных стадий микобактериального заболевания. Это особенно предпочтительно, так как микобактериальная инфекция происходит в различных фазах - острой фазе, латентной фазе и фазе реактивации.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления экспрессия или активность первого микобактериального антигена повышена при состоянии латентности микобактерий, тогда как экспрессия или активность второго и/или дополнительного микобактериальных антигенов повышены при активной микобактериальной инфекции или при реактивации из латентного состояния (и/или подавлены при состоянии латентности микобактерий).

В альтернативном варианте осуществления экспрессия или активность первого микобактериального антигена подавлены при состоянии латентности микобактерий, тогда как экспрессия или активность второго и/или дополнительных микобактериальных антигенов подавлены при активной микобактериальной инфекции или при реактивации из латентного состояния (и/или повышены при состоянии латентности микобактерий).

В одном из вариантов осуществления, где присутствуют несколько дополнительных микобактериальных антигенов (например, 2 или более дополнительных микобактериальных антигенов, а также первый и второй микобактериальные антигены), каждый дополнительный микобактериальный антиген экспрессирован/активирован на различных стадиях микобактериальной инфекции, или активность каждого дополнительного микобактериального антигена повышена на различных стадиях микобактериальной инфекции.

В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов происходят из микобактерии, отличной от M. tuberculosis. Например, один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов могут происходить из другого представителя MTC, такого как M. microti, M. bovis, M. canetti или M. africanum, или микобактерии, не принадлежащей MTC, такой как M. avium-intracellulare, M. kansasii, M. marinum или M. ulcerans.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция в дополнение к первому и второму микобактериальным антигенам, описанным выше, содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления каждые из указанных по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных микобактериальных антигенов отличаются друг от друга и от первого и второго микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит приблизительно до 10 различных микобактериальных антигенов (например, включая первый и второй микобактериальный антигены, описанные выше).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит 1 дополнительный микобактериальный антиген и, таким образом, всего содержит 3 различных микобактериальных антигена (т.е. антигенная композиция является тримерной). В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит 2 дополнительных микобактериальных антигена и, таким образом, всего содержит 4 различных микобактериальных антигена (т.е. антигенная композиция является тетрамерной). В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит 3 дополнительных микобактериальных антигена и, таким образом, всего содержит 4 различных микобактериальных антигена (т.е. антигенная композиция является пентамерной). В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит до 8 дополнительных микобактериальных антигенов, и таким образом, всего содержит до 10 различных микобактериальных антигенов (т.е. антигенная композиция является вплоть до декамерной).

Один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов могут содержать (или состоять из) полипептидные последовательности.

В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов содержат (или состоят из) полипептидные последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот, как определено выше в отношении первого микобактериального антигена (при условии, что один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов отличаются от первого микобактериального антигена).

Альтернативно, или кроме того, один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов могут содержать (или состоять из) полипептидные последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9-20 и 34-44 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот, как определено выше в отношении второго микобактериального антигена (при условии, что один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов отличны от второго микобактериального антигена).

Один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов могут содержать (или состоять из) полинуклеотидные последовательности.

В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов содержат (или состоят из) полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные последовательности, как описано выше в отношении первого микобактериального антигенного полипептида (при условии, что один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов отличаются от первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов содержат (или состоят из) полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные последовательности, как описано выше в отношении второго микобактериального антигенного полипептида (при условии, что один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов отличны от второго микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов содержат (или состоят из) полинуклеотидные последовательности с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид, как описано выше в отношении первого микобактериального антигена (при условии, что один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов отличаются от первого микобактериального антигена).

Альтернативно, или кроме того, один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов могут содержать (или состоять из) полинуклеотидные последовательности с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 21-32 и 45-55 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид, как описано выше в отношении второго микобактериального антигена (при условии, что один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов отличны от второго микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

и дополнительно содержит:

(iii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид;

и дополнительно содержит:

(v) по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид, отличный от указанного первого микобактериального антигенного полипептида и/или указанного второго микобактериального антигенного полипептида; или по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид, отличный от указанного первого микобактериального полинуклеотида и/или указанного второго микобактериального полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит ни антиген Rv1806, ни антиген Rv1807.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1806, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полипептидным антигеном Rv1807. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1806, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полинуклеотидным антигеном Rv1807. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1806, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полинуклеотидным антигеном Rv1807. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1806, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полипептидным антигеном Rv1807.

В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1807, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полипептидным антигеном Rv1806. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1807, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полинуклеотидным антигеном Rv1806. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полипептидный антиген Rv1807, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полинуклеотидным антигеном Rv1806. В одном из вариантов осуществления, если первый микобактериальный антиген представляет собой полинуклеотидный антиген Rv1807, указанный дополнительный микобактериальный антиген в антигенной композиции не является полипептидным антигеном Rv1806.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит антиген Rv0111, антиген Rv0198 и антиген Rv3812. Таким образом, если антигенная композиция содержит антиген Rv0111 и антиген Rv0198, антигенная композиция также не содержит антиген Rv3812.

В качестве примера, если первый микобактериальный антигенный полипептид или первый микобактериальный полипептид содержит антиген Rv0111, и если второй микобактериальный антигенный полипептид или второй микобактериальный полинуклеотид содержит антиген Rv0198, один или несколько дополнительных антигенных полипептидов или полинуклеотидов в антигенной композиции не содержат (или не состоят из) антиген Rv3812. Альтернативно, если первый микобактериальный антигенный полипептид или первый микобактериальный полипептид содержит антиген Rv0198, и если второй микобактериальный антигенный полипептид или второй микобактериальный полинуклеотид содержит антиген Rv0111, один или несколько дополнительных антигенных полипептидов или полинуклеотидов в антигенной композиции не содержат (или не состоят из) антиген Rv3812.

В качестве примера в одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

и дополнительно содержит:

(iii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид;

и, кроме того, дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид, отличный от указанного первого микобактериального антигенного полипептида и/или указанного второго микобактериального антигенного полипептида; где указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид не является полипептидным антигеном Rv3812.

Как указано выше, "полипептидный антиген Rv3812" содержит или состоит из SEQ ID NO: 7 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании). Таким образом, по этому варианту осуществления изобретения по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид может содержать или состоять из полипептидной последовательности с аминокислотной последовательностью, менее чем на 50% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или ее фрагмента, содержащего менее 7 ее последовательных аминокислот.

В альтернативном варианте осуществления антигенная композиция содержит:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(ii) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

и дополнительно содержит:

(iii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид;

и, кроме того, дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид, отличный от указанного первого микобактериального полинуклеотида и/или указанного второго микобактериального полинуклеотида; где указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид не является полинуклеотидным антигеном Rv3812.

Как указано выше, "полинуклеотидный антиген Rv3812" содержит или состоит из SEQ ID NO: 8 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании). Таким образом, по этому варианту осуществления изобретения по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид может содержать или состоять из полинуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, менее чем на 50% идентичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8, или ее фрагменту, содержащему менее 21 ее последовательных нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит SEQ ID NO: 1 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), и SEQ ID NO: 5 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), и SEQ ID NO: 7 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит SEQ ID NO: 2 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), и SEQ ID NO: 6 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), и SEQ ID NO: 8 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере два из микобактериальных антигенов в антигенной композиции содержат (или состоят из) полипептидную последовательность, и указанные по меньшей мере две полипептидные последовательности связаны вместе с формированием слитого белка.

В качестве примера в одном из вариантов осуществления каждый из первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена содержит (или состоит из) полипептидную последовательность, как определено выше, и указанные первая и вторая полипептидные последовательности связаны вместе с формированием слитого белка.

В одном из вариантов осуществления указанный слитый белок представляет собой слитый белок Rv0111-Rv0198, где указанный слитый белок Rv0111-Rv0198 содержит или состоит из (в любом направлении от N-конца к C-концу):

(i) первого микобактериального антигенного полипептида, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второго микобактериального антигенного полипептида, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанный слитый белок представляет собой слитый белок Rv3812-Rv0198, где указанный слитый белок Rv3812-Rv0198 содержит или состоит из (в любом направлении от N-конца к C-концу):

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанный слитый белок дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную микобактериальную антигенную полипептидную последовательность, связанную с указанными первой и/или второй полипептидными последовательностями, где каждый из указанных дополнительных микобактериальных антигенов отличны друг от друга и от первого и второго микобактериальных антигенов. Например, слитый белок в дополнение к указанным первому и второму микобактериальным антигенам может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных микобактериальных антигенов, где каждый из указанных дополнительных микобактериальных антигенов отличаются друг от друга и от первого и второго микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления слитый белок может содержать приблизительно до 10 различных микобактериальных антигенов (например, включая первый и второй микобактериальные антигены).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных микобактериальных антигенов) и первый микобактериальный антиген, и каждый указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полипептидную последовательность, как определено выше, и указанные полипептидные последовательности связаны вместе с формированием слитого белка.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных микобактериальных антигенов) и второй микобактериальный антиген, и каждый указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген содержит (или состоит из) полипептидную последовательность, как определено выше, и указанные полипептидные последовательности связаны вместе с формированием слитого белка.

Альтернативно в одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере два дополнительных микобактериальных антигена (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных микобактериальных антигенов), и каждый из указанных по меньшей мере двух дополнительных микобактериальных антигенов содержит (или состоит из) полипептидную последовательность, как определено выше, и указанные полипептидные последовательности связаны вместе с формированием слитого белка.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит слитый белок, одновременно содержащий антиген Rv1806 и антиген Rv1807. Таким образом, в одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит слитый белок, одновременно содержащий SEQ ID NO: 3 (или "вариант" или "фрагмент" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 56 (или "вариант" или "фрагмент" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит слитый белок, состоящий из антигена Rv1806 и антигена Rv1807. Таким образом, в одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит слитый белок, одновременно состоящий из SEQ ID NO: 3 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 56 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления, если антигенная композиция содержит антиген Rv0111 и антиген Rv1098 (например, раздельно, или в форме слитого белка), антигенная композиция (или слитый белок) также не содержит антиген Rv3821.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления антигенная композиция не содержит слитый белок, содержащий или состоящий из: SEQ ID NO: 1 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), и SEQ ID NO: 5 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), и SEQ ID NO: 7 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

Порядок полипептидных последовательностей в слитом белке не важен.

Способы получения слитых белков хорошо известны в данной области.

В одном из вариантов осуществления рекомбинантный слитый белок можно получать посредством экспрессии рекомбинантной полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный слитый белок. В качестве примера полинуклеотидные последовательности, кодирующие микобактериальные антигенные полипептиды по изобретению, можно располагать в экспрессирующем векторе в одной рамке считывания ниже промотора, таким образом, обеспечивая непрерывную транскрипцию полинуклеотидных последовательностей и трансляцию в виде одного белкового продукта.

В одном из вариантов осуществления между полинуклеотидными последовательностями для каждого полипептидного антигена расположены промежуточные "линкерные" последовательности, являющиеся результатом вставки участков рестрикции. Как правило, аминокислоты, кодируемые этими линкерными последовательностями, не оказывают отрицательного влияния на иммуногенность получаемого слитого белка и даже могут быть благоприятными для иммуногенности. Альтернативно слитый белок по изобретению можно получать в виде цепи эпитопов посредством экспрессии полинуклеотидных последовательностей, связанных без промежуточных нуклеотидов. Отсутствие промежуточной линкерной последовательности позволяет избежать наличия ненужного материала нуклеиновых кислот и/или аминокислот.

Альтернативно слитый белок по изобретению можно получать посредством химической конъюгации микобактериальных антигенных полипептидов по изобретению. В качестве примера первый, и/или второй, и/или дополнительные микобактериальные полипептиды по изобретению можно связывать друг с другом общепринятыми способами химической конъюгации.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере два из микобактериальных антигенов в антигенной композиции содержат (или состоят из) полинуклеотидную последовательность, и указанные по меньшей мере две полинуклеотидные последовательности связаны с формированием полицистронной последовательности нуклеиновой кислоты.

В качестве примера в одном из вариантов осуществления каждый из первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, как определено выше, и указанные первая и вторая полинуклеотидные последовательности связаны вместе с формированием полицистронной последовательности нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления указанная полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из (в любом порядке от 5'-конца к 3'-концу):

(i) первого микобактериального полинуклеотида, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второго микобактериального полинуклеотида, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления указанная полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из (в любом порядке от 5'-конца к 3'-концу):

(i) первого микобактериального полинуклеотида, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второго микобактериального полинуклеотида, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления указанная полицистронная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную микобактериальную антигенную полинуклеотидную последовательность, связанную с указанными первой и второй полинуклеотидными последовательностями.

Альтернативно в одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген, и каждый из первого микобактериального антигена и по меньшей мере одного дополнительного микобактериального антигена содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, как определено выше, и указанные полинуклеотидные последовательности связаны вместе с формированием полицистронной последовательности нуклеиновой кислоты.

Альтернативно в одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антиген, и каждый из второго микобактериального антигена и по меньшей мере одного дополнительного микобактериального антигена содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, как определено выше, и указанные полинуклеотидные последовательности связаны вместе с формированием полицистронной последовательности нуклеиновой кислоты.

Альтернативно в одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере два дополнительных микобактериальных антигена, и каждый из указанных по меньшей мере двух дополнительных микобактериальных антигенов содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, как определено выше, и указанные полинуклеотидные последовательности связаны вместе с формированием полицистронной последовательности нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность не содержит ни антиген Rv1806, ни антиген Rv1807. В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность не состоит из антигена Rv1806 и антигена Rv1807.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность одновременно не содержит SEQ ID NO: 3 (или "вариант" или "фрагмент" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 56 (или "вариант" или "фрагмент" ее последовательности, как определено в настоящем описании). В одном из вариантов осуществления антигенная композиция одновременно не состоит из SEQ ID NO: 3 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 56 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления, если антигенная композиция содержит антиген Rv0111 и антиген Rv0198 (например, в форме полицистронной последовательности, содержащей или состоящей из полинуклеотида Rv0111 и полинуклеотида Rv0198), антигенная композиция (или полицистронная последовательность) также не содержит антиген Rv3812. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, если антигенная композиция содержит полицистронную последовательность, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 2 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 6 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании), антигенная композиция также не содержит SEQ ID NO: 8 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность не содержит или не состоит из антигена Rv0111, антигена Rv0198 и антигена Rv3812. Таким образом, в одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность не содержит или не состоит из SEQ ID NO: 2 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 6 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании) и SEQ ID NO: 8 (или "варианта" или "фрагмента" ее последовательности, как определено в настоящем описании).

Порядок полинуклеотидных последовательностей в полицистронной последовательность от 5' к 3' не важен.

Способы получения полицистронных последовательностей нуклеиновой кислоты известны в данной области и, как правило, включают получение рекомбинантной молекулы, содержащей индивидуальные полинуклеотидные последовательности в одной рамке считывания.

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению расположена ниже промотора в рамке в векторе (например, экспрессирующем векторе или вирусном векторе, как описано ниже), таким образом, обеспечивая непрерывную транскрипцию полинуклеотидных последовательностей и необязательную трансляцию в виде продукта одного "слитого белка".

Таким образом, в одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует слитый белок, как указано выше. Альтернативно в одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует отдельные микобактериальные антигенные полипептидные последовательности, как указано выше.

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей маркерный полипептид так, что после трансляции кодируемая метка ковалентно связана с кодируемым антигенным полипептидом(ами).

Метка может облегчать детекцию экспрессии антигенного полипептида или детекцию клонов, экспрессирующих антиген, и/или может приводить к увеличению эффективности антигена. Подходящие маркерные полипептиды включают метку PK, метку FLAG, метку MYC, полигистидиновую метку или любую детектируемую метку (например, метку, которую можно детектировать посредством антитела, такого как моноклональное антитело). Специалистам в данной области очевидны другие примеры меток. Метка PK может иметь последовательность Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp (SEQ ID NO: 33).

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, может располагаться так, что после трансляции метка располагается на C-конце экспрессируемого антигенного полипептида (т.е. в порядке: антигенный полипептид-метка). Альтернативно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, может располагаться так, что после трансляции метка располагается на N-конце экспрессируемого антигенного полипептида (т.е. в порядке: метка-антигенный полипептид). Альтернативно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, может располагаться так, что после трансляции метка располагается внутри экспрессируемого антигенного полипептида или между экспрессируемыми антигенными полипептидами кодируемого слитого белка.

Между полицистронной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный полипептид(ы), и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей маркерный полипептид, можно вставлять нуклеотиды, кодирующие линкерную последовательность. В одном из вариантов осуществления линкерная последовательность кодирует аминокислотную последовательность Gly-Ser-Ile.

В одном из вариантов осуществления кодируемая линкерная последовательность расположена между экспрессируемым антигенным полипептидом и маркерным полипептидом (т.е. в порядке: антигенный полипептид-линкер-метка или метка-линкер-антигенный полипептид). В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, и нуклеотиды, кодирующие линкерную последовательность, расположены так, что после трансляции линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile) располагается на C-конце экспрессируемого антигенного полипептида, а метка располагается на C-конце экспрессируемой линкерной последовательности (т.е. в порядке антигенный полипептид-линкер-метка).

Альтернативно (или дополнительно) промежуточные "линкерные" последовательности (например, кодирующие Gly-Ser-Ile) могут располагаться между микобактериальными полинуклеотидными последовательностями полицистронной последовательности, что является результатом вставки участков рестрикции (например, в форме: микобактериальный полинуклеотид-линкер-микобактериальный полинуклеотид). Однако во избежание присутствия излишнего материала нуклеиновой кислоты и/или аминокислот, полинуклеотидные последовательности можно связывать без промежуточных нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с лидерной последовательностью. Например, лидерную последовательность можно сливать с N-концом полицистронной последовательности (т.е. в форме: лидерная последовательность-полицистронная последовательность) или с C-концом полицистронной последовательности (т.е. в форме: полицистронная последовательность-лидерная последовательность).

Лидерная последовательность может влиять на процессинг первичного транскрипта ДНК в мРНК и/или может влиять на стабильность мРНК или эффективность трансляции. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность обеспечивает направление кодируемого полипептидного антигена в секреторный аппарат клетки-хозяина. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность увеличивает экспрессию и/или иммуногенность антигена. Увеличенную экспрессию можно определять посредством общепринятого анализа, такого как использование антитела (например, моноклонального антитела) для детекции количества получаемого белка. Увеличенную иммуногенность можно определять с применением общепринятого анализа, такого как анализ ELISPOT в культуре или ex vivo. В одном из вариантов осуществления присутствие лидерной последовательности увеличивает экспрессию и/или иммуногенность микобактериального антигенного полипептида по сравнению с антигенным полипептидом, экспрессируемым без лидерной последовательности, в 2 раза, 3 раза или более.

Примером подходящей лидерной последовательности является t-PA (тканевой активатор плазминогена).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанные микобактериальные антигенные полипептиды, функционально связана с лидерной последовательностью и последовательностью метки. Например, лидерная последовательность может быть связана с N-концом полицистронной последовательности, и последовательность метки может быть связана с C-концом полицистронной последовательности (т.е. в форме: лидерная последовательность-полицистронная последовательность-метка). В одном из вариантов осуществления между полицистронной последовательностью и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей метку, расположена линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile) (т.е. в форме лидерная последовательность-полицистронная последовательность-линкер-метка).

В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность t-PA и/или последовательность метки представляет собой последовательность метки PK (т.е. в форме: лидерная последовательность t-PA-полицистронная последовательность-метка PK). В одном из вариантов осуществления между полицистронной последовательностью и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей метку, расположена линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile) (т.е. в форме лидерная последовательность t-PA-полицистронная последовательность-линкер-метка PK).

В одном из вариантов осуществления промежуточная лидерная последовательности расположена между одним или несколькими микобактериальными полинуклеотидными последовательностями полицистронной последовательности (т.е. в форме: микобактериальный полинуклеотид-лидерная последовательность-микобактериальный полинуклеотид).

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая микобактериальные антигенные полипептиды, функционально связана с N-концевой лидерной последовательностью, внутренней лидерной последовательностью и последовательностью метки (т.е. в форме: лидерная последовательность-первый микобактериальный полинуклеотид-лидерная последовательность-второй микобактериальный полинуклеотид-метка). В одном из вариантов осуществления между полицистронной последовательностью и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей метку, расположена линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile) (т.е. в форме: лидерная последовательность-первый микобактериальный полинуклеотид-лидерная последовательность-второй микобактериальный полинуклеотид-линкер-метка).

В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность t-PA и/или последовательность метки представляет собой последовательность метки PK (т.е. в форме: лидерная последовательность t-PA-первый микобактериальный полинуклеотид-лидерная последовательность t-PA-второй микобактериальный полинуклеотид-метка PK).

В одном из вариантов осуществления между полицистронной последовательностью и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей метку, расположена линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile) (т.е. в форме лидерная последовательность t-PA-первый микобактериальный полинуклеотид-лидерная последовательность t-PA-второй микобактериальный полинуклеотид-линкер-метка PK).

В одном из вариантов осуществления полицистронная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит сигнал полиаденилирования, такой как сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит одну или несколько клеток, где указанные клетки содержат по меньшей мере один из микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанные одна или несколько клеток содержат первый микобактериальный антиген, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность, как определено выше, такую как полипептидная последовательность Rv0111 или Rv3812, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность, как определено выше, такую как полинуклеотидная последовательность Rv0111 или Rv3812, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанные одна или несколько клеток содержат второй микобактериальный антиген, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность, как определено выше, такую как полипептидная последовательность Rv0198, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность, как указано выше, такую как полинуклеотидная последовательность Rv0198, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанные одна или несколько клеток содержат один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов, как определено выше. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов содержат полипептидную последовательность, как определено выше. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов содержат полинуклеотидную последовательность, как указано выше.

В одном из вариантов осуществления ограничения, описываемые выше в отношении антигенной композиции, содержащей первый и второй микобактериальные антигены, равным образом применимы к антигенной композиции, содержащей одну или несколько клеток, где указанные клетки содержат по меньшей мере один из микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанный по меньшей мере один микобактериальный антиген (например, полипептид) по меньшей мере частично экспонирован на поверхности клетки(ок).

В альтернативном варианте осуществления клетка in vivo разрушается так, что иммунной системе хозяина становится доступна по меньшей мере часть микобактериального антигена (например, полипептида). В альтернативном варианте осуществления клетка по меньшей мере частично высвобождает (например, секретирует или экспортирует) микобактериальный антиген (например, полипептид) вне клетки так, что он становится доступен иммунной системе хозяина.

В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельную клетку, где указанная клетка содержит по меньшей мере два из указанных микобактериальных антигенов.

В качестве примера в одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельную клетку, где указанная клетка одновременно содержит указанный первый микобактериальный антиген и указанный второй микобактериальный антиген. В одном из вариантов осуществления указанная отдельная клетка содержит полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv0111 или полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv3812, как определено в настоящем описании, а также содержит полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv0198, как определено в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления указанная отдельная клетка дополнительно содержит один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельную клетку, где указанная клетка содержит указанный первый микобактериальный антиген и указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельную клетку, где указанная клетка содержит указанный второй микобактериальный антиген и указанные один или более дополнительных микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельную клетку, где указанная клетка содержит указанные по меньшей мере два из указанных дополнительных микобактериальных антигенов.

В альтернативном варианте осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере первую и вторую клетки, где указанная первая клетка содержит указанный первый микобактериальный антиген (как определено выше), и где указанная вторая клетка содержит указанный второй микобактериальный антиген (как определено выше). В этом варианте осуществления первый и второй микобактериальные антигены не находятся в одной и той же клетке; то есть, первый и второй микобактериальные антигены находятся в различных клетках.

В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере третью клетку, где указанная клетка содержит дополнительный микобактериальный антиген, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления, если указанная антигенная композиция содержит полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv0111, как определено в настоящем описании, и полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv0198, как определено в настоящем описании (например, в одной и той же или различных клетках), указанная антигенная композиция (или указанная клетка) также не содержит полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv3812, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления указанная по меньшей мере одна клетка представляет собой аттенуированный микробный носитель. Аттенуированный носитель представляет собой клетку (такую как бактериальная клетка), которая не способна вызывать значимый патологический эффект у животного, как правило, млекопитающего, такого как человек, корова, свинья или лошадь.

Подходящие примеры аттенуированных микробных носителей включают аттенуированную сальмонеллу, аттенуированную M. tuberculosis или аттенуированную M. bovis (например, штамм BCG).

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция содержит один или несколько векторов, где указанные векторы содержат по меньшей мере один из микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанные один или несколько векторов содержат первый микобактериальный антиген, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность, как определено выше, такую как полипептидный антиген Rv0111 или полипептидный антиген Rv3812, как определено в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность, как указано выше, такую как полинуклеотидный антиген Rv0111 или полинуклеотидный антиген Rv3812, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления указанные один или несколько векторов содержат второй микобактериальный антиген, как определено выше. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность, как определено выше, такую как полипептидный антиген Rv0198, как определено в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит полинуклеотидную последовательность, как указано выше, такую как полинуклеотидный антиген Rv0198, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления указанный вектор содержит указанный первый микобактериальный антиген и указанный второй микобактериальный антиген. В качестве примера указанный вектор может содержать первый микобактериальный полинуклеотид, как определено в настоящем описании, и второй микобактериальный полинуклеотид, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления указанный вектор содержит:

(i) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления указанный вектор содержит или состоит из:

(i) первого микобактериального полинуклеотида, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(ii) второго микобактериального полинуклеотида, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность, кодирующую второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит (или состоит из) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит (или состоит из) полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления указанные один или несколько векторов содержат один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов, как определено выше. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов содержат полипептидную последовательность, как определено выше. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов содержат полинуклеотидную последовательность, как указано выше.

В одном из вариантов осуществления, если указанная антигенная композиция содержит полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv0111, как определено в настоящем описании, и полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv0198, как определено в настоящем описании (например, в одном и том же или в различных векторах), указанная антигенная композиция (или указанный вектор) также не содержит полипептидный или полинуклеотидный антиген Rv3812, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления ограничения, описываемые выше в отношении антигенной композиции, содержащей первый и второй микобактериальные антигены, равным образом применимы к антигенной композиции одного или нескольких векторов, где указанные векторы содержат по меньшей мере один из микобактериальных антигенов.

Примеры векторов включают ДНК-содержащие векторы и РНК-содержащие векторы. Термин "вектор" включает экспрессирующие векторы (которые могут быть пригодными для получения микобактериальных антигенов по изобретению) и вирусные векторы (которые могут быть пригодны для репликации и/или доставки микобактериальных антигенов по изобретению).

Векторы необязательно включают соответствующие контрольные последовательности, такие как промотор и/или терминатор. Экспрессия контрольных последовательностей для таких векторов известна специалистам в данной области, и их можно выбирать в зависимости от клеток-хозяев. Дополнительное описание общепринятых компонентов векторов предоставлено ниже в этом описании.

В одном из вариантов осуществления вектор содержит одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанный микобактериальный антиген(ы). Указанная полинуклеотидная последовательность может быть функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей маркерный полипептид так, что после трансляции кодируемая метка ковалентно связывается с антигеном. Метка может облегчать детекцию экспрессии антигена или клонов, экспрессирующих антиген, и/или может приводить к увеличению эффективности антигена.

Подходящий маркерный полипептид включает метку PK, метку FLAG, метку MYC, полигистидиновую метку или любую детектируемую метку (например, метку, которую можно детектировать посредством антитела, такого как моноклональное антитело). Специалистам в данной области очевидны другие примеры меток. Метка PK может иметь последовательность Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp (SEQ ID NO: 33).

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, может располагаться так, что после трансляции метка располагается на C-конце экспрессируемого антигена. Альтернативно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, может располагаться так, что после трансляции метка располагается на N-конце экспрессируемого антигена. Альтернативно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, может располагаться так, что после трансляции метка располагается внутри экспрессируемого антигена.

Между полинуклеотидом, кодирующим экспрессируемый антиген, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей маркерный полипептид, можно вставлять нуклеотиды, кодирующие линкерную последовательность. В одном из вариантов осуществления кодируемая линкерная последовательность расположена между экспрессируемым антигенным полипептидом и маркерным полипептидом. В одном из вариантов осуществления линкерная последовательность кодирует аминокислотную последовательность Gly-Ser-Ile.

В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркерный полипептид, и нуклеотиды, кодирующие линкерную последовательность, расположены так, что после трансляции линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile) располагается на C-конце экспрессируемого антигена, а метка располагается на C-конце экспрессируемой линкерной последовательности.

В одном из вариантов осуществления вектор содержит одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, кодирующих микобактериальный антигенный полипептид(ы), где указанная полинуклеотидная последовательность функционально связана с лидерной последовательностью. Лидерная последовательность может влиять на процессинг первичного транскрипта в мРНК и/или может влиять на стабильность мРНК или эффективность трансляции. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность обеспечивает направление кодируемого полипептидного антигена в секреторный аппарат клетки-хозяина. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность увеличивает экспрессию и/или иммуногенность антигена. Увеличенную иммуногенность можно определять с применением общепринятого анализа, такого как анализ ELISPOT в культуре или ex vivo. Увеличенную экспрессию можно определять посредством общепринятого анализа, такого как использование антитела (например, моноклонального антитела) для детекции количества получаемого белка. В одном из вариантов осуществления присутствие лидерной последовательности увеличивает экспрессию и/или иммуногенность микобактериального антигена а по сравнению с антигеном, экспрессируемым без лидерной последовательности, в 2 раза, 3 раза или более.

Примером подходящей лидерной последовательности является t-PA (тканевой активатор плазминогена).

В одном из вариантов осуществления вектор содержит укороченный на C-конце полинуклеотид, кодирующий указанный микобактериальный антиген, слитый с лидерной последовательностью t-PA. В одном из вариантов осуществления вектор содержит укороченный на C-конце полинуклеотид, кодирующий указанный микобактериальный антиген, слитый с лидерной последовательностью t-PA и с последовательностью метки PK. Например, лидерная последовательность может быть связана с N-концом полинуклеотида, кодирующего антиген, а последовательность метки может быть связана с C-концом полинуклеотида, кодирующего антиген. В одном из вариантов осуществления между полинуклеотидом, кодирующим антиген, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей метку, расположена линкерная последовательность (например, Gly-Ser-Ile).

В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельный вектор, где указанный вектор одновременно содержит указанный первый микобактериальный антиген и указанный второй микобактериальный антиген. В одном из вариантов осуществления указанный отдельный вектор дополнительно содержит один или несколько из указанных дополнительных микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельный вектор, где указанный вектор содержит указанный первый микобактериальный антиген и указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельный вектор, где указанный вектор содержит указанный второй микобактериальный антиген и указанные один или более дополнительных микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция содержит отдельный вектор, где указанная клетка содержит указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов.

В альтернативном варианте осуществления антигенная композиция содержит по меньшей мере первый и второй векторы, где указанный первый вектор содержит указанный первый микобактериальный антиген (как определено выше), и где указанный второй вектор содержит указанный второй микобактериальный антиген (как определено выше). В этом варианте осуществления первый и второй микобактериальные антигены не находятся на одном и том же векторе; то есть, первый и второй микобактериальные антигены находятся в различных векторах.

В одном из вариантов осуществления указанная антигенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий вектор, где указанный третий вектор содержит (один или несколько) дополнительный микобактериальный антиген(ы), как определено выше.

В одном из вариантов осуществления вектор (или по меньшей мере один из указанных векторов) представляет собой вирусный вектор.

Вирусные векторы, как правило, являются нереплицирующимися векторами или векторами с нарушенной репликацией, что означает, что вирусный вектор не может реплицироваться в нормальных клетках (например, в нормальных клетках человека) в значимой степени, как определяют общепринятыми способами - например, посредством определения синтеза ДНК и/или вирусного титра. Нереплицирующиеся векторы или векторы с нарушенной репликацией могут становиться такими в природе (т.е. их выделяют в таком виде из природной среды) или их можно получать искусственным путем (например, посредством отбора in vitro или генетическими способами). Как правило, должен существовать по меньшей мере один тип клеток, в которых можно выращивать вирусный вектор с нарушенной репликацией - например, модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA) можно выращивать в клетках CEF.

Как правило, вирусный вектор не способен вызывать значимой инфекции у животного, как правило, у млекопитающего, такого как пациент, являющийся человеком, коровой, свиньей или лошадью.

Примеры вирусных векторов, пригодных в этом отношении, включают векторы из аттенуированных вирусов коровьей оспы, такие как модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA) и NYVAC или полученные из них штаммы.

Другие подходящие вирусные векторы включают поксвирусные векторы, такие как векторы из вирусов оспы птиц, например, векторы из аттенуированных вирусов оспы кур (например, FP9) или векторы из вирусов оспы кенаров (например, ALVAC и полученные из него штаммы). Альтернативные вирусные векторы, пригодные по настоящему изобретению, включают аденовирусные векторы (например, не поражающие человека аденовирусные векторы), альфавирусные векторы, флавивирусные векторы, векторы из вируса герпеса, векторы из вирусов гриппа и ретровирусные векторы.

В одном из вариантов осуществления вектор (или по меньшей мере один из указанных векторов) представляет собой экспрессирующий вектор.

Экспрессирующие векторы представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты (линейные или циклические), содержащие одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид(ы), функционально связанные с дополнительными регуляторными элементами, необходимыми для экспрессии.

В этом отношении экспрессирующие векторы, как правило, содержат последовательности промотора и терминатора и необязательно одну или несколько энхансерных последовательностей, сигналов полиаденилирования и т.п. Экспрессирующие векторы также могут содержать подходящие элементы регуляции трансляции, включая участки связывания рибосом и последовательности инициации и терминации трансляции. Элементы регуляции транскрипции и трансляции, используемые в экспрессирующих векторах по изобретению, являются функционирующими в клетке-хозяине, используемой для экспрессии, и могут включать элементы, ассоциированные с генами микобактерий в природе.

Выбор подходящих промоторов, терминаторов, селективных маркеров и других элементов является объектом стандартного конструирования специалистов в данной области.

У прокариотических хозяев можно использовать такие промоторы, как trp, lac и фаговые промоторы, промоторы тРНК и промоторы ферментов гликолиза. Пригодные промоторы дрожжей включают промоторные области металлотионеина, 3-фосфоглицераткиназы или других ферментов гликолиза, таких как енолаза или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы, и другие. Подходящие неприродные промоторы млекопитающих могут включать ранние и поздние промоторы SV40 или промоторы, получаемые из вируса лейкоза мышей Молони, вируса опухоли молочной железы мыши, вируса саркомы птиц, аденовируса II, вируса папилломы или полиомы коровы. В одном из вариантов осуществления экспрессирующий вектор содержит промотор CMV.

Как правило, "функционально связанные" означает, что связанные последовательности нуклеиновой кислоты являются смежными и расположены так, что они по своему назначению функционируют совместно - например, транскрипция начинается в промоторе и продолжается в кодирующем полинуклеотидном участке до терминатора. Когда необходимо связать две кодирующих белок области, полинуклеотидные кодирующие последовательности должны быть смежными и находиться в одной рамке считывания.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей антигенную композицию по изобретению, как определено выше. Таким образом, клетка-хозяин содержит первый микобактериальный антиген и второй микобактериальный антиген по изобретению, где указанные микобактериальные антигены могут содержать полипептидные и/или полинуклеотидные последовательности, как указано выше.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления клетка-хозяин содержит антигенную композицию, содержащую первый микобактериальный антиген и второй микобактериальный антиген; где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанная клетка-хозяин содержит:

(i) первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) первый микобактериальный полинуклеотид, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

а также содержит:

(iii) второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) второй микобактериальный полинуклеотид, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

Антигенные композиции, полинуклеотиды или полипептиды по настоящему изобретению можно получать посредством экспрессии полинуклеотидных последовательностей по изобретению в векторах или других экспрессирующих носителях в сочетаемых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах стандартными способами молекулярной биологии (например, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; включенное в настоящий документ в качестве ссылки).

Наиболее широко используемые прокариотические хозяева представляют собой штаммы E. coli, хотя можно использовать другие прокариоты, такие как B. subtilis или Pseudomonas. Также по настоящему изобретению можно использовать клетки-хозяева млекопитающих или других эукариот, такие как клетки видов дрожжей, нитевидных грибов, растений, насекомых, амфибий или птиц. По существу хорошо известно воспроизведение клеток млекопитающих в культуре. Примеры широко используемых клеточных линий хозяев-млекопитающих представляют собой клетки VERO и HeLa, клетки яичника китайского хомяка (CHO) и клеточные линии WI38, BHK и COS, хотя для обеспечения более высокой экспрессии могут подходить другие клеточные линии.

В рамках изобретения "рекомбинантные клетки-хозяева", "клетки-хозяева", "клетки", "клеточные линии", "клеточные культуры" и другие подобные термины, обозначающие микроорганизмы или клеточные линии высших эукариот, культивируемых в виде одноклеточных единиц, относятся к клеткам, которые можно использовать или использовали в качестве реципиентов рекомбинантного вектора или другой трансфицируемой ДНК, и включают потомство исходной клетки, которое было трансформировано. Следует понимать, что потомство одной родительской клетки вследствие природных, случайных или спланированных мутаций не обязательно может быть полностью идентичным по морфологии или по геномной ДНК или общей комплементарной ДНК с исходным родителем.

Представляющие интерес полинуклеотидные последовательности можно транскрибировать in vitro и полученную РНК вводить в клетку-хозяина (например, посредством инъекции) или полинуклеотидные последовательности можно вводить непосредственно в клетки-хозяева способами, которые варьируют в зависимости от типа клетки-хозяина, включая электропорацию; трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; инфекцию (где вектор представляет собой возбудитель инфекции, такой как ретровирусный геном). "Трансформация" относится к вставке экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина, безотносительно способа, применяемого для вставки, например, прямого захвата, трансдукции, спаривание посредством f-пилей или электропорации.

Векторы могут реплицироваться автономно или могут реплицироваться при вставке в геном клетки-хозяина, в случае чего они содержат последовательность вставки.

Экспрессирующие и клонирующие векторы могут содержать селективный маркер, ген, кодирующий белок, необходимый для выживания или роста клетки-хозяина, трансформированной вектором. Этот ген обеспечивает рост только тем клеткам-хозяевам, которые экспрессируют вставки. Общепринятые селективные гены кодируют белки, которые (a) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсичным веществам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату и т.д.; (b) дополняют ауксотрофный дефицит; или (c) восполняют критические питательные вещества, недоступные в комплексных средах, например ген, кодирующий D-аланинрацемазу для бацилл. Выбор подходящего селективного маркера зависит от клетки-хозяина.

Трансформированную клетку-хозяина можно культивировать известными способами, а экспрессируемый полипептид можно восстанавливать и выделять (например, из среды для культивирования) с использованием общепринятых протоколов.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения антигенной композиции, содержащей (по меньшей мере) первый микобактериальный антиген и второй микобактериальный антиген, как определено выше; где указанный способ включает:

(a) экспрессию полинуклеотидных последовательностей, как определено выше, кодирующих указанные по меньшей мере первый и второй микобактериальные антигены; или

(b) культивирование клетки-хозяина, как описано выше, в результате чего указанная клетка продуцирует указанные по меньшей мере первый и второй микобактериальный антигены;

и выделение экспрессируемых антигенов.

В одном из вариантов осуществления ограничения, описываемые выше в отношении антигенной композиции, содержащей первый и второй микобактериальные антигены, равным образом применимы к указанному выше способу получения антигенной композиции, содержащей по меньшей мере первый и второй микобактериальные антигены.

Изобретение также относится к антителам, которые связывают первый микобактериальный антиген (например, полипептид), как определено выше, и второй микобактериальный антиген (например, полипептид), как определено выше.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей первое антитело и второе антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген, и указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген;

где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антиген содержит или состоит из антигенного полипептида по изобретению, такого как полипептидный антиген Rv0111 или полипептидный антиген Rv3812, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из антигенного полипептида по изобретению, такого как полипептидный антиген Rv0198, как определено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция содержит первое антитело и второе антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид, а указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид;

где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция содержит первое антитело и второе антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид, а указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид;

где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Необязательно, указанная иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере третье антитело (например, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8 дополнительных антител), где указанное третье антитело связывает третий микобактериальный антиген, отличный от первого и второго микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления, если иммуногенная композиция содержит (i) антитело, связывающее антиген Rv0111, как определено в настоящем описании (например, содержащий или состоящий из полипептидной последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот); и (ii) антитело, связывающее антиген Rv0198, как определено в настоящем описании (например, содержащий или состоящий из полипептидной последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот); композиция не содержит антитело, связывающее антиген Rv3812, как определено в настоящем описании (например, содержащий или состоящий из полипептидной последовательности с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот).

В одном из вариантов осуществления ограничения, описываемые выше в отношении антигенной композиции, содержащей по меньшей мере первый и второй микобактериальные антигены, равным образом применимы к микобактериальным антигенам, с которыми связываются по меньшей мере первое и второе антитела из описанной выше антигенной композиции.

Термин "антитело" включает любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий домен. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают, поликлональные, моноклональные, специфические, моноспецифические, полиспецифические, неспецифические, гуманизированные, человеческие, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутантные, привитые и получаемые in vitro антитела.

Если нет предшествующего слова "интактное", термин "антитело" включает фрагменты антител, такие как Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb и другие фрагменты антител, сохраняющие функцию связывания антигена.

В одном из вариантов осуществления антитело принадлежит семействам изотипов IgG, IgM или IgA. Указание на изотип IgA включает секреторную форму этого антитела (т.е. sIgA). Секреторный компонент (SC) sIgA можно добавлять in vitro или in vivo. В последнем случае можно использовать природный аппарат мечения SC пациента.

В одном из вариантов осуществления антитело специфически связывает описываемый микобактериальный антиген. "Специфическое связывание" предназначено для обозначения формирования комплекса между двумя или более молекулами, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и от низкой до средней емкостью, в отличие от неспецифического связывания, которое, как правило, обладает низкой аффинностью с емкостью от средней до высокой. Как правило, связывание между антителом и антигеном считают специфическим, когда константа ассоциации KA превышает 106 М 1. Если необходимо, неспецифическое связывание можно снижать без существенного влияния на специфическое связывание, варьируя условия связывания.

Подходящие условия связывания, такие как концентрация антитела, ионная сила раствора, температура, время, предусматриваемое для связывания, концентрация блокирующего средства (например, сывороточного альбумина, молочного казеина), и т.д., может оптимизировать специалист стандартными способами.

В одном из вариантов осуществления указанные первое и второе антитела индуцированы к первому и второму микобактериальным антигенам по изобретению, как описано в настоящем описании, соответственно. В одном из вариантов осуществления указанные первое и второе антитела индуцированы к первому и второму микобактериальным антигенным полипептидам по изобретению, как описано в настоящем описании, соответственно.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к антисыворотке, выделяемой у животных, иммунизированных антигенной композицией по изобретению. В рамках изобретения термин "антисыворотка" относится к антителам в сыворотке, обладающей детектируемым, например, посредством ELISA или проточной цитометрии, связыванием с конкретным антигеном.

Способы получения иммунной сыворотки известны в данной области. Например, первое и второе антитела (и необязательные дополнительные антитела) по изобретению или иммуногенную композицию по изобретению можно вводить животному (такому как млекопитающее - например, лошадь или человек) до получения ответа антителами (например, ответа нейтрализующими антителами) на первый и второй микобактериальный антигены.

Общий принцип получения моноклональных антител посредством гибридом включает, например, получение бессмертных продуцирующих антитела клеточных линий посредством слияния клеток или можно использовать другие способы, такие как прямая трансформация B-лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейна-Барр.

Антитела, индуцированные к фрагментам антигенов, описываемым в настоящем описании (например, полипептидным фрагментам), могут обладать свойством распознавания полноразмерного антигена (например, полноразмерного полипептида), из которого они получены. В этом отношении полипептидные фрагменты несут антигенные детерминанты, детектируемые общепринятыми иммунологическими анализами. Полноразмерные антигены по изобретению и их фрагменты содержат одну или несколькими антигенных детерминант, таким образом, антитела, индуцированные к антигенному фрагменту, также могут связывать соответствующие полноразмерные антигены по изобретению.

В одном из вариантов осуществления антитела получают в выделенной форме.

Антитела можно метить детектируемой или функциональной меткой. Эти метки включают радиоактивные метки (например, 131I или 99Tc), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу) и другие химические группы (например, биотин).

Описанные выше антитела при введении млекопитающему, такому как человек, до или вскоре после воздействия микобактерий, таких как M. tuberculosis, могут обеспечивать улучшенную выживаемость. Таким образом, первое и второе антитела (и необязательные дополнительные антитела) по изобретению (или содержащая антитела иммуногенная композиция по изобретению) можно использовать в качестве пассивной иммунной сыворотки для предотвращения микобактериальной инфекции или для лечения пациентов, подвергаемых действию микобактерий (таких как M. tuberculosis).

В одном из вариантов осуществления связывание антител с микобактериальными антигенами по изобретению может инициировать покрытие микобактерии, экспрессирующей указанный антиген. Покрытие микобактерии предпочтительно приводит к ее опсонизации, что приводит к разрушению бактерии. Опсонизация антителами может влиять на проникновение в клетки и распространение микобактерий в фагоцитирующих и нефагоцитирующих клетках посредством предотвращения или модуляции опосредованного рецепторами проникновения в макрофаги и репликации в них.

Без связывания с какой-либо теорией, возможно, что после микобактериальной инфекции макрофага, макрофаг уничтожается и бациллы высвобождаются. Полагают, что на этом этапе микобактерии являются наиболее уязвимыми для атаки антител. Таким образом, возможно, что антитела по настоящему изобретению действуют на высвобождаемые после гибели макрофагов бациллы и, таким образом, оказывают постинфекционное действие.

Возможно, что аспект пассивной защиты (т.е. доставка антител) по настоящему изобретению облегчается увеличенной доступностью антигенов на микобактериальных бациллах антителам по настоящему изобретению. Также возможно, что связывание антител может блокировать инфицирование макрофагов посредством создания стерических препятствий или нарушения ее олигомерной структуры. Таким образом, антитела, действующие на микобактериальные бациллы, высвобождаемые из погибших инфицированных макрофагов, могут препятствовать распространению повторной инфекции в новые макрофаги. Эта гипотеза включает синергическое действие между антителами и цитотоксическими T-клетками, действующими на ранних этапах после инфекции, например, NK T-клетками, но позже также может включать CD8 и CD4 цитотоксические T-клетки.

В другом варианте осуществления композиции, содержащие антитела (например, моноклональные антитела) по изобретению, можно использовать для индукции антиидиотипических антител. Антиидиотипические антитела представляют собой иммуноглобулины, которые несут "внутренний образ" антигена инфекционного микобактериального агента, против которого желательна защита. Эти антиидиотипические антитела также могут быть полезны для лечения, вакцинации и/или диагностики микобактериальных инфекций.

Первый и второй микобактериальные антигены по изобретению стимулируют иммунный ответ против микобактериальных антигенов, таких как M. tuberculosis.

В отношении терапевтических применений и способов, описываемых ниже, "индивидуум" представляет собой любое животное, у которого можно получить положительный эффект при стимуляции иммунного ответа против микобактериальных антигенов, таких как M. tuberculosis. Типичными животными являются млекопитающие, например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собака или кошка. В одном из вариантов осуществления индивидуум представляет собой человека, корову, свинью или лошадь.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена для получения лекарственного средства для стимуляции иммунного ответа у индивидуума, такого как млекопитающее (например, человек, корова, свинья или лошадь); где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

Изобретение также относится к первому микобактериальному антигену и второму микобактериальному антигену для применения в стимуляции иммунного ответа у индивидуума, такого как млекопитающее (например, человек, корова, свинья или лошадь); где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотидной последовательности, таких как микобактериальный антигенный полипептид или полинуклеотидная последовательность, как определено в (i) или (ii) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к (a) первому микобактериальному антигенному полипептиду или первому микобактериальному полинуклеотиду, и (b) второму микобактериальному антигенному полипептиду или второму микобактериальному полинуклеотиду для применения в стимуляции иммунного ответа у индивидуума; где

(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот;

(ii) указанная первая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(iv) указанная вторая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к (a) первому микобактериальному антигенному полипептиду или первому микобактериальному полинуклеотиду и (b) второму микобактериальному антигенному полипептиду или второму микобактериальному полинуклеотиду для применения в стимуляции иммунного ответа у индивидуума; где

(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот;

(ii) указанная первая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(iv) указанная вторая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления иммунную стимуляцию определяют по защитному действию в анализе выживания in vivo. В одном из вариантов осуществления иммунную стимуляцию определяют по увеличенной частоте иммунных клеток, таких как T-лимфоциты, специфичных к антигену вакцины - т.е. по клеточному иммунному ответу (например, T-клеточному иммунному ответу). В одном из вариантов осуществления иммунная стимуляция представляет собой иммунный ответ T-клеток памяти, такой как иммунный ответ центральных T-клеток памяти (например, ответ CCR7+). В одном из вариантов осуществления иммунную стимуляцию определяют по увеличению титра антител, специфичных к антигену вакцины.

В одном из вариантов осуществления указанное лекарственное средство дополнительно содержит один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании, также предназначены для использования с указанными первым и вторым микобактериальными антигенами. В одном из вариантов осуществления, если указанный первый микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv0111 (как определено в настоящем описании), и если указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv1098 (как определено в настоящем описании), указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов не содержат или не состоят из антигена Rv3812 (как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического применения указанные первый и второй (и необязательный дополнительный микобактериальный антигены(ы)) предоставлены в форме антигенной композиции, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных первого, второго и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов могут содержаться в одном или нескольких векторах или клетках, как описано в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического применения любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго микобактериальных антигенов (и необязательных дополнительных микобактериальных антигенов), равным образом применимы к их терапевтическим применениям.

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического применения указанные первый и второй микобактериальные антигены (и необязательный дополнительный микобактериальный антиген(ы)) предназначены для введения индивидууму по существу одновременно или последовательно. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

Настоящее изобретение также относится к применению первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения микобактериальной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis) у индивидуума, такого как млекопитающее (например, человек, корова, свинья или лошадь); где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

Изобретение также относится к первому микобактериальному антигену и второму микобактериальному антигену для применения в лечении или предотвращении микобактериальной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis) у индивидуума, такого как млекопитающее (например, человек, корова, свинья или лошадь); где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотидной последовательности, такой как микобактериальный антигенный полипептид или полинуклеотидная последовательность, как определено в (i) или (ii) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к (a) первому микобактериальному антигенному полипептиду или первому микобактериальному полинуклеотиду и (b) второму микобактериальному антигенному полипептиду или второму микобактериальному полинуклеотиду для применения в лечении или предотвращении микобактериальной инфекции (например, инфекция M. tuberculosis) у индивидуума; где:

(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот;

(ii) указанная первая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(iv) указанная вторая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательностям нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или 8 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

Например, указанное применение или лекарственное средство могут защищать индивидуума от инфекции микобактериями, такими как M. tuberculosis. Например, указанное применение или лекарственное средство могут быть пригодны для лечения TB у индивидуума, как правило, млекопитающего, такого как человек, корова, свинья или лошадь.

В одном из вариантов осуществления указанное применение или лекарственное средство могут защищать индивидуума от инфекции микобактериями на ранней стадии, такими как M. tuberculosis. Термин "инфекция на ранней стадии" относится к начальному периоду после инфекции, в котором микобактерии размножаются в легких, преодолев врожденный иммунитет организма индивидуума (неспецифический иммунитет). При инфекции на ранней стадии пролиферация микобактерий у инфицированного индивидуума стимулирует возрастающий иммунный ответ. Иммунная система индивидуума старается контролировать рост бактерий так, чтобы его можно было замедлить, ограничив в гранулеме, а затем снизить до устойчивого низкого уровня. В течение этого периода может произойти диссеминация в другие органы, такие как селезенка. Период, в течение которого происходит инфекция на ранней стадии, у людей четко не определен; однако в экспериментальных моделях, таких как на морских свинках, этот период составляет приблизительно 3-4 недели.

Таким образом, инфекция на ранней стадии отличается от латентной инфекции. При латентной инфекции, вследствие наличия непрерывного успешного иммунного ответа, уровень микобактерий удерживается на низком уровне в гранулеме, в которой микобактерии могут демонстрировать "покой" (иначе известный как "персистенция без репликации").

В одном из вариантов осуществления указанное лекарственное средство дополнительно содержит один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании, также предназначены для применения с указанными первым и вторым микобактериальными антигенами. В одном из вариантов осуществления, если указанный первый микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv0111 (как определено в настоящем описании) и если указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv1098 (как определено в настоящем описании), указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов не содержат или не состоят из антигена Rv3812 (как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического применения указанные первый и второй (и необязательно дополнительный микобактериальный антиген(ы)) предоставлены в форме антигенной композиции, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных первого, второго и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов могут содержаться в одном или нескольких векторах или клетках, как описано в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического применения любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго микобактериальных антигенов (и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов), равным образом применимы к их терапевтическим применениям.

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического применения указанные первый и второй микобактериальные антигены (и необязательный дополнительный микобактериальный антиген(ы)) предназначены для введения индивидууму по существу одновременно или последовательно. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

Связанный аспект включает способ стимуляции иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму, такому как млекопитающее (например, человек, корова, свинья или лошадь), эффективного количества первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена;

где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотидной последовательности, таких как микобактериальный антигенный полипептид или полинуклеотидная последовательность, как определено в (i) или (ii) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа у индивидуума, включающему введение указанному индивидууму: (a) первого микобактериального антигенного полипептида или первого микобактериального полинуклеотида и (b) второго микобактериального антигенного полипептида или второго микобактериального полинуклеотида; где:

(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот;

(ii) указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(iv) указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

В одном из вариантов осуществления иммунную стимуляцию определяют по защитному действию в анализе выживания in vivo. В одном из вариантов осуществления иммунную стимуляцию определяют по увеличенной частоте иммунных клеток, таких как T-лимфоциты, специфичных к антигену вакцины - т.е. по клеточному иммунному ответу (например, T-клеточному иммунному ответу). В одном из вариантов осуществления иммунная стимуляция представляет собой иммунный ответ T-клеток памяти, такой как иммунный ответ центральных T-клеток памяти (например, ответ CCR7+). В одном из вариантов осуществления иммунную стимуляцию определяют по увеличению титра антител, специфичных к антигену вакцины.

В одном из вариантов осуществления указанный способ дополнительно включает введение одного или нескольких дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления, если указанный первый микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv0111 (как определено в настоящем описании), и если указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv1098 (как определено в настоящем описании), указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов не содержат или не состоят из антигена Rv3812 (как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического способа указанные первый и второй (и необязательно дополнительный микобактериальный антиген(ы)) предоставлены в форме антигенной композиции или состава, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных первого, второго и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов могут содержаться в одном или нескольких векторах или клетках, как описано в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического способа любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго микобактериальных антигенов (и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов), равным образом применимы к их терапевтическим применениям.

В одном из вариантов осуществления способ включает введение указанных первого и второго микобактериальных антигенов индивидууму по существу одновременно или последовательно. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

В связанном аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики микобактериальной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis), включающему введение индивидууму, такому как млекопитающее (например, человек, корова, свинья или лошадь), эффективного количества первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена;

где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотидной последовательности, таких как микобактериальный антигенный полипептид или полинуклеотидная последовательность, как определено в (i) или (ii) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу лечения или профилактики микобактериальной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis) у индивидуума; включающему введение указанному индивидууму: (a) первого микобактериального антигенного полипептида или первого микобактериального полинуклеотида и (b) второго микобактериального антигенного полипептида или второго микобактериального полинуклеотида; где:

(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот;

(ii) указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(iv) указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

Например, указанный способ может защищать индивидуума от инфекции микобактериями, такими как M. tuberculosis. Например, указанным способом можно лечить TB у индивидуума. В одном из вариантов осуществления указанный способ может защищать индивидуума от инфекции микобактериями, такими как M. tuberculosis, на ранней стадии. Микобактериальная инфекция на ранней стадии определена выше.

В одном из вариантов осуществления указанный способ дополнительно включает введение одного или нескольких дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления, если указанный первый микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv0111 (как определено в настоящем описании), и если указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из антигена Rv1098 (как определено в настоящем описании), указанные один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов не содержат или не состоят из антигена Rv3812 (как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического способа указанные первый и второй (и необязательно дополнительный микобактериальный антиген(ы)) предоставлены в форме антигенной композиции, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления один или несколько из указанных первого, второго и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов могут содержаться в одном или нескольких векторах или клетках, как описано в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления этого терапевтического способа любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго микобактериальных антигенов (и/или необязательных дополнительных микобактериальных антигенов), равным образом применимы к их терапевтическим применениям.

В одном из вариантов осуществления способ включает введение указанных первого и второго микобактериальных антигенов индивидууму по существу одновременно или последовательно. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

Первое и второе антитела по изобретению также пригодны для стимуляции иммунного ответа против микобактериальных антигенов, таких как M. tuberculosis.

Таким образом, изобретение также относится к терапевтическим применениям и способам, включающим первое антитело и второе антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген, а указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген;

где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i); или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериальной антигенной полипептидной последовательности, как определено в (i). В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериальной антигенной полипептидной последовательности, такой как микобактериальная антигенная полипептидная последовательность, как определено в (i) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления указанное первое антитело и второе антитело предоставлены в форме иммуногенных содержащих антитело композиции или состава, как описано в настоящем описании.

В качестве примера изобретение относится к применению первого и второго антител по изобретению (например, в форме иммуногенной содержащей антитело композиции по изобретению) для получения лекарственного средства для стимуляции иммунного ответа у индивидуума (как правило, млекопитающего - например, человека, коровы, свиньи или лошади); или для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения микобактериальной инфекции (например, TB) или предполагаемой инфекции у индивидуума (такого как млекопитающее - например, человек, корова, свинья или лошадь).

Изобретение также относится к первому и второму антителам по изобретению (например, в форме иммуногенной содержащей антитело композиции по изобретению) для применения в стимуляции иммунного ответа у индивидуума (как правило, млекопитающего - например, человека, коровы, свиньи или лошади) или для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения микобактериальной инфекции (например, TB) или предполагаемой инфекции у индивидуума (такого как млекопитающее - например, человек, корова, свинья или лошадь).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к первому антителу и второму антителу для применения в стимуляции иммунного ответа у индивидуума;

где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; и

где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Изобретение также относится к способу стимуляции иммунного ответа у индивидуума (такого как млекопитающее - например, человек, корова, свинья или лошадь) или лечения или предотвращения микобактериальной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis, TB) у индивидуума (такого как млекопитающее - например, человек, корова, свинья или лошадь), включающему введение указанному индивидууму (до или после инфекции) первого и второго антител (и необязательных дополнительных антител) по изобретению (например, в форме иммуногенной содержащей антитело композиции по изобретению).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа у индивидуума, включающему введение указанному индивидууму:

(a) первого антитела, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид; где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; и

(b) второго антитела, где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид; где указанный второй микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанных применений и способов указанные первое антитело и второе антитело предоставлены в форме иммуногенных содержащих антитело композиции или состава, как описано в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления указанные применение или способ дополнительно включают введение одного или нескольких дополнительных антител, связывающих один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления, если указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген, содержащий или состоящий из антигена Rv0111 (как определено в настоящем описании), и если указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген, содержащий или состоящий из антигена Rv1098 (как определено в настоящем описании), указанные один или несколько дополнительных антител не связывают микобактериальный антиген, содержащий или состоящий из антигена Rv3812 (как определено в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго антител (и/или антигенов, с которыми эти антитела связываются), равным образом применимы к их терапевтическим способам и применениям.

Указанный способ или применения могут предназначаться для одновременного или последовательного введения указанных первого и второго антител (и/или необязательных дополнительных антител). В одном из вариантов осуществления первое и второе антитела против микобактериальных антигенов предназначены для введения индивидууму по существу одновременно или последовательно. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

В одном из вариантов осуществления указанные применение или способ могут защищать индивидуума от инфекции микобактериями, такими как M. tuberculosis, на ранней стадии. Микобактериальная инфекция на ранней стадии определена выше.

В связанном аспекте первый и второй (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены, антигенная композиция, антитела, иммуногенная композиция или лекарственное средство по настоящему изобретению, как определено в настоящем описании, могут быть пригодны для лечения (включая профилактическое лечение) ряда микобактериальных заболеваний, в качестве неограничивающих примеров включающих туберкулез (TB), лепру, инфекцию M. avium, инфекцию M. bovis, инфекцию M. paratuberculosis, инфекцию M. ulcerans (например, язву Бурули) или другую нетуберкулезную микобактериальную инфекцию.

Первый и второй (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены, антигенная композиция, антитела, иммуногенная композиция или лекарственное средство по настоящему изобретению могут быть пригодны для индукции иммунного ответа определенного диапазона и, таким образом, могут быть пригодны в способах лечения ряда заболеваний.

В одном из вариантов осуществления первый и второй (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены, антигенная композиция или лекарственное средство по настоящему изобретению пригодны для лечения или предотвращения ряда немикобактериальных заболеваний, в которых участвуют микобактерии. Например, заболевания, в которых можно получать улучшение при применении лекарственного средства по изобретению, включают воспалительные заболевания, такие как аутоиммунное заболевание, злокачественная опухоль (например, рак мочевого пузыря), воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, болезнь Джона, болезнь Хансена, остеомиелит, лимфаденит, натуральная оспа или оспа обезьян.

В рамках изобретения термин "лечение" или "проведение лечения" включает терапевтические или превентивные/профилактические меры и включает лечение после инфекции и улучшение состояния при микобактериальной инфекции.

В рамках изобретения термин "предотвращение" включает предотвращение начала микобактериальной инфекции и/или снижение тяжести или интенсивности микобактериальной инфекции.

В одном из вариантов осуществления антигенная композиция или лекарственное средство по изобретению содержат микобактериальные антигены, представляющие различные стадии микобактериальной инфекции (например, латентность, реактивация или активная инфекция). В одном из вариантов осуществления антигенная композиция или лекарственное средство по изобретению содержат по меньшей мере один микобактериальный антиген, экспрессирующийся при латентности, и по меньшей мере один микобактериальный антиген, подавленный при латентности.

Таким образом, это сочетание антигенов пригодно для предотвращения и/или для лечения нескольких стадий микобактериальной инфекции, так как антигены вызывают у индивидуума ответ против различных стадий заболевания (например, ранняя фаза, латентная фаза, фаза реактивации или острая фаза микобактериального заболевания).

В рамках изобретения термин "эффективность вакцины" описывает способность вакцины защищать индивидуума (как правило, млекопитающего, например, человека, коровы, свиньи или лошади) от заражения микобактериями, такими как M. tuberculosis. В качестве примера "эффективность вакцины" может относиться к эффективности вакцины в предотвращении начала микобактериальной инфекции и/или снижения тяжести/интенсивности микобактериальной инфекции.

Терапевтическую/профилактическую композицию или лекарственное средство можно вводить индивидууму (как правило, млекопитающему, такому как человек, корова, свинья или лошадь) уже с микобактериальной инфекцией, состоянием или симптомами, ассоциированными с микобактериальной инфекцией, для лечения или предотвращения указанной микобактериальной инфекции. В одном из вариантов осуществления предполагают наличие контакта индивидуума с микобактериями или известно о наличии у него контакта с микобактериями, но у него еще не наблюдают симптомы воздействия. В одном из вариантов осуществления инфекция у индивидуума находится на ранней стадии.

При введении индивидууму (например, млекопитающему, такому как человек, корова, свинья или лошадь), у которого уже присутствует микобактериальная инфекция или заболевание или у которого наблюдают симптомы, ассоциированные с микобактериальной инфекцией, терапевтическая композиция/лекарственное средство могут лечить, задерживать, снижать тяжесть одного или нескольких симптомов или улучшать состояние при них и/или увеличивать продолжительность жизни индивидуума сверх ожидаемого в отсутствие такого лечения.

Альтернативно терапевтическую/профилактическую композицию или лекарственное средство можно вводить тому индивидууму (например, млекопитающему, такому как человек, корова, свинья или лошадь), который может подвергнуться микобактериальной инфекции в перспективе, для предотвращения, лечения, задержки, снижения тяжести одного или нескольких симптомов указанной микобактериальной инфекции или улучшения состояния при них или для увеличения продолжительности жизни индивидуума сверх ожидаемого в отсутствие такого лечения.

В одном из вариантов осуществления индивидуум ранее подвергался воздействию микобактерий. Например, индивидуум в прошлом мог перенести микобактериальную инфекцию (но он необязательно инфицирован микобактериями в настоящее время). Индивидуум может быть латентно инфицирован микобактериями. Альтернативно, или кроме того, индивидуум в прошлом мог проходить вакцинацию против микобактериальной инфекции (например, индивидуум ранее проходил вакцинацию BCG).

Лечение и профилактическое лечение по настоящему изобретению применимо для множества различных индивидуумов различного возраста. В отношении людей лечение применимо для детей (например, грудных детей, детей до 5 лет, более старших детей или подростков) и взрослых. В отношении других животных (например, млекопитающих, таких как корова, свинья или лошадь) лечение применимо для детенышей (например, телят, поросят, жеребят) и взрослых особей. Лечение и профилактическое лечение по настоящему изобретению применимо для индивидуумов с ослабленным иммунитетом или с иммуносупрессией (например, пациенты-люди с ВИЧ или СПИД или другие пациенты-животные со сравнимыми заболеваниями с иммунодефицитом), индивидуумов, подвергнутых трансплантации органов, трансплантации костного мозга или с врожденным иммунодефицитом.

Изобретение относится к терапевтическим составам, лекарственным средствам и профилактическим составам (например, вакцинам), содержащим фармацевтически приемлемый носитель, первый микобактериальный антиген по изобретению, как определено выше, и второй микобактериальный антиген по изобретению, как определено выше (и необязательно один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов по изобретению, как описано выше).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к терапевтическому или профилактическому составу (например, вакцине), содержащему фармацевтически приемлемый носитель и:

(a) первый микобактериальный антиген, где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i) или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и

(b) второй микобактериальный антиген, где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена;

где указанный состав предназначен для одновременного или последовательного введения указанных первого и второго микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотидной последовательности, таких как микобактериальный антигенный полипептид или полинуклеотидная последовательность, как определено в (i) или (ii) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления указанный терапевтический или профилактический состав (например, вакцина), содержит (a) фармацевтически приемлемый носитель; (b) первый микобактериальный антигенный полипептид или первый микобактериальный полинуклеотид и (c) второй микобактериальный антигенный полипептид или второй микобактериальный полинуклеотид; где:

(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот;

(ii) указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;

(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и

(iv) указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид;

где указанный состав предназначен для одновременного или последовательного введения указанного первого микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотида и указанного второго микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательностям нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или 8 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 21 ее последовательный нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления указанные терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцина) по изобретению содержат антигенную композицию по изобретению, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанные терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцина) содержат антигенную композицию, содержащую один или несколько векторов или клеток, как описано выше, где указанные векторы или клетки содержат по меньшей мере один из микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления указанных терапевтического состава, лекарственного средства или профилактического состава (например, вакцины) любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго (или дополнительных) микобактериальных антигенов, равным образом применимы к указанным терапевтическому составу, лекарственному средству или профилактическому составу (например, вакцины).

В одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению представляет собой "векторную вакцину", содержащую один или несколько векторов, как описано выше.

В одном из вариантов осуществления терапевтические составы, лекарственные средства или профилактические составы (например, вакцины) по изобретению предназначены для одновременного введения указанных первого и второго (и/или необязательных дополнительных) микобактериальных антигенов. В альтернативном варианте осуществления терапевтические составы, лекарственные средства или профилактические составы (например, вакцины) по изобретению предназначены для последовательного введения указанных первого и второго (и/или необязательных дополнительных) микобактериальных антигенов. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

Изобретение также относится к терапевтическим составам, лекарственным средствам и профилактическим составам (например, вакцинам), содержащим фармацевтически приемлемый носитель, первое антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген по изобретению, как определено выше; и второе антитело, где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген по изобретению, как определено выше (и необязательно одно или несколько дополнительных антител по изобретению, как описано выше).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к терапевтическому или профилактическому составу (например, вакцине), содержащему фармацевтически приемлемый носитель и:

(a) первое антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген; где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i) или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и

(b) второе антитело, где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген, отличный от указанного первого микобактериального антигена;

где указанный состав предназначен для одновременного или последовательного введения указанных первого и второго антител.

В одном из вариантов осуществления указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген, содержащий микобактериальную антигенную полипептидную последовательность, как определено в (i). В одном из вариантов осуществления указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген, содержащий микобактериальную антигенную полипептидную последовательность, как определено в (i) (где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид отличен от указанного первого микобактериального антигенного полипептида).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к терапевтическому или профилактическому составу (например, вакцине), содержащему фармацевтически приемлемый носитель и:

(a) первое антитело, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид; где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; и

(b) второе антитело, где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид; где указанный второй микобактериальный антиген содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот;

где указанный состав предназначен для одновременного или последовательного введения указанных первого и второго антител.

В одном из вариантов осуществления указанные терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцина) по изобретению содержат содержащую антитело иммуногенную композицию по изобретению, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанного терапевтического состава, лекарственного средства или профилактического состава (например, вакцины) любые из ограничений, описываемые в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго (или дополнительных) антител (или микобактериальных антигенов, с которыми они связываются), равным образом применимы к указанным терапевтическому составу, лекарственному средству или профилактическому составу (например, вакцине).

В одном из вариантов осуществления терапевтические составы, лекарственные средства или профилактические составы (например, вакцины) по изобретению предназначены для одновременного введения указанных первого и второго (и/или необязательных дополнительных) антител. В альтернативном варианте осуществления терапевтические составы, лекарственные средства или профилактические составы (например, вакцины) по изобретению предназначены для последовательного введения указанных первого и второго (и/или необязательных дополнительных) антител. Режимы одновременного и последовательного введения более подробно описаны ниже.

Терапевтические составы, лекарственные средства и профилактические составы (например, вакцины) по изобретению содержат фармацевтически приемлемый носитель и необязательно один или несколько из соли, эксципиента, разбавителя и/или адъюванта.

В одном из вариантов осуществления терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцина) по изобретению могут содержать один или несколько иммунорегулирующих средств, выбранных, например, из иммуноглобулинов, антибиотиков, интерлейкинов (например, IL-2, IL-12) и/или цитокинов (например, IFNγ).

В одном из вариантов осуществления терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцина) по изобретению могут содержать одно или несколько противомикробных соединений, таких как общепринятые противотуберкулезные лекарственные средства (например, рифампицин, изониазид, этамбутол или пиризинамид).

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способу получения терапевтического или профилактического состава (например, вакцины), где способ включает комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с первым микобактериальным антигеном по изобретению, как определено выше; и вторым микобактериальным антигеном по изобретению, как определено выше (и необязательно одним или несколькими дополнительными микобактериальными антигенами, как определено выше).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения терапевтического или профилактического состава (например, вакцины), где способ включает комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с:

(a) первым микобактериальным антигеном, где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i) или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и

(b) вторым микобактериальным антигеном, где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанный второй микобактериальный антиген содержит или состоит из микобактериального антигенного полипептида или полинуклеотидной последовательности, таких как микобактериальный антигенный полипептид или полинуклеотидная последовательность, как определено в (i) или (ii) (где указанный второй микобактериальный антиген отличается от указанного первого микобактериального антигена).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения терапевтического или профилактического состава (например, вакцины), где способ включает:

комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с:

(i) первым микобактериальным антигенным полипептидом, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) первым микобактериальным полинуклеотидом, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид; и с:

(iii) вторым микобактериальным антигенным полипептидом, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или

(iv) вторым микобактериальным полинуклеотидом, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

В одном из вариантов осуществления указанные микобактериальные антигены находится в форме антигенной композиции по изобретению, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанного способа любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго (или дополнительных) микобактериальных антигенов, равным образом применимы к указанному способу.

В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает комбинацию указанных фармацевтически приемлемого носителя и микобактериальных антигенов (или антигенной композиции) с одним или несколькими из соли, эксципиента, разбавителя, адъюванта, иммунорегулирующего средства и/или противомикробного соединения.

Изобретение также относится к способу получения терапевтического или профилактического состава (например, вакцины), где способ включает комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с первым антителом, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген по изобретению, как определено выше; и вторым антителом, где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген по изобретению, как определено выше (и необязательно с одним или несколькими дополнительными микобактериальными антителами по изобретению, как определено выше).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения терапевтического или профилактического состава (например, вакцины), где способ включает комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с:

(a) первым антителом, где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген; где указанный первый микобактериальный антиген содержит:

(i) полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности регулируемого латентностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 и 56 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или

(ii) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность по (i), или полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты регулируемого латентностью полинуклеотида, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 57 или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 21 их последовательный нуклеотид;

и

(b) вторым антителом, где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген, отличный от указанного первого микобактериального антигена.

В одном из вариантов осуществления указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антиген, содержащий микобактериальную антигенную полипептидную последовательность, как определено в (i). В одном из вариантов осуществления указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антиген, содержащий микобактериальную антигенную полипептидную последовательность, как определено в (i) (где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид отличен от указанного первого микобактериального антигенного полипептида).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения терапевтического или профилактического состава (например, вакцины), где способ включает комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с первым антителом и вторым антителом;

где указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; и

где указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления указанные первое и второе антитела находятся в форме иммуногенной композиции по изобретению, как определено выше.

В одном из вариантов осуществления указанного способа любые из ограничений, описываемых в настоящем описании в отношении указанных первого и/или второго (или дополнительных) антител (или микобактериальных антигенов, с которыми они связываются), равным образом применимы к указанному способу.

В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает комбинацию указанных фармацевтически приемлемого носителя и антител (или иммуногенной композиции) с одним или несколькими из соли, эксципиента, разбавителя, адъюванта, иммунорегулирующего средства и/или противомикробного соединения.

В рамках изобретения "вакцина" представляет собой состав, который при введении животному, такому как млекопитающее (например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собака или кошка), стимулирует защитный иммунный ответ против микобактериальной инфекции. Иммунный ответ может быть гуморальным и/или клеточным иммунным ответом (например, T-клеточным ответом). Вакцину по изобретению можно использовать, например, для защиты животного от действия микобактериальной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis), такой как инфекция на ранней стадии.

Иммуногенность эпитопов первого и второго микобактериальных антигенов (например, полипептидов) по изобретению можно увеличить, получая их в системах млекопитающих или дрожжей, слитыми или в сборе с формирующими частицы белками, такими как, например, поверхностный антиген, ассоциированный с гепатитом B. В одном из вариантов осуществления вакцина содержит по меньшей мере один микобактериальный полипептид, обработанный химическим модифицирующим средством (таким как формальдегид), с получением вакцины увеличенной эффективности.

Полипептиды (включая антитела) и/или полинуклеотиды по изобретению можно формулировать в вакцину в нейтральной форме или форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот, формируемые с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или с органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, малеиновая и т.п. Соли, формируемые со свободными карбоксильными группами, также можно получать из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.

Как правило, введение терапевтических составов, лекарственных средств и профилактических составов (например, вакцин) проводят общепринятыми способами, например, внутривенным, подкожным, интраперитонеальным или слизистым способами. Введение может представлять собой парентеральную инъекцию, например, подкожную или внутримышечную инъекцию. Для составов, содержащих нейтрализующие антитела, особенно подходящим может являться внутривенное, внутримышечное, интрадермальное или подкожное введение.

Таким образом, терапевтические составы, лекарственные средства и профилактические составы (например, вакцины) по изобретению, как правило, получают в виде инъецируемых средств, в виде жидких растворов или суспензий. Альтернативно можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также можно эмульгировать, или пептид можно инкапсулировать в липосомы или микрокапсулы.

Активные иммуногенные ингредиенты часто смешивают с эксципиентами, являющимися фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящие эксципиенты представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол или т.п. и их сочетания. Кроме того, при желании, вакцина может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как средства для смачивания или эмульгаторы, средства для буферирования pH и/или адъюванты, увеличивающие эффективность вакцины.

Как правило, носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают воду, физиологический раствор и фосфатно-солевой буфер. Однако в некоторых вариантах осуществления композиция находится в лиофилизированной форме, в случае чего она может включать стабилизатор, такой как BSA. В некоторых вариантах осуществления, для облегчения длительного хранения, желательным может являться формулировать композицию с консервантом, таким как тиомерсал или азид натрия.

Примеры адъювантов, которые могут являться эффективными, в качестве неограничивающих примеров включают: полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IVA), сапонин, фракцию очищенного экстракта сапорина, такую как Quil A, производное сапорина, такое как QS-21, липидные частицы на основе сапонина, такие как ISCOM/ISCOMATIX, мутантные формы термолабильного токсина E. coli (LT), такие как LTK63 и/или LTK72, гидроксид алюминия, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, обозначаемый как nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (CGP 19835A, обозначаемый как MTP-PE) и RIBI, содержащий три компонента, экстрагированных из бактерий, монофосфориллипид A, димиколат трегалозы и каркас клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквалена/Tween 80.

Примеры буферных средств в качестве неограничивающих примеров включают сукцинат натрия (pH 6,5) и фосфатно-солевой буфер (PBS; pH 6,5 и 7,5).

Дополнительные составы, подходящие для других способов введения, включают суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные составы или составы подходящие для распределения в виде аэрозолей. Для суппозиториев традиционные связывающие средства и носители могут включать, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно формировать из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне от 0,5% до 10%, предпочтительно 1%-2%.

Пероральные составы включают такие обычно применяемые эксципиенты как, например, маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, целлюлоза, карбонат магния фармацевтических степеней очистки и т.п. Эти композиции находятся в формах растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, составов с длительным высвобождением или порошков.

В случае микобактериальной респираторной инфекции (например, инфекции M. tuberculosis), эффективной доставки терапевтической/профилактической композиции или лекарственного средства в участок инфекции в легких можно добиваться посредством перорального или интраназального введения (и./н.). Эти пути доставки соответствуют пути проникновения инфекции M. tuberculosis. В случае композиций на основе антител эти пути доставки обеспечивают присутствие антител в участке инфекции для борьбы с бактерией до ее попадания внутрь клетки, а также в течение периода, когда она распространяется между клетками.

Составы для интраназального введения могут находиться в форме назальных капель или назального спрея. Интраназальный состав может содержать капли с приблизительными диаметрами в диапазоне 100-5000 мкм, таком как 500-4000 мкм, 1000-3000 мкм или 100-1000 мкм. Альтернативно, в единицах объема, капли могут находиться в диапазоне приблизительно 0,001-100 мкл, таком как 0,1-50 мкл или 1,0-25 мкл или таком как 0,001-1 мкл.

Альтернативно терапевтический/профилактический состав или лекарственное средство могут представлять собой аэрозольный состав. Аэрозольный состав может находиться в форме порошка, суспензии или раствора. Размер частиц аэрозоля соответствует возможности доставки аэрозоля. Более мелкие частицы могут проходить ниже по дыхательным путям в направлении альвеол, чем более крупные частицы. В одном из вариантов осуществления частицы аэрозоля обладают распределением диаметров, облегчающим доставку по всей длине бронхов, бронхиол и альвеол. Альтернативно распределение размера частиц можно выбирать для направления в конкретный участок дыхательных путей, например, альвеолы. В случае доставки лекарственного средства посредством аэрозоля, диаметр частиц может находиться в приблизительном диапазоне 0,1-50 мкм, предпочтительно 1-25 мкм, более предпочтительно 1-5 мкм.

Частицы аэрозоля могут быть предназначены для доставки с применением распылителя (например, через рот) или назального спрея. Аэрозольный состав необязательно может содержать газ-вытеснитель и/или поверхностно-активное вещество.

Возможно, что при и./н. доставке микобактериальных антигенов или антител против микобактериальных антигенов, их прохождение в легкие облегчается обратным током слизистого секрета, хотя считается, что мукоцилиарное действие в дыхательных путях выводит частицы в слизи из легких. Относительно длительное нахождение в легочном лаваже, быстрое выведение из желчи и отсутствие транспорта некоторых антител в слюну позволяет предполагать роль специфичных для участка слизистых механизмов.

Посредством контроля размера капель/частиц в пределах определенного диапазона по настоящему изобретению возможно избежать (или минимизировать) случайной доставки антигена в альвеолы и, таким образом, избежать ассоциированных с альвеолами таких патологических проблем, как воспаление и фиброзное рубцевание легких.

И./н. вакцинация включает опосредуемые T- и B-клетками эффекторные механизмы в ассоциированных с назальной полостью и бронхами слизистых тканях, которые отличаются от других ассоциированных со слизистыми лимфоидных тканей. Защитные механизмы, активизируемые назальным путем введения могут включать: активацию T-лимфоцитов с преимущественным хомингом в легкие; активацию костимуляторных молекул (например, B7.2) и/или активацию макрофагов или секреторных антител IgA.

Интраназальная доставка антигенов может облегчать активацию ответа антителами в слизистых, который поддерживается сдвигом в T-клеточном ответе в направление фенотипа Th2, способствующего продукции антител. Ответ в слизистых характеризуется увеличенной продукцией IgA, а ответ Th2 характеризуется увеличенной продукцией IL-4.

Интраназальная доставка микобактериальных антигенов по изобретению обеспечивает направление антигенов к подслизистым B-клеткам дыхательной системы. Эти B-клетки являются основными локальными IgA-продуцирующими клетками у млекопитающих и интраназальная доставка способствует быстрому увеличению продукции этими клетками IgA против микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления терапевтический/профилактический состав или лекарственное средство по изобретению стимулирует иммунный ответ в слизистых и/или иммунный ответ Th2. В другом варианте осуществления стимулируется продукция антител IgA, и антитела IgA связываются с микобактериальным антигеном.

В одном из вариантов осуществления первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению предназначены для одновременного введения.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления способы/применения по изобретению включают одновременное введение первого и второго (и необязательных дополнительных) микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления способы/применения по изобретению включают одновременное введение первого и второго (и необязательных дополнительных) антител.

Одновременное введение означает введение (по существу) в одно и то же время. Например, в одном из вариантов осуществления первый и второй (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены вводят индивидууму в пределах 5 минут друг от друга, например, в пределах 4, 3, 2 или 1 минуты друг от друга, например, в пределах 30 секунд друг от друга.

В одном из вариантов осуществления "одновременного введения" в одной композиции (например, одной антигенной композиции или иммуногенной композиции по изобретению, как определено в настоящем описании) комбинируют по меньшей мере два компонента (т.е. антигены или антитела) по изобретению. Эту композицию вводят индивидууму (такому как млекопитающее - например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собаки или кошка), таким образом, вводя индивидууму оба компонента одновременно.

В альтернативном варианте осуществления "одновременного введения" по меньшей мере два компонента (т.е. антигены или антитела) по изобретению предоставлены раздельно друг от друга, но их вводят индивидууму (такому как млекопитающее - например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собаки или кошка) (по существу) в одно и то же время. Совместное/параллельное введение указанных отдельных композиций предоставляет компоненты индивидууму (по существу) в одно и то же время. В качестве примера терапевтический или профилактический состав (например, вакцина) по изобретению может содержать первый микобактериальный антиген или первое антитело в первой композиции, а второй микобактериальный антиген или второе антитело во второй композиции.

В одном из вариантов осуществления первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению предназначены для одновременного введения (по существу) в одном участке. Таким образом, в одном из вариантов осуществления способы/применения по изобретению включают одновременное введение первого и второго (и необязательных дополнительных) микобактериальных антигенов (по существу) в одном участке. В одном из вариантов осуществления способы/применения по изобретению включают одновременное введение первого и второго (и необязательных дополнительных) микобактериальных антител (по существу) в одном участке.

В этом отношении предпочтительным считают введение каждого отличающегося антигенного компонента обычной поливалентной вакцины в различные участки тела индивидуума для стимуляции различных лимфоузлов. Введение различных антигенных компонентов обычной поливалентной вакцины в различные участки также считают предпочтительным для снижения или во избежание нежелательной конкуренции антигенов.

В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предпочтительно избегают необходимости введения каждого из различных антигенных компонентов в различные участки/точки тела индивидуума. В этом отношении, в одном из вариантов осуществления первый и второй (и необязательные дополнительные) антигены по настоящему изобретению (по существу) не конкурируют друг с другом или ассоциированы с относительно низкими уровнями конкуренции антигенов по сравнению с эффектом конкуренции, который можно было бы ожидать, принимая во внимание известные поливалентные вакцинные композиции.

Если в одной композиции (например, в одной антигенной композиции или иммуногенной композиции по изобретению, как определено в настоящем описании) объединены по меньшей мере два компонента (т.е. антигены или антитела) по изобретению, очевидно, что все компоненты по изобретению вводят индивидууму в одном и том же участке.

В одном из вариантов осуществления, если первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению, предоставлены раздельно друг от друга для одновременного параллельного введения индивидууму (по существу) в одно и то же время, раздельные композиции вводят индивидууму в одном и том же (или по существу в одном и том же) участке.

В одном из вариантов осуществления введение индивидууму (по существу) в одном и том же участке означает, что участок, в который вводят каждый микобактериальный антиген или каждое антитело по изобретению, находится в области или в непосредственной близости участка, в который вводят другой микобактериальный антиген или другое антитело по изобретению. Альтернативно введение индивидууму (по существу) в одном и том же участке означает, что участок, в который вводят каждый микобактериальный антиген или каждое антитело по изобретению находится в точно определенном участке, в который вводят другой микобактериальный антиген или другое антитело по изобретению.

В качестве примера первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению могут быть предназначены для введения в ту же вену, артерию или мышцу индивидуума, или в ту же ноздрю индивидуума, или в ту же конечность (например, руку) индивидуума (например, в то же плечо индивидуума); или все первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению могут быть предназначены для перорального или сублингвального введения. В одном из вариантов осуществления все первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению могут быть предназначены для введения в один и тот же лимфоузел или в непосредственной близости от него.

Альтернативно микобактериальные антигены или антитела по изобретению предназначены для введения индивидууму (например, млекопитающему, такому как человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собаки или кошка) последовательно (т.е. один за другим). В этом варианте осуществления по меньшей мере два компонента (т.е. антигены или антитела) по изобретению предоставлены раздельно друг от друга, и их индивидууму вводят последовательно.

В качестве примера терапевтический или профилактический состав (например, вакцина) по изобретению может содержать первый микобактериальный антиген или первое антитело в первой композиции и второй микобактериальный антиген или второе антитело во второй композиции. Последовательное введение указанных первой и второй композиций обеспечивает введение индивидууму компонентов одного за другим.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления способы по изобретению включают введение первого микобактериального антигена, а затем введение второго микобактериального антигена. Альтернативно можно вводить второй микобактериальный антиген, а затем вводить первый микобактериальный антиген. Любые дополнительные микобактериальные антигены можно вводить вместе с первым и/или вторым микобактериальными антигенами. Альтернативно любые дополнительные микобактериальные антигены можно вводить до или после первого и/или второго микобактериальных антигенов.

В одном из вариантов осуществления способы по изобретению включают введение первого микобактериального антитела, а затем введение второго микобактериального антитела. Альтернативно можно вводить второе микобактериальное антитело, а затем первое микобактериальное антитело. Любые дополнительные микобактериальные антитела можно вводить вместе с первым и/или вторым микобактериальными антителами. Альтернативно любые дополнительные микобактериальные антитела можно вводить до или после первого и/или второго микобактериальных антител.

В одном из вариантов осуществления каждое последовательное введение антигена/антитела проводят непосредственно одно за другим. В одном из вариантов осуществления между одним или несколькими (например, между каждыми) введениями существует временной интервал или пауза. Временной интервал или пауза между последовательными введениями может составлять по меньшей мере 5, 10, 15 или 30 минут, или может составлять по меньшей мере 1, 2, 5, 12, 18 или 24 часа, или может составлять по меньшей мере 1, 2 или 5 суток, или может составлять по меньшей мере 1 или 2 недели.

В одном из вариантов осуществления первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению предназначены для последовательного введения (по существу) в одном и том же участке. Таким образом, в одном из вариантов осуществления способы/применения по изобретению включают последовательное введение первого и второго (и необязательных дополнительных) микобактериальных антигенов (по существу) в одном и том же участке. В одном из вариантов осуществления способы/применения по изобретению включают последовательное введение первого и второго (и необязательных дополнительных) микобактериальных антител (по существу) в одном и том же участке.

В одном из вариантов осуществления введение индивидууму (по существу) в одном и том же участке означает, что участок, в который вводят каждый микобактериальный антиген или каждое антитело по изобретению, находится в области или в непосредственной близости участка, в который вводят другой микобактериальный антиген или другое антитело по изобретению. Альтернативно введение индивидууму (по существу) в одном и том же участке означает, что участок, в который вводят каждый микобактериальный антиген или каждое антитело по изобретению, находится в точно определенном участке, в который вводят другой микобактериальный антиген или другое антитело по изобретению.

В качестве примера первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению могут быть предназначены для введения в ту же вену, артерию или мышцу индивидуума, или в ту же ноздрю индивидуума, или в ту же конечность (например, руку) индивидуума (например, в то же плечо индивидуума); или все первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению могут быть предназначены для перорального или сублингвального введения. В одном из вариантов осуществления все первые и вторые (и необязательные дополнительные) микобактериальные антигены или антитела по изобретению могут быть предназначены для введения в один и тот же лимфоузел или в непосредственной близости от него.

Терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцину) по изобретению можно вводить по схеме с однократной дозой (т.е. всю дозу вводят по существу в один момент времени). Альтернативно терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцину) по изобретению можно вводить по схеме с несколькими дозами.

Схема с несколькими дозами представляет собой схему, при которой первичный курс лечения (например, вакцинацию) можно проводить 1-6 отдельными дозами с последующими дополнительными дозами, вводимыми с последующими временными интервалами, необходимыми для поддержания и/или усиления иммунного ответа, например, (для человека), при 1-4 месяцах для второй дозы и, если необходимо, с последующей дозой(ами) еще через 1-4 месяца.

Режим дозирования определяют, по меньшей мере частично, в зависимости от необходимости индивидуума, и она зависит от решения практикующего специалиста (например, врача или ветеринара).

В одном из вариантов осуществления вакцину по настоящему изобретению можно вводить как часть схемы вакцинации "примирование-вторичная иммунизация".

Схемы вакцинации "примирование-вторичная иммунизация" включают: примирование - т.е. воздействие на индивидуума одним или несколькими антигенами или вакциной; а затем: вторичную иммунизацию - т.е. воздействие на индивидуума одним или несколькими антигенами или вакциной. Как правило, "вторичные" антигены/вакцина отличаются от "первичных" антигенов/вакцины (известны как "гетерологичные" примирование-вторичная иммунизация). В этом отношении, показано, что стратегии гетерологичных примирования-вторичной иммунизации индуцируют более высокие уровни клеточного иммунного ответа (например, ответа эффекторными T-клетками) у индивидуумов по сравнению с гомологичной вторичной иммунизацией той же вакциной. Например, повторная вакцинация общепринятыми вакцинами, такими как BCG, по-видимому, дополнительно защиту от TB не увеличивает. Однако включение BCG в схему гетерологичных примирования-вторичной иммунизации может сохранять защитное действие BCG.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу вакцинации против микобактериальной инфекции, включающему "примирование" иммунной системы индивидуума посредством введения гетерологичной общепринятой вакцины (например, вакцины BCG), а затем "вторичную иммунизацию" иммунной системы индивидуума посредством введения вакцин по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу вакцинации против микобактериальной инфекции, включающему введение вакцины по настоящему изобретению индивидууму, которого предварительно подвергали воздействию гетерологичной общепринятой вакцины, такой как BCG.

Альтернативно иммунную систему индивидуума можно "примировать" посредством введения вакцины по настоящему изобретению, а затем "вторично иммунизировать" посредством введения гетерологичной общепринятой вакцины (например, вакцины BCG). Таким образом, в одном из вариантов осуществления вакцину вводят индивидууму, которого затем подвергают воздействию гетерологичной общепринятой вакцины, такой как BCG.

Этап "примирование" можно проводить индивидууму в любом возрасте - в случае млекопитающих (например, человека, коровы, свиньи, овцы, козы, лошади, оленя, собаки или кошки) примирование BCG, как правило, проводят в неонатальном периоде или в раннем детстве, подростковом возрасте или после совершеннолетия. Этап "вторичной иммунизации" можно проводить в любое время после этапа "примирования". В случае млекопитающих (например, человека, коровы, свиньи, овцы, козы, лошади, оленя, собаки или кошки) этап вторичной иммунизации можно проводить по меньшей мере приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель после этапа примирования, или по меньшей мере приблизительно через 3, 6, 8 или 12 месяцев после этапа примирования, или по меньшей мере приблизительно через 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 или более лет после этапа вторичной иммунизации. В одном из вариантов осуществления для человека этап примирования проводят в раннем детстве, а этап вторичной иммунизации проводят в подростковом возрасте.

В одном из вариантов осуществления терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцину) по изобретению можно вводить индивидууму, такому как млекопитающее (например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собаки или кошка) в сочетании (одновременно или последовательно) с одним или несколькими иммунорегулирующими средствами, например, выбранными из иммуноглобулинов, антибиотиков, интерлейкинов (например, IL-2, IL-12) и/или цитокинов (например, IFNγ).

В одном из вариантов осуществления терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцину) по изобретению можно вводить индивидууму, такому как млекопитающее (например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собаки или кошка) в сочетании (одновременно или последовательно) с одним или несколькими противомикробными соединениями, такими как общепринятые противотуберкулезные лекарственные средства (например, рифампицин, изониазид, этамбутол или пиризинамид).

Терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцина) может содержать от 5% до 95% активного ингредиента, например, по меньшей мере 10% или 25% активного ингредиента, или по меньшей мере 40% активного ингредиента, или по меньшей мере 50, 55, 60, 70 или 75% активного ингредиента.

Терапевтический состав, лекарственное средство или профилактический состав (например, вакцину) вводят способом, совместимым с лекарственным составом, и в таком количестве, которое является профилактически и/или терапевтически эффективным.

В этом отношении, В рамках изобретения "эффективное количество" представляет собой дозировку или количество, которых достаточно для достижения желательного биологического результата. В рамках изобретения "терапевтически эффективное количество" представляет собой количество, которое эффективно при введении индивидууму (такому как млекопитающее - например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собака или кошка) одной или нескольких доз для лечения, предотвращения, исцеления, задержки, снижения тяжести по меньшей мере одного симптома нарушения или рецидива нарушения, улучшения состояния при нем или для увеличения продолжительности жизни индивидуума сверх ожидаемого в отсутствие такого лечения.

Таким образом, количество активного ингредиента для введения, которое, как правило, находится в диапазоне от 5 микрограмм до 250 микрограмм антигена на дозу (или более, если доставку производят перорально или в форме вирусных векторов), зависит от индивидуума, подлежащего лечению, емкости иммунной системы индивидуума для генерации защитного иммунного ответа и степени желаемой защиты. Точные требуемые для введения количества активного ингредиента могут зависеть от решения практикующего специалиста и могут быть особыми для каждого индивидуума.

По дополнительному аспекту изобретения первый и второй микобактериальные антигены (и необязательные дополнительные микобактериальные антигены) по изобретению, как описано в настоящем описании, пригодны в иммунологических анализах для детекции наличия в тестируемом образце антител к указанным первому и второму микобактериальным антигенам. В одном из вариантов осуществления указанные первый и второй микобактериальные антигены (и необязательные дополнительные антигены) применяют в форме антигенной композиции, как описано в настоящем описании.

По другому аспекту изобретения первое и второе антитела (и необязательные дополнительные антитела) по изобретению, как описано в настоящем описании, пригодны в иммунологических анализах для детекции присутствия в тестируемом образце указанных первого и второго микобактериальных антигенов. В одном из вариантов осуществления указанные первое и второе антитела (и необязательные дополнительные антитела) применяют в форме содержащих антитела иммуногенных композиций, как описано в настоящем описании.

Тестируемый образец может представлять собой биологический образец, такой как клинический образец или образец из окружающей среды. В рамках изобретения "клинический образец" относится к образцам ткани или жидкости, выделенным у индивидуума, включая в качестве неограничивающих примеров, например, плазму, сыворотку, цереброспинальную жидкость, лимфу, внешние участки кожи, дыхательных, кишечных и мочеполовых путей, слезы, слюну, молоко, кровь клетки, опухоли, органы и также образцы составляющих клеточной культуры in vitro (включая в качестве неограничивающих примеров кондиционированную среду, являющуюся результатом роста клеток в среде для культивирования клеток, предположительно инфицированных клеток, рекомбинантных клеток и компонентов клеток).

В отношении способов диагностики, описанных ниже, "индивидуум" представляет собой любое животное, у которого можно получить положительный эффект при детекции микобактериальной инфекции, такой как инфекция M. tuberculosis. Типичными животными являются млекопитающие, например, человек, корова, свинья, овца, коза, лошадь, ворона, собаки или кошка. В одном из вариантов осуществления индивидуум представляет собой человека, корову, свинью или лошадь.

Конструктивное решение иммунологических анализов является объектом широкого варьирования, и в данной области известно множество форматов. Например, протоколы могут быть основаны на конкуренции, прямой реакции или анализах по типу "сэндвич". Также в протоколах можно использовать, например, твердые подложки или можно использовать иммунопреципитацию. В большинство анализов включено использование меченых антител или полипептидов; метки могут являться, например, ферментативными, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или молекулами красителей. Также известны анализы, включающие амплификацию сигнала; например, анализы, в которых используют биотин и авидин, или иммунологические анализы с ферментной меткой и опосредованные ферментами, такие как анализы ELISA.

В одном из аспектов изобретения первый и второй микобактериальный антигены (или антигенная композиция) по изобретению пригодны для определения присутствия у пациента T-лимфоцитов, которые ранее подвергались действию антигенного компонента микобактериальной инфекции.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу in vitro диагностики микобактериальной инфекции, такой как микобактериальная инфекция на ранней стадии, включающему инкубацию ("стимуляцию") тестируемого образца, содержащего иммунные клетки, такие как T-лимфоциты индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек, корова, свинья или лошадь), с первым микобактериальным антигеном по изобретению и вторым микобактериальным антигеном по изобретению, как определено в настоящем описании; или антигенной композицией по изобретению, как определено в настоящем описании; и определение активации указанных иммунных клеток (например, T-лимфоцитов). Активация указанных иммунных клеток является показателем микобактериальной инфекции у индивидуума.

В одном из вариантов осуществления указанного способа in vitro указанный первый микобактериальный антиген выбран из (i) первого микобактериального антигенного полипептида, содержащего полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или (ii) первой микобактериальной полинуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид. В одном из вариантов осуществления указанного способа in vitro указанный второй микобактериальный антиген выбран из (iii) второго микобактериального антигенного полипептида, содержащего полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; или (iv) второй микобактериальной полинуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид.

Иммунная клетка, такая как T-лимфоцит, которая ранее подвергалась воздействию одного или обоих первого и второго микобактериальных антигенов, при последующей стимуляции тем же антигеном "активируется". Таким образом, активация указанной иммунной клетки (например, T-лимфоцита) является показателем микобактериальной инфекции у индивидуума и предоставляет средство определения положительного диагноза микобактериальной инфекции. В отличие от этого, такой же активации у иммунной клетки (например, T-лимфоцита), которая ранее не подвергалась воздействию конкретного антигена, не происходит.

Описанную выше "активацию" иммунной клетки (например, T-лимфоцита) иногда обозначают как "вторичный ответ", и его можно детектировать, например, определяя высвобождение из активированной иммунной клетки (например, T-лимфоцита) интерферона (например, IFN-γ).

Таким образом, наличие у пациента микобактериальной инфекции можно определять посредством детекции активации иммунных клеток (например, T-лимфоцитов) в ответ на стимуляцию первым и вторым микобактериальными антигенами (или антигенной композицией) по настоящему изобретению in vitro - например, детектируя высвобождение из иммунных клеток (например, T-лимфоцитов) минимальной концентрации интерферона после определенного периода времени после стимуляции.

Описанный выше диагностический анализ иммунных клеток (например, T-лимфоцитов) может дополнительно включать антигенпрезентирующие клетки (APC), экспрессирующие по меньшей мере одну из молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II, экспрессируемых обследуемым пациентом. APC могут присутствовать в биологическом образце изначально, или их можно добавлять извне. В одном из вариантов осуществления T-лимфоцит представляет собой CD4 T-лимфоцит.

Альтернативные иммунологические анализы для диагностики микобактериальной инфекции зависят от детекции антител к первому и второму микобактериальным антигенам (например, полипептидам) по изобретению. Такие анализы могут включать этап инкубации тестируемого образца (например, биологического образца), в котором предполагают наличие антител, с указанными первым и вторым антигенами (или антигенной композицией) по изобретению.

Таким образом, изобретение также относится к способу диагностики микобактериальной инфекции, такой как микобактериальная инфекция на ранней стадии, in vitro, включающему инкубацию тестируемого образца, полученного у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек, корова, свинья или лошадь), с первым микобактериальным антигеном и вторым микобактериальным антигеном по изобретению, как определено в настоящем описании; или антигенной композицией по изобретению, как определено в настоящем описании; где указанную инкубацию проводят в условиях, обеспечивающих связывание указанных первого и второго микобактериальных антигенов с антителами в образце с формированием комплексов антиген-антитело; а затем детекцию формирования таких комплексов. Наличие комплексов антиген-антитело является показателем микобактериальной инфекции у индивидуума.

В одном из вариантов осуществления указанного способа in vitro указанный первый микобактериальный антиген выбран из (i) первого микобактериального антигенного полипептида, содержащего полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; или (ii) первой микобактериальной полинуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид; и указанный второй микобактериальный антиген выбран из (iii) второго микобактериального антигенного полипептида, содержащего полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот; и (iv) второй микобактериальной полинуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид.

Комплексы антиген-антитело (или, в случае конкурентных анализов, количество конкурирующего антитела) можно детектировать любым из множества известных способов в зависимости от формата. Например, немеченые антитела в комплексе можно детектировать с использованием конъюгата Ig против чужеродных антител в комплексе с меткой (например, ферментативной меткой).

Иммунологический анализ может быть стандартного или конкурирующего типа.

В одном из вариантов осуществления для облегчения отделения образца от антигенов после инкубации первый и второй микобактериальные антигены связаны с одной или несколькими твердыми подложками. Примеры твердых подложек, которые можно использовать, представляют собой нитроцеллюлозу (например, в форме мембраны или лунки планшета для микротитрования), поливинилхлорид (например, в виде плат или лунок планшета для микротитрования), полистироловый латекс (например, в виде гранул или планшетов для микротитрования), поливинилидинфторид (известный как Иммулон), диазотированную бумагу, найлоновые мембраны, активированные гранулы и гранулы с белком A. Например, можно использовать планшеты для микротитрования Иммулон из Dynatech или полистироловые гранулы диаметром 60 мм (Precision Plastic Ball). Как правило, твердую подложку(и), содержащую первый и второй микобактериальные антигены, после отделения от тестируемого образца и перед детекцией связанных антител отмывают.

Изобретение также относится к иммунологическим анализам для детекции присутствия в тестируемом образце (например, биологическом образце) первого и второго микобактериальных антигенов (например, полипептидов) по изобретению. В таких способах тестируемый образец, в котором предполагают присутствие указанных микобактериальных антигенов, можно инкубировать с антителами к первому и второму микобактериальным антигенам.

Таким образом, изобретение относится к способу диагностики микобактериальной инфекции, такой как микобактериальная инфекция на ранней стадии, in vitro, включающему инкубацию тестируемого образца, полученного у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек, корова, свинья или лошадь), с первым антителом и вторым антителом по изобретению, как определено в настоящем описании; или иммуногенной композицией по изобретению, как определено в настоящем описании; где указанную инкубацию проводят в условиях, обеспечивающих связывание указанных первого и второго антител с антигенами в образце с формированием комплексов антиген-антитело; а затем детекцию формирования таких комплексов, где присутствие комплексов антиген-антитело является показателем микобактериальной инфекции у индивидуума.

В одном из вариантов осуществления указанного способа in vitro указанное первое антитело связывает первый микобактериальный антигенный полипептид, где указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1 или 7 или их фрагментам, содержащим по меньшей мере 7 их последовательных аминокислот; а указанное второе антитело связывает второй микобактериальный антигенный полипептид, где указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 7 ее последовательных аминокислот.

Перед тестированием может являться желательным обрабатывать биологический образец для высвобождения предполагаемых бактериальных компоненты. Можно использовать различные форматы. Например, можно использовать "сэндвич-анализ", где с тестируемым образцом инкубируют связанные с твердой подложкой антитела; отмывают; инкубируют со вторыми мечеными антителами к первому и второму антигенам и подложку снова отмывают. Первый и второй микобактериальные антигены детектируют, определяя связывание второго антитела с подложкой. В конкурентном формате тестируемый образец, как правило, инкубируют с антителами и метят, также, последовательно или одновременно, инкубируют конкурирующий антиген.

В одном из аспектов изобретение относится к набору для иммунологического анализа, содержащему антигенную композицию по изобретению или антитела к указанным первому и второму микобактериальным антигенам. Набор для иммунологического анализа дополнительно может содержать буфер.

Термин "полипептид" на всем протяжении этого описания является синонимом терминам "олигопептид", "пептид" и "белок". Эти термины используют взаимозаменяемо, и они не относятся к конкретной длине продукта. Эти термины включают посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, ацетилирование и фосфорилирование.

В одном из вариантов осуществления выделенные полипептиды по изобретению по существу не содержат других белков, с которыми они совместно продуцируются, а также других примесей. Например, выделенный полипептид по существу не содержит материала или других белков из клеток, бактерий или тканевого источника, из которого его получали.

В рамках изобретения "очищенная" молекула по существу не содержит ее исходного окружения и в достаточной степени очищена для применения в фармацевтических композициях. В рамках изобретения по существу чистый полипептид относится к полипептиду, который является по меньшей мере приблизительно на 50% (масс./масс.) чистым; или по меньшей мере приблизительно на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% (масс./масс.) чистым; или по меньшей мере приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% (масс./масс.) чистым.

Полипептиды по настоящему изобретению можно очищать от микобактерий или можно очищать от других типов клеток, экспрессирующих эти пептиды (например, так как они трансформированы рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, кодирующими эти пептиды). Экспрессируемый полипептид можно очищать, например, посредством комбинации хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий, ионообменной хроматографии и хроматографии в керамическом гидроксиапатите. Можно использовать другие способы хроматографии, известные в области очистки белков, такие как эксклюзионная хроматография. Чистоту или гомогенность полипептидов можно проверять, например, посредством электрофореза образца белка в полиакриламидном геле с последующей визуализацией одиночной полосы полипептида после окрашивания геля или с применением ВЭЖХ.

Полипептиды по изобретению, как правило, должны быть растворимыми или преимущественно растворимыми (например, по меньшей мере приблизительно растворимыми на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или даже 99%).

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые в значительной степени гомологичны полипептиду по любому из эталонов SEQ ID NO, указанных в этой заявке (включая их фрагменты). Термины "идентичность последовательностей" и "гомология последовательностей" в этом описании считают синонимами.

В качестве примера представляющий интерес полипептид может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотным последовательностям с аминокислотной последовательностью эталонного полипептида.

Для выравнивания двух аминокислотных последовательностей существует множество признанных алгоритмов.

Как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой можно сравнивать тестируемые последовательности. Посредством алгоритма сравнения последовательностей для тестируемой последовательности(ей) рассчитывают процент идентичности последовательностей относительно эталонной последовательности на основе установленных параметров программы. Выравнивание аминокислотных последовательностей для сравнения можно проводить, например, посредством компьютерно-реализованных алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA или TFASTA) или алгоритмов BLAST и BLAST 2.0.

Таблица BLOSUM62, представленная ниже, представляет собой матрицу замены аминокислот, полученную приблизительно из 2000 локальных множественных выравниваний участков белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные области более чем 500 групп родственных белков (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992; включенная в настоящий документ в качестве ссылки). Аминокислоты указаны посредством стандартных однобуквенных кодов. Процент идентичности рассчитывают как:

Таблица BLOSUM62

При сравнении гомологии идентичность можно наблюдать в областях последовательностей, составляющих по меньшей мере 7 аминокислотных остатков в длину (например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или 650 аминокислотных остатков в длину - например, до всей длины эталонной последовательности.

В значительной степени гомологичные полипептиды содержат одно или несколько из замен, делеций или добавлений аминокислот. Во многих вариантах осуществления эти изменения являются незначительными, например, затрагивая только консервативные замены аминокислот. Консервативные замены представляют собой замены, получаемые при замене одной аминокислоты на другую аминокислоту в пределах следующих групп: основные: аргинин, лизин, гистидин; кислые: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота; полярные: глутамин, аспарагин; гидрофобные: лейцин, изолейцин, валин; ароматические: фенилаланин, триптофан, тирозин; малые: глицин, аланин, серин, треонин, метионин. В значительной степени гомологичные полипептиды также включают полипептиды, содержащие другие замены, которые в значительной степени не влияют на фолдинг или активность полипептида; небольшие делеции, как правило, от 1 до приблизительно 30 аминокислот (например, 1-10 или 1-5 аминокислот); и небольшие удлинения на N- или C-концах, такие как N-концевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид приблизительно до 20-25 остатков или аффинная метка.

Полипептиды по настоящему изобретению также могут содержать остатки неприродных аминокислот. В этом отношении в дополнение к 20 стандартным аминокислотам, аминокислотные остатки микобактериальных полипептидов по настоящему изобретению могут замещать нестандартные аминокислоты (такие как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомаслянная кислота, изовалин и α-метилсерин). Аминокислотные остатки микобактериального полипептида может замещать ограниченный ряд неконсервативных аминокислот, аминокислот, не кодируемых генетическим кодом, и неприродных аминокислот. Неприродные аминокислоты в качестве неограничивающих примеров включают транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин.

В данной области известно несколько способов встраивания остатков неприродных аминокислот в полипептиды. Например, можно использовать систему in vitro, где с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК подавляют нонсенс-мутации. Способы синтеза аминокислот и аминоацилированных тРНК известны в данной области. Транскрипция и трансляция плазмид, содержащих нонсенс-мутации, можно проводить в бесклеточной системе, содержащей экстракт S30 E. coli и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Пептиды можно очищать, например, посредством хроматографии. Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus посредством микроинъекции мутантных мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК. В третьем способе клетки E. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, которую необходимо заменить (например, фенилаланина) и в присутствии желаемой неприродной аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Неприродная аминокислота встраивается в полипептид вместо ее природного аналога. Природные аминокислотные остатки можно преобразовывать в неприродные молекулы посредством химической модификации in vitro. Для дальнейшего увеличения диапазона замен химическую модификацию можно комбинировать с сайт-специфическим мутагенезом.

Незаменимые аминокислоты, такие как аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению, можно идентифицировать известными в данной области способами, такими как сайт-специфический мутагенез или мутагенез со сканированием аланином. Также можно определять участки биологического взаимодействия посредством физического анализа структуры, как определяют такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого участка контакта. Наличие незаменимых аминокислот также можно предполагать на основе анализа гомологии с родственными представителями семейства представляющего интерес полипептида.

С применением известных способов мутагенеза и скрининга можно проводить и тестировать множественные замены аминокислот. Известны способы одновременной рандомизации двух или более позиций в полипептиде, отбора функционального полипептида, а затем секвенирования мутантных полипептидов для определения спектра возможных замен в каждом положении. Другие способы, которые можно использовать, включают фаговый дисплей.

Для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, можно проводить общепринятые анализы делеций молекул нуклеиновой кислоты. В качестве иллюстрации молекулы ДНК можно расщеплять нуклеазой Bal31 с получением ряда вложенных делеций. Затем эти фрагменты ДНК вставляют в экспрессирующие векторы в подходящую рамку считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и тестируют на желаемую активность. Альтернативой расщеплению экзонуклеазами является использование для определения продукции желаемого фрагмента сайт-специфического мутагенеза с внесением делеций или стоп-кодонов. Альтернативно конкретные полинуклеотидные фрагменты можно синтезировать с применением полимеразной цепной реакции.

Мутантная форма полипептида по изобретению по сравнению с последовательностью эталонного полипептида может содержать один или несколько аналогов аминокислот (например, неприродную аминокислоту) или замещенную связь. В дополнительном варианте осуществления представляющий интерес полипептид может имитировать эталонный полипептид, где имитация воспроизводит по меньшей мере один эпитоп эталонного полипептида.

Мутантные формы описываемых полинуклеотидных и полипептидных последовательностей по изобретению можно получать посредством перестановки ДНК. В кратком изложении, мутантную ДНК получают посредством гомологичной рекомбинации in vitro посредством случайной фрагментации исходной ДНК с последующей повторной сборкой с применением ПЦР, что приводит к случайно встроенным точечным мутациям. Этот способ можно модифицировать, используя семейство исходных ДНК, для внесения в процесс дополнительной вариабельности. Отбор или скрининг на желаемую активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и анализа обеспечивает быструю "эволюцию" последовательностей вследствие отбора желательных мутаций при одновременном отбрасывании неблагоприятных изменений.

Для детекции активности клонированных мутантных полипептидов описанные выше способы мутагенеза можно комбинировать со способами высокопроизводительного скрининга. Мутагенизированные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению или их фрагменты, можно выделять из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением современного оборудования. Эти способы обеспечивают быстрое определение важности отдельных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде, и их можно применять для полипептидов неизвестной структуры.

"Фрагмент" представляющего интерес полипептида содержит группу последовательных аминокислотных остатков из последовательности указанного полипептида. В качестве примера "фрагмент" представляющего интерес полипептида может содержать (или состоять из) по меньшей мере 7 последовательных аминокислотных остатков из последовательности указанного полипептида (например, по меньшей мере 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 или 675 последовательных аминокислотных остатков указанного полипептида). Фрагмент может содержать по меньшей мере один эпитоп представляющего интерес полипептида.

Представляющий интерес полипептид или его фрагмент могут сохранять активный центр эталонного полипептида.

Представляющий интерес полипептид или его фрагмент могут обладать общей перекрестной антигенной реактивностью и/или по существу одинаковой биологической активностью in vivo с эталонным пептидом. Например, полипептиды или фрагменты полипептидов и эталонные полипептиды обладают общей способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит (например, CD4+, CD8+, эффекторная T-клетка или T-клетка памяти, такая как TEM или TCM), которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции.

В течение последних 10 лет разработаны новые иммунологические анализы для измерения и количественного определения клеточного иммунного ответа (например, T-клеточного ответа). Например, в качестве иммунологического показателя пригоден анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISPOT, так как секреция IFN-γ антиген-специфических T-клеток хорошо коррелирует с защитой от M. tuberculosis. Кроме того, анализ ELISPOT является хорошо воспроизводимым и очень чувствительным способом количественного определения секретирующих IFN-γ антиген-специфических иммунных клеток (например, T-клеток).

Альтернативно, или кроме того, антитело, способное к связыванию с представляющим интерес полипептидом или его фрагментом, также может связывать эталонный пептид.

В рамках изобретения термины "последовательность нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" используют взаимозаменяемо, и они не предполагают никаких ограничений на длину. В рамках изобретения термины "нуклеиновая кислота" и "нуклеотид" используют взаимозаменяемо. Термины "последовательность нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" включают последовательности ДНК (включая кДНК) и РНК.

Полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению включают последовательности нуклеиновой кислоты, выделенные из их природного окружения, выделенные рекомбинантные или клонированные ДНК и химически синтезированные аналоги или аналоги, синтезированные биологически в гетерологичных системах.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получать любыми известными в данной области способами. Например, большие количества полинуклеотидов можно получать посредством репликации в подходящей клетке-хозяине. Природные или синтетические фрагменты ДНК, кодирующей желаемый фрагмент, встраивают в конструкции рекомбинантных нуклеиновых кислот, как правило, конструкции ДНК, способные к введению в прокариотическую или эукариотическую клетку и репликации в ней. Как правило, конструкции ДНК подходят для автономной репликации в одноклеточном хозяине, таком как дрожжи или бактерии, но также могут предназначаться для введения и интеграции в геном культивируемых клеточных линий насекомых, млекопитающих, растений или других эукариот.

Также полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получать химическим синтезом, например, посредством фосфорамидитного способа или тиоэфирного способа, и их можно проводить на коммерческих автоматизированных олигонуклеотидных синтезаторах. Двухцепочечный фрагмент можно получать из одноцепочечного продукта химического синтеза или посредством синтеза комплементарной цепи и отжига цепей в подходящих условиях, или посредством добавления комплементарной цепи с использованием ДНК-полимеразы с последовательностями соответствующих праймеров.

В рамках изобретения термин "рекомбинантный" означает полинуклеотид геномного происхождения, происходящий из кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который в силу своего происхождения и действий с ним: (1) не ассоциирован со всем или частью полинуклеотида, с которым он ассоциирован в природе; или (2) связан с полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, с которым он связан в природе; и (3) не встречается в природе. Эту искусственную комбинацию часто проводят общепринятыми способами химического синтеза или посредством искусственных манипуляций с выделенными участками нуклеиновых кислот - например, посредством общепринятых способов генетической инженерии.

При применении к последовательности нуклеиновой кислоты термин "выделенная" в контексте настоящего изобретения означает, что полинуклеотидную последовательность выделяют из ее природного генетического окружения, и, таким образом, она не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей (но может содержать природные 5'- и 3'-нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы), и находится в форме, пригодной для использования в генетически сконструированных системах продукции белков. Такие выделенные молекулы представляют собой молекулы, отделенные от их природного окружения.

Способы выделения последовательностей нуклеиновой кислоты известны в данной области.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по изобретению, можно получать общепринятыми способами клонирования, такими как ПЦР, или ее можно синтезировать с использованием устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Альтернативным способом получения полноразмерного полинуклеотида является синтез заданного набора перекрывающихся олигонуклеотидов (например, от 40 до 100 нуклеотидов), как описано (например) в Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (1994). Можно добавлять другие последовательности, содержащие сигналы для надлежащей инициации и терминации транскрипции и трансляции.

Ввиду вырожденности генетического кода, в полинуклеотидах по настоящему изобретению возможна значительная вариация последовательности. Ниже приведены вырожденные кодоны, включающие все возможные кодоны для данной аминокислоты:

Специалисту в данной области понятно, что в определение вырожденного кодона внесена некоторая определенность, характерная для всех возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту. Например, некоторые полинуклеотиды, включенные в вырожденную последовательность, могут кодировать варианты аминокислотных последовательностей, но специалист в данной области может легко идентифицировать такие варианты последовательностей, исходя из аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению.

"Вариант" последовательности нуклеиновой кислоты обладает значительной гомологией или значительным сходством с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты (или фрагментом). Последовательность нуклеиновой кислоты или ее фрагмент "по существу гомологична" (или "по существу идентична") с эталонной последовательностью, если при оптимальном выравнивании (с соответствующими вставками или делециями нуклеотидов) с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью), идентичность нуклеотидных последовательностей составляет по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 или 99% нуклеотидных оснований. Определение гомологии проводят, как описано выше для полипептидов.

Альтернативно "вариант" последовательности нуклеиновой кислоты по существу гомологичен (или по существу идентичен) с эталонной последовательностью (или фрагментом), если "вариант" и эталонная последовательность способны к гибридизации в жестких (например, очень жестких) условиях гибридизации. Как легко поймут специалисты в данной области, на гибридизацию последовательностей нуклеиновой кислоты кроме состава оснований, длины комплементарных цепей и количества несоответствий нуклеотидных оснований между гибридизующимися нуклеиновыми кислотами влияют такие условия, как концентрация солей (например, NaCl), температура или органические растворители. Предпочтительно используют жесткие температурные условия, и, как правило, они включают температуры более 30°C, как правило, более 37°C, а предпочтительно более 45°C. Жесткие солевые условия, как правило, составляют менее 1000 мМ, как правило, менее 500 мМ, а предпочтительно менее 200 мМ. Как правило, pH составляет от 7,0 до 8,3. Комбинация параметров намного более важна, чем любой один параметр.

Специалист в данной области понимает, что различные виды демонстрируют "предпочтительное использование кодонов". В рамках изобретения термин "предпочтительное использование кодонов" относится к кодонам, наиболее часто используемых в клетках определенных видов, таким образом, предпочитая один или несколько представителей из возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту. Например, аминокислоту треонин (Thr) могут кодировать ACA, ACC, ACG или ACT, но в клетках-хозяевах млекопитающих наиболее широко используемым кодоном является ACC; у других видов предпочтительными могут быть другие кодоны Thr. Предпочтительные кодоны для клеток-хозяев конкретных видов можно вводить в полинуклеотиды по настоящему изобретению множеством известных в данной области способов. Введение последовательностей предпочтительных кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, увеличить продукцию белка, делая трансляцию белка в конкретном типе клеток более эффективной.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения у последовательности нуклеиновой кислоты кодоны оптимизированы для экспрессии в клетке-хозяине.

"Фрагмент" представляющего интерес полинуклеотида содержит группу последовательных аминокислотных остатков из последовательности указанного полноразмерного полинуклеотида. В качестве примера "фрагмент" представляющего интерес полинуклеотида может содержать (или состоять из) по меньшей мере 21 последовательный остаток нуклеиновой кислоты из последовательности указанного полипептида (например, по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 последовательных остатков нуклеиновой кислоты указанного полинуклеотида). Фрагмент может содержать по меньшей мере одну антигенную детерминанту и/или может кодировать по меньшей мере один антигенный эпитоп соответствующего представляющего интерес полипептида.

Представляющий интерес полинуклеотид или его вариант или фрагмент могут кодировать полипептид с общей перекрестной антигенной реактивностью и/или по существу с одинаковой биологической активностью in vivo с эталонным пептидом.

Например, полипептиды, кодируемые полинуклеотидом (или фрагментом или вариантом) и эталонный полинуклеотид могут обладать общей способностью индуцировать "вторичный ответ" иммунной клетки, такой как T-лимфоцит (например, CD4+, CD8+, эффекторная T-клетка или T-клетка памяти, такая как TEM или TCM), которая ранее подвергалась действию антигенного компонента микобактериальной инфекции.

В течение последних 10 лет разработаны новые иммунологические анализы для измерения и количественного определения клеточного иммунного ответа (например, T-клеточного ответа). Например, в качестве иммунологического показателя пригоден анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISPOT, так как секреция IFN-γ антиген-специфических T-клеток хорошо коррелирует с защитой от M. tuberculosis. Кроме того, анализ ELISPOT является хорошо воспроизводимым и очень чувствительным способом количественного определения секретирующих IFN-γ антиген-специфических иммунных клеток (например, T-клеток).

Альтернативно, или кроме того, антитело, способное к связыванию с полипептидом, кодируемым представляющим интерес полинуклеотидом или его фрагментом или вариантом, также может связываться с полипептидом, кодируемым эталонным полинуклеотидом.

Ключ к SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 1 Регулируемый латентностью пептид Rv0111
SEQ ID NO: 2 Регулируемый латентностью ген Rv0111
(кодирует SEQ ID NO: 1)
SEQ ID NO: 3 Регулируемый латентностью пептид Rv1806
SEQ ID NO: 4 Регулируемый латентностью ген Rv1806
(кодирует SEQ NO: 3)
SEQ ID NO: 5 Регулируемый латентностью пептид Rv0198
SEQ ID NO: 6 Регулируемый латентностью ген Rv1098
(кодирует SEQ ID NO: 5)
SEQ ID NO: 7 Регулируемый латентностью пептид Rv3812
SEQ ID NO: 8 Регулируемый латентностью ген Rv3812
(кодирует SEQ ID NO: 7)
SEQ ID NO: 9 Микобактериальный пептид Ag85A/Rv3804c
SEQ ID NO: 10 Микобактериальный пептид Ag85B/Rv1886c
SEQ ID NO: 11 Микобактериальный пептид ESAT6/Rv3875
SEQ ID NO: 12 Микобактериальный пептид TB10.4/Rv0288
SEQ ID NO: 13 Микобактериальный пептид Rv0125
SEQ ID NO: 14 Микобактериальный пептид PPE18/Rv1196
SEQ ID NO: 15 Микобактериальный пептид P27/Rv1411c
SEQ ID NO: 16 Микобактериальный пептид HSP65/Rv0440
SEQ ID NO: 17 Микобактериальный пептид HBHA/Rv0475
SEQ ID NO: 18 Микобактериальный пептид Rv2659c
SEQ ID NO: 19 Микобактериальный пептид Rv2660c
SEQ ID NO: 20 Микобактериальный пептид HspX/Rv2031c
SEQ ID NO: 21 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Ag85A
SEQ ID NO: 22 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Ag85B
SEQ ID NO: 23 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид ESAT6
SEQ ID NO: 24 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид TB10.4
SEQ ID NO: 25 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv0125
SEQ ID NO: 26 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv1196
SEQ ID NO: 27 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv1411
SEQ ID NO: 28 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид HSP65
SEQ ID NO: 29 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид HBHA
SEQ ID NO: 30 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2659c
SEQ ID NO: 31 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2660c
SEQ ID NO: 32 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид HspX/Rv2031c
SEQ ID NO: 33 Последовательность метки PK
SEQ ID NO: 34 Микобактериальный пептид RPFA/Rv0867c
SEQ ID NO: 35 Микобактериальный пептид RPFB/Rv1009
SEQ ID NO: 36 Микобактериальный пептид RPFC/Rv1884c
SEQ ID NO: 37 Микобактериальный пептид RPFD/Rv2389c
SEQ ID NO: 38 Микобактериальный пептид RPFE/Rv2450c
SEQ ID NO: 39 Микобактериальный пептид Rv1733c
SEQ ID NO: 40 Микобактериальный пептид Rv2029c
SEQ ID NO: 41 Микобактериальный пептид Rv2032
SEQ ID NO: 42 Микобактериальный пептид Rv2626c
SEQ ID NO: 43 Микобактериальный пептид Rv2627c
SEQ ID NO: 44 Микобактериальный пептид Rv2628
SEQ ID NO: 45 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид RPFA/Rv0867c
SEQ ID NO: 46 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид RPFB/Rv1009
SEQ ID NO: 47 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид RPFC/Rv1884c
SEQ ID NO: 48 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид RPFD/Rv2389c
SEQ ID NO: 49 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид RPFE/Rv2450c
SEQ ID NO: 50 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv1733c
SEQ ID NO: 51 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2029c
SEQ ID NO: 52 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2032
SEQ ID NO: 53 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2626c
SEQ ID NO: 54 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2627c
SEQ ID NO: 55 Микобактериальный полинуклеотид, кодирующий пептид Rv2628
SEQ ID NO: 56 Регулируемый латентностью пептид Rv1807
SEQ ID NO: 57 Регулируемый латентностью ген Rv1807 (кодирует SEQ ID NO: 56)

Изобретение дополнительно пояснено в приведенных ниже примерах, которые предназначены исключительно для иллюстрации изобретения и никоим образом не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Субъединичные вакцины, содержащие полипептиды по изобретению

Для получения субъединичных вакцин, содержащих полипептиды, прежде всего необходимо получить запас полипептида для получения вакцины. Этого можно достигать, очищая представляющие интерес белки из культуры TB или клонируя представляющий интерес ген и получая рекомбинантный белок.

Кодирующие последовательности представляющих интерес генов амплифицируют посредством ПЦР со вставленными на N-концах и C-концах участками рестрикции для обеспечения клонирования в рамку считывания в экспрессирующий белок вектор, такой как pET-15b. Гены вставляют под контроль индуцибельного промотора, такого как lacZ. Затем вектор трансформируют в E. coli, которую выращивают в культуре. Рекомбинантный белок сверхэкспрессируют и очищают.

Одним из общих способов очистки является получение рекомбинантного белка с N-концевой меткой для очистки - например, His-меткой. Затем белок можно очищать на основании аффинности His-метки к ионам металлов на Ni-NTA колонке, после чего His-метку отщепляют. Затем очищенный белок вводят животным в подходящем адъюванте.

Когда используют по меньшей мере 2 микобактериальных антигена в комбинации, первый и второй микобактериальный антигены можно экспрессировать в виде отдельных полипептидов и использовать в комбинации, смешивать с адъювантом и вводить в один участок. Альтернативно первый и второй микобактериальные антигены можно экспрессировать в виде слитого белка, смешивать с адъювантом и использовать для инокуляции в один участок.

Пример 2 - использование BCG в качестве микробного носителя

Представляющую интерес полинуклеотидную последовательность амплифицируют посредством ПЦР. Продукт амплификации очищают и клонируют в плазмиду (pMV306), которая сайт-специфически интегрируется в геном микобактерий по участку интеграции (attB) микобактериофага L5.

BCG трансформируют плазмидой посредством электропорации, включающей повреждение клеточной оболочки электрическими импульсами высокого напряжения, что приводит к захвату ДНК. Плазмида интегрируется в хромосому BCG по участку attB, образуя стабильные рекомбинанты. Рекомбинанты отбирают и проверяют посредством ПЦР или саузерн-блоттингом для подтверждения интеграции гена. Затем рекомбинантный штамм используют для изучения защиты.

Представляющая интерес полинуклеотидная последовательность может содержать один микобактериальный антиген, первый и второй микобактериальные антигены или их фрагменты, как определено в настоящем описании.

Пример 3 - Вирусные векторы (например, аттенуированный вирус коровьей оспы), экспрессирующие гены микобактерий

Одним из лучших примеров этого типа подходов является использование модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA). Способы, обеспечивающие рекомбинацию чужеродных генов или генов-мишеней в геном MVA, хорошо известны в данной области [1,2].

Вставка гена(ы)-мишени опосредуется транспортной ДНК с элементами, сходными с элементами, представленными выше. Транспортная ДНК может находиться в форме плазмиды, которую можно размножать в бактериальном штамме, оптимизированном для общепринятых способов клонирования. Ген(ы)-мишень встраивают в кассету ниже промотора, такого как mH5, p7.5 или подобный. Ген(ы)-мишень может содержать один или несколько из полинуклеотидов по изобретению и/или их фрагменты. Ген(ы)-мишень также может содержать вспомогательные кофакторы, такие как B7-1 или IL-12, как хорошо описано в данной области [3]. Ген(ы)-мишень расположены ниже и в рамке считывания с оптимизированной последовательностью Козака - например, GCCACCATGG. Ген(ы)-мишень также можно располагать ниже и в рамке считывания с лидерной последовательностью - например, tPA. Ген(ы)-мишень можно располагать выше расположенной в рамке метки - например, V5, HIS или подобной. Перенос кассеты в геном MVA опосредован гомологичными фланкирующими областями, хорошо известными в данной области - например, Del I-VI.

Пример 4 - вакцины плазмидной ДНК, несущей микобактериальные полинуклеотиды

Представляющую интерес полинуклеотидную последовательность амплифицируют посредством ПЦР, очищают и вставляют в специализированные векторы, разработанные для разработки вакцин, такие как pVAX1. Эти векторы содержат промоторные последовательности (например, промоторы CMV или SV40), которые обеспечивают высокую экспрессию встраиваемого полинуклеотида (кодирующего кандидата в антигены) в эукариотических клетках; и сигналы полиаденилирования (например, SV40 или бычьего гормона роста) для стабилизации транскрипта мРНК.

Вектор трансформируют в E. coli и выбирают трансформанты с использованием маркера, такого как устойчивость к канамицину, кодируемого плазмидой. Затем плазмиду выделяют из трансформированных колоний и секвенируют для проверки присутствия и правильного кодирования без вносимых ПЦР мутаций представляющего интерес полинуклеотида.

Затем в E. coli продуцируют большие количества плазмиды и плазмиду выделяют и очищают с использованием коммерчески доступных наборов (например, Qiagen Endofree-plasmid preparation). Затем вакцину вводят животным (например, посредством внутримышечной инъекции) в присутствии или в отсутствие адъюванта.

Плазмидную ДНК, кодирующую первые микобактериальные антигены или вторые микобактериальные антигены раздельно, можно смешивать и вводить в один участок введения. Можно конструировать одну плазмиду, экспрессирующую и первый, и второй микобактериальные антигены (и необязательно третий микобактериальный антиген).

Пример 5 - вакцины из плазмидной ДНК, несущей несколько микобактериальных полинуклеотидов

Кроме того, можно раздельно получать плазмидные ДНК, кодирующие третий и/или дополнительные (например, четвертый и пятый) микобактериальные антигены, как описано в пример 4. Отдельные плазмиды, кодирующие третий и/или дополнительные микобактериальные антигены, можно вводить в один участок введения одновременно или последовательно с плазмидной ДНК, кодирующей первый и второй микобактериальные антигены (например, как получено в примере 4).

Альтернативно можно конструировать одну плазмиду, как описано в примере 4, которая экспрессирует третий и один или несколько дополнительных (например, четвертый и пятый) микобактериальных антигенов. Эту одну плазмиду можно вводить в один участок введения одновременно или последовательно с плазмидной ДНК, кодирующей первый и второй микобактериальные антигены раздельно или в одной плазмиде. Альтернативно можно конструировать одну плазмиду, как описано в примере 4, которая экспрессирует первый, второй и третий (и необязательно один или несколько дополнительных - например, четвертый и пятый) микобактериальные антигены.

Пример 6 - Получение экспрессирующих векторов ДНК

Вакцины ДНК состоят из представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, клонированной в бактериальную плазмиду. В получении вакцин ДНК широко используют плазмидный вектор pVAX1. Вектор сконструирован для обеспечения высококопийной репликации в E. coli и высокой транзиторной экспрессии представляющего интерес пептида в большинстве клеток млекопитающих (для подробностей см. протокол производителя для pVAX1 (каталожный № V260-20 www.invitrogen.com).

Вектор содержит следующие элементы:

- Предранний промотор цитомегаловируса человека (CMV) для высокоуровневой экспрессии в ряде клеток млекопитающих

- промотор T7/участок связывания праймера для обеспечения транскрипции in vitro в смысловой ориентации и секвенирования через вставку

- сигнал полиаденилирования бычьего гормон роста (BGH) для эффективной терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК

- ген устойчивости к канамицину для отбора в E. coli

- участок множественного клонирования

- точка начала репликации pUC для высококопийной репликации и роста в E. coli

- участок связывания обратного праймера BGH для обеспечения секвенирования через вставку

Векторы можно получать стандартными способами рекомбинации, известными в данной области, например, Sambrook et al. (1989). Ключевыми этапами получения вакцины являются следующие:

- Представляющий интерес полинуклеотид лигируют в pVAX1 в один из участков множественного клонирования.

- Затем смесь после лигирования трансформируют в компетентный штамм E. coli (например, TOP10) и для отбора трансформантов используют планшеты с LB, содержащие 50 мкг/мл канамицина.

- Отбирают клоны, и их можно секвенировать для подтверждения присутствия и ориентации представляющего интерес гена.

- После подтверждения присутствия гена, вектор можно использовать для трансфекции клеточной линии млекопитающего для проверки экспрессии белка. Способы трансфекции известны в данной области и включают, например, электропорацию, фосфат кальция и липофекцию.

- После подтверждения экспрессии полипептида можно получать большие количества вектора и очищать из соответствующей клетки-хозяина, например, E. coli.

pVAX1 не интегрирует в хромосому хозяина. Для минимизации возможности интеграции все не являющиеся незаменимыми последовательности удалены. При конструировании конкретного вектора можно вставлять лидерную последовательность для направления секреции кодируемого белка при экспрессии в эукариотической клетке.

Другие примеры векторов, которые можно использовать, включают V1Jns.tPA и pCMV4.

Можно использовать экспрессирующие векторы, которые интегрируют в геном хозяина, однако более часто и более предпочтительно используют неинтегрирующий вектор.

Интеграция может приводить к получению генетически модифицированного хозяина, что создает другие проблемы.

Пример 7 - Получение экспрессирующих векторов ДНК, содержащих несколько антигенов

Вакцины ДНК состоят из представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, клонированной в бактериальную плазмиду. В получении вакцин ДНК широко используют плазмидный вектор pVAX1. Вектор сконструирован для обеспечения высококопийной репликации в E. coli и высокой транзиторной экспрессии представляющего интерес пептида в большинстве клеток млекопитающих (для подробностей см. протокол производителя для pVAX1 (каталожный № V260-20 www.invitrogen.com).

Вектор содержит следующие элементы:

- Предранний промотор цитомегаловируса человека (CMV) для высокоуровневой экспрессии в ряде клеток млекопитающих

- промотор T7/участок связывания праймера для обеспечения транскрипции in vitro в смысловой ориентации и секвенирования через вставку

- сигнал полиаденилирования бычьего гормон роста (BGH) для эффективной терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК

- ген устойчивости к канамицину для отбора в E. coli

- участок множественного клонирования

- точка начала репликации pUC для высококопийной репликации и роста в E. coli

- участок связывания обратного праймера BGH для обеспечения секвенирования через вставку

Векторы можно получать стандартными способами рекомбинации, известными в данной области, например, Sambrook et al. (1989), cloning Gateway® (Invitrogen, UK). Ключевыми этапами получения вакцины являются следующие:

- Представляющие интерес полинуклеотиды лигируют в pVAX1 в один из участков множественного клонирования или вводят посредством клонирования Gateway®.

- Полинуклеотиды для нескольких антигенов можно экспрессировать в виде рекомбинантного слияния.

- Трансформируют компетентный штамм E. coli (например, TOP10) и для отбора трансформантов используют планшеты с LB, содержащие 50 мкг/мл канамицина.

- Отбирают клоны, и их можно секвенировать для подтверждения присутствия и ориентации представляющего интерес гена.

- После подтверждения присутствия гена, вектор можно использовать для трансфекции клеточной линии млекопитающего для проверки экспрессии белка. Способы трансфекции известны в данной области и включают, например, электропорацию, фосфат кальция и липофекцию.

- После подтверждения экспрессии полипептида можно получать большие количества вектора и очищать из соответствующей клетки-хозяина, например, E. coli.

pVAX1 не интегрирует в хромосому хозяина. Для минимизации возможности интеграции все не являющиеся незаменимыми последовательности удалены. При конструировании конкретного вектора можно вставлять лидерную последовательность для направления секреции кодируемого белка при экспрессии в эукариотической клетке.

Другие примеры векторов, которые можно использовать, включают V1Jns.tPA и pCMV4.

Можно использовать экспрессирующие векторы, которые интегрируют в геном хозяина; однако более часто и более предпочтительно используют неинтегрирующий вектор. Интеграция может приводить к получению генетически модифицированного хозяина, что создает другие проблемы.

Таким образом, можно конструировать одну плазмиду, экспрессирующую несколько микобактериальных антигенов. Например, одна плазмида может кодировать и первый, и второй микобактериальные антигены. Одна плазмида может дополнительно кодировать один или несколько дополнительных микобактериальных антигенов, таких как третий микобактериальный антиген (и необязательно один или несколько дополнительных - например, четвертый и пятый микобактериальные антигены).

Пример 8 - вакцина РНК

РНК можно вводить непосредственно хозяину. Таким образом, можно использовать векторную конструкцию для получения РНК in vitro и затем инъецировать очищенную РНК хозяину. Затем РНК служит в качестве матрицы для трансляции в клетке-хозяине. В этом варианте осуществления интеграция в норме произойти не может.

Альтернативным вариантом является использование возбудителя инфекции, такого как ретровирусный геном, несущий РНК, соответствующую представляющему интерес гену. В этом варианте осуществления интеграция в геном хозяина происходит.

Другим вариантом является использование вакцины из репликонов РНК, которую можно получать из таких вирусных векторов, как вирус Синдбис или вирус леса Семлики. Эти вакцины являются самореплицирующимися и самоограничивающими, и их можно вводить в виде РНК или ДНК, которая затем транскрибируется в репликоны РНК in vivo. Вектор в конечном счете лизирует трансфицированные клетки, таким образом, снижая обеспокоенность об интеграции в геном хозяина.

Пример 9 - Диагностические анализы на основе оценки клеточного иммунного ответа

Для диагностического анализа на основе оценки клеточного иммунного ответа (например, T-клеточного ответа) достаточно получения у пациента образца крови.

Мононуклеарные клетки (моноциты, T- и B-лимфоциты) можно выделять из крови с использованием градиентов плотности, таких как градиенты фиколла.

И моноциты, и B-лимфоциты способны к презентации антигена, хотя и менее эффективно, чем "профессиональные антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как дендритные клетки. Последние более локализованы в лимфоидной ткани.

Простейший подход представляет собой добавление антигена к выделенным мононуклеарным клеткам и инкубацию в течение недели, а затем оценку уровня пролиферации. Если индивидуум ранее подвергался воздействию антигена вследствие инфекции, тогда в образце должны преобладать и должны отвечать клоны иммунных клеток (например, T-клеточные клоны), специфичные к антигену.

Если желательно контролировать отношение T-клеток к APC, также возможно разделять различные популяции клеток.

Другим вариантом анализа этого типа является измерение продукции цитокинов отвечающими лимфоцитами в качестве меры ответа. Подходящим примером этого анализа является анализ ELISPOT.

Пример 10 - детекция латентных микобактерий

Присутствие ассоциированного с латентными микобактериями антигена можно детектировать или посредством детекции в образцах крови антиген-специфических антител, или посредством детекции иммунных клеток, таких как T-клетки.

96-луночный планшет покрывают специфичным к цитокину (например, к интерферону-γ, IL-2) антителом. Затем из цельной крови пациента выделяют моноциты периферической крови и вносят в лунки.

Добавляют антиген для стимуляции специфических иммунных клеток (например, T-клеток), которые могут присутствовать, и планшеты инкубируют в течение 24 часов. Антиген стимулирует продукцию иммунными клетками (например, T-клетками) цитокинов, которые связываются со специфическим антителом.

Планшеты отмывают, оставляя в случае присутствия антиген-специфических иммунных клеток (например, T-клеток) "отпечаток". Затем добавляют второе антитело, связанное с подходящей системой детекции, например, с ферментом, и после добавления подходящего субстрата подсчитывают количество точек. Количество точек, где каждая соответствует одной антиген-специфической иммунной клетке (например, T-клетке), находится в зависимости от исходно добавленного общего количества клеток.

Описанный выше анализ также можно использовать для различения индивидуумов, инфицированных TB, от индивидуумов, инфицированных BCG.

Пример 11 - антигенная активность нескольких антигенов

Мышей иммунизируют по меньшей мере первым и вторым микобактериальным антигеном. Системы доставки включают (но не ограничены) вакцины ДНК, рекомбинантный MVA, белок с адъювантом. Маршруты введения включают (но не ограничены) подкожное, интрадермальное, внутримышечное введение. Режим иммунизации может включать гетерологичные примирование-вторичную иммунизацию - например, "примирование" вакциной ДНК с последующей "вторичной иммунизацией" вакциной MVA. Режим иммунизации может включать несколько доз.

После вакцинации (например, приблизительно через 2 недели) у вакцинированных животных выделяют спленоциты и стимулируют полипептидом(ами), представляющими иммунизирующий антиген или антигены. Иммунный ответ определяют посредством антиген-специфической индукции высвобождения цитокинов - например, IFN-γ, и он является свидетельством иммунизации к антигену-мишени.

Когда животных иммунизируют вакциной, содержащей первый и второй микобактериальные антигены, вторичный ответ на первый и второй микобактериальные антигены в одном и том же образце демонстрирует иммуногенность обоих антигенов при совместном введении. Иммуногенность является необходимым условием для защитной эффективности.

Данные, полученные в этом примере, проиллюстрированы на фигурах 1-6.

Фигура 1A и B иллюстрируют ответ спленоцитов на антигены Ag85A и Rv1807, отдельно и в комбинации (Фиг. 1A = внутримышечно; Фиг. 1B = интрадермально).

Фигура 2 иллюстрирует ответ спленоцитов на антигены Ag85A и Rv0111, отдельно и в комбинации.

Фигура 3 иллюстрирует ответ спленоцитов на антигены Ag85A и Rv0198, отдельно и в комбинации.

Фигура 4 иллюстрирует ответ спленоцитов на антигены Ag85A и Rv1807, отдельно и в комбинации (повтор данных о в/м введении фигуры 1B).

Фигура 5 иллюстрирует ответ спленоцитов на антигены Ag85A и Rv1806, отдельно и в комбинации.

Фигура 6 иллюстрирует ответ спленоцитов на антигены Rv1806, Rv1807, Rv0198 и Rv0111, отдельно и в комбинации.

Пример 12 - демонстрация эффективности вакцины в экспериментальной модели

Эффективность кандидатов в вакцины у морских свинок можно оценивать на основе снижения бактериальной нагрузки M. tuberculosis в легких и/или селезенке на 4 неделе после ингаляторной стимуляции.

Первый и второй микобактериальные антигены доставляют в виде субъединичных вакцин ДНК или белка в индуцирующем Th1 адъюванте, таком как DDA/MPL, или посредством экспрессирующих векторов, таких как рекомбинантные вирусы или BCG (см. примеры 1-4). Первый и второй микобактериальные антигены доставляют таким способом, чтобы примировать иммунную систему, который включает все из указанного выше. Для начального примирования посредством введения ДНК, полипептида или вирусного вектора или (менее часто) рекомбинантной BCG вводят по меньшей мере один "вторичный стимулятор". Группу из морских свинок в количестве от шести до восьми иммунизируют два или три раза с задержкой между каждой иммунизацией от 2 до 3 недель. После последнего введения морским свинкам давали покой в течение 6 недель перед стимуляцией.

Группе животных положительного контроля подкожно вводят 5×104 колониеобразующих единиц (КОЕ) BCG Danish (1331), а группе животных отрицательного контроля вводят физиологический раствор.

Через шесть недель после последней вакцинации непосредственно в нос животным с применением имеющегося устройства Хендерсона вводили тонкодисперсные аэрозоли M. tuberculosis (средний диаметр 2 мкм; получаемые в распылителе Коллисона). Суспензию стимулирующего штамма, M. tuberculosis H37Rv (NCTC 7416), культивируемую в определенных условиях в хемостате, разбавляют до 1×106 КОЕ/мл с получением расчетной хранимой ингалируемой дозы приблизительно 10 КОЕ/легкое.

Через четыре недели после стимуляции аэрозолем животных безболезненно умерщвляют и выделяют легкие для определения КОЕ.

Гомогенизированные образцы серийно разводят и высевают на селективный агар Middlebrook 7H11 и для каждой группы обработки определяют среднее количество КОЕ. Эффективность вакцины оценивают в отношении снижения количества бактерий в легких или селезенке по сравнению с контрольной группой с физиологическим раствором. Средний log10 КОЕ тестируемых вакцин сравнивают c отрицательными контролями и различия между группами статистически анализируют с использованием подходящего критерия, такого как критерий Манна-Уитни.

Любая комбинация первого и второго микобактериальных антигенов, дающая снижение количества жизнеспособных M. tuberculosis, статистически значимо (p=<0,05) ниже ложно вакцинированных (физиологический раствор) контролей, демонстрирует защитную эффективность антигенов при совместном введении.

Защитная эффективность у морских свинок является показателем способности комбинационной вакцины защищать людей и животных от патогенетической микобактериальной инфекции.

Пример 13 - демонстрация эффективности вакцины в экспериментальной модели

Эффективность кандидатов в вакцины у морских свинок можно оценивать на основе снижения бактериальной нагрузки M. tuberculosis в селезенке на 4 неделе после ингаляторной стимуляции.

Первый и второй микобактериальные антигены доставляют в виде субъединичных вакцин ДНК или белка в индуцирующем Th1 адъюванте, таком как DDA/MPL, или посредством экспрессирующих векторов, таких как рекомбинантные вирусы или BCG (см. примеры 1-4). Первый и второй микобактериальные антигены доставляют таким способом, чтобы примировать иммунную систему, который включает все из указанного выше. Для начального примирования посредством введения ДНК, полипептида или вирусного вектора или (менее часто) рекомбинантной BCG вводят по меньшей мере один "вторичный стимулятор". Группу из морских свинок в количестве от шести до восьми иммунизируют два или три раза с задержкой между каждой иммунизацией от 2 до 3 недель. После последнего введения морским свинкам давали покой в течение 6 недель перед стимуляцией.

Группе животных положительного контроля подкожно вводят 5×104 колониеобразующих единиц (КОЕ) BCG Danish (1331), а группе животных отрицательного контроля вводят физиологический раствор или оставляют ее без вакцинации.

Через шесть недель после последней вакцинации непосредственно в нос животным с применением имеющегося устройства Хендерсона вводили тонкодисперсные аэрозоли M. tuberculosis (средний диаметр 2 мкм; получаемые в распылителе Коллисона). Суспензию стимулирующего штамма, M. tuberculosis H37Rv (NCTC 7416), культивируемую в определенных условиях в хемостате, разбавляют до 1×106 КОЕ/мл с получением расчетной хранимой ингалируемой дозы приблизительно 10 КОЕ/легкое.

Через четыре недели после стимуляции аэрозолем животных безболезненно умерщвляют и выделяют селезенку для определения КОЕ.

Гомогенизированные образцы серийно разводят и высевают на селективный агар Middlebrook 7H11 и для каждой группы обработки определяют среднее количество КОЕ. Эффективность вакцины оценивают в отношении снижения количества бактерий в селезенке по сравнению с контрольной группой с физиологическим раствором или без вакцинации. Средний log10 КОЕ тестируемых вакцин сравнивают c отрицательными контролями и различия между группами статистически анализируют с использованием подходящего критерия, такого как критерий Манна-Уитни.

Любая комбинация первого и второго микобактериальных антигенов, дающая снижение количества жизнеспособных M. tuberculosis, статистически значимо (p=<0,05) ниже контролей без вакцинации (с физиологическим раствором), демонстрирует защитную эффективность антигенов при совместном введении.

Защитная эффективность у морских свинок является показателем способности комбинационной вакцины защищать людей и животных от патогенетической микобактериальной инфекции.

Данные, полученные в этом примере, проиллюстрированы на фигуре 7. Фигура 7 иллюстрирует уменьшение бактериальной нагрузки в ответ на каждый из антигенов Rv0111, Rv0198c, Rv3812, Rv1806 и Rv180 отдельно и в ответ на комбинацию антигенов Rv0111 и Rv0198c.

Пример 14 - антигенная активность нескольких антигенов

Мышей иммунизируют по меньшей мере первым и вторым микобактериальными антигенами. Системы доставки включают (но не ограничены) вакцинами ДНК, рекомбинантным MVA или белком с адъювантом. Маршруты введения включают (но не ограничены) подкожное, интрадермальное или внутримышечное введение. Режим иммунизации может включать гетерологичные примирование-вторичную иммунизацию - например, "примирование" вакциной ДНК с последующей "вторичной иммунизацией" вакциной MVA, и/или может включать несколько доз.

После вакцинации (например, приблизительно через 2 недели) у вакцинированных животных выделяют сыворотку и подвергают скринингу на наличие антител. Иммунный ответ определяют посредством детекции антител, специфичных к иммунизирующему антигену - например, как определяют посредством ELISA.

Когда животных иммунизируют вакциной, содержащей первый и второй микобактериальные антигены, наличие в одном и том же образце антител к первому и второму микобактериальным антигенам демонстрирует иммуногенность обоих антигенов при совместном введении. Иммуногенность является необходимым условием для защитной эффективности.

1. Антигенная композиция, способная стимулировать специфичный иммунный ответ против микобактерий, содержащая:
(a) первый микобактериальный антигенный полипептид и второй микобактериальный антигенный полипептид; или
(b) первый микобактериальный полинуклеотид и второй микобактериальный полинуклеотид, включенные в один или более векторов экспрессии или в один или более вирусных векторов, причем
(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1;
(ii) указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;
(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и
(iv) указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

2. Антигенная композиция по п. 1, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

3. Антигенная композиция по п. 1, где указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6.

4. Антигенная композиция по п. 1, причем композиция содержит первый микобактериальный антигенный полипептид и второй микобактериальный антигенный полипептид и дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид, отличный от указанного первого микобактериального антигенного полипептида и указанного второго микобактериального антигенного полипептида.

5. Антигенная композиция по п. 4, где указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 3, 7, 9-20, 34-44 или 56;
где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO: 3, 7, 9-20, 34-44 или 56.

6. Антигенная композиция по п. 1, причем композиция содержит первый микобактериальный полинуклеотид и второй микобактериальный полинуклеотид и дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид, отличный от указанного первого микобактериального полинуклеотида и указанного второго микобактериального полинуклеотида.

7. Антигенная композиция по п. 6, где указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 3, 7, 9-20, 34-44 или 56;
где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO: 3, 7, 9-20, 34-44 или 56.

8. Антигенная композиция по п. 7, где указанный по меньшей мере один дополнительный микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 4, 8, 21-32, 45-55 или 57.

9. Антигенная композиция по п. 1, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид и указанный второй микобактериальный полинуклеотид включены в один и тот же вектор экспрессии или вирусный вектор.

10. Антигенная композиция по п. 1, где указанный первый микобактериальный полинуклеотид и указанный второй микобактериальный полинуклеотид включены в два разных вектора экспрессии или вирусных вектора.

11. Антигенная композиция по п. 1, где указанный вирусный вектор представляет собой аттенуированный вектор вируса коровьей оспы или аденовирусный вектор.

12. Антигенная композиция по п. 1, где указанная антигенная композиция содержит по меньшей мере одну клетку и где указанная клетка содержит указанные первый и второй микобактериальные антигенные полипептиды или указанные первый и второй микобактериальные полинуклеотиды; например, где указанная клетка представляет собой аттенуированный микробный носитель, такой как аттенуированная сальмонелла; аттенуированная М. bovis, такая как штамм BCG; или аттенуированная М. tuberculosis.

13. Способ получения терапевтической или профилактической композиции, включающий комбинацию фармацевтически приемлемого носителя с:
(a) первым микобактериальным антигенным полипептидом и вторым микобактериальным антигенным полипептидом; или
(b) первым микобактериальным полинуклеотидом и вторым микобактериальным полинуклеотидом, включенными в один или более векторов экспрессии или в один или более вирусных векторов, причем
(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1;
(ii) указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;
(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и
(iv) указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид.

14. Способ по п. 13, включающий комбинацию указанного фармацевтически приемлемого носителя с антигенной композицией по п. 1.

15. Способ по п. 13, в котором терапевтическая или профилактическая композиция представляет собой вакцину.

16. Терапевтическая или профилактическая композиция, способная лечить или предотвращать микобактериальные инфекции, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и:
(a) первый микобактериальный антигенный полипептид и второй микобактериальный антигенный полипептид; или
(b) первый микобактериальный полинуклеотид и второй микобактериальный полинуклеотид, включенные в один или более векторов экспрессии или в один или более вирусных векторов, причем
(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1;
(ii) указанный первый микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;
(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и
(iv) указанный второй микобактериальный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный полипептид; и
где указанная композиция предназначена для одновременного или последовательного введения указанных первого и второго микобактериальных антигенных полипептидов или указанных первого и второго микобактериальных полинуклеотидов.

17. Терапевтическая или профилактическая композиция по п. 16, содержащая антигенную композицию по п. 1.

18. Терапевтическая или профилактическая композиция по п. 16, причем композиция представляет собой вакцину.

19. Применение первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена для получения лекарственного средства для стимуляции специфичного иммунного ответа против микобактерий у индивидуума; где
(a) указанный первый микобактериальный антиген представляет собой первый микобактериальный антигенный полипептид, и указанный второй микобактериальный антиген представляет собой второй микобактериальный антигенный полипептид; или
(b) указанный первый микобактериальный антиген представляет собой первый микобактериальный полинуклеотид, и указанный второй микобактериальный антиген представляет собой второй микобактериальный полинуклеотид, причем указанные первый и второй микобактериальные полинуклеотиды включены в один или более векторов экспрессии или в один или более вирусных векторов, причем
(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1;
(ii) указанная первая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;
(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и
(iv) указанная вторая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид.

20. Применение по п. 19, где указанный первый микобактериальный антиген и указанный второй микобактериальный антиген предназначены для введения индивидууму по существу одновременно или последовательно.

21. Применение по п. 19, где указанный первый микобактериальный антиген и указанный второй микобактериальный антиген находятся в форме композиции по п. 16.

22. Применение по п. 19, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения или предотвращения микобактериальной инфекции у указанного индивидуума; например, где указанная микобактериальная инфекция представляет собой инфекцию на ранней стадии.

23. Применение по п. 19, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения или предотвращения инфекции туберкулеза.

24. Способ диагностики микобактериальной инфекции, такой как микобактериальная инфекция на ранней стадии, in vitro, включающий инкубацию тестируемого образца, содержащего иммунные клетки индивидуума, такие как Т-лимфоциты, с:
(a) антигенной композицией по п. 1; или
(b) первым микобактериальным антигенным полипептидом и вторым микобактериальным антигенным полипептидом; или
(c) первым микобактериальным полинуклеотидом и вторым микобактериальным полинуклеотидом, включенными в один или более векторов экспрессии или в один или более вирусных векторов, причем
(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1;
(ii) указанная первая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность,
кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;
(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и
(iv) указанная вторая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид;
и детекцию активации указанных иммунных клеток, где активация указанных иммунных клеток является показателем микобактериальной инфекции у индивидуума.

25. Способ диагностики микобактериальной инфекции, такой как микобактериальная инфекция на ранней стадии, in vitro, включающий инкубацию тестируемого образца, полученного у индивидуума с:
(a) антигенной композицией по п. 1;
(b) первым микобактериальным антигенным полипептидом и вторым микобактериальным антигенным полипептидом; или
(c) первым микобактериальным полинуклеотидом и вторым микобактериальным полинуклеотидом, включенными в один или более векторов экспрессии или в один или более вирусных векторов, причем
(i) указанный первый микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1;
(ii) указанная первая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный первый микобактериальный антигенный полипептид;
(iii) указанный второй микобактериальный антигенный полипептид содержит полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; где полипептидная последовательность обладает общей перекрестной антигенной реактивностью с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и
(iv) указанная вторая микобактериальная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный второй микобактериальный антигенный полипептид; и
где указанную инкубацию проводят в условиях, обеспечивающих связывание указанных первого и второго микобактериальных антигенов с антителами в образце с формированием комплексов антиген-антитело; а затем детекцию формирования таких комплексов, где присутствие комплексов антиген-антитело является показателем микобактериальной инфекции у индивидуума.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для специфической профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота. Для этого проводят иммунизацию крупного рогатого скота с 10-20 суточного возраста специфическим иммуномодулятором КИМ-М2 подкожно в дозе 20 мкг белка на 1 кг массы животного.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и онкохирургии, и может быть использовано для комплексного эндоуретрального лечения и профилактики рецидивов мышечно-неинвазивных форм рака мочевого пузыря.
Настоящее изобретение относится к применению иммунотерапевтического средства, включающего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма Mycobacterium tuberculosis для получения лекарственного средства, предназначенного для первичной профилактики туберкулеза у индивидуумов, подвергшихся воздействию возбудителя инфекции, и у которых не выявлена положительная кожная проба на туберкулин (ТКП).

Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и вакцинологии. Предложена полиэпитопная противотуберкулезная вакцинная конструкция для формирования иммунного ответа, обеспечивающая индукцию иммунного ответа CD8+ Т-лимфоцитов, состоящая из универсального полиэпитопного иммуногена, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов М.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биологической промышленности, в частности к способам получения аллергенов для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих.
Группа изобретений относится к биохимии, в частности к получению аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза.

Изобретение относится к области аллергологии и иммунологии и предназначено для оценки влияния иммунобиологических препаратов на кожную реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения антител к Mycobacterium leprae. Способ включает выявление в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae с помощью иммуноферментного метода.

Настоящее изобретение относится к применению Mycobacterium w для лечения экспрессирующего десмоколлин-3 рака. Mycobacterium w вводят млекопитающим, страдающим экспрессирующими десмоколлин-3 типами рака. Технический результат: введение Mycobacterium w приводит к регулированию опухоли и к статистически достоверному повышению выживаемости, к длительной, более 15 месяцев ремиссии. Mycobacterium w можно также применять по необходимости вместе с другим терапевтическим агентом (терапевтическими агентами) и/или способами воздействия. 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 6 пр.
Наверх