Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе



Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе
Молекула интерферона-β-1а человека, модифицированная полиэтиленгликолем, обладающая противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, с повышенной стабильностью, уменьшенной иммуногенностью, улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами, пригодная для медицинского применения и иммунобиологическое средство на ее основе

 


Владельцы патента RU 2576372:

Закрытое Акционерное Общество "БИОКАД" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению конъюгата ПЭГ и интерферона-β-1a человека, и может быть использовано в медицине. Присоединением линейной молекулы ПЭГ 20-40 кДа к интерферону-β-1a человека получен конъюгат формулы (I):

,

где: n - целые значения от 454 до 909; m - целое число ≥4; IFN -природный или рекомбинантный интерферон-β-1a человека. Конъюгат может быть использован для лечения различных аутоиммунных, вирусных и онкологических заболеваний. По сравнению с природным интерферона-β-1a человека конъюгат формулы (I) обладает большей стабильностью, сниженной иммуногенностью и улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами. 8 н. и 20 з.п. ф-лы, 10 ил., 9 табл., 20 пр.

 

Настоящее изобретение относится к фармацевтике и медицине, а именно к новым биологически активным конъюгатам интерферона-β, в частности к новым конъюгатам интерферона-β-1a с полиэтиленгликолем, которые могут быть использованы в медицине, например, для лечения вирусных, иммунных и онкологических заболеваний.

Интерферон β (ИФН-β) человека является терапевтическим цитокином, нашедшим широкое применение в медицине (Pozzilli et al., 2006). Механизм действия ИФН-β до настоящего времени изучен не полностью, однако известно, что в реализации биологического действия ИФН-β участвуют различные молекулярные механизмы. После взаимодействия ИФН с рецепторами, расположенными на поверхности клеток, происходит передача сигнала и инициируется каскад синтеза более 100 различных внутриклеточных белков (Der et al., 1998), опосредующих противовирусное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действие ИФН-β (Pestka et al., 2004; Bekisz, 2004). Предполагается, что ИФН-β выступает антагонистом по отношению к ИФН-гамма и другим противовоспалительным цитокинам (например, к интерлейкину-1α и к ФНО - фактору некроза опухолей) и способен снижать активность Т-клеток. Противовоспалительные цитокины и активированные Т-клетки являются медиаторами воспаления и деструкции тканей при ряде заболеваний. Широкий спектр биологической активности является основанием для терапевтического использования ИФН в лечении ряда вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваний.

В клинической практике ИФН-β в основном используется для лечения рассеянного склероза (Pozzilli et al., 2006), однако препараты на основе ИФН-β могут быть также использованы при локальном лечении различных опухолей, включая карциномы головы и шеи (Steuer et al., 1992), остроконечные кондиломы (Dinsmore et al., 1998) и злокачественные меланомы (Paul et al., 2003). В качестве противовирусной терапии препараты на основе ИФН-β в ряде случаев используются для лечения вирусного гепатита в виде монотерапии или в комбинации с ИФН-α2 (Montalto et al., 1998; Pellicano et al., 2005)

В настоящее время в клинике используются две формы рекомбинантного ИФН-β: ИФН-β-1a и ИФН-β-1b. ИФН-β-1a получают из клеток млекопитающих, его аминокислотная последовательность (166 аминокислот) и физико-химические свойства идентичны природному ИФН-β человека. ИФН-β-1b получают из клеток Е. coli, он негликозилирован, состоит из 165 аминокислотных остатка (в молекуле отсутствует N-концевой метионин) и содержит одну аминокислотную замену (цистеин в 17 положении заменен на серии). Удельная противовирусная активность in vitro ИФН-β-1b в 10 раз ниже, чем у ИФН-β-1a. Следует отметить, что терапевтическая эффективность препаратов на основе ИФН-β-1a ограничена быстрым всасыванием из подкожных тканей, большим объемом распределения, относительно низкой стабильностью, коротким периодом полувыведения, высокой иммуногенностью и токсичностью. В результате, в течение нескольких часов после введения наблюдается быстрое падение концентрации интерферона в плазме крови, при этом интерферон не определяется в плазме уже через 24 ч после инъекции (Salmon et al., 1996). Для достижения эффективных терапевтических концентраций в плазме крови возникает необходимость частых введений препаратов, что приводит к возникновению дозозависимых побочных эффектов. Терапевтическая эффективность интерферонов может быть повышена при использовании препаратов пролонгированного действия, в частности - «пегилированных» интерферонов. в которых нативная молекула белка химически связана с полиэтиленгликолем (Bailon and Won, 2009; Pasut and Veronese, 2009).

Присоединение молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ) к ИФН приводит к улучшению фармакокинетики, повышению стабильности, увеличению времени полувыведения из крови, снижению колебаний концентрации в крови, увеличению активности in vivo (при снижении активности in vitro); снижению иммуногенности и токсичности (Bailon and Won, 2009; Pasut and Veronese, 2009.

Противовирусная активность и биологические свойства конъюгатов ПЭГ-ИФН в значительной степени зависят также от используемых активированных мПЭГ, функциональные группы которых различаются по способности модифицировать различные аминокислотные остатки белка и по типу образуемых с белком химических связей (Roberts et al., 2002).

Из уровня техники известны различные конъюгаты ПЭГ с ИФН-β, включая ИФН-β-1b и ИФН-β-1a.

Так, в работе Basu et al. (2006) описаны конъюгаты рекомбинантного ИФН-β-1b, полученного из клеток Е. coli, с различными производными мПЭГ, молекулярная масса которых варьировала от 12 до 40 кДа. В зависимости от использованного ПЭГ связывание с молекулой ИФН проходило через доступные свободные аминогруппы или избирательно через α-аминогруппу N-концевой аминокислоты. Противовирусная активность полученных конъюгатов зависела от размера и структуры присоединенного ПЭГ и составляла 1-68% активности от немодифицированного ИФН-β-1b. Исследование фармакокинетики, проведенное на грызунах (мыши и крысы), показало, что общий клиренс для конъюгатов ПЭГ-ИФН-β-1b был значительно меньше, чем у немодифицированного ИФН-β-1b. Время полувыведения конъюгатов ПЭГ-ИФН-β-1b было примерно в 6-9 раз выше, чем у немодицифированного ИФН-β-1b.

В патенте US 8273343 (WO 2010/014874, EA 201170278) также описаны конъюгаты рекомбинантного ИФН-β-1b человека с разветвленным альдегидным производным ПЭГ 40 кДа (2×20 кДа). Связывание ПЭГ с молекулой ИФН-β происходило через N-концевую аминогруппу. Показано, что при внутривенном введении грызунам время полужизни полученного конъюгата ПЭГ-ИФН-β увеличивалось в 10 раз по сравнению с немодифицированным ИФН-β.

В заявке на патент US 2009208454 описаны конъюгаты мутантных рекомбинантных ИФН-β-1b человека, полученных из клеток Е. coli, с различными производными мПЭГ, молекулярная масса которых варьировала от 3,4 до 40 кДа.

Недостатками описанных выше конъюгатов является использование рекомбинантного ИФН-β-1b, полученного из клеток Е. coli и обладающего низкой противовирусной удельной активностью (в 10 раз ниже, чем у природного ИФН-β человека). Добавление ПЭГ приводило к дополнительному снижению противовирусной активности.

В работе Pepinsky et al., 2001 описано получение конъюгата ИФН-β-1a с пропилальдегидным производным мПЭГ с молекулярной массой 20 кДа. Полученный конъюгат очищали от продуктов реакции при помощи двухэтапной хроматографии с использованием эксклюзионной и ионообменной хроматографии. Удельная активность полученного конъюгата была сравнима с активностью немодифицированного ИФН-β-1a. Исследования фармакокинетики в экспериментах на обезьянах показало, что в сравнении с немодифицированным ИФН-β время полувыведения полученного ПЭГ-ИФН-β-1a было увеличено примерно в три раза.

В ряде работ (например, WО 99/55377) описаны конъюгаты ПЭГ-интерферон-β-1a, в котором ПЭГи с молекулярной массой 20-40 кДа, содержащие тиол-активированную группу, ковалентно связывали со свободной SH-группой остатка Cys17 ИФН-β человека.

Прототипом настоящего изобретения является конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a, описанный в патенте EA 9783 (заявка №200400962, дата подачи: 17.01.2003). Для реакции ПЭГилирования использовали различные производные мПЭГ-О-2-пропиональдегида (mPEG-O-2-метилпропиональдегид, mPEG-O-пара-метилфенил-O-2-метилпропион-альдегид, mPEG-O-пара-фенилацетальдегид, mPEG-O-пара-фенил-пропиональдегид, mPEG-O-мета-фенилацетальдегид, mPEG-O-мета-метилфенил-О-2-метилпропион-альдегид) с молекулярной массой 20 кДа. Для очистки полученных конъюгатов использовали два этапа хроматографической очистки с использованием ионообменной и эксклюзионной хроматографии на сорбентах SP-сефароза и супероза 6 HR соответственно. В результате были получены различные очищенные конъюгаты ПЭГ-ИФН-β с чистотой более 95%. Противовирусная удельная активность полученных конъюгатов практически не зависела от структуры присоединенного ПЭГ и составляла 43.8-52% от немодифицированного белка. Данные об иммуномодулирующей и противоопухолевой активности полученных конъюгатов в патенте не раскрыты (приведены только методы, которые могут быть использованы для определения этих активностей). По сравнению с немодифицированным ИФН-β-1a полученные конъюгаты обладали улучшенными фармакокинетическими параметрами. Так, при внутривенном введении грызунам клиренс полученных конъюгатов в сравнении с немодифицированным ИФН-β уменьшался в 20-40 раз. В сравнении с немодифицированным ИФН-β время полуэлиминации (t½) ПЭГилированных конъюгатов при введении грызунам возрастало в 5,2-13 раз.

По описанному в патенте EA 9783 методу был получен конъюгат ИФН-β-1a с mPEG-O-2-метилпропиональдегидом ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа, фармакокинетические и фармакодинамические свойства которого были подробно изучены в работах Baker et al., 2006; Hu et al., 2011. Показано, что при парентеральном (внутримышечном и подкожном) введении обезьянам клиренс полученного ПЭГ-ИФН-β был снижен примерно в 40 раз по сравнению с немодифицированным ИФН-β. Время полувыведения описанного ПЭГ-ИФН-β 1a составляло в среднем 20 часов, что было выше примерно в 3 раза, чем у немодифицированного ИФН-β. Иммуногенность полученного ПЭГ-ИФН-β-1a была сравнима с иммуногенностью немодифицированного ИФН-β-1a.

Дальнейшее улучшение фармакокинетических параметров ИФН-β может быть достигнуто за счет использования активированных ПЭГ различной структуры и присоединения молекулы ПЭГ с большей молекулярной массой.

В связи с вышеизложенным в настоящее время существует необходимость в получении новых конъюгатов интерферона-β, обладающих сниженными нежелательными побочными эффектами и повышенными терапевтическими свойствами.

Задача настоящего изобретения состояла в получении нового стабильного конъюгата ПЭГилированного ИФН-β, обладающего противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностью, с улучшенной стабильностью, со сниженной иммуногенностью, с улучшенными фармакокинетическими параметрами, с оптимальным сочетанием параметров молекулярной массы ПЭГ и противовирусной активности, пригодного для создания лекарственного препарата медицинского назначения, способствующего расширению арсенала лекарственных средств заданной направленности, фармацевтической композиции на основе полученного ПЭГ-ИФН-β.

Поставленная задача решается созданием новой молекулы функционально активного конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, обладающего противовирусной иммуномодулирующей и антипролиферативной активностями, в котором линейная молекула ПЭГ с молекулярной массой 20-40 кДа связана с молекулой ИФН-β-1a стабильной связью строго через α-аминогруппу N-концевого метионина так, что общая формула конъюгата ПЭГ-ИФН-β с линейным мПЭГ представляет собой следующее соединение (I):

где: n - целые значения от 454 до 909;

m - целое число ≥4;

IFN - природный или рекомбинантный полипептид, обладающий активностью ИФН-β-1a.

В полученном конъюгате линейный ПЭГ с молекулярной массой 20-40 кДа связан с α-аминогруппой N-концевой аминокислоты ИФН.

Избирательность модификации ИФН строго по α-аминогруппе N-концевой аминокислоты достигается за счет использования альдегид-активированных мПЭГ общей формулы (II) и проведения реакции ПЭГилирования при pH ≤6:

где: n - целые значения от 454 до 909, так что молекулярная масса ПЭГ составляет примерно 20-40 кДа;

m - целое число ≥4;

Оптимальное соотношение параметров молекулярной массы ПЭГ и противовирусной активности достигается за счет использования активированного мПЭГ (II) со значением m≥4.

Снижение иммуногенности, токсичности и улучшение фармакокинетических параметров достигается за счет увеличения молекулярной массы присоединенного ПЭГ. С учетом того, что молекулярная масса элементарного звена ПЭГ составляет 44 Да, был использован ПЭГ с количеством звеньев от 454 до 909, что соответствует молекулярной массе ПЭГа в конъюгате от 20 до 40 кДа.

Новым по сравнению с прототипом является:

1. Для получения конъюгата ПЭГ-ИФН использованы бутиральдегидные производные активированных мПЭГ (в способе-прототипе использовали mPEG-O-2-метилпропиональдегид);

2. Структурная формула конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a;

3. Увеличение молекулярной массы конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a за счет размера присоединенного ПЭГ;

4. Улучшенные фармакокинетические параметры.

Для получения заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a был использован рекомбинантный ИФН-β-1a человека (производство ЗАО «Биокад») и бутиральдегидные производные мПЭГ формулы (II) с молекулярной массой 20-40 кДа.

Реакцию конъюгирования проводили при pH ниже 6,0 в присутствии восстанавливающего агента при температуре, равной или ниже 20°C. Молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 1,5-5/1. Контроль образования конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС) в восстанавливающих условиях и обратнофазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Очистку моноПЭГ-ИФН от продуктов реакции, немодифицированного ИФН и от нежелательных форм ПЭГ-ИФН, содержащих две и более молекулы ПЭГ на молекулу белка, проводили при помощи одноэтапной хроматографии на катионообменных сорбентах. Элюцию моноПЭГ-ИФН проводили градиентом концентрации хлористого натрия от 0,05 до 0,2 М в буферном растворе с pH ниже 6. Очищенный препарат моноПЭГ-ИФН диализовали против 1-20 мМ буферного раствора с рН 4-5, добавляли соли, или полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпирролидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и неионные детергенты и хранили в пластиковых или стеклянных флаконах с силиконизированной поверхностью при температуре 4-2°C.

Для характеристики полученного конъюгата моноПЭГ-ИФН-β-1a исследовали его чистоту, гомогенность, физико-химические, биологические и фармакокинетические параметры в сравнении с немодифицированным ИФН-β.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурами графического изображения, где представлены:

Фиг.1. Кинетика образования конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при проведении реакции с использованием бутиральдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 30 кДа.

Фиг.2. Хроматограмма конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, полученная с помощью обратнофазной ВЭЖХ на колонке "Symmetry C18" (4,6×150 мм).

Фиг.3. Электрофоретический анализ конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении немодифицированным ИФН-β-1a.

Фиг.4. MALDI Масс-спектры конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a (A) в сравнении с немодифицированным ИФН-β-1a (B) в области m/z 16000-65000.

Фиг.5. Локализация сайта ПЭГилирования в конъюгате ПЭГ-ИФН-β-1a. Сравнение масс-спектров триптических пептидов немодифицированного ИФН-β-1a (A) и конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a (B) в диапазоне m/z 600-2300.

Фиг.6. Динамика изменения концентрации неоптерина в сыворотке после однократного введения конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в различных дозах.

Фиг.7. Термостабильность конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с немодифицированным ИФН-β-1a

Фиг.8. Протеолитическая стабильность конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при обработке трипсином.

Фиг.9. Иммуногенность конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с немодифицированным ИФН-β-1a.

Фиг.10. Фармакокинетика конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с немодифицированным ИФН-β-1a.

Примеры конкретного выполнения способа получения ПЭГ-ИФН-β-1a и исследования его свойств приведены ниже.

Конъюгаты ПЭГ-ИФН-β формулы (I), являющиеся объектом настоящего изобретения, могут быть использованы для получения лекарственных средств для профилактики и/или лечения аутоиммунных заболеваний, в частности рассеянного склероза, онкологических заболеваний (в частности, остроконечных кондилом, меланом и др.) и вирусных заболеваний (вирусные гепатиты), поскольку помимо высокой стабильности и сниженной иммуногенности обладают противовирусной, иммуномодулирующей и антипролиферативной активностью. Также фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента эффективное количество конъюгата формулы (I) и получаемые известными методами, применяемыми в фармацевтике, могут использоваться как отдельно, так и совместно с другими терапевтическими средствами (например, рибавирин) для профилактики и/или лечения вирусных заболеваний (хронический активный гепатит (в частности, гепатиты B и C) (Jay et al., 2006; McHutchison et al., 2009).

Конъюгат формулы (I) с необязательным фармакологически приемлемым наполнителем, носителем, разбавителем и/или фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно или каким-либо другим подходящим способом, например, в виде капсул, сиропа, спрея, капель, инъекции или суппозитория или др. Путь введения варьируют в зависимости, например, от симптомов и возраста, частоту введения и интервал между введениями выбирают в зависимости от заболевания и его тяжести или от цели (терапевтическое или профилактическое применение), при этом эффективное количество активного начала ПЭГ-ИФН-β выбирается с учетом вышеизложенных факторов.

В качестве фармацевтически приемлемых вспомогательных компонентов, которые могут входить в фармацевтическую композицию с ПЭГ-ИФН-β-1a, могут быть использованы: буферные соли (например, ацетатный, цитратный, водород-карбонатный, фосфатный буферы), стабилизаторы (например, полисорбаты, ЭДТА, поливинилпирролидоны, декстраны, ЧСА, эфиры пара-оксибензойной кислоты, спирты (например, бензиловый спирт), фенолы, сорбиновая кислота), обеззараживающий компонент (например, бензиловый спирт), регулятор осмотического давления (например, хлорид натрия, хлорид калия, полиолы, например глицерин, арабитол, сорбитол, маннитол, лактоза, декстран), сурфактанты (например, ЧСА, поливинилпирролидон, лецитин, Твин 80, сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, казеин), поверхностно-активные вещества (например, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, пропиленоксида и этиленоксида, сорбитанмонолаурат, сложный эфир сорбита, сложный эфир жирной кислоты полиглицирина, кокамид DEA лаурилсульфат, алканоламид, стеарит полиоксиэтилен пропилен гликоля, лауриновый эфир полиоксиэтилена, цетиловый эфир полиоксиэтилена, полисорбат, моностеарат глицерина, дистеарат глицерина, монопальмитат сорбита, сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена, сорбитанмонолаурат полиоксиэтилена и моностеарат пропиленгликоля), антиоксиданты (например, Трилон Б, L-цистеин, сульфит натрия, аскорбат натрия, глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотриитол, цистеингидрохлорид моногидрат, аскорбиновая кислота) и разбавители (например, вода).

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a с использованием линейного монометоксибутиральдегид-ПЭГ с молекулярной массой 30 кДа

К 360 мл буферного раствора (10 мМ натрий-ацетата, pH 5,0), содержащего рекомбинантный ИФН-β-1a в концентрации 0,36 мг/мл (131 мг), добавляли 7,2 мл 1 М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 1 г сухого бутиральдегидного производного ПЭГ с молекулярной массой 30 кДа. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 22 часов при температуре 18±3°C. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС. Для этого к отобранной пробе добавляли 1/3 объема буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% ДДС, 0,005% бромфеноловый синий, и нагревали 3 мин на кипящей водяной бане. Пробы в объеме 5 мкл вносили в лунки подготовленных пластин ПААГ и проводили электрофорез в 12,5% ПААГ в присутствии ДДС. По окончании электрофореза гель окрашивали при помощи Кумасси R-250. Кинетика образования конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a представлена на Фиг.1. В момент времени, когда содержание ПЭГ-ИФН составляло более 70%, реакционную смесь разводили в 10 раз апирогенной водой и доводили рН раствора до pH 3,8.

Пример 2

Получение конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a с использованием линейного монометоксибутиральдегид-ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа

К 440 мл буферного раствора (10 мМ натрий-ацетата, pH 5,0), содержащего рекомбинантный ИФН-β-1b в концентрациии 0,66 мг/мл (290 мг), добавляли 0,44 мл 1 М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 1 г сухого бутиральдегидного производного ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 22 часов при температуре 25±3°C. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС, как описано в Примере 1.

Пример 3

Получение конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1b с использованием разветвленного монометоксибутиральдегид ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа

К 30 мл раствора ИФН-β (0,66 мг/мл, всего 20 мг) в 100 мМ NaAc, pH 5.0, добавили 0,6 мл 1 М раствора NaCNBH4 и 50 мг сухого бутиральдегида-ПЭГ - 40 кДа. Реакционную смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 22 часов при температуре 4±2°C. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС, как описано в Примере 1.

Пример 4

Очистка конъюгата моноПЭГ-ИФН-β-1a при помощи ионообменной хроматографии на катионообменном сорбенте

Разбавленный раствор, полученный в Примере 1, наносили на колонку с катиоонообменным сорбентом (СМ-сефароза, 300 мл), уравновешенным 5 мМ натрий ацетатным буфером, pH 3,8, (буфер A) со скоростью 5 мл/мин. Колонку с сорбентом промывали последовательно буфером А, 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 6,8 (буфер A1) и буфером A1, содержащим градиент концентрации NaCl от 0 до 0,2 М. Из каждой фракции отбирали аликвоты для анализа проб методом электрофореза в ПААГ, как описано в Примере 1. Фракции, содержащие моноПЭГилированный конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a, объединяли и проводили концентрирование полученного раствора.

Пример 5

Концентрирование конъюгата моноПЭГ-ИФН-β-1a при помощи ионообменной хроматографии на катионообменном сорбенте

Объединенные фракции, полученные в Примере 4, разбавляли апирогенной водой в 4 раза и проводили коррекцию pH до pH 3,8. Полученный раствор ПЭГ-ИФН-β-1a наносили на колонку с CM Sepharose FF (5 мл), уравновешенную 5 мМ натрий ацетатным буфером, pH 3,8, (буфер A) со скоростью 3,5 мл/мин. После нанесения раствора белка колонку промывали буфером A до базовой линии (10 объемов колонки). Элюцию ПЭГ-ИФН-β-1a проводили буфером 5 мМ ацетата натрия, содержащим 500 мМ хлористого натрия, pH 6,8. Элюат собирали в одну емкость, измеряли объем, оптическую плотность при длинах волны 280 нм и 260 нм, и определяли концентрацию белка. Полученный раствор диализовали против 100 объемов 5 мМ натрий ацетатного буфера, pH 4,2, проводили стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2°C.

Пример 6

Анализ конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при помощи метода обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии

Конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a, полученный согласно Примеру 5, разводили 5 мМ натрий-ацетатным буфером, pH 5,0, до концентрации 0,1 мг/мл и 100 мкл полученной пробы вносили на колонку Symmetry С18 (4.6×150 mm). Исследование проводили на хроматографе «Breeze» фирмы "Waters" при длине волны 214 нм. Из результатов, представленных на Фиг.2, следует, что по данным ОФ ВЭЖХ чистота заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a составляет 100%.

Пример 7

Определение уровня эндотоксинов

Содержание бактериальных эндотоксинов (БЭ) в пробах конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, приготовленных согласно Примеру 5, определяли in vitro с помощью ЛАЛ-теста (модификация гель-тромб тест) в соответствии с требованиями ОФС 42-0002-00. В работе использовали диагностический многокомпонентный набор фирмы «Associates of CAPE COD, Inc.» ЛАЛ-реактив PYROTELL® с чувствительностью 0,03 ЕЭ/мл, контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ, 0,5 мкг во флаконе), воду для ЛАЛ-теста. Из результатов, представленных в табл.1, видно, что содержание БЭ в пробах конъюгата составляет менее 0,7 единиц эндотоксина (еЭ) на мг белка, что гораздо ниже уровня БЭ, допустимого для медицинских препаратов на основе рекомбинантных белков.

Пример 8

Электрофоретический анализ конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с немодифицированным ИФН-β-1a

Пробу конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, полученную согласно Примеру 5, анализировали методом электрофореза в ПААГ, как описано в Примере 1. Электрофорез проводили с нагрузкой на лунку 40 мкг белка в нередуцирующих условиях. Окраску белков в геле проводили красителем Кумасси R-250. Одновременно проводили электрофорез немодифицированного ИФН-β-1a. Конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a был представлен одной полосой (Фиг.3, трек 1). Из электрофореграмм конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a и немодифицированного ИФН-β-1a, представленных на Фиг.3, видно, что конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a имеет значительно более высокую молекулярную массу, чем ИФН-β-1a (Фиг.3, треки 1 и 2). Следует отметить, что методом ЭФ точное значение молекулярной массы для ПЭГилированных белков определить нельзя, так как присоединение гидрофильной молекулы ПЭГ к белку значительно увеличивает радиус Стокса образовавшегося комплекса. В результате продвижение комплекса ПЭГ-белок в геле замедляется и значение его молекулярной массы оказывается значительно выше, чем сумма молекулярных масс белка и ПЭГ.

Пример 9

Определение молекулярной массы конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с немодифицированным ИФН-β-1a методом масс-спектрометрии

Образцы ПЭГ-ИФН-β-1a и немодифицированного ИФН-β-1a сконцентрировали до концентрации 3,7 и 5.0 мг/мл соответственно и отдиализовали против пяти смен воды. Для приготовления матрицы к навеске 2 мг 2,5 дигидроксибензойной кислоты добавили 100 мкл 50% ацетонитрила в 0,1% трифтроуксусной кислоте, проинкубировали в УЗ-бане в течение 5 мин и тщательно перемешали. Раствор матрицы наносили последовательно 2 раза по 0,5 мкл. Раствор анализируемых образцов ПЭГ-ИФН-β-1a и немодифицированного ИФН-β-1a наносили поверх матрицы на 2-3 лунки в 5-6 нанесений по 0,5 мкл на каждую лунку.

Масс-спектры были получены на масс-спектрометре MALDI-TOF-TOF ABSciex 4800 (Канада). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов, в линейном режиме, погрешность измерения средней массы не превышает 10-15 Да. Результаты по масс-спектрометрическому анализу немодифицированного ИФН-β-1a и конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в диапазоне m/z от 16000-65000 приведены на Фиг.4. По данным, представленным на Фиг.4B, видно, что масс-спектр ИФН-β-1a содержит основной пик, соответствующий однозарядному иону [М]+ с молекулярной массой 22,364 кДа. В масс-спектре конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, приведенном на Фиг.4A, имеется размытый основной пик при 52-56 кДа, соответствующий однозарядному иону [М]+ с молекулярной массой 54,130±2 кДа. Размытость пика связана с гетерогенностью препаратов монометоксиПЭГ. Для конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a измеренное значение m/z в максимуме пика (54,130±2,0) кДа совпадает с расчетными данными по сумме молекулярных масс ИФН-β-1a (22,364 кДа) и присоединенного ПЭГ (30 кДа).

Пример 10

Определение локализации сайта ПЭГилирования в молекуле ПЭГ-ИФН-β-1a

Препараты ПЭГ-ИФН-β-1a и немодифицированного ИФН-β-1a разделяли электрофорезом в 12,5% ПААГ, как описано в Примере 1. После окраски геля красителем Кумасси R=-250 из геля вырезали участки, соответствующие анализируемым белкам. Фрагмент геля размером 1 мм3 дважды промывали 100 мкл 40% раствора ацетонитрила в 0,1 М аммония гидрокарбонате в течение 30 мин при 37°C. Фрагмент обесцвеченного геля высушивали на воздухе и добавляли 4 мкл раствора модифицированного трипсина с концентрацией 15 мкг/мл в 0,05 М растворе аммония гидрокарбоната. Гидролиз проводили в течение 18 ч при 37°C, затем к раствору добавляли 8 мкл 0,5% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в 10% растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Раствор над гелем использовали для получения MALDI-масс-спектров триптических пептидов.

Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетно-масс-спектрометре Ultraflex II фирмы «BRUKER» (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов в линейной моде с использованием рефлектрона и в тандемном режиме; точность измеренных средних масс в линейной моде составляла 10-15 Да, точность измеренных моноизотопных масс в рефлекто-моде после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0,005%, точность измеренных масс фрагментов составляла 2 Да.

Локализацию участка присоединения ПЭГ в молекуле модифицированного ПЭГ-ИФН-β-1a определяли путем сравнения масс-спектров триптических пептидов, полученных из ПЭГ-ИФН-β-1a и немодифицированного ИФН-β-1a. В триптическом гидролизате ПЭГ-ИФН-β-1a должен отсутствовать пептид (пептиды), соответствующий участку белка, по которому произошла модификация. На Фиг.5 представлен сравнительный анализ масс-спектров триптических пептидов немодифицированного ИФН-β-1a в сравнении с ПЭГ-ИФН β-1a. В табл.2 представлены результаты идентификации экспериментальных пептидов ПЭГ-ИФН-β-1a и немодифицированного ИФН-β-1a с теоретическими данными для природного белка.

Анализ результатов, представленных в табл.2, показал, что масс-спектры триптических пептидов ПЭГ-ИФН-β-1a соответствуют теоретическим масс-спектрам триптических пептидов из природного ИФН-β человека и практически совпадают с масс-спектрами триптических пептидов ИФН-β-1a, но в триптическом переваре ПЭГ-ИФН-β-1a отсутствует пептиды с m/z 1341.6983 и 1357.6933, присутствующие в триптическом переваре ИФН-β-1a (Фиг.5, табл.2). Согласно анализу теоретических масс триптического гидролизата ИФН-β человека (табл.2), пики с m/z 1341.6983 и 1357.6933 соответствуют N-концевому пептиду (нативный пептид 1-11 и пептид 1-11, содержащий окисленный метионин, соответственно). Отсутствие этих пептидов в триптическом переваре ПЭГ-ИФН-β-1a свидетельствует о модификации N-концевого пептида, который, став тяжелее на массу ПЭГ (30 кДа), должен находиться за пределами исследуемой области спектра.

Для подтверждения первичной структуры положительного однозарядного иона с m/z 1341.730 использовался метод тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Родительский ион (m/z 1341.730) изолировали в ионной ловушке и фрагментировали методом столкновительной диссоциации. Совокупный поиск в базе данных по MC+MC/MC.) с использованием программы BioTools v.3 (Bruker, Германия) показал, что пик положительного однозарядного иона с m/z 1341.730 принадлежит протонированному пептиду ИФН-β-1a человека с первичной структурой MSYNLLGFLQR, соответствующему N-концевому триптическому пептиду 1-11 ИФН-β-1a человека.

Пример 11

Определение специфической противовирусной активности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a

В пробе ПЭГ-ИФН-β-1a, полученной по Примеру 5, исследовали противовирусную специфическую активность согласно протоколу, описанному в Европейской фармакопее с использованием культуры перевиваемых клеток А-549 (клетки карциномы легкого человека), чувствительных к интерферону, и вируса везикулярного стоматита (VSV). В табл.3 представлены результаты исследования противовирусной активности. В качестве стандарта был использован коммерческий препарат «Ребиф» производства компании MERCK SERONO S.p.A. (Италия). Препарат «Ребиф» содержит рекомбинантный человеческий интерферон, полученный методом генной инженерии с использованием культуры клеток яичника китайского хомячка (СНО). Из табл.3 видно, что несмотря на присоединение молекулы ПЭГ с молекулярной массой 30 кДа противовирусная активность полученного конъюгата составит около 30% от активности немодифицированного ИФН-β-1a.

Пример 12

Определение антипролиферативной активности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a

Антипролиферативную активность конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a in vitro определяли на человеческих клетках линии Daudi (лимфома Беркитта). В качестве стандарта был использован коммерческий препарат «Ребиф». В лунки планшета для микротитрования вносили серию разведений, содержащих конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a, полученный по Примеру 5, в концентрации от 0,02 до 2000 пкг/мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Параллельно в лунки вносили немодифицированный ИФН-β-1a в тех же концентрациях. К 90 мкл разведенных образцов добавляли 90 мкл суспензии клеток Daudi в концентрации 1,1×105 кл/мл (конечная концентрация клеток составила 1×104 кл./лунку). Инкубировали клетки с образцами при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 3 суток. Затем добавляли витальный краситель AlamarBlue (10-кратный раствор) и оставляли на ночь в инкубаторе. На следующий день измеряли количество живых пролиферирующих клеток с помощью флуориметра Fluoroskan Ascent FL 2.5. Относительную антипролиферативную активность немодифицированного ИФН-β-1a и конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a согласно изобретению определяли сравнивая дозы, вызывающие 50% снижение пролиферации (IC50).

В табл.4 представлены результаты исследования. Из данных табл.4 видно, что антипролиферативная активность полученного конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a составляет 15-25% от активности немодифицированного ИФН-β-1a.

Пример 13

Определение иммуномодулирующей активности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a in vivo

Чтобы охарактеризовать иммуномодулирующую активность конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, исследовалась его способность стимулировать синтез неоптерина в клетках иммунной системы. Неоптерин является маркером активации клеточного иммунитета (Murr et al., 2002). Индукция синтеза неоптерина в популяции моноцитов/макрофагов и изменение его концентрации в крови является показателем иммуномодулирующей активности исследуемого препарата. Конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a, полученный по Примеру 5, вводили однократно подкожно половозрелым макакам резус (Масаса mulatta) в различных дозах (6, 30 и 60 мкг/кг). Через различные интервалы времени после введения конъюгата проводили определение концентрации неоптерина в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА с использованием коммерческой тест-системы фирмы «IBL», Германия). На Фиг.6 представлены экспериментальные данные, показывающие изменение концентрации неоптерина в сыворотке обезьян в ответ на введение конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a. В зависимости от дозы введенного конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a концентрация неоптерина увеличивалась примерно в 3-5 раз по сравнению с контролем. Из полученных данных следует, что введение препарата вызывало дозозависимое увеличение концентрации неоптерина в сыворотке, обусловленное иммуномодулирующей активностью заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a.

Пример 14

Исследование термостабильности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a 5 мл пробы конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, полученного по Примеру 5, помещали в водяную баню при температуре (50±2)°C, через различные интервалы времени пробы тщательно перемешивали, пробы центрифугировали, супернатант отбирали, анализировали при помощи ОФ ВЭЖХ, как описано в примере 6, и определяли площадь основного пика. Аналогично проводили исследование термостабильности немодифицированного ИФН-β-1a. На Фиг.7 представлены результаты исследования. За период наблюдения (53 час) примерно 70% конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a оставалось в растворе, тогда как немодифицированный ИФН-β-1a в пробах уже не определялся.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о значительном увеличении термостабильности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a по сравнению с немодифицированным белком ИФН-β-1a.

Пример 15

Исследование протеолитической стабильности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при обработке трипсином

К 1 мл конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, полученному по Примеру 5, прибавляли 150 мкл М трис-HCI буфера, pH 8,5, 2 мкл 0,5 М раствора CaCI2 и 15 мкл трипсина (поставщик - фирма «Promega», США) с концентрацией 20 мкг/мл. Пробы инкубировали при 37°C. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты в 100 мкл и прибавляли 150 мкл 0,5% раствора трифторуксусной кислоты для остановки реакции. Аналогично готовили пробы, содержащие немодифицированный ИФН-β-1a. Далее пробы анализировали при помощи обратнофазовой ВЭЖХ как описано в примере 6 и определяли площадь основного пика. Результаты исследования, приведенные на Фиг.8, показывают, что при обработке трипсином протеолитическая стабильность конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a значительно выше, чем у немодифицированного ИФН-β-1a.

Пример 16

Определение стабильности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при хранении

Из пробы, полученной по Примеру 5, отбирали аликвоты в стерильные пробирки с крышками типа "Эппендорф". Концентрация белка в конъюгате ПЭГ-ИФН-β-1a составляла 0,1 мг/мл. Пробы помещали в термостат при температуре (34±2)°C. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и анализировали специфическую противовирусную активность и гомогенность препарата при помощи ОФ ВЭЖХ Из данных, приведенных в табл.4, видно, что при хранении при температуре (34±2)°C конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a стабилен в течение, по крайней мере, 4 недель. Полученные результаты означают, что при температуре (4±2)°C стабильность заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a составит не менее 2 лет (1 неделя хранения при температуре (34±2)°C соответствует хранению при температуре (4±2)°C в течение 6 месяцев).

Пример 17

Исследование иммуногенности конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a

Конъюгат ПЭГ-ИФН-Р-1а, полученный по Примеру 5, вводили подкожно обезьянам макакам резус (Macaca mulatta) 1 раз в 2 недели в дозе 3×106 МЕ/кг в течение 12 недель Параллельно готовили пробу немодифицированного ИФН-β-1a и вводили аналогичным образом обезьянам также в дозе 3×106 МЕ/кг 3 раза в неделю в течение 12 недель. В конце 12 недели у животных отбирали кровь и получали сыворотку крови стандартным методом. Титр антител в сыворотках определяли при помощи прямого твердофазного иммуноферментного метода (ИФА). Для этого в лунки микропланшета вносили по 100 мкл раствора немодифицированного ИФН-β-1a в концентрации 200 нг/100 мкл. Антисыворотки, полученные от разных групп животных, вносили в лунки планшета в серии из последовательных разведений в два раза. Для детекции образовавшегося иммунного комплекса использовали антитела против иммуноглобулинов обезьяны, сконъюгированные с пероксидазой. Через 12 недель после 1 введения немодифицированного ИФН-β-1a титр антисыворотки составлял 1/72. Титр антисывороток после введения конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a составлял 1/25. Результаты исследования представлены на Фиг.9.

Таким образом, из полученных результатов следует, что иммуногенность полученного конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в 3 раз ниже, чем у немодифицированного ИФН-β-1a.

Пример 18

Исследование фармакокинетики конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при однократном подкожном введении обезьянам

Пробу конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a, полученного по Примеру 5, вводили однократно подкожно обезьянам макакам резус (Macaca mulatta) в дозе 1.5 ММЕ/кг. Параллельно другой группе обезьян вводили подкожно немодифицированный ИФН-β-1a в той же дозе. Через определенные промежутки времени у животных отбирали кровь и получали сыворотку стандартным методом. Уровни немодифицированного ИФН-β-1a и ПЭГ-ИФН-β-1a в сыворотке крови оценивали с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием коммерческой тест-системы “VeriKine-HS™ Human IFN-β Serum ELISA kit" производства компании "PBL Interferon Source", США (кат. №41415-1). Результаты фармакокинетики представлены на Фиг.10. Из приведенных результатов следует, что заявляемый конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a обладает значительным пролонгированным эффектом по сравнению с немодифицированным ИФН-β-1a. При введении нативного ИФН-β-1a его содержание в крови животных достигало максимума через 1,5 ч после введения и затем очень быстро снижалось. При введении конъюгата ПЭГ-ИФН-β максимальное содержание ИФН в крови животных наблюдалось через 24-48 ч (Фиг.10), и этот уровень сохранялся в течение 100 ч и только затем происходило медленное снижение содержания ИФН-β в течение 350 ч.

Исходя из полученных результатов (Фиг.10) были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a при однократном подкожном введении обезьянам (табл.6). Из представленных результатов видно, что клиренс (Cl) заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a значительно замедлен по сравнению с немодифицированным ИФН-β-1a; его величина была примерно в 150-200 раз ниже, чем у немодифицированного ИФН-β-1a, что обеспечило длительную циркуляцию заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в крови (более 14 дней). Площадь под кривой (AUC) для заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в 200 раз превышала соответствующее значение для немодифицированного ИФН-β-1a. Время полувыведения заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a было в 8 раз больше, чем у немодифицированного ИФН-β-1a.

Табл. 6 Основные фармакокинетические параметры для заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с немодифицированным ИФН β-1a при однократном подкожном введении. Параметры AUC и Cmax нормировали на дозу.

В табл.8 приведены аналогичные результаты для конъюгата, описанного в прототипе, при подкожном введении обезьянам (Hu et al., 2011, стр.988). Сравнение фармакокинетических параметров (табл.8) показывает, что по сравнению с конъюгатом согласно прототипу, заявляемый конъюгат имеет более низкий клиренс по сравнению с конъюгатом согласно прототипу (1,78±0,55 vs 10,0±2,97, соответственно). Площадь под фармакокинетической кривой (AUC), максимальная концентрация (Cmax), и время полувыведения (Т1/2) заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a значительно выше, чем аналогичные величины для конъюгата согласно прототипу. Так, время полувыведения заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в было в 3 раза больше, чем конъюгатом согласно прототипу (59±15 vs 19.1±4.67, соответственно). При подкожном введении заявляемого конъюгата, площадь под фармакокинетической кривой, нормированная на дозу, была почти в 6 раз выше чем при использовании конъюгата, полученного согласно прототипу (600±191 vs 108±31,7 соответственно).

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об улучшенных фармакокинетических параметрах заявляемого конъюгата в сравнении с аналогичными характеристиками конъюгата, описанными в прототипе.

На основании полученных данных по фармакокинетике и фармакодинамике полученного конъюгата были сделаны рекомендации о возможности введения препарата 1 раз в две-три недели вместо многократного введения немодифицированного ИФН-β-1a (3 раза в неделю)

Пример 19

Сравнительная характеристика заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с конъюгатом ПЭГ-ИФН-β-1a согласно прототипу

Проведено сравнение структуры, основных физико-химических и фармакокинетических параметров заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с конъюгатом ПЭГ-ИФН-β-1a согласно прототипу (табл.9). Представленные данные свидетельствуют об отличиях в структуре и об улучшении фармакокинетических параметров заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с конъюгатом согласно прототипу.

Табл. 9. Основные физико-химические и фармакокинетические параметры заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a в сравнении с конъюгатом ПЭГ-ИФН-β-1a согласно прототипу

* - Данные по фармакокинетическим и фармакодинамическим параметрам конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1а, полученного согласно способу, описанном в прототипе, при однократном подкожном введении обезьянам дана по ссылке Hu et al., (2011).

Пример 20

Примеры фармацевтических композиций на основе заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a

(A)

ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат тригидрат 1-5 мг
Уксусная кислота ледяная до pH 5,0
Натрий хлористый 8-9 мг
Полисорбат 20
ЭДТА
0,01-0,1 мг
0,01-0,1 мг
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(Б)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат тригидрат 1-5 мг
Уксусная кислота ледяная до pH 5,0
Маннитол 50 мг
Полисорбат 20 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1 мг
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(B)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат тригидрат 1-5 мг
Уксусная кислота ледяная до pH 5,0
Маннитол 50 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1 мг
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(Г)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат 0,4-2,0 мг
Уксусная кислота до pH 5,5
Сорбитол 50 мг
Декстран 15-30 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(Д)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат 0,4-2,0 мг
Уксусная кислота до pH 5,5
Маннитол 50 мг
Альбумин 10-12,5 мг
человеческий
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(E)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат 0,4-2,0 мг
Уксусная кислота до pH 5,5
Маннитол 50 мг
Глицин 3-12,5 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(Ж)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат 0,4-2,0 мг
Уксусная кислота до pH 5,5
Маннитол 50 мг
Глютамин 10-12,5 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(З)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат 0,4-2,0 мг
Уксусная кислота до pH 5,5
Маннитол 50 мг
Аспарагин 10-12,5 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл
(И)
ПЭГ-ИФН-β-1a 10-500 мкг
по Примеру 5
Натрий ацетат 0,4-2,0 мг
Уксусная кислота до pH 5,5
Маннитол 50 мг
Метионин 3-10 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
ЭДТА 0,01-0,1
динатриевая соль
Вода для инъекций 1,0 мл

Пример 21

Упаковка в контейнер лекарственного средства, содержащего конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a

Лекарственное средство, включающее эффективное количество заявляемого конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a (Пример 20), разливают в стерильных условиях по 0,5, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 100 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 200 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 300 мкг/мл) в шприцы из нейтрального стекла I гидролитического класса с впаянными иглами, покрытыми защитными эластичными или жесткими колпачками, укупоренные наконечниками на поршни из бутилкаучука, ламинированного фторполимером, или автоинжекторы из полимерного материала.

Пример 22

Упаковка в контейнер лекарственного средства, содержащего конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a

Лекарственное средство, включающее эффективное количество конъюгата ПЭГ-ИФН-β-1a (Пример 20), разливают в стерильных условиях по 0,5, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 100 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 200 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 300 мкг/мл) во флаконы из нейтрального стекла I гидролитического класса, укупоренные фторрезиновыми или бутилрезииовыми пробками с тефлоновым покрытием, обжатыми алюминиевыми колпачками, или автоинжекторы из полимерного материала.

Пример 23

Набор, включающий упакованное в контейнеры лекарственное средство, содержащее конъюгат ПЭГ-ИФН-β-1a

Набор содержит по 1 или 4 шприца в комплекте с поршнем (1 или 4 соответственно) / флакона или автоинжектора в контурной ячейковой упаковке из пленки полимерной вместе с инструкцией по применению, которые помещают в пачку из картона.

ЛИТЕРАТУРА

Bailon P., Won C.Y. (2009), "PEG-modified biopharmaceuticals". Expert Opin Drug Deliv, v.6 (1): 1-16;

Basu A., Yang K., Wang M., Liu S., Chintala R, et al., (2006) "Structure-Function Engineering of Interferon-â-1b for Improving Stability, Solubility, Potency, Immunogenicity, and Pharmacokinetic Properties by Site-Selective Mono-PEGylation", Bioconjugate Chem., 17, 618-630;

Bekisz, J., Schmeisser, H., Hernandez, J., Goldman, N.D., Zoon K.C., (2004), "Human Interferons Alpha, Beta and Omega". Growth Factors, Vol.22 (4), pp.243-251;

Chatelut E., Rostaing L., Gregoire N., Payen J.L., Pujol A., Izopet J., Houin G., Canal P.A. (1999) "Pharmacokinetic model for alpha interferon administered subcutaneously". Br. J. Clin. Pharmacol.; 47:365-371.

Der S.D., Zhou A., Williams B.R.G., Silverman R.H. (1998), "Identification of genes differentially regulated by interferons α, β, or γ using oligonucleotide ar-rays". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:15623-15628;

Dinsmore W., Jordan J., O′Mahony C, Harris J.R., McMillan A., Radcliffe K.W., Engrand P., Jackson B.W., Galazka A.R., Abdul-Ahad A.K., Illingworth J.M (1997) "Recombinant human interferon-beta in the treatment of condylomata acuminate", Int JSTD AIDS. 8(10):622;

Hu X., Miller L., Richman S., Hitchmart S., Glick G., Liu S., Zhu Y., Crossman M., Nestorov I., Gronke R., Baker D., Rogge M., Subramanyam M., Davar G.. (2012) "A Novel PEGylated Interferon Beta-la for Multiple Sclerosis: Safety, Pharmacology, and Biology". The Journal of Clinical Pharmacology, v.52, n6, p.798-808;

Montalto G., Tripi S., Cartabellotta A. et al. (1998) "Intravenous natural beta-interferon in white patients with chronic hepatitis С who are non-responders to alpha-interferon", Am J Gastroenterol., v.93, p.950-953;

Pasut G., Veronese F.M. (2009) PEGylation for improving the effectiveness of therapeutic biomolecules. Drugs Today, (Bare) 2009; 45(9):687-95;

Paul E., Müller I., Renner H., Bödeker R.H., Cochran A.J. (2003), "Treatment of locoregional metastases of malignant melanomas with radiotherapy and intralesional beta-interferon injection", Melanoma Res., (6):611-617;

Pellicano R., Craxi A., Almasio P.L. et al. (2005), " Interferon beta-la alone or in combination with ribavirin: a randomized trial to compare efficacy and safety in chronic hepatitis C". World J Gastroenterol, v.11, p.4484-4489.

Pepinsky R.B., Lepage D.J., GILL A., Chakraborty A., et al., (2001), "Improved Pharmacokinetic Properties of a Polyethylene Glycol-Modified Form of Interferon-b-1 a with Preserved in Vitro Bioactivity", J. Pharm. Exper. Therapeutics, Vol.297, No.3, p.1059-1066;

Pestka, S., Krause, CD., Walter M.R (2004), "Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors", Immunological Reviews, 202:8-32.

Pozzilli C, Prosperini L., Sbardella E., Paolillo A. (2006), "Interferon after 10 years in patients with multiple sclerosis", Neurol Sci., 27:S369-S372

Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. (2002)" Chemistry for peptide and protein PEGylation". Adv Drug Deliv Rev., 54(4):459-76;

Salmon P., Le Cotonnec J.-Y., Galazka A., Abdul-Ahad A., and Darragh A." (1996), "Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Recombinant Human Interferon-β in Healthy Male Volunteers" J. Inreferon and Cytokine Research", V.16, p.759-764;

Steuer M.K., Matthias R., Schulze C., Brusis T. (1992), "Intralesional therapy with natural interferon-beta in refractory squamous epithelial cancers of the ENT area". Laryngorhinootologie, 12:618-625;

1. Стабильный конъюгат ПЭГ и интерферона-β человека формулы (I), представляющий собой один позиционный изомер:

где:
n - целые значения от 454 до 909;
m=4;
NαH-IFN - интерферон-β-1а,
где ПЭГ имеет линейную структуру, а связь между линкером и белком является ковалентной.

2. Конъюгат по п. 1, в котором интерферон-β-1а представляет собой природный или рекомбинантный интерферон-β-1a человека.

3. Конъюгат по п. 1, в котором средняя молекулярная масса ПЭГ составляет от 20 до 40 кДа.

4. Конъюгат по п. 3, где средняя молекулярная масса ПЭГ предпочтительно составляет 30 кДа.

5. Конъюгат по п. 1, в котором N-концевая группа представлена остатком метионина (Met).

6. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью, содержащая конъюгат по п. 1 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6 для применения в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунных, вирусных и онкологических заболеваний и заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, где аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз.

9. Фармацевтическая композиция по п. 7, где вирусное заболевание представляет собой гепатит С или гепатит В.

10. Фармацевтическая композиция по п. 7, где вирусное заболевание представляет собой остроконечные кондиломы.

11. Фармацевтическая композиция по п. 7, где онкологическое заболевание представляет собой меланому.

12. Лекарственное средство, включающее конъюгат по п. 1, обладающее противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью.

13. Лекарственное средство, по п. 12, дополнительно включающее буфер, изотонирующий агент, стабилизатор и воду.

14. Лекарственное средство по п. 12, дополнительно включающее натрия ацетата тригидрат, уксусную кислоту, маннитол, полисорбат 80, ЭДТА, воду для инъекций.

15. Применение конъюгата по п. 1 для получения лекарственного средства, обладающего иммуномодулирующей, противовирусной и антипролиферативной активностью.

16. Применение по п. 15 для получения лекарственного средства, обладающего иммуномодулирующей активностью в отношении рассеянного склероза.

17. Применение по п. 15 для получения лекарственного средства, обладающего противовирусной активностью в отношении гепатита В или гепатита С.

18. Применение по п. 15 для получения лекарственного средства, обладающего противовирусной активностью в отношении остроконечных кондилом.

19. Применение по п. 15 для получения лекарственного средства, обладающего антипролиферативной активностью в отношении меланомы.

20. Способ профилактики или лечения аутоиммунных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата по п. 1.

21. Способ по п. 20, где аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз.

22. Способ профилактики или лечения вирусных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата по п. 1.

23. Способ по п. 22, где вирусное заболевание представляет собой гепатит В или гепатит С.

24. Способ по п. 22, где вирусное заболевание представляет собой остроконечные кондиломы.

25. Способ по п. 22, включающий дополнительное введение терапевтически эффективного количества рибавирина.

26. Способ профилактики или лечения заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата по п. 1.

27. Способ профилактики или лечения онкологических заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата по п. 1.

28. Способ по п. 27, где онкологическое заболевание представляет собой меланому.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению молекулы Фактора VIII с укороченным В-доменом и ковалентно конъюгированной с гидрофильным полимером, имеющей измененное время полужизни в кровотоке, и может быть использовано в медицине для лечения гемофилии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгату варианта эксендина с молекулой ПЭГ, и может быть использовано в медицине. Указанный конъюгат включает эксендин с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 и одну молекулу ПЭГ с молекулярным весом от 21 кДа до 29 кДа, конъюгированную с остатком цистеина в эксендине.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен ПЭГ-модифицированный эксендин или аналог эксендина, содержащий одно или более ПЭГ-производных (варианты).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пептидного производного - миметика ЭПО, имеющего формулу (I): и его фармацевтических солей, где R1, R5 выбраны из циклических пептидов, имеющих последовательности SEQ ID NO:5, 6, 7 и 8; n1, n2 представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10; R2, R4 выбраны из -СО или -CH2; R3 выбран из О, S, CH2, N(CH2)n3NHR6, NCO(CH2)n4NHR6, CHOCONH(CH2)n5NHR6, CHSCON(CH2)n5NHR6 или CHNHCON(CH2)n5NHR6; где n3 представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n4 представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n5 представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R6 выбран из Н или производных метоксиполиэтиленгликоля.

Изобретение относится к области технологий изготовления биологических препаратов и может быть использовано в фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения. .
Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей, применяемых в качестве носителей для контролируемого выделения инсулина.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к области продукции рекомбинантных белков в бактериальных хозяевах. Изобретение дополнительно относится к экстракции растворимого, активного рекомбинантного белка из нерастворимой фракции без применения денатурации и без необходимости в стадии рефолдинга.

Изобретение относится к области генетической инженерии. Предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты для терапии кур или для поддержания, стимуляции или усиления у них иммунного ответа, выбранная из числа молекул, кодирующих лямбда-интерферон (IFN-λ) кур, представленных в SEQ ID NO: 1 или 3, или молекул, представляющих собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 или 4, либо последовательность нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться с SEQ ID No: 1 или 3 в строгих условиях, а также предложены выделенный полипептид, терапевтический способ и применение для терапии кур.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы 1 или 2 или их фармацевтически приемлемым солям, обладающим сродством к CD16а рецептору. Изобретение также относится к модифицированным этими соединениями белкам (конъюгатам), усиливающим и направляющим антителозависимую клеточную цитотоксичность.

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению новых пептидов, и может быть использовано в лечении и профилактике цитокинзависимых нарушений.

Изобретение относится к генной инженерии и может использоваться для лечения вирусных инфекций. .
Изобретение относится к препаративной биохимии, фармакологии, медицине. .

Изобретение относится к медицине . .

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа.
Наверх