Способ определения степени энергизации т-лимфоцита

Изобретение относится медицине и может быть использовано для определения степени энергизации Т-лимфоцита. Для этого проводят исследование отдельных лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии. При котором из суспензии мононуклеаров крови пациента выделяют пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде топограммы, представляющей собой двумерное распределение фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки в виде зон оптической плотности для вычисления значимых параметров, при этом в качестве значимых параметров используют границы зон в фазовом изображении одиночной клетки, которые соответствуют границам органелл и каждая из которых ограничивает участок в фазовом изображении одиночной клетки, толщина которого отличается от толщины смежно расположенного участка или участков, для построения характеристических прямых и интегральной функции по зависимости толщины участков в границах зон от фазового объема этих зон. Степень энергизации Т-лимфоцита одиночной клетки определяют путем сравнения величины параметра, полученного отношением тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся в области ретикулума клетки, с нормой и крайними значениями параметра степени энергизации клетки. Изобретение обеспечивает увеличение информативности изображений клетки путем введения новых параметров. Один из таких параметров, имеющих высокий диагностический потенциал, может быть связан с состоянием ретикулума и рефрактерностью митохондрий, где происходит синтез молекулы АТФ, которая является единственным и универсальным источником энергии для процессов в клетках. 12 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения in vitro степени энергизации Т-лимфоцита.

Новые методы микроскопии (конфокальной, флуоресцентной, нелинейной, интерференционной, комбинационной и др.) позволяют получить в функциональных изображениях значительно большую информацию о морфологии клетки. Однако их общим недостатком является большое время анализа, трудоемкость и большой расход материалов. Кроме того, эти методы дают ограниченную информацию о параметрах органелл клетки в изображении окрашенной клетки.

Известно, что интерференционные или фазовые изображения обладают рядом необычных свойств. На экране монитора они представлены в виде двумерного распределения оптической разности хода лучей, нормированного на длину волны света. Это свойство фазовых изображений позволяет сравнивать морфологические параметры, полученные в различных условиях и приборах на неокрашенных клетках и использовать их в медицине, например, для иммунной диагностики и исследования механизма действия препаратов на эритроциты и другие клетки.

В работе Yonng Keun Park, выполненной в лаборатории G. Popescu, MIT, США и опубликованной в PNAS, в 2008 году, приведены результаты измерений рефрактерности и флуктуаций мембраны отдельных эритроцитов. Эритроциты были выделены из крови пациента, инфицированного паразитом Plasmodium falciparum. Измерения на оригинальном дифракционном фазовом микроскопе показали корреляцию между средним по объему показателем преломления (или рефрактерностью) эритроцита и температурой пациента на различных стадиях лихорадки. Для вычисления показателя преломления здоровых доноров и больных использовались абсолютные значения фазовой толщины. В качестве дополнительных параметров приведены значения концентрации гемоглобина. Благоприятным обстоятельством являлась их оптическая однородность и отсутствие ядер. Поэтому средние по объему значения показателя преломления, приведенные в указанной выше и во многих других работах, не могут быть использованы в качестве единственного значимого параметра морфологии, характеризующего состояние отдельного мононуклеара.

Ближе к заявляемому изобретению является способ оценки влияния глюкокортикостероидов на моноциты периферической крови по изменению их морфометрических показателей методом компьютерной фазово-интерференционной микроскопии (Терпигорев С.А., Ильченко В.А., Василенко И.А. и др. «Соотношение результатов лечения глюкокортикостероидами с их влиянием на моноциты in vitro при бронхиальной астме» Бюл. Эксп. биол. и мед., 2003, Т. 135-6, стр. 683-687). Этот способ основан на определении изменений морфометрических показателей моноцитов (диаметра, периметра, высоты, площади, объема) после их инкубации с преднизолоном в концентрации 10^-7 и 10^-4 ммоль/л в течение 60 минут при комнатной температуре. При снижении показателей (диаметра, периметра и площади) клеток на 10% и более по сравнению с контролем (с необработанными клетками) прогнозируется эффективность глюкокортикостероидной терапии.

Недостатком этого способа является ограниченная достоверность анализа, связанная с использованием в качестве критерия эффективности терапии фиксированного уровня (10% и более) снижения значимых параметров, большое время измерений и тестирования одного типа препаратов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является, описанный в RU 2382364, и опубликованный 20.02.2010, способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами, включающими исследование методом фазово-интерференционной микроскопии моноцитов периферической крови, определение морфометрических параметров клеток и анализ полученных результатов. Отличительной чертой способа является активация моноцитов больного в течение 15 минут излучением гелий-неонового лазера. В качестве критерия эффективности лечения используется оптическая толщина ядер.

Этот способ прогнозирования методом фазово-интерференционной микроскопии эффективности лечения глюкокортикостероидами, включает в себя исследование in vitro моноцитов периферической крови, обработанных преднизолоном, определение морфометрических параметров моноцитов, анализ полученных результатов, при этом перед обработкой преднизолоном моноциты активируют в течение 10-20 мин гелий-неоновым лазером при мощности (0,5-1,0)10³ Вт/см², регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, затем обрабатывают преднизолоном и повторно регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, и при увеличении этого показателя на 30% и более прогнозируют эффективность лечения глюкокортикостероидами.

Основным недостатком этого способа, который ограничивает возможность его более широкого применения, является использование в качестве активирующего фактора излучения гелий-неонового лазера без указания дозировки. В качестве значимого параметра используется фазовая толщина, в которую дают вклад кроме ядра также другие органеллы.

Заявляемое изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении точности определения состояния Т-лимфоцита, на снижение вероятности нежелательных побочных эффектов и на сокращение времени исследования и стоимости диагноза.

Указанный результат достигается тем, что способ определения степени энергизации Т-лимфоцита, заключающийся в построении фазового изображения (топограммы) Т-лимфоцита, вычислении значимых параметров и анализе полученных результатов, при этом вычисленные значимые параметры используют для построения характеристических прямых и интегральной функции, затем вычисляют отношение тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, - причем участки характеристических прямых должны определяться соответственно ядру и хондриому, после чего результат вычисления сравнивают с табличными значениями степени энергизации клетки.

Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Настоящее изобретение поясняется конкретным примером исполнения, который, однако, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

На фиг. 1 - схематически показано строение клетки;

фиг. 2 - топограмма - проекция лимфоцита и его органелл: цитоплазмы, разветвленной митохондрии (хондриома), ядра и ядрышка в виде двумерного распределения фазовой толщины. В окружающей лимфоцит среде обозначены окружностями различных диаметров внешняя (d₀) и границы (d₁) других органелл.

фиг. 3 - схематически показаны площадь S(h_i) и фазовый объем W(h_i) в сечении 3-мерного изображения h(x,y) горизонтальной плоскостью h_i=const. Максимальное значение фазовой толщины h_max. Наибольшие значения W(h_i) и S(h) соответствуют h_i=0.

фиг. 4 - условное деление на окружности - зоны;

фиг. 5 - профили фазовой толщины h(x) и h(y) в ортогональных сечениях топограммы h(x,y). Диаметры d_i и фазовые толщины h_i (i=0-4) соответствуют предполагаемому положению границ «зон»;

фиг. 6 - s-гистограмма и график функции S(h), на которых обозначены значения фазовой толщины, площади и диаметров, которые отождествлялись с указанными границами «зон»: s-гистограмма отображает зависимость s(h) площади пикселей от фазовой толщины и является статистической характеристики фазового изображения h(x,y). Показаны значения площади S_i на границах «зон» (h_i).

фиг. 7 - различие в профилях рефрактерности Δn_A-D(r) вдоль радиусов, отличающихся поворотом на 90°, объясняется асимметрией структурных элементов клетки. Максимумы на участке (r₂-r₃≈2,8-2 мкм) в профилях рефрактерности Δn_A-D(r) связаны с пространственной неоднородностью хондриома. Сравнительно плоские части профиля с рефрактерностью Δn₃₄≈0.03 в интервале радиусов r₃-r₄≈2-1.25 мкм соответствует ядру, а более высокие значения (Δn₄₅≈0.05-0,06) в ближней к центру зоне (r≤1.25 мкм) - ядрышку;

фиг. 8 - w-гистограмма отображает зависимость плотности фазового объема w(h) клетки от фазовой толщины. Малые (w≈0,01 мкм³/нм) плотности при h≤135 нм соответствуют малой рефрактерности цитоплазмы. Значения W_i обозначают фазовый объем на границах (h_i) «зон»;

фиг. 9 - топограмма лимфоцита в норме. Показаны различные зоны клетки 01, 12, 2, 23, 3. Зона 2 (между 12 и 23) соответствует хондриому клетки, а зона 3 - ядру клетки.

фиг. 10 - демонстрация метода - показаны тангенсы углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся между точками 12, 23 в области 2 и участком интегральной функции фазового объема в области 3, прилегающим к точке 23. Отношение тангенсов углов является параметром, характеризующим степень энергизации клетки;

фиг. 11 - из сравнения профилей фазовой толщины видно изменение формы, отсутствие характерных «плеч» и снижение толщины при ФГА-активации лимфоцита;

фиг. 12 - функции фазового объема Т-лимфоцита в состоянии деэнергизация (3), покоя (2) и повышенной активности (1).

Согласно настоящего изобретения рассматривается новый способ определения степени энергизации Т-лимфоцита, который заключается в исследовании отдельных лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии. Согласно этого метода из суспензии мононуклеаров крови пациента выделяют пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде топограммы, представляющей собой двумерное распределение фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки в виде зон оптической плотности для вычисления значимых параметров.

Новый способ использует в качестве значимых параметров границы зон в фазовом изображении одиночной клетки, которые соответствуют границам органелл и каждая из которых ограничивает участок в фазовом изображении одиночной клетки, толщина которого отличается от толщины смежно расположенного участка или участков, для построения характеристических прямых и интегральной функции по зависимости толщины участков в границах зонах от фазового объема этих зон. При таком подходе степень энергизации Т-лимфоцита одиночной клетки определяется путем сравнения величины параметра, полученного отношением тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, определенным соответственно ядру и хондриому, с табличными значениями параметров степени энергизации клетки.

Показанные на фиг. 5-12 изменения оптических параметров объясняются влиянием происходящих в клетке процессов и внешних факторов на физические параметры ее органелл. Поэтому изменения морфологии, регистрируемые методами оптической микроскопии, традиционно используются в биофизике клетки и для in vitro диагностики в медицине. Мы предлагаем новый метод определения функционального состояния отдельной клетки, основанный на уникальных свойствах фазовых изображений. В фазовом изображении клетки, полученном на интерференционном микроскопе, применение оригинальных алгоритмов позволяет получить набор значимых биофизических параметров. Эти параметры (фазовая толщина, площади и поперечные размеры органелл, фазовые объемы, показатель преломления и др.) являются физическими параметрами и количественно характеризуют морфологию клетки. Они определяются в абсолютных единицах и могут быть получены на различных типах интерференционных микроскопов.

В основу заявленного способа лежит общая последовательность действий, заключающаяся в следующем:

1. Из суспензии мононуклеаров (в т.ч. лимфоцитов) в нормальной среде выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе (в т.ч. в когерентном фазовом микроскопе) для получения изображения мононуклеара в виде топограммы - двумерного распределения фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки, отличающихся по показателю преломления. Клетка представляет собой сложную структуру из функционально связанных между собой органелл. В проекции клетки при ее сканировании с высоким разрешением можно получить «зоны» - области, отличающиеся по фазовой толщине. В трехмерном изображении клетки ее участкам с более высокими значениями показателя преломления, например, ядра, соответствуют большие фазовые толщины.

Набор параметров физических параметров (площадь, диаметр, рефрактерность, фазовый объем и др.) на границах «зон» мы используем в качестве характеристики функционального состояния. Мы обозначаем здесь термином «значимые» такие параметры, изменениям которых можно дать биофизическую или медицинскую интерпретацию. В фазовую толщину каждой «зоны» дают вклад органеллы клетки. На этом основано определение «нормы», в виде набора параметров в базе (банке) данных нормально функционирующей клетки здорового (не больного и не подверженного внешнему воздействию или воздействию лекарственных препаратов) человека. Формирование банка наборов параметров для клеток доноров разного пола, возраста и т.д. людей, позволит количественно сравнивать его набор с наборами, характерными для «нормы» и для различных патологий, и затем по данным корреляционного анализа предлагать диагноз с численной вероятностной оценкой.

В перспективе такой подход может быть использован в проблеме т.н. персонализированной медицины, для индивидуальной оценки аллергенного и фармакологического действия препаратов, трансплантатов и других факторов на конкретного человека. Формирование личного (персонифицированного) банка наборов значимых параметров позволит анализировать динамику изменений, проследить тенденции изменения этих параметров и прогнозировать начало отклонений.

2. Фазовое изображения оптически неоднородной клетки представляет собой двумерное распределение оптической разности хода, которое характеризует локальное значение оптической плотности клетки или т.н. локальную фазовую толщину. Более плотным органеллам, например, ядру, соответствуют большие значения фазовой толщины. Границы «зон» в фазовом изображении клетки соответствуют границам органелл и распознаются по заметному изменению фазовой толщины. В сечении горизонтальной плоскостью фазового изображения можно определить площадь органеллы и т.н. фазовый объем отсеченного фрагмента. Под фазовым объемом мы понимаем произведение физического объема на рефрактерность. По значениям фазовой толщины на границах «зон» с помощью гистограмм фазовой толщины и фазового объема и других алгоритмов можно определить значимые параметры в изображении клетки и использовать их набор для характеристики ее функционального состояния.

3. Наборы значимых параметров одиночных мононуклеаров используют для установления уровня нормы и для характеристики изменений функционального состояния мононуклеаров при действии различных факторов и формирования базы (банка) данных.

На функциональное состояние и параметры микроскопического изображения клетки влияют внешние факторы и происходящие внутри нее метаболические процессы. Типы клеток, и характеристики процессов очень разнообразны. Для их анализа, в частности, используются новые методы оптической микроскопии. Они обеспечили значительное увеличение информативности изображений клетки путем введения новых параметров. Одним из таких параметров, имеющих высокий диагностический потенциал, может быть связан с состоянием ретикулума и рефрактерностью митохондрий

Здесь мы предлагаем использовать рефрактерность ретикулума и ядра Т-лимфоцита в качестве такого достаточно «универсального» параметра метаболической активности. Физической основой для этого нового метода является хорошо известный факт - синтез в митохондриях молекулы АТФ, которая является универсальным источником энергии для процессов в клетках различной природы и их органеллах.

4. Количественную оценку степени энергизации клеток производят по результатам анализа фазового изображения, полученного с помощью указанных выше или других типов интерференционного микроскопа. Для определения набора значимых параметров изображения клетки используют различные известные алгоритмы и программное обеспечение.

В качестве параметра, характеризующего энергизацию клетки, предлагается использовать отношение тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся между точками 12 23 в области 2 и участком интегральной функции фазового объема в области 3, прилегающим к точке 23 (фиг. 10):

Для построения характеристических прямых используется аппроксимация первой степени зон функции фазового объема, соотносимых с ретикулумом (зона 2) и ядром (зона 3).

В качестве экспериментальной модели для проверки метода использовались мононуклеары периферической крови здоровых доноров. Свежевыделенные клетки суспендировали в среде 199 и определяли ее параметры в "норме". Для характеристики "активированного" состояния клетки ее предварительно выдерживали в течение 1 ч при 37°C в среде с поликлональным митогеном - фитогемагглютинином (ФГА; 2 мкг/мл). Суспензию клеток наносили в виде капли на полированную кремниевую подложку и затем под покровным стеклом помещали на предметный стол когерентного фазового микроскопа "Эйрискан" (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V. 2010, 58(3). P. 107-1016; В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т. 177(5), стр. 535-552). Спейсер толщиной 15 мкм между кремниевой подложкой и покровным стеклом препятствовал деформации клеток. Измерения проводили не более 30 мин с использованием предохранительной шторки для минимизации действия на клетки излучения гелий-неонового лазера (λ=633 нм, 1 мВт).

Положение клетки в измерительной камере схематически показано на фиг. 2. Изображение получали на фазовом микроскопе "Эйрискан" растровым методом (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V. 2010, 58(3). P. 107-1016), в котором значения ОРХ определялись последовательно в каждом пикселе изображения компенсационным методом (В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т. 177(5), стр. 535-552). В этом методе фаза опорной волны изменялась по линейно-периодическому закону движением зеркала в опорном плече интерферометра. Растровое сканирование изображения и регистрация интерференционного сигнала производились координатно-чувствительным фотоприемником - диссектором ЛИ-620. Этот метод позволил получить сверхдифракционное пространственное разрешение и регистрировать в клетках динамические процессы в реальном времени. Ограниченная шумами чувствительность к изменениям ОРХ была около 1 нм. Авторы считают, что параметры интерференционного микроскопа в данном случае не имели решающего влияния на результаты.

Авторы исходили из предположения, что в фазовом изображении клетки можно выделить "зоны" с различной фазовой толщиной, границы которых соответствуют границам органелл и различаются по показателю преломления. В отдельных случаях преобладающий вклад в фазовую толщину дает только одна органелла. Например, известно, что ядро и окружающая его разветвленная митохондрия (хондриом) являются наиболее плотной частью структуры клетки (см. фиг. 2, 3 и 4), и наименее плотная - периферийная часть цитоплазмы (см. фиг. 3 и фиг. 4). Разработанные авторами алгоритмы обеспечивали получение в фазовых изображениях следующих функций и параметров: а - профиля фазовой толщины h(x) - зависимости фазовой толщины в поперечном сечении клетки; б - зависимости рефрактерности Δn(r) от радиуса в изображении клетки, и численных значений рефрактерности органелл Δn(r_i) на границах «зон»; в - гистограмм s(h) - зависимости плотности площади пикселей от фазовой толщины (h) в топограмме h(x,y); r - функции S(h) - зависимости площади в сечении изображения клетки от фазовой толщины; д - гистограммы w(h) - зависимости плотности фазового объема структурного элемента изображения от фазовой толщины; е - функции W(h) - зависимости фазового объема элементов клетки в интервале значений фазовой толщины (0-h). В гистограммах, в профилях фазовой толщины, графиках S(h) и s(h) были определены значения фазовой толщины (h_i), которые являются границами "зон". Из оптической модели клетки следовало, что, в отдельных «зонах» можно было выделить преобладающий вклад конкретных органелл (периферийной и плотной цитоплазмы, хондриома, ядра и ядрышка). Численные значения функций S(h_i) и W(h_i) позволили определить площадь частей изображения внутри контура с фиксированной фазовой толщиной (h_i) и вычислить диаметры (d_i) окружностей, равных им по площади (см. фиг. 4). Было показано, что при некоторых условиях диаметры d_i можно отождествить с границами органелл и дать адекватную биофизическую интерпретацию параметрам «зон».

На изображении (топограмме) Т-лимфоцита на фиг. 2 границы "зон" показаны в виде окружностей соответствующих диаметров (d_i). Диаметр d₀ мы отождествляем с внешней границей клетки, d₁ - с границей периферийной и плотной частей цитоплазмы, d₂ - с границей плотной части цитоплазмы с хондриомом (разветвленной гигантской митохондрией), d₃ - с границей хондриома с ядром, d₄ - с границей ядра и ядрышка. На площадь кольца ΔS_ij=S_i-S_j ограниченную диаметрами d_i и d_j, проецируется часть клетки, которой соответствует фазовый объем ΔW_ij. На фиг. 3 схематически показаны площадь S(h) в сечении 3-мерного изображения h(x,y) горизонтальной плоскостью h_i=const и часть фазового объема W(h_i). Под фазовым объемом части клетки мы понимаем произведение W(h_i)=Δn_0iV(h_i) ее геометрического объема V(h_i) и рефрактерности (Δn_0i=n_i-n₀), где n_i - показатель преломления органеллы.

Параметры соответствующих "зон", площадь которых ограничена диаметрами d_i и d_j (j=i+1), мы обозначаем двумя индексами границ. Из фиг. 2, 3 и 4 следует, что на площадь «зон» (за исключением 1-2) проецируется и дает вклад в фазовую толщину нескольких органелл. Одним из наиболее значимых параметров являются значения рефрактерности (Δn_0i) на i-й границе. Для их вычисления было использовано представление фазовой толщины суммой вкладов (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V. 2010, 58(3). P. 107-1016):

где h_i(x,y)=H_i(x,y)Δn_0i, H_i(x,y) - геометрическая толщина i-й границы, и оптической модели клетки в виде системы концентрических сферических слоев.

В профилях фазовой толщины h(x) и h(y) на фиг. 5, полученных в диаметральных сечениях топограммы Т-лимфоцита (фиг. 2), обозначены диаметры (d_i) и значения толщины (h_i), которые соответствуют границам "зон". Видно, что профили h(x) и h(y) несколько отличаются по форме. Внешнему диаметру клетки (d₀) на профиле h(x) соответствует нижнее значение фазовой толщины (h₀=0). В фазовую толщину (h₀≤h≤h₁) первой "зоны" (0-1) дает вклад только периферийная часть цитоплазмы, почти лишенная крупных органелл. С приближением к центру клетки фазовая толщина растет. Это связано с последовательно возрастающими вкладами: плотной части цитоплазмы с ретикулома в интервале высот и диаметров в области (1-2), хондриома (2-3), ядра (3-4) и ядрышка (h₄≤h≤h_max) (4-5). Морфология клетки, размеры и рефрактерность органелл влияют на долю точек в заданном интервале фазовой толщины (h, Δh) и, соответственно, на форму s-гистограммы. Проекции пологих участков h(x,y) соответствует большое число точек и максимум в s-гистограмме для этого интервала фазовых толщин.

Выше отмечалось, что функция S(h), полученная интегрированием s-гистограммы, отображает зависимость площади в сечении клетки от положения плоскости h=const. Часть левого максимума в s-гистограмме на фиг. 6 соответствует сравнительно большой площади подложки и не имеет отношения к клетке. Правый его склон отражает вклад рефрактерности (Δn₀₁) периферийной части цитоплазмы. Известно, что ее показатель преломления мало отличается от n₀=1,333 для воды. Максимальный вклад периферийной цитоплазмы в фазовую толщину на границе с плотной цитоплазмой не превышает h₁=25 нм. Широкий правый максимум s-гистограммы в интервале 115≤h≤165 нм соответствует вкладу в фазовую толщину более плотной части клетки (хондриома, ядра и ядрышка). Монотонный рост функции S(h) (фиг. 6) от нуля в центре (при h_max≈220 нм) до максимального значения S₀=40 мкм² соответствует увеличению площади сечения у основания (h=0). Значения функции S(h_i) в характерных точках (h_i) были использованы для определения диаметров (d_i) эквивалентных по площади окружностей, которые условно отождествлялись с границей i-й «зоны». Увеличение S(h) при отрицательных значениях (h≤0) соответствует площади подложки и не связано с клеткой. В фазовую толщину 1-й "зоны", площадь которой ΔS₀₁=S₀-S₁=8 мкм₂ ограничена внешней (d₀≈7,14 мкм, h₀=0) и внутренней d₁≈6.4 мкм, h₁=35 нм) окружностями, проецируется и дает вклад только периферийная часть цитоплазмы клетки. На фиг. 6 обозначены значения фазовой толщины, площади и диаметров, которые условно отождествлялись с указанными границами органелл: S₂=24 мкм², h₂=115 нм (d₂≈5.5 мкм); S₃=10 мкм, h₃=165 нм (d₃≈3.6 мкм); S₄≈2 мкм², h₄=200 нм, (d₄≈1,6 мкм). Площади колец ("зон") соответственно были равны, мкм²: ΔS₀₁=8; ΔS₁₂=8; ΔS₂₃=14; ΔS₃₄=6; ΔS₄₅=S₄≈2 мкм². В некоторых случаях граница между хондриомом и ядром (h₃) была трудно различима. Из приведенных выше величин следует, что на цитоплазму (ΔS₀₁+ΔS₁₂)=16 мкм² в топограмме Т-лимфоцита в норме приходится 40% площади всей клетки (S₀).

W-гистограмма и функция W(h) (фиг. 8) позволили получить дополнительные сведения о морфологии Т-лимфоцита. Понятие фазового объема, по-видимому, не часто используется в биофизике клетки, и мы здесь на конкретных примерах покажем возможность его использования для характеристики состояния Т-лимфоцита. Малые значения (w≈0,01 мкм³/нм) плотности фазового объема в интервале 0≤h≤135 нм отображают малую рефрактерность периферийной цитоплазмы и ретикулума. Увеличение плотности до w≈0,04 мкм³/нм и сохранение высокого уровня в интервале 115≤h≤165 нм объясняется более высокой рефрактерностью и большими геометрическими объемами хондриома и ядра. Снижение плотности в интервале 165≤h≤200 нм связано с малым геометрическим объемом ядрышка, несмотря на его высокую рефрактерность. Функция W(h) позволяет получить численные значения фазового объема W(h_i) на границах "зон", мкм3: W₀=10; W₁=9,7; W₂=7,6; W₃=3,6; W₄=0,8; Соответственно, разность этих значений позволяет оценить фазовые объемы структур, которые проецируются в эти «зоны», мкм³: ΔW₀₁=0,3; ΔW₁₂=2,1; ΔW₂₃=4,0; ΔW₃₄≈2,8; ΔW₄₅=W₄≈0,8. В данном случае на цитоплазму Т-лимфоцита в норме приходится (ΔW₀₁+ΔW₁₂)=2,4 мкм³ или ≈24% от всего фазового объема. Остальные 76% приходятся на оптически более плотные структуры клетки (ядро и хондриом). Ниже будет показано, что функциональное состояние клетки оказывает заметное влияние на фазовые объемы органелл.

На фиг. 7 показаны результаты вычисления профиля рефрактерности Δn(r)_A-D в виде ее зависимости от радиуса r. Четыре профиля были получены в сечениях (А-D), отличающихся поворотом на 90°. Различие в форме и в положении максимумов свидетельствует о заметной асимметрии распределения оптической плотности в Т-лимфоците, несмотря на его близкую к сфере форму. Там же обозначены радиусы r_i=d_i/2, соответствующие границам органелл. Следует обратить внимание на максимумы рефрактерности (Δn₂₃≈0.035-0,05) в интервале радиусов r₂-r₃≈2,8-2 мкм, которые мы отождествляем с границами 3-й «зоны» с преобладающим вкладом хондриома. Из приведенных в статье Т. Кару изображений на электронном микроскопе следует, что пространственная структура хондриома весьма неоднородна. С этим обстоятельством, по-видимому, связано различие в форме профилей в сечениях A-D. Эта асимметрия становилась менее заметна при деэнергизации Т-лимфоцита. Расположенные ближе к центру участки профиля мы отождествляем с вкладом ядра (Δn₃₄≈0.03), которому по нашим оценкам соответствует внешняя граница r₃≈2,0 мкм, и ядрышку (Δn₄₅≈0.05-0,06) в пределах r₄≤1,25 мкм. Эти значения рефрактерности на границах «зон» входят в набор значимых параметров.

Для проведения исследований забор крови (4-5 мл) производят из локтевой вены и стабилизируют ее в пробирке гепарином в концентрации 25 ЕД на 1 мл крови. Мононуклеары выделяют стандартным методом на градиенте плотности для лимфоцитов Ficoll-Paque (p=1,077 г/см³) производства AmershamBiosciences (Швеция). Кровь разбавляют физраствором 1:1 и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 45 мин. Суспензию Т-лимфоцитов в среде 199 вместе с тестируемый препаратом наносят в виде капли 3-4 мкл на полированную кремниевую подложку, накрывают покровным стеклом и помещают на предметный стол микроскопа. Измерения производят на каком-либо интерференционном микроскопе, например, на когерентных фазовых микроскопах «Эйрискан» или «Цитоскан».

Для проверки метода были выделены Т-лимфоциты 12 доноров. Среди них были 5 здоровых и 7 пациентов с различными системными заболеваниями. Ниже показаны характерные для нормы гистограммы, профиль рефрактерности Т-лимфоцита здорового донора и усредненный по Т-лимфоцитам пяти здоровых доноров их «фазовый портрет».

В таблицах 1 и 2 показаны значимые параметры характерных «фазовых портретов» Т-лимфоцитов здорового донора в норме (таблица 1) и ФГА-активированного Т-лимфоцита (таблица 2). Здесь для обозначения величин параметров на границах органелл использованы индексы: 0 - внешняя граница периферийной части цитоплазмы; 1 - плотная часть цитоплазмы, 2 - хондриом (разветвленная митохондрия); 3 - ядро; 4 - ядрышко. Вариабельность параметров в ансамбле Т-лимфоцитов не превышала ±15%.

В табл. 1 приведены характерные значения параметров Т-лимфоцита в норме. Измерения 30 клеток показали сравнительно небольшую вариабельность параметров. Например, в норме максимальная фазовая толщина находилась в пределах h₀=200-250 нм, площадь S₀=40-50 мкм², фазовый объем W₀=8-12 мкм³, средние значения рефрактерности <Δn>=0,03-0,04. Вариабельность остальных параметров была в тех же пределах.

Смещение вправо в столбцах значений ΔS, ΔW и <Δn> обозначает, что они относятся к "зоне" между границами.

Далее мы кратко отметим важность адекватной биофизической интерпретации параметров набора в общепринятых терминах. Результатов измерений лимфоцитов в различных средах пока еще очень мало и мы ниже приводим один пример, из которого следует вывод о зависимости параметров набора от состояния клетки и возможность их биофизической интерпретации.

Из учебников по иммунологии и работы (V. Manteifel, L. Bakeeva, Т. Kara, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V. 38. P. 25-30) известно, что в начальной фазе ФГА-активации (в пределах ≈1 ч воздействия) в Т-лимфоцитах происходит переход из состояния покоя (G0) в активированное (S-состояние) и оно сопровождается индукцией транскрипции, трансляцией и секрецией цитокинов. Естественно предполагать, что эти процессы отражаются на параметрах фазового изображения. Результаты измерений ФГА-активированного Т-лимфоцита приведены в табл. 2.

Измерения Т-лимфоцита в среде с ФГА (2 мкг/мл) показали заметное снижение фазовой толщины от 220 до ≈150 нм и изменение формы профиля (фиг. 11). Площадь хондриома ΔS₂₃ снизилась до 8 мкм и немного возросла (до S₃=20 мкм²) у ядра. Увеличение площади S₂ периферийной цитоплазмы связано с большим диаметром клетки (d₀≈9,8 мкм). Но более заметные изменения произошли в графике функции W(h). Произошло 4-кратное увеличение фазового объема периферийной цитоплазмы (ΔW₀₁=1,3 мкм) и снижение фазового объема плотной части (от W₂=7,6 до 5,2 мкм³). Общий объем также снизился до W₀≈8.5 мкм³.

В таблице 2 приведены характерные значения параметров ФГА-активированного Т-лимфоцита.

Сравнение данных в двух таблицах позволяет сделать следующие выводы. При ФГА-активации заметные количественные изменения произошли почти во всех параметрах и в этом смысле их можно отнести к «значимым». Увеличение площади и фазового объема периферийной части цитоплазмы можно объяснить процессами синтеза белков и цитокинов на рибосомах, дроблением хондриома на митохондрии, транспортом субстрата из внешней среды и синтезом АТФ. Причиной увеличения фазового объема периферийной цитоплазмы может быть перемещение в нее митохондрий, имеющих более высокий уровень рефрактерости. Этот вывод согласуется со снижением (до W₂=5.2 мкм³) фазового объема плотной части клетки (хондриома и ядра). В норме в фазовую толщину (h₂=135 нм) на границе плотной части (h₂≤135 нм) преобладающий вклад давали хондриом и ядро. Их вклады в фазовый объем (W₂=7,6 мкм) были близки. Снижение фазового объема плотной части при активации объясняется отсутствием вклада хондриома при почти неизменном объеме ядра (W₃≈3.2 мкм). Снижение рефрактерности ядра при ФГА-активации мы объясняем увеличением его диаметра до d₃≈6 мкм и 2-3-кратным увеличением геометрического объема. Физической причиной снижения рефрактерности может быть деконденсация хроматина (V. Manteifel, L. Bakeeva, Т. Каш, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V. 38. P. 25-30), которая связана с РНК-транскрипцией, секрецией цитокинов и другими характерными для S-фазы процессами.

Из сравнения значимых параметров в таблицах следует вывод о зависимости значимых параметров от состава среды и состояния донора.

По-видимому, рефрактерность и фазовый объем "зон" являются основными значимыми параметрами в сложной иерархии диагностических факторов ФП. Это объясняется фундаментальным характером зависимости физических параметров клетки от процессов синтеза АТФ, транскрипции РНК, синтеза аминокислот на рибосомах и т.д. Авторы не исключают также, что на последних фазах активации становятся заметными признаки апоптоза. Известно (V. Tychinsky, A. Kretushev, I. Klemyashov, T. Vyshenskaya, N. Filippova, N. Rakchlin, A. Shtil, Quantitative real-time analysis of nuclear stress by coherent phase microscopy, J. of Biomedical Optics, 2008. V. 13(6). P. 1205-1214; С.В. Бойчук, М.Л. Миннебаев, И.Г. Мустафин, Ключевая роль митохондрий в апоптозе лимфоцитов, Бюл. Эксп. биологии и медицины. 2001, Т. 132(12), С. 644-647), что его характеристиками являются снижение метаболической активности хондриома и мембранного потенциала митохондрий.

Выше неоднократно отмечалось уникальное свойство фазовых изображений - абсолютным, нормированным на длину волны значением ОРХ. Наиболее важным его достоинством набора является большое число значимых параметров и увеличение объема информации в изображении одной клетки. Это имеет фундаментальное значение для биофизики клетки и дает возможность измерений в реальном времени физических параметров органелл клетки, исследовать механизмы действия на нее внешних факторов и т.д. Важным фактором считается возможность количественной характеристики состояния клетки физическими параметрами. Это позволит сравнивать результаты, полученные на различных объектах и приборах. Использование этой методологии позволит существенно уменьшить объем измерений и время диагноза. Эти факторы имеют решающее значение при обстоятельствах, когда время анализа ограничено и приходится искать нетрадиционные подходы к проблеме in vitro диагностики и для исследований индивидуального отклика иммунно-компетентных клеток крови. В методах in vitro диагностики увеличение числа значимых параметров позволит уменьшить число анализируемых клеток, сократить время измерений и расход материалов. Представление значимых параметров в абсолютных величинах позволит сравнивать результаты регистрации в реальном времени структурных изменений и процессов в живой, неокрашенной клетке, полученные на различных интерференционных микроскопах.

Применение предлагаемого способа определения метаболической активности клетки могут быть различные параметры, в т.ч. ее микроскопических изображений. Здесь, по-видимому впервые, разность крутизны ΔP двух смежных участков графика функции фазового объема, использовалась в качестве значимого параметра. Функция фазового объема универсальна и ее значения определяются только оптической плотностью и размерами органелл. позволяет избежать неоправданного назначения этих препаратов, поскольку даже кратковременное их применение может привести к различным осложнениям.

Для подтверждения метода, заявляемого в патенте, были проведены следующие эксперименты: длительное облучение одной клетки лазером, приводящее к ее деэнергизации, исследование деэнергизации клеток в результате длительного нахождения в буфере в отсутствии питательных субстратов и воздействие на клетку веществ, приводящих к уменьшению мембранного потенциала митохондрий (фитогемагглютинин, ротенон). Фазовые изображения клеток в питательной среде при минимизации облучения лазером были приняты за норму. В результате удалось выделить три основных энергетических состояния Т-лимфоцита: 1 - повышенная энергизация E≥4.5; 2 - норма 1.5≤E<4 и 3 - деэнергизация E<1.5 (фиг. 12).

Способ определения степени энергизации Т-лимфоцита, заключающийся в исследовании отдельных лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии, при котором из суспензии мононуклеаров крови пациента выделяют пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде топограммы, представляющей собой двумерное распределение фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки в виде зон оптической плотности для вычисления значимых параметров, отличающийся тем, что в качестве значимых параметров используют границы зон в фазовом изображении одиночной клетки, которые соответствуют границам органелл и каждая из которых ограничивает участок в фазовом изображении одиночной клетки, толщина которого отличается от толщины смежно расположенного участка или участков, для построения характеристических прямых и интегральной функции по зависимости толщины участков в границах зон от фазового объема этих зон, а степень энергизации Т-лимфоцита одиночной клетки определяют путем сравнения величины параметра, полученного отношением тангенсов углов наклона характеристических прямых к участкам интегральной функции, находящихся в области ретикулума клетки, с нормой и крайними значениями параметра степени энергизации клетки.