Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины



Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины
Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины
Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2576780:

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ГЕН-ТЕХНОЛОГИЯ" (RU)

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины. Предложен набор с лиофилизированными праймерами, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD. Все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации. Изобретение обеспечивает создание набора, эффективного для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины с увеличенным сроком годности, с возможностью транспортировки в дальние регионы без строгого соблюдения температурного режима. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и используется для диагностики резус-фактора плода по крови резус-отрицательной беременной женщины для своевременной профилактики гемолитической болезни плода и новорожденного.

Известен «Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления» по патенту РФ №2296328 от 21.09.2005, опубликовано 27 03.2007, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, включающий выделение ДНК; проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из начального плавления, ряда циклов из плавления, отжига и синтеза и финального синтеза; проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindi I и BstFNI, а также электрофорез в полиакриламидном геле.

Самым близким к заявляемому изобретению по технической сущности является способ определения ДНК гена резус-фактора и диагностический набор для его осуществления, описанный в заявке на изобретение №2010130842 от 23.07.2010 г., опубл. 27.01.2012 г., включающий диагностический набор для определения ДНК гена резус-фактора, включающий компоненты 67 мМ трис-HCl, pH 8,8 при 25°C; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, отличающийся тем, что все компоненты для проведения полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) смешаны в одном объеме, а в набор дополнительно включены ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции вода ампулированная и следующие олигопраймеры:

RHD-7-F: GGGTGTTGTAACCGAGTGCTG

RHD-7-R: CCGGCTCCGACGGTATC

RHD-7-FAM: FAM-CCCACAGCTCCATCATGGGCTACAA-BHQ1

RHD-5-F: CGCCCTCTTCTTGTGGATG

RHD-5-R: GAACACGGCATTCTTCCTTTC

RHD-5-FAM: FAM-TCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCTGCT-BHQ1

GAPDH-F: TGCTCCCACTCCTGATTTCTG

GAPDH-R: TTCTCTAAGTCCCTCCTACAAAAG

GAPDH-F AM: FAM-TTCCCCTCTTCCCACCCGCCCC-BHQ1

Но данные диагностические наборы имеют ограниченный срок годности до 1 года и чувствительны к перепадам температур, поэтому требуют сохранения температурного режима при хранении и транспортировке, что затрудняет транспортировку в дальние регионы. А также поставка в виде стоковых растворов праймеров и Taq-полимеразы требует затрат времени и большого числа манипуляций при подготовке к амплификации, в частности надо произвести подсчет необходимого объема в зависимости от числа образцов, «раскапывание» по реакционным пробиркам. Важным обстоятельством является то, что фетальная ДНК сильно разбавлена и ее количества может не хватить для реакции амплификации, т.о. будет наблюдаться ложноотрицательный результат.

Предлагаемое изобретение направлено на получение следующего технического результата: создание набора для ПЦР-диагностики гена резус-фактора развивающегося плода по крови беременной женщины, обладающего большей чувствительностью и специфичностью, с подготовленными реакционными пробирками к амплификации, с увеличенным сроком годности до 5 лет, с возможностью транспортировки набора в дальние регионы без строгого соблюдения температурного режима, при этом увеличить точность и скорость процесса постановки теста при уменьшении трудозатрат.

Поставленная задача решается за счет того, что набор с лиофилизированными праймерами для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD (3 пробирки на пробу) и гена GAPDH, дополнительно пробирки с положительной контрольной ДНК, с деионизированной водой, с ПЦР-буфером, включающим компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, причем все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин, и финальной сушки при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин. Основной причиной гемолитической болезни новорожденных является иммунологическая несовместимость плода и матери. Несовместимость по резус-фактору составляет до 95% клинически значимых случаев. В качестве профилактики резус-сенсибилизации используют антирезус-иммуноглобулин, что подтверждает свою эффективность в 80% случаев. Однако при беременности резус-отрицательным плодом нет необходимости введения иммуноглобулина, так как этот белковый препарат в данном случае будет бесполезным, небезопасным и затратным в финансовом плане. В связи с этим пренатальное определение резус-фактора не инвазивным методом на ранней стадии беременности (10-12 недель) решает вопрос своевременной профилактики у резус-отрицательных беременных при положительном резус-факторе плода и исключает ненужные процедуры при резус-отрицательной принадлежности плода. Основа анализа - ПЦР-реакция с флуоресцентной спектрометрией (Real-time) с помощью праймеров и праймеров-зондов. Праймеры и праймеры-зонды доводят до необходимой концентрации и ставят реакцию для проверки работоспособности и контроля контаминации на ДНК Jurkat и деионизированной воде. При ожидаемом результате стоковые растворы праймеров и праймеров-зондов аликвотируются в реакционные пробирки. Для сохранения работоспособности микрообъема праймера используется лиофилизация, что позволяет не зависеть от перепада температур при транспортировке и хранении, а также увеличить срок годности набора с одного года до пяти лет. А содержание дополнительного объема праймера для постановки ПЦР-реакции на определение гена RHD (3 пробирки, вместо стандартных 2) увеличивает чувствительность метода. Все смеси праймеров в необходимых пропорциях добавлены в амплификационные пробирки, совместимые с используемым амплификатором, что уменьшает время постановки и риск контаминации за счет уменьшения числа манипуляций, т.е. увеличивается точность и уменьшаются трудозатраты. Лиофилизация смеси праймеров и праймеров-зондов проводится в лиофильной сушке ALPHA 1-4 LSC №102041. Праймеры в необходимых концентрациях подготовлены к реакции, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин. Финальная сушка - при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин. Процесс лиофилизации позволяет сохранить стабильность праймера, транспортировать и хранить набор без строгого соблюдения температурного режима, также позволяет увеличить срок годности набора с одного года до 5 лет. Все смеси праймеров и праймеров-зондов в необходимых концентрациях подготовлены для реакции и добавлены в реакционные пробирки, сводя процесс подготовки образцов к амплификации к одному действию, а именно добавлению раствора ДНК, что позволяет ускорить процедуру подготовки образцов к амплификации. По результатам исследований дополнительная амплификационная пробирка, используемая в предлагаемом наборе, позволяет увеличить чувствительность с 97,2% до 98,4%, а специфичность с 94,4% до 95,2% соответственно.

При определении гена резус-фактора сотрудник лаборатории после выделения ДНК при постановке амплификации использует тонкостенные оптически-прозрачные пробирки, совместимые с используемым амплификатором, в которых уже находится необходимый объем праймера, добавляет ПЦР-смесь в пробирку с выделенной ДНК и уже из нее аликвотирует по 20 мкл раствора в подготовленные пробирки, затем запускает программу амплификации. Определение гена резус-фактора проводится с помощью полимеразно-цепной реакции следующим образом: начальное плавление 5 мин при температуре 95°С, далее проводят цикл 60 раз, включающий плавление при 94°С в течение 15 с, отжиг и синтез при температуре 60°С в течение 1 мин, во время отжига проводят детекцию с помощью флуоресцентной спектрометрии. Регистрируется накопление специфического продукта амплификации путем изменения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой в режиме «реального времени». По каналу, соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ДНК гена RHD и гена GAPDH. В предлагаемом техническом решении используется дополнительная реакционная пробирка, т.е. для каждого образца проводится амплификация гена GAPDH, как контроль выделения ДНК, 7 экзона гена RHD и две пробирки для 5 экзона гена RHD, а смеси праймеров и праймеров-зондов для каждого экзона гена RHD и гена GAPDH, содержащиеся в амплификационных пробирках, лиофилизированны.

Проверка работоспособности проводилась на образцах крови 80 пациенток, срок беременности 27-35 недель. При рождении ребенка резус-фактор был определен серологическим методом. По результатам исследований набор и способ может использоваться для диагностики со следующими аналитическими характеристиками: чувствительность 98,4%, специфичность 95,2%.

Набор с лиофилизированными праймерами для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD (3 пробирки на пробу) и гена GAPDH, дополнительно пробирки с положительной контрольной ДНК, с деионизированной водой, с ПЦР-буфером, включающим компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, причем все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин, и финальной сушки при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области онкологии и касается комплекса, включающего сочетания полиинозинполицитидиловой кислоты (pIC) и полиэтиленимина (PEI), и его применения в качестве средства для лечения рака, в частности меланомы.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу неинвазивной диагностики развития тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ) у пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС).
Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии. Изобретение представляет cпособ диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза у больных с хронической ишемической болезнью сердца, включающий анализ образца для определения содержания интерлейкин-10-продуцирующих T-лимфоцитов, отличающийся тем, что из периферической венозной крови выделяют мононуклеарную фракцию клеток с последующей активацией клеток в культуре, фенотипированием лимфоцитов с использованием моноклональных антител к CD4 и интерлейкину-10 (ИЛ-10), меченных флуоресцентными метками, и цитофлуориметрией в потоке, при этом содержание ИЛ-10-продуцирующих T-лимфоцитов (CD4+ИЛ-10+ клеток), выраженное в процентном (%) отношении от CD4+ лимфоцитов, менее 3,5% свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ мониторинга экспрессии представляющего интерес гена полипептида CADM1, Rb, ZMYND10, RASSF5, PTEN, SERPINB5, EPB41L3 или DAPK1 для определения терапевтического эффекта соединения при лечении заболевания, связанного с экспрессией указанного представляющего интерес гена полипептида.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики возможности заражения новорожденных вирусными гепатитами В и С у беременных женщин, больных этой инфекцией или носителей вирусов.
Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу культивирования одиночной В-клетки, которая получена из популяции В-клеток экспериментального животного.
Изобретение касается способа выявления пациента с риском развития расстройства щитовидной железы в результате лечения в режиме, который истощает лимфоциты. Способ включает определение до лечения наличия антител, направленных против пероксидазы щитовидной железы или микросом щитовидной железы, у пациента.

Изобретение относится к медицинской технике. Портативный медицинский прибор для измерения уровня глюкозы в крови содержит корпус с кассетоприемником, помещаемую в кассетоприемник сменную кассету с тест-лентой и привод, включающий в себя электрический двигатель и передаточный механизм, предназначенный для поворачивания катушки кассеты с тест-лентой таким образом, чтобы тест-лента кассеты наматывалась на катушку с возможностью последовательного использования расположенных на тест-ленте тест-элементов.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики хронического гастродуоденита у детей. Определяют уровень катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в кале методом иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии и к спортивной медицине, и может применяться для индивидуализированного определения биологических резервов адаптации организма к физической нагрузке.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения кукурузного растения с улучшенной оптимизаций водопотребления и растение, полученное таким способом.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ мониторинга экспрессии представляющего интерес гена полипептида CADM1, Rb, ZMYND10, RASSF5, PTEN, SERPINB5, EPB41L3 или DAPK1 для определения терапевтического эффекта соединения при лечении заболевания, связанного с экспрессией указанного представляющего интерес гена полипептида.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу выявления РНК вируса бешенства и набору, который используется в данном способе. Способ включает проведение ОТ-ПЦР с олигонуклеотидными праймерами.

Настоящее изобретение относится к фосфодиэстеразе 4D7 (PDE4D7) для применения в качестве маркера для агрессивного гормон-чувствительного рака предстательной железы, где экспрессия маркера повышена при сравнении экспрессии в ткани агрессивного гормон-чувствительного рака предстательной железы с экспрессией в нормальной ткани или ткани доброкачественной опухоли предстательной железы, и к применению PDE4D7 в качестве диагностического маркера для агрессивного гормон-чувствительного рака предстательной железы.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен способ молекулярно-генетического внутривидового типирования Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и риска развития побочных эффектов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности володушки многожильчатой (Bupleurum multinerve DC.), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК.

Биомаркер // 2573925
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к маркерам рака, и может быть использовано в медицине. Выявление белка Engrailed-2 (EN2) или кодирующей его нуклеиновой кислоты в образце тканей мочевого пузыря или мочи от пациента может быть использовано в диагностике рака мочевого пузыря или для идентификации пациента, имеющего риск развития рака мочевого пузыря, а также для мониторинга прогрессирования рака мочевого пузыря у пациента или мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению натрийуретического пептида C-типа (CNP), и может быть использовано в медицине. Получают пептид структуры PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37), который используют для лечения дегенеративных костных патологий, отвечающих на CNP.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности растения сои, включающего арилоксиалканоатдиоксигеназу (AAD-12) с SEQ ID NO: 1, где указанное растение содержит трансгенную конструкцию, включающую ген AAD-12, состоящий из остатков 2731-9121 SEQ ID NO: 1, и указанная трансгенная конструкция фланкирована 5′-фланкирующей геномной ДНК сои и 3′-фланкирующей геномной ДНК сои, где указанная 5′-фланкирующая геномная ДНК содержит остатки 1-2730 SEQ ID NO: 1, указанная 3′-фланкирующая геномная ДНК содержит остатки 9122-10212 SEQ ID NO: 1, а также к комплекту для его выполнения.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу поиска белков-мишеней, запускающих процесс канцерогенеза, в образцах тканей индивидуального пациента, для последующей противоопухолевой фармакотерапии. Определяют методом секвенирования транскриптомные данные об уровнях экспрессии генов в образцах. Получают набор активированных генно-регуляторных сетей, состоящих из центрального гена регулятора и регулируемых им генов. Определяют из транскриптомных данных дифференциально экспрессированные гены. Определяют методами секвенирования изменения в последовательностях ДНК, представленных в виде набора однонуклеотидных полиморфизмов в образцах. Определяют среди найденных генетических вариантов гены-драйверы. Проводят поиск канонических сигнальных путей, значимо обогащенных ранее найденными центральными генами регуляторами экспрессии, дифференциально экспрессированными генами, генами с идентифицированными однонуклеотидными полиморфизмами и инделами, генами-драйверами. Проводят поиск методом перебора в составе идентифицированных сигнальных путей существующих белков-мишеней для лекарственных препаратов, предназначенных для противоопухолевой терапии. Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью найти белки-мишени, запускающие процесс канцерогенеза, в образцах тканей индивидуального пациента. 1 ил., 5 табл.
Наверх