Способ определения степени энергизации т-лимфоцита



Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита
Способ определения степени энергизации т-лимфоцита

 


Владельцы патента RU 2577118:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет информационных технологий, радиотехники и электроники" (МИРЭА) (RU)

Изобретение относится медицине и может быть использовано для определения степени энергизации Т-лимфоцита. Для этого проводят исследование отдельных лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии. При котором из суспензии мононуклеаров крови пациента выделяют пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде топограммы, представляющей собой двумерное распределение фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки в виде зон оптической плотности для вычисления значимых параметров, при этом в качестве значимых параметров используют границы зон в фазовом изображении одиночной клетки, которые соответствуют границам органелл и каждая из которых ограничивает участок в фазовом изображении одиночной клетки, толщина которого отличается от толщины смежно расположенного участка или участков, для построения характеристических прямых и интегральной функции по зависимости толщины участков в границах зон от фазового объема этих зон. Степень энергизации Т-лимфоцита одиночной клетки определяют путем сравнения величины параметра, полученного отношением тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся в области ретикулума клетки, с нормой и крайними значениями параметра степени энергизации клетки. Изобретение обеспечивает увеличение информативности изображений клетки путем введения новых параметров. Один из таких параметров, имеющих высокий диагностический потенциал, может быть связан с состоянием ретикулума и рефрактерностью митохондрий, где происходит синтез молекулы АТФ, которая является единственным и универсальным источником энергии для процессов в клетках. 12 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения in vitro степени энергизации Т-лимфоцита.

Новые методы микроскопии (конфокальной, флуоресцентной, нелинейной, интерференционной, комбинационной и др.) позволяют получить в функциональных изображениях значительно большую информацию о морфологии клетки. Однако их общим недостатком является большое время анализа, трудоемкость и большой расход материалов. Кроме того, эти методы дают ограниченную информацию о параметрах органелл клетки в изображении окрашенной клетки.

Известно, что интерференционные или фазовые изображения обладают рядом необычных свойств. На экране монитора они представлены в виде двумерного распределения оптической разности хода лучей, нормированного на длину волны света. Это свойство фазовых изображений позволяет сравнивать морфологические параметры, полученные в различных условиях и приборах на неокрашенных клетках и использовать их в медицине, например, для иммунной диагностики и исследования механизма действия препаратов на эритроциты и другие клетки.

В работе Yonng Keun Park, выполненной в лаборатории G. Popescu, MIT, США и опубликованной в PNAS, в 2008 году, приведены результаты измерений рефрактерности и флуктуаций мембраны отдельных эритроцитов. Эритроциты были выделены из крови пациента, инфицированного паразитом Plasmodium falciparum. Измерения на оригинальном дифракционном фазовом микроскопе показали корреляцию между средним по объему показателем преломления (или рефрактерностью) эритроцита и температурой пациента на различных стадиях лихорадки. Для вычисления показателя преломления здоровых доноров и больных использовались абсолютные значения фазовой толщины. В качестве дополнительных параметров приведены значения концентрации гемоглобина. Благоприятным обстоятельством являлась их оптическая однородность и отсутствие ядер. Поэтому средние по объему значения показателя преломления, приведенные в указанной выше и во многих других работах, не могут быть использованы в качестве единственного значимого параметра морфологии, характеризующего состояние отдельного мононуклеара.

Ближе к заявляемому изобретению является способ оценки влияния глюкокортикостероидов на моноциты периферической крови по изменению их морфометрических показателей методом компьютерной фазово-интерференционной микроскопии (Терпигорев С.А., Ильченко В.А., Василенко И.А. и др. «Соотношение результатов лечения глюкокортикостероидами с их влиянием на моноциты in vitro при бронхиальной астме» Бюл. Эксп. биол. и мед., 2003, Т. 135-6, стр. 683-687). Этот способ основан на определении изменений морфометрических показателей моноцитов (диаметра, периметра, высоты, площади, объема) после их инкубации с преднизолоном в концентрации 10-7 и 10-4 ммоль/л в течение 60 минут при комнатной температуре. При снижении показателей (диаметра, периметра и площади) клеток на 10% и более по сравнению с контролем (с необработанными клетками) прогнозируется эффективность глюкокортикостероидной терапии.

Недостатком этого способа является ограниченная достоверность анализа, связанная с использованием в качестве критерия эффективности терапии фиксированного уровня (10% и более) снижения значимых параметров, большое время измерений и тестирования одного типа препаратов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является, описанный в RU 2382364, и опубликованный 20.02.2010, способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами, включающими исследование методом фазово-интерференционной микроскопии моноцитов периферической крови, определение морфометрических параметров клеток и анализ полученных результатов. Отличительной чертой способа является активация моноцитов больного в течение 15 минут излучением гелий-неонового лазера. В качестве критерия эффективности лечения используется оптическая толщина ядер.

Этот способ прогнозирования методом фазово-интерференционной микроскопии эффективности лечения глюкокортикостероидами, включает в себя исследование in vitro моноцитов периферической крови, обработанных преднизолоном, определение морфометрических параметров моноцитов, анализ полученных результатов, при этом перед обработкой преднизолоном моноциты активируют в течение 10-20 мин гелий-неоновым лазером при мощности (0,5-1,0)103 Вт/см2, регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, затем обрабатывают преднизолоном и повторно регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, и при увеличении этого показателя на 30% и более прогнозируют эффективность лечения глюкокортикостероидами.

Основным недостатком этого способа, который ограничивает возможность его более широкого применения, является использование в качестве активирующего фактора излучения гелий-неонового лазера без указания дозировки. В качестве значимого параметра используется фазовая толщина, в которую дают вклад кроме ядра также другие органеллы.

Заявляемое изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении точности определения состояния Т-лимфоцита, на снижение вероятности нежелательных побочных эффектов и на сокращение времени исследования и стоимости диагноза.

Указанный результат достигается тем, что способ определения степени энергизации Т-лимфоцита, заключающийся в построении фазового изображения (топограммы) Т-лимфоцита, вычислении значимых параметров и анализе полученных результатов, при этом вычисленные значимые параметры используют для построения характеристических прямых и интегральной функции, затем вычисляют отношение тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, - причем участки характеристических прямых должны определяться соответственно ядру и хондриому, после чего результат вычисления сравнивают с табличными значениями степени энергизации клетки.

Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Настоящее изобретение поясняется конкретным примером исполнения, который, однако, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

На фиг. 1 - схематически показано строение клетки;

фиг. 2 - топограмма - проекция лимфоцита и его органелл: цитоплазмы, разветвленной митохондрии (хондриома), ядра и ядрышка в виде двумерного распределения фазовой толщины. В окружающей лимфоцит среде обозначены окружностями различных диаметров внешняя (d0) и границы (d1) других органелл.

фиг. 3 - схематически показаны площадь S(hi) и фазовый объем W(hi) в сечении 3-мерного изображения h(x,y) горизонтальной плоскостью hi=const. Максимальное значение фазовой толщины hmax. Наибольшие значения W(hi) и S(h) соответствуют hi=0.

фиг. 4 - условное деление на окружности - зоны;

фиг. 5 - профили фазовой толщины h(x) и h(y) в ортогональных сечениях топограммы h(x,y). Диаметры di и фазовые толщины hi (i=0-4) соответствуют предполагаемому положению границ «зон»;

фиг. 6 - s-гистограмма и график функции S(h), на которых обозначены значения фазовой толщины, площади и диаметров, которые отождествлялись с указанными границами «зон»: s-гистограмма отображает зависимость s(h) площади пикселей от фазовой толщины и является статистической характеристики фазового изображения h(x,y). Показаны значения площади Si на границах «зон» (hi).

фиг. 7 - различие в профилях рефрактерности ΔnA-D(r) вдоль радиусов, отличающихся поворотом на 90°, объясняется асимметрией структурных элементов клетки. Максимумы на участке (r2-r3≈2,8-2 мкм) в профилях рефрактерности ΔnA-D(r) связаны с пространственной неоднородностью хондриома. Сравнительно плоские части профиля с рефрактерностью Δn34≈0.03 в интервале радиусов r3-r4≈2-1.25 мкм соответствует ядру, а более высокие значения (Δn45≈0.05-0,06) в ближней к центру зоне (r≤1.25 мкм) - ядрышку;

фиг. 8 - w-гистограмма отображает зависимость плотности фазового объема w(h) клетки от фазовой толщины. Малые (w≈0,01 мкм3/нм) плотности при h≤135 нм соответствуют малой рефрактерности цитоплазмы. Значения Wi обозначают фазовый объем на границах (hi) «зон»;

фиг. 9 - топограмма лимфоцита в норме. Показаны различные зоны клетки 01, 12, 2, 23, 3. Зона 2 (между 12 и 23) соответствует хондриому клетки, а зона 3 - ядру клетки.

фиг. 10 - демонстрация метода - показаны тангенсы углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся между точками 12, 23 в области 2 и участком интегральной функции фазового объема в области 3, прилегающим к точке 23. Отношение тангенсов углов является параметром, характеризующим степень энергизации клетки;

фиг. 11 - из сравнения профилей фазовой толщины видно изменение формы, отсутствие характерных «плеч» и снижение толщины при ФГА-активации лимфоцита;

фиг. 12 - функции фазового объема Т-лимфоцита в состоянии деэнергизация (3), покоя (2) и повышенной активности (1).

Согласно настоящего изобретения рассматривается новый способ определения степени энергизации Т-лимфоцита, который заключается в исследовании отдельных лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии. Согласно этого метода из суспензии мононуклеаров крови пациента выделяют пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде топограммы, представляющей собой двумерное распределение фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки в виде зон оптической плотности для вычисления значимых параметров.

Новый способ использует в качестве значимых параметров границы зон в фазовом изображении одиночной клетки, которые соответствуют границам органелл и каждая из которых ограничивает участок в фазовом изображении одиночной клетки, толщина которого отличается от толщины смежно расположенного участка или участков, для построения характеристических прямых и интегральной функции по зависимости толщины участков в границах зонах от фазового объема этих зон. При таком подходе степень энергизации Т-лимфоцита одиночной клетки определяется путем сравнения величины параметра, полученного отношением тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, определенным соответственно ядру и хондриому, с табличными значениями параметров степени энергизации клетки.

Показанные на фиг. 5-12 изменения оптических параметров объясняются влиянием происходящих в клетке процессов и внешних факторов на физические параметры ее органелл. Поэтому изменения морфологии, регистрируемые методами оптической микроскопии, традиционно используются в биофизике клетки и для in vitro диагностики в медицине. Мы предлагаем новый метод определения функционального состояния отдельной клетки, основанный на уникальных свойствах фазовых изображений. В фазовом изображении клетки, полученном на интерференционном микроскопе, применение оригинальных алгоритмов позволяет получить набор значимых биофизических параметров. Эти параметры (фазовая толщина, площади и поперечные размеры органелл, фазовые объемы, показатель преломления и др.) являются физическими параметрами и количественно характеризуют морфологию клетки. Они определяются в абсолютных единицах и могут быть получены на различных типах интерференционных микроскопов.

В основу заявленного способа лежит общая последовательность действий, заключающаяся в следующем:

1. Из суспензии мононуклеаров (в т.ч. лимфоцитов) в нормальной среде выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе (в т.ч. в когерентном фазовом микроскопе) для получения изображения мононуклеара в виде топограммы - двумерного распределения фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки, отличающихся по показателю преломления. Клетка представляет собой сложную структуру из функционально связанных между собой органелл. В проекции клетки при ее сканировании с высоким разрешением можно получить «зоны» - области, отличающиеся по фазовой толщине. В трехмерном изображении клетки ее участкам с более высокими значениями показателя преломления, например, ядра, соответствуют большие фазовые толщины.

Набор параметров физических параметров (площадь, диаметр, рефрактерность, фазовый объем и др.) на границах «зон» мы используем в качестве характеристики функционального состояния. Мы обозначаем здесь термином «значимые» такие параметры, изменениям которых можно дать биофизическую или медицинскую интерпретацию. В фазовую толщину каждой «зоны» дают вклад органеллы клетки. На этом основано определение «нормы», в виде набора параметров в базе (банке) данных нормально функционирующей клетки здорового (не больного и не подверженного внешнему воздействию или воздействию лекарственных препаратов) человека. Формирование банка наборов параметров для клеток доноров разного пола, возраста и т.д. людей, позволит количественно сравнивать его набор с наборами, характерными для «нормы» и для различных патологий, и затем по данным корреляционного анализа предлагать диагноз с численной вероятностной оценкой.

В перспективе такой подход может быть использован в проблеме т.н. персонализированной медицины, для индивидуальной оценки аллергенного и фармакологического действия препаратов, трансплантатов и других факторов на конкретного человека. Формирование личного (персонифицированного) банка наборов значимых параметров позволит анализировать динамику изменений, проследить тенденции изменения этих параметров и прогнозировать начало отклонений.

2. Фазовое изображения оптически неоднородной клетки представляет собой двумерное распределение оптической разности хода, которое характеризует локальное значение оптической плотности клетки или т.н. локальную фазовую толщину. Более плотным органеллам, например, ядру, соответствуют большие значения фазовой толщины. Границы «зон» в фазовом изображении клетки соответствуют границам органелл и распознаются по заметному изменению фазовой толщины. В сечении горизонтальной плоскостью фазового изображения можно определить площадь органеллы и т.н. фазовый объем отсеченного фрагмента. Под фазовым объемом мы понимаем произведение физического объема на рефрактерность. По значениям фазовой толщины на границах «зон» с помощью гистограмм фазовой толщины и фазового объема и других алгоритмов можно определить значимые параметры в изображении клетки и использовать их набор для характеристики ее функционального состояния.

3. Наборы значимых параметров одиночных мононуклеаров используют для установления уровня нормы и для характеристики изменений функционального состояния мононуклеаров при действии различных факторов и формирования базы (банка) данных.

На функциональное состояние и параметры микроскопического изображения клетки влияют внешние факторы и происходящие внутри нее метаболические процессы. Типы клеток, и характеристики процессов очень разнообразны. Для их анализа, в частности, используются новые методы оптической микроскопии. Они обеспечили значительное увеличение информативности изображений клетки путем введения новых параметров. Одним из таких параметров, имеющих высокий диагностический потенциал, может быть связан с состоянием ретикулума и рефрактерностью митохондрий

Здесь мы предлагаем использовать рефрактерность ретикулума и ядра Т-лимфоцита в качестве такого достаточно «универсального» параметра метаболической активности. Физической основой для этого нового метода является хорошо известный факт - синтез в митохондриях молекулы АТФ, которая является универсальным источником энергии для процессов в клетках различной природы и их органеллах.

4. Количественную оценку степени энергизации клеток производят по результатам анализа фазового изображения, полученного с помощью указанных выше или других типов интерференционного микроскопа. Для определения набора значимых параметров изображения клетки используют различные известные алгоритмы и программное обеспечение.

В качестве параметра, характеризующего энергизацию клетки, предлагается использовать отношение тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся между точками 12 23 в области 2 и участком интегральной функции фазового объема в области 3, прилегающим к точке 23 (фиг. 10):

Для построения характеристических прямых используется аппроксимация первой степени зон функции фазового объема, соотносимых с ретикулумом (зона 2) и ядром (зона 3).

В качестве экспериментальной модели для проверки метода использовались мононуклеары периферической крови здоровых доноров. Свежевыделенные клетки суспендировали в среде 199 и определяли ее параметры в "норме". Для характеристики "активированного" состояния клетки ее предварительно выдерживали в течение 1 ч при 37°C в среде с поликлональным митогеном - фитогемагглютинином (ФГА; 2 мкг/мл). Суспензию клеток наносили в виде капли на полированную кремниевую подложку и затем под покровным стеклом помещали на предметный стол когерентного фазового микроскопа "Эйрискан" (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V. 2010, 58(3). P. 107-1016; В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т. 177(5), стр. 535-552). Спейсер толщиной 15 мкм между кремниевой подложкой и покровным стеклом препятствовал деформации клеток. Измерения проводили не более 30 мин с использованием предохранительной шторки для минимизации действия на клетки излучения гелий-неонового лазера (λ=633 нм, 1 мВт).

Положение клетки в измерительной камере схематически показано на фиг. 2. Изображение получали на фазовом микроскопе "Эйрискан" растровым методом (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V. 2010, 58(3). P. 107-1016), в котором значения ОРХ определялись последовательно в каждом пикселе изображения компенсационным методом (В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т. 177(5), стр. 535-552). В этом методе фаза опорной волны изменялась по линейно-периодическому закону движением зеркала в опорном плече интерферометра. Растровое сканирование изображения и регистрация интерференционного сигнала производились координатно-чувствительным фотоприемником - диссектором ЛИ-620. Этот метод позволил получить сверхдифракционное пространственное разрешение и регистрировать в клетках динамические процессы в реальном времени. Ограниченная шумами чувствительность к изменениям ОРХ была около 1 нм. Авторы считают, что параметры интерференционного микроскопа в данном случае не имели решающего влияния на результаты.

Авторы исходили из предположения, что в фазовом изображении клетки можно выделить "зоны" с различной фазовой толщиной, границы которых соответствуют границам органелл и различаются по показателю преломления. В отдельных случаях преобладающий вклад в фазовую толщину дает только одна органелла. Например, известно, что ядро и окружающая его разветвленная митохондрия (хондриом) являются наиболее плотной частью структуры клетки (см. фиг. 2, 3 и 4), и наименее плотная - периферийная часть цитоплазмы (см. фиг. 3 и фиг. 4). Разработанные авторами алгоритмы обеспечивали получение в фазовых изображениях следующих функций и параметров: а - профиля фазовой толщины h(x) - зависимости фазовой толщины в поперечном сечении клетки; б - зависимости рефрактерности Δn(r) от радиуса в изображении клетки, и численных значений рефрактерности органелл Δn(ri) на границах «зон»; в - гистограмм s(h) - зависимости плотности площади пикселей от фазовой толщины (h) в топограмме h(x,y); r - функции S(h) - зависимости площади в сечении изображения клетки от фазовой толщины; д - гистограммы w(h) - зависимости плотности фазового объема структурного элемента изображения от фазовой толщины; е - функции W(h) - зависимости фазового объема элементов клетки в интервале значений фазовой толщины (0-h). В гистограммах, в профилях фазовой толщины, графиках S(h) и s(h) были определены значения фазовой толщины (hi), которые являются границами "зон". Из оптической модели клетки следовало, что, в отдельных «зонах» можно было выделить преобладающий вклад конкретных органелл (периферийной и плотной цитоплазмы, хондриома, ядра и ядрышка). Численные значения функций S(hi) и W(hi) позволили определить площадь частей изображения внутри контура с фиксированной фазовой толщиной (hi) и вычислить диаметры (di) окружностей, равных им по площади (см. фиг. 4). Было показано, что при некоторых условиях диаметры di можно отождествить с границами органелл и дать адекватную биофизическую интерпретацию параметрам «зон».

На изображении (топограмме) Т-лимфоцита на фиг. 2 границы "зон" показаны в виде окружностей соответствующих диаметров (di). Диаметр d0 мы отождествляем с внешней границей клетки, d1 - с границей периферийной и плотной частей цитоплазмы, d2 - с границей плотной части цитоплазмы с хондриомом (разветвленной гигантской митохондрией), d3 - с границей хондриома с ядром, d4 - с границей ядра и ядрышка. На площадь кольца ΔSij=Si-Sj ограниченную диаметрами di и dj, проецируется часть клетки, которой соответствует фазовый объем ΔWij. На фиг. 3 схематически показаны площадь S(h) в сечении 3-мерного изображения h(x,y) горизонтальной плоскостью hi=const и часть фазового объема W(hi). Под фазовым объемом части клетки мы понимаем произведение W(hi)=Δn0iV(hi) ее геометрического объема V(hi) и рефрактерности (Δn0i=ni-n0), где ni - показатель преломления органеллы.

Параметры соответствующих "зон", площадь которых ограничена диаметрами di и dj (j=i+1), мы обозначаем двумя индексами границ. Из фиг. 2, 3 и 4 следует, что на площадь «зон» (за исключением 1-2) проецируется и дает вклад в фазовую толщину нескольких органелл. Одним из наиболее значимых параметров являются значения рефрактерности (Δn0i) на i-й границе. Для их вычисления было использовано представление фазовой толщины суммой вкладов (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V. 2010, 58(3). P. 107-1016):

где hi(x,y)=Hi(x,y)Δn0i, Hi(x,y) - геометрическая толщина i-й границы, и оптической модели клетки в виде системы концентрических сферических слоев.

В профилях фазовой толщины h(x) и h(y) на фиг. 5, полученных в диаметральных сечениях топограммы Т-лимфоцита (фиг. 2), обозначены диаметры (di) и значения толщины (hi), которые соответствуют границам "зон". Видно, что профили h(x) и h(y) несколько отличаются по форме. Внешнему диаметру клетки (d0) на профиле h(x) соответствует нижнее значение фазовой толщины (h0=0). В фазовую толщину (h0≤h≤h1) первой "зоны" (0-1) дает вклад только периферийная часть цитоплазмы, почти лишенная крупных органелл. С приближением к центру клетки фазовая толщина растет. Это связано с последовательно возрастающими вкладами: плотной части цитоплазмы с ретикулома в интервале высот и диаметров в области (1-2), хондриома (2-3), ядра (3-4) и ядрышка (h4≤h≤hmax) (4-5). Морфология клетки, размеры и рефрактерность органелл влияют на долю точек в заданном интервале фазовой толщины (h, Δh) и, соответственно, на форму s-гистограммы. Проекции пологих участков h(x,y) соответствует большое число точек и максимум в s-гистограмме для этого интервала фазовых толщин.

Выше отмечалось, что функция S(h), полученная интегрированием s-гистограммы, отображает зависимость площади в сечении клетки от положения плоскости h=const. Часть левого максимума в s-гистограмме на фиг. 6 соответствует сравнительно большой площади подложки и не имеет отношения к клетке. Правый его склон отражает вклад рефрактерности (Δn01) периферийной части цитоплазмы. Известно, что ее показатель преломления мало отличается от n0=1,333 для воды. Максимальный вклад периферийной цитоплазмы в фазовую толщину на границе с плотной цитоплазмой не превышает h1=25 нм. Широкий правый максимум s-гистограммы в интервале 115≤h≤165 нм соответствует вкладу в фазовую толщину более плотной части клетки (хондриома, ядра и ядрышка). Монотонный рост функции S(h) (фиг. 6) от нуля в центре (при hmax≈220 нм) до максимального значения S0=40 мкм2 соответствует увеличению площади сечения у основания (h=0). Значения функции S(hi) в характерных точках (hi) были использованы для определения диаметров (di) эквивалентных по площади окружностей, которые условно отождествлялись с границей i-й «зоны». Увеличение S(h) при отрицательных значениях (h≤0) соответствует площади подложки и не связано с клеткой. В фазовую толщину 1-й "зоны", площадь которой ΔS01=S0-S1=8 мкм2 ограничена внешней (d0≈7,14 мкм, h0=0) и внутренней d1≈6.4 мкм, h1=35 нм) окружностями, проецируется и дает вклад только периферийная часть цитоплазмы клетки. На фиг. 6 обозначены значения фазовой толщины, площади и диаметров, которые условно отождествлялись с указанными границами органелл: S2=24 мкм2, h2=115 нм (d2≈5.5 мкм); S3=10 мкм, h3=165 нм (d3≈3.6 мкм); S4≈2 мкм2, h4=200 нм, (d4≈1,6 мкм). Площади колец ("зон") соответственно были равны, мкм2: ΔS01=8; ΔS12=8; ΔS23=14; ΔS34=6; ΔS45=S4≈2 мкм2. В некоторых случаях граница между хондриомом и ядром (h3) была трудно различима. Из приведенных выше величин следует, что на цитоплазму (ΔS01+ΔS12)=16 мкм2 в топограмме Т-лимфоцита в норме приходится 40% площади всей клетки (S0).

W-гистограмма и функция W(h) (фиг. 8) позволили получить дополнительные сведения о морфологии Т-лимфоцита. Понятие фазового объема, по-видимому, не часто используется в биофизике клетки, и мы здесь на конкретных примерах покажем возможность его использования для характеристики состояния Т-лимфоцита. Малые значения (w≈0,01 мкм3/нм) плотности фазового объема в интервале 0≤h≤135 нм отображают малую рефрактерность периферийной цитоплазмы и ретикулума. Увеличение плотности до w≈0,04 мкм3/нм и сохранение высокого уровня в интервале 115≤h≤165 нм объясняется более высокой рефрактерностью и большими геометрическими объемами хондриома и ядра. Снижение плотности в интервале 165≤h≤200 нм связано с малым геометрическим объемом ядрышка, несмотря на его высокую рефрактерность. Функция W(h) позволяет получить численные значения фазового объема W(hi) на границах "зон", мкм3: W0=10; W1=9,7; W2=7,6; W3=3,6; W4=0,8; Соответственно, разность этих значений позволяет оценить фазовые объемы структур, которые проецируются в эти «зоны», мкм3: ΔW01=0,3; ΔW12=2,1; ΔW23=4,0; ΔW34≈2,8; ΔW45=W4≈0,8. В данном случае на цитоплазму Т-лимфоцита в норме приходится (ΔW01+ΔW12)=2,4 мкм3 или ≈24% от всего фазового объема. Остальные 76% приходятся на оптически более плотные структуры клетки (ядро и хондриом). Ниже будет показано, что функциональное состояние клетки оказывает заметное влияние на фазовые объемы органелл.

На фиг. 7 показаны результаты вычисления профиля рефрактерности Δn(r)A-D в виде ее зависимости от радиуса r. Четыре профиля были получены в сечениях (А-D), отличающихся поворотом на 90°. Различие в форме и в положении максимумов свидетельствует о заметной асимметрии распределения оптической плотности в Т-лимфоците, несмотря на его близкую к сфере форму. Там же обозначены радиусы ri=di/2, соответствующие границам органелл. Следует обратить внимание на максимумы рефрактерности (Δn23≈0.035-0,05) в интервале радиусов r2-r3≈2,8-2 мкм, которые мы отождествляем с границами 3-й «зоны» с преобладающим вкладом хондриома. Из приведенных в статье Т. Кару изображений на электронном микроскопе следует, что пространственная структура хондриома весьма неоднородна. С этим обстоятельством, по-видимому, связано различие в форме профилей в сечениях A-D. Эта асимметрия становилась менее заметна при деэнергизации Т-лимфоцита. Расположенные ближе к центру участки профиля мы отождествляем с вкладом ядра (Δn34≈0.03), которому по нашим оценкам соответствует внешняя граница r3≈2,0 мкм, и ядрышку (Δn45≈0.05-0,06) в пределах r4≤1,25 мкм. Эти значения рефрактерности на границах «зон» входят в набор значимых параметров.

Для проведения исследований забор крови (4-5 мл) производят из локтевой вены и стабилизируют ее в пробирке гепарином в концентрации 25 ЕД на 1 мл крови. Мононуклеары выделяют стандартным методом на градиенте плотности для лимфоцитов Ficoll-Paque (p=1,077 г/см3) производства AmershamBiosciences (Швеция). Кровь разбавляют физраствором 1:1 и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 45 мин. Суспензию Т-лимфоцитов в среде 199 вместе с тестируемый препаратом наносят в виде капли 3-4 мкл на полированную кремниевую подложку, накрывают покровным стеклом и помещают на предметный стол микроскопа. Измерения производят на каком-либо интерференционном микроскопе, например, на когерентных фазовых микроскопах «Эйрискан» или «Цитоскан».

Для проверки метода были выделены Т-лимфоциты 12 доноров. Среди них были 5 здоровых и 7 пациентов с различными системными заболеваниями. Ниже показаны характерные для нормы гистограммы, профиль рефрактерности Т-лимфоцита здорового донора и усредненный по Т-лимфоцитам пяти здоровых доноров их «фазовый портрет».

В таблицах 1 и 2 показаны значимые параметры характерных «фазовых портретов» Т-лимфоцитов здорового донора в норме (таблица 1) и ФГА-активированного Т-лимфоцита (таблица 2). Здесь для обозначения величин параметров на границах органелл использованы индексы: 0 - внешняя граница периферийной части цитоплазмы; 1 - плотная часть цитоплазмы, 2 - хондриом (разветвленная митохондрия); 3 - ядро; 4 - ядрышко. Вариабельность параметров в ансамбле Т-лимфоцитов не превышала ±15%.

В табл. 1 приведены характерные значения параметров Т-лимфоцита в норме. Измерения 30 клеток показали сравнительно небольшую вариабельность параметров. Например, в норме максимальная фазовая толщина находилась в пределах h0=200-250 нм, площадь S0=40-50 мкм2, фазовый объем W0=8-12 мкм3, средние значения рефрактерности <Δn>=0,03-0,04. Вариабельность остальных параметров была в тех же пределах.

Смещение вправо в столбцах значений ΔS, ΔW и <Δn> обозначает, что они относятся к "зоне" между границами.

Далее мы кратко отметим важность адекватной биофизической интерпретации параметров набора в общепринятых терминах. Результатов измерений лимфоцитов в различных средах пока еще очень мало и мы ниже приводим один пример, из которого следует вывод о зависимости параметров набора от состояния клетки и возможность их биофизической интерпретации.

Из учебников по иммунологии и работы (V. Manteifel, L. Bakeeva, Т. Kara, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V. 38. P. 25-30) известно, что в начальной фазе ФГА-активации (в пределах ≈1 ч воздействия) в Т-лимфоцитах происходит переход из состояния покоя (G0) в активированное (S-состояние) и оно сопровождается индукцией транскрипции, трансляцией и секрецией цитокинов. Естественно предполагать, что эти процессы отражаются на параметрах фазового изображения. Результаты измерений ФГА-активированного Т-лимфоцита приведены в табл. 2.

Измерения Т-лимфоцита в среде с ФГА (2 мкг/мл) показали заметное снижение фазовой толщины от 220 до ≈150 нм и изменение формы профиля (фиг. 11). Площадь хондриома ΔS23 снизилась до 8 мкм и немного возросла (до S3=20 мкм2) у ядра. Увеличение площади S2 периферийной цитоплазмы связано с большим диаметром клетки (d0≈9,8 мкм). Но более заметные изменения произошли в графике функции W(h). Произошло 4-кратное увеличение фазового объема периферийной цитоплазмы (ΔW01=1,3 мкм) и снижение фазового объема плотной части (от W2=7,6 до 5,2 мкм3). Общий объем также снизился до W0≈8.5 мкм3.

В таблице 2 приведены характерные значения параметров ФГА-активированного Т-лимфоцита.

Сравнение данных в двух таблицах позволяет сделать следующие выводы. При ФГА-активации заметные количественные изменения произошли почти во всех параметрах и в этом смысле их можно отнести к «значимым». Увеличение площади и фазового объема периферийной части цитоплазмы можно объяснить процессами синтеза белков и цитокинов на рибосомах, дроблением хондриома на митохондрии, транспортом субстрата из внешней среды и синтезом АТФ. Причиной увеличения фазового объема периферийной цитоплазмы может быть перемещение в нее митохондрий, имеющих более высокий уровень рефрактерости. Этот вывод согласуется со снижением (до W2=5.2 мкм3) фазового объема плотной части клетки (хондриома и ядра). В норме в фазовую толщину (h2=135 нм) на границе плотной части (h2≤135 нм) преобладающий вклад давали хондриом и ядро. Их вклады в фазовый объем (W2=7,6 мкм) были близки. Снижение фазового объема плотной части при активации объясняется отсутствием вклада хондриома при почти неизменном объеме ядра (W3≈3.2 мкм). Снижение рефрактерности ядра при ФГА-активации мы объясняем увеличением его диаметра до d3≈6 мкм и 2-3-кратным увеличением геометрического объема. Физической причиной снижения рефрактерности может быть деконденсация хроматина (V. Manteifel, L. Bakeeva, Т. Каш, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V. 38. P. 25-30), которая связана с РНК-транскрипцией, секрецией цитокинов и другими характерными для S-фазы процессами.

Из сравнения значимых параметров в таблицах следует вывод о зависимости значимых параметров от состава среды и состояния донора.

По-видимому, рефрактерность и фазовый объем "зон" являются основными значимыми параметрами в сложной иерархии диагностических факторов ФП. Это объясняется фундаментальным характером зависимости физических параметров клетки от процессов синтеза АТФ, транскрипции РНК, синтеза аминокислот на рибосомах и т.д. Авторы не исключают также, что на последних фазах активации становятся заметными признаки апоптоза. Известно (V. Tychinsky, A. Kretushev, I. Klemyashov, T. Vyshenskaya, N. Filippova, N. Rakchlin, A. Shtil, Quantitative real-time analysis of nuclear stress by coherent phase microscopy, J. of Biomedical Optics, 2008. V. 13(6). P. 1205-1214; С.В. Бойчук, М.Л. Миннебаев, И.Г. Мустафин, Ключевая роль митохондрий в апоптозе лимфоцитов, Бюл. Эксп. биологии и медицины. 2001, Т. 132(12), С. 644-647), что его характеристиками являются снижение метаболической активности хондриома и мембранного потенциала митохондрий.

Выше неоднократно отмечалось уникальное свойство фазовых изображений - абсолютным, нормированным на длину волны значением ОРХ. Наиболее важным его достоинством набора является большое число значимых параметров и увеличение объема информации в изображении одной клетки. Это имеет фундаментальное значение для биофизики клетки и дает возможность измерений в реальном времени физических параметров органелл клетки, исследовать механизмы действия на нее внешних факторов и т.д. Важным фактором считается возможность количественной характеристики состояния клетки физическими параметрами. Это позволит сравнивать результаты, полученные на различных объектах и приборах. Использование этой методологии позволит существенно уменьшить объем измерений и время диагноза. Эти факторы имеют решающее значение при обстоятельствах, когда время анализа ограничено и приходится искать нетрадиционные подходы к проблеме in vitro диагностики и для исследований индивидуального отклика иммунно-компетентных клеток крови. В методах in vitro диагностики увеличение числа значимых параметров позволит уменьшить число анализируемых клеток, сократить время измерений и расход материалов. Представление значимых параметров в абсолютных величинах позволит сравнивать результаты регистрации в реальном времени структурных изменений и процессов в живой, неокрашенной клетке, полученные на различных интерференционных микроскопах.

Применение предлагаемого способа определения метаболической активности клетки могут быть различные параметры, в т.ч. ее микроскопических изображений. Здесь, по-видимому впервые, разность крутизны ΔP двух смежных участков графика функции фазового объема, использовалась в качестве значимого параметра. Функция фазового объема универсальна и ее значения определяются только оптической плотностью и размерами органелл. позволяет избежать неоправданного назначения этих препаратов, поскольку даже кратковременное их применение может привести к различным осложнениям.

Для подтверждения метода, заявляемого в патенте, были проведены следующие эксперименты: длительное облучение одной клетки лазером, приводящее к ее деэнергизации, исследование деэнергизации клеток в результате длительного нахождения в буфере в отсутствии питательных субстратов и воздействие на клетку веществ, приводящих к уменьшению мембранного потенциала митохондрий (фитогемагглютинин, ротенон). Фазовые изображения клеток в питательной среде при минимизации облучения лазером были приняты за норму. В результате удалось выделить три основных энергетических состояния Т-лимфоцита: 1 - повышенная энергизация E≥4.5; 2 - норма 1.5≤E<4 и 3 - деэнергизация E<1.5 (фиг. 12).

Способ определения степени энергизации Т-лимфоцита, заключающийся в исследовании отдельных лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии, при котором из суспензии мононуклеаров крови пациента выделяют пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде топограммы, представляющей собой двумерное распределение фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки в виде зон оптической плотности для вычисления значимых параметров, отличающийся тем, что в качестве значимых параметров используют границы зон в фазовом изображении одиночной клетки, которые соответствуют границам органелл и каждая из которых ограничивает участок в фазовом изображении одиночной клетки, толщина которого отличается от толщины смежно расположенного участка или участков, для построения характеристических прямых и интегральной функции по зависимости толщины участков в границах зон от фазового объема этих зон, а степень энергизации Т-лимфоцита одиночной клетки определяют путем сравнения величины параметра, полученного отношением тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся в области ретикулума клетки, с нормой и крайними значениями параметра степени энергизации клетки.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики туберкулеза, заключающийся в том, что выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, культивируют их в питательной среде, получают образец супернатанта культуры мононуклеарных клеток периферической крови и проводят иммуноферментный анализ (ИФА), при этом перед проведением ИФА в лунки отрицательного контроля вносят питательную среду для культивирования клеток, а в лунки положительного контроля вносят сыворотку крови больного туберкулезом, заведомо содержащую анти-Mtb IgG и анти-Mtb IgA и разведенную 1:100, при ИФА используют в качестве сорбента раствор антигенов Mtb и определяют оптическую плотность образца супернатанта культуры мононуклеарных клеток периферической крови испытуемых ОПобр, образца отрицательного контроля К- и образца положительного контроля К+, после чего определяют критическое значение оптической плотности из соотношения ОПкр=К-+0,1 и при значениях ОПобр>ОПкр и К+>ОПкр устанавливают диагноз активный туберкулез, при значениях ОПобр<ОПкр и К+>ОПкр устанавливают отсутствие туберкулезной инфекции или латентную туберкулезную инфекцию, а при значениях К+<ОПкр и любых значениях ОПобр результат анализа считают недостоверным.

Изобретение относится к поглощающему изделию, выполненному с возможностью определения ионной силы мочи. Изделие включает непроницаемый для жидкости слой; проницаемый для жидкости слой; поглощающий внутренний слой, расположенный между непроницаемым для жидкости слоем и проницаемым для жидкости слоем; устройство с латеральным потоком, интегрированное в изделие и расположенное таким образом, что оно находится в жидкостном соединении с потоком мочи, выделяемой пользователем изделия.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия.

Изобретение относится к медицине и предназначено для предупреждения развития вариабельного иммунодефицита с поражением, преимущественно, клеток моноцитарно-макрофагальной системы иммунитета у детей, потребляющих питьевую воду с остаточными количествами продуктов гиперхлорирования.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения функционального состояния яичников у самок сельскохозяйственных животных в условиях первой лактации.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования изменения состояния цитоскелета эритроцитов. Для этого эритроциты отмывают от плазмы крови, помещают на водяную баню при 49,2°C и прогревают в течение 15 мин.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может использоваться для прогнозирования частой заболеваемости ОРВИ у детей раннего возраста со спастическими формами ДЦП.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения растворимого фибриногена, заключающегося в том, что свежезамороженную плазму размораживают и центрифугируют, полученный криопреципитат солюбилизируют и подвергают обработке гидроокисью алюминия, полученную суспензию центрифугируют, образовавшийся осадок, содержащий нецелевые белки, отбрасывают, супернатант подвергают обработке полиэтиленгликолем, суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок солюбилизируют и подвергают вирусной инактивации, освобождают от продуктов вирусной инактивации, встряхивая с вазелиновым маслом и переосаждая глицином, процедуру осаждения повторяют дважды, полученный раствор фибриногена разливают и лиофильно высушивают.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения кислотной устойчивости эритроцитов. Способ заключается в том, что в пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (трилон Б) из расчета 10 мкл на 2 мл крови.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии применительно к взятию, хранению и транспортировке проб крови или сыворотки с целью последующего проведения анализа материала на содержание биологически активных веществ.

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для определения концентрации аналита в образце. Способ определения концентрации анализируемого вещества в биологическом образце содержит этапы, на которых: генерируют выходной сигнал в ответ на реакцию окисления/восстановления анализируемого вещества в биологическом образце; генерируют вторичный выходной сигнал из биологического образца от дополнительного электрода в ответ на содержание гематокрита в образце; определяют по меньшей мере одну индексную функцию, зависящую от множества параметров ошибки и определяют концентрацию анализируемого вещества по меньшей мере по одному выходному сигналу и уравнению компенсации наклона, зависящему от индексной функции, причем уравнение компенсации наклона включает в себя опорную корреляцию и отклонение наклона. Группа изобретений относится также к системе биологического датчика для определения концентрации аналита в образце. Группа изобретений обеспечивает повышение точности анализа. 3 н. и 49 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики резистентности и чувствительности к ацетилсалициловой кислоте (АСК). Для этого проводят забор крови у пациента до начала антитромбоцитарной терапии. В качестве антикоагулянта применяют 3,2% цитрата натрия, помещают 0,5 мл крови в опытную кювету, пропускают через образец крови короткий, порядка 10-5 с, импульс тока с последующей регистрацией функции спада поляризации образца, а затем выполняют Фурье-преобразование этой функции и рассчитывают параметры импеданс-годографов в диапазоне частот 0,1-125 кГц, используя диэлектрический Фурье-спектрометр. При значениях референтного интервала r0=4,518-4,551, x0=1,925-1,939, y0=-1,395--1,385 диагностируют чувствительность, а при значениях r0=4,504-4,517, х0=1,914-1,926, y0=-1,384--1,375 - резистентность к ацетилсалициловой кислоте. Изобретение позволяет быстро и достоверно осуществить диагностику резистентности к АСК у пациента до начала лечения, что предотвратит развитие нежелательных коронарных событий у больных ИБС. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности пульмонологии, и предназначено для скрининговой диагностики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и бронхиальной астмы. Способ включает регистрацию выдыхаемого воздуха пациента и его анализ, для чего проводят регистрацию и анализ спектра поглощения выдыхаемого воздуха пациента, причем предварительно проводят измерения спектра поглощения выдыхаемого воздуха верифицированных групп пациентов с бронхолегочными заболеваниями, представляющими диагностический интерес, вычисляют средние значения квадрата расстояний Махаланобиса от спектра поглощения выдыхаемого воздуха каждого члена группы до спектров поглощения выдыхаемого воздуха остальных членов группы. Затем находят среднее значение от указанных средних значений и доверительный интервал. При значении в интервале от 1,28 до 2,29 диагностируют ХОБЛ, а при значении более 2,29 диагностируют бронхиальную астму. 5 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ). Цель изобретения - создание удобного способа оценки риска развития недифференцированной дисплазии соединительной ткани, не требующего выполнения большого количества длительных и дорогостоящих диагностических исследований. Способ оценки риска развития недифференцированной дисплазии соединительной ткани включает определение концентраций оксипролина и ионов магния в суточной моче методом спектрофотометрии. Далее рассчитывают риск развития нДСТ по формуле: , где: Р - риск развития нДСТ, ОП - концентрация оксипролина в суточной моче, мкмоль/сут; Mg - концентрация магния в суточной моче, ммоль/сут; е - основание натурального логарифма. При Р≤15 риск развития нДСТ у пациента низкий; при значениях Р от 16 до 29 риск развития нДСТ у пациента средний; при Р от 30 до 49 риск развития нДСТ у пациента высокий; при Р≥50 риск развития нДСТ у пациента очень высокий.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии и может быть использовано для оценки степени нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов крови у детей с внебольничной пневмонией (ВП). Для этого методом проточной цитометрии проводят учет лимфоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий. При показателях от 0 до 35% диагностируют уровень нормы, 36 до 75% - субкомпенсированные нарушения, не требующие специфической терапии, 76% и более - декомпенсированные нарушения, требующие в комплексном лечении внебольничных пневмоний назначения энерготропных препаратов. Использование данного способа позволяет определить нарушения энергообеспеченности клеток на более раннем этапе, при отсутствии изменений активности сукцинатдегидрогеназы, что позволяет использовать его в клинической практике для выделения групп риска детей с ВП, требующих метаболической коррекции. 1 табл., 4 пр. .

Группа изобретений относится к медицине. Способ контроля дыхания субъекта реализуют с помощью устройства для контроля дыхания. При этом принимают газ в измерительную ячейку из канала, который соединен по текучей среде с дыхательными путями субъекта с помощью приспособления сопряжения, которое вставлено в дыхательные пути субъекта. Измерительная ячейка сконфигурирована для выкачивания газа, принятого из канала. Формируют с помощью детектора состава выходные сигналы относительно состава газа, принятого в измерительную ячейку. Формируют с помощью детектора давления выходные сигналы относительно давления в канале. Идентифицируют с помощью процессора дыхание на основе выходных сигналов относительно давления в канале. Определяют с помощью процессора параметр дыхания на основе выходных сигналов относительно состава газа и на основе идентифицированного дыхания. Определяют с помощью процессора тип приспособления сопряжения на основе выходных сигналов детектора давления. Определяют с помощью процессора параметр дыхания на основе выходных сигналов детектора состава и на основе определенного типа приспособления сопряжения. Достигается повышение точности измерения параметра дыхания посредством определения типа приспособления сопряжения, которое вставляется в дыхательные пути субъекта, и последующей коррекции контролируемых параметров дыхания согласно обнаруженному типу приспособления сопряжения. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения осмотической стойкости эритроцитов путем исследования крови, характеризующийся тем, что кровь в равных объемах помещают в мерные пробирки №1 и №2 с цитратом натрия, подвергают центрифугированию, после этого плазму отсасывают пипеткой, полученную эритроцитарную массу из мерной пробирки №1 разводят 0,85% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1, эритроцитарную массу из мерной пробирки №2 разводят 0,425% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1, обе мерные пробирки одновременно центрифугируют, после чего покачиванием или легким встряхиванием кровь перемешивают с надосадочной жидкостью до однородного состояния, затем из каждой пробирки с помощью устройства для исследования проб крови Microvette забирают по 200 мкл эритроцитарной массы и производят подсчет эритроцитов в автоматическом гематологическом анализаторе и в заключение рассчитывают индекс осмотической стойкости (ИОС), который определяют по формуле ИОС=RBC1/RBC2, где RBC1 - количество эритроцитов (×1012/л) из мерной пробирки №1, RBC2 - количество эритроцитов (×1012/л) из мерной пробирки №2, и при значении ИОС 1,50-1,60 эритроциты оценивают как среднестойкие к осмотическому гемолизу, 1,30-1,49 - как низкостойкие, 1,61-1,8 - как высокостойкие. Осуществление изобретения позволяет упростить способ определения стойкости эритроцитов.

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки эффективности лечения больных хроническим бруцеллезом. Сущность способа заключается в том, что у больных хроническим бруцеллезом в фазе обострения до начала терапии и по ее окончании проводится определение сывороточного уровня ФНО α, ИФН γ, ИЛ 10, рассчитывается соотношение ИФН γ / ИЛ 10. При сохраняющейся после курса терапии высокой экспрессии в крови ФНО α и ИЛ 10 в 1,5 раза выше, чем в группе здоровых лиц и более; пониженном в 2 раза и более сывороточным уровне ИФН γ; и сниженном в 2,5 раза и более по сравнению со здоровыми лицами соотношении ИФН γ / ИЛ 10, лечение оценивается как недостаточно эффективное. Способ позволяет определить необходимость в дополнительных лечебных мероприятиях и, таким образом, повысить качество лечения больных хроническим бруцеллезом. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а в частности к гепатологии и ультразвуковой диагностике, и может быть использовано для диагностики портальной гипертензии при хронических диффузных заболеваниях печени. Проводят биохимические анализы крови. Проводят биопсию ткани печени. На основании их результатов устанавливают степень активности хронического заболевания печени. Осуществляют измерение показателей гемодинамики в воротной и селезеночной венах методом ультразвуковой допплерографии. Вычисляют индекс застоя в воротной вене по формуле. Рассчитывают индекс застоя в селезеночной вене по формуле. При умеренной активности хронического заболевания печени и превышении индекса застоя в селезеночной вене более 0,015 и индекса застоя в воротной вене более 0,039 или при высокой активности хронического заболевания печени и превышении индекса застоя в селезеночной вене более 0,018 и индекса застоя в воротной вене более 0,051 устанавливают наличие портальной гипертензии на ранней, доцирротической стадии. Способ позволяет повысить качество диагностики портальной гипертензии на ранней, доцирротической стадии до появления ее клинических признаков, прогнозировать течение заболевания и контролировать эффективность лечения за счет комплексной оценки лабораторных, гистологических показателей и показателей гемодинамики в воротной и селезеночной венах. 5 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки аллогенного иммунного ответа в кратковременной смешанной культуре мононуклеаров неродственных доноров. Для этого с помощью проточной цитофлуориметрии проводят одномоментный анализ субпопуляций мононуклеаров с фенотипом CD3+HLA-DR+, CD3-HLA-DR+, CD45+HLA-DR+ каждого донора, разделенных и гейтированных различным флуоресцентным красителем в их смешанной культуре. После чего рассчитывают коэффициенты прироста (КП) для каждой субпопуляции. При положительных значениях КПCD3-HLA-DR+, и КПCD45+HLA-DR+ делают заключение о наличии иммунного распознавания по аллоHLA, а коэффициент КПCD3+HLA-DR+ указывает на функциональные особенности взаимодействующих генотипов HLA-DRB1*. Изобретение позволяет оценить иммунные взаимодействия и выявить аллогенную клеточную сенсибилизацию по аллогенным антигенам главного комплекса тканевой совместимости. 1 табл., 2 ил., 3 пр.
Наверх