Улучшенные аминокислотные последовательности, направленные против респираторно-синцитиального вируса человека (hrsv), и полипептиды, включающие такие последовательности, для профилактики и/или лечения инфекций дыхательных путей

Авторы патента:

ДЕПЛА Эрик (BE)

СТОРТЕЛЕРС Кателейне (BE)

СТАЛЕНС Стефани (BE)

C07K16/10 - из РНК вирусов

A61P31/14 - против вирусов РНК

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2577134:

АБЛИНКС НВ (BE)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к аминокислотным последовательностям, которые направлены против и/или которые могут специфически связывать белок F hRSV. Заявлены соединения или конструкции, в частности белки и полипептиды, которые включают или, по существу, состоят из одной или трех таких аминокислотных последовательностей. Также изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные аминокислотные последовательности и полипептиды, к фармацевтическим композициям, способам лечения и профилактики заражения hRSV. Полипептиды и композиции по изобретению проявляют улучшенную стабильность, меньшую иммуногенность и/или улучшенную аффинность и/или авидность в отношении белка F hRSV. 16 н. и 12 з.п. ф-лы, 21 ил., 16 табл., 22 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые направлены на и/или которые могут специфически связывать (как определено в данном описании) белок F hRSV, а также к соединениям иди конструкциям, и в частности, белкам и полипептидам, которые включают или, по существу, состоят из одной или нескольких таких аминокислотных последовательностей (также называемым в данном описании «аминокислотная(ые) последовательностей) по изобретению», «соединение(я) по изобретению», «конструкция(и) по изобретению» и «полипептид(ы) по изобретению», соответственно).

Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие аминокислотные последовательности (также называемым в данном описании «нуклеиновая(ые) кислота(ы) по изобретению» или «нуклеотидная(ые) последовательностей) по изобретению»; к способам получения таких аминокислотных последовательностей и полипептидов; к клеткам-хозяевам, экспрессирующим или способным экспрессировать такие аминокислотные последовательности или полипептиды; к композициям, и в частности, фармацевтическим композициям, которые включают такие аминокислотные последовательности, полипептиды, соединения или конструкции, нуклеиновые кислоты и/или клетки-хозяева; и к применениям таких аминокислотных последовательностей, полипептидов, соединений или конструкций, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев и/или композиций, в частности, для профилактических и/или лечебных целей, таких как профилактические и/или лечебные цели, упоминаемые в данном описании.

Другие аспекты, преимущества и применения изобретения станут ясными из дальнейшего описания.

Уровень техники

Респираторно-синцитиальный вирус человека (hRSV) является членом семейства Paramyxoviridae и является оболочечным вирусом с двумя основными гликопротеинами поверхности, которые образуют шипы на вирусной частице. Один из таких гликопротеинов (белок G) является прикрепляющим белком, который опосредует связывание вируса с поверхностью клетки. Другой гликопротеин (белок F или слияния) опосредует слияние вирусной и клеточной мембран, допуская проникновение вирусного нуклеокапсида в цитоплазму клетки. Ингибирование стадий, опосредуемых или G- или F-гликопротеинами, блокирует начальные стадии инфекционного цикла и нейтрализует инфекционность вируса. Поэтому антитела, направленные против или G или F и ингибирующие их соответствующую активность, могут нейтрализовать инфекционность вируса и могут защитить от заражения hRSV. Белок F является высококонсервативным и образует тримерные выступы, которые претерпевают конформационные изменения после активации.

В зимние месяцы hRSV является основной причиной тяжелых инфекций нижних дыхательных путей (бронхиолита и пневмонии) у новорожденных и детей младшего возраста и вызывает ежегодные эпидемии. Вирус также является причиной тяжелых заболеваний среди людей пожилого возраста, и взрослых предрасположенных к сердечно-легочным расстройствам и/или иммуносупрессивным состояниям, которые также находятся в группе риска тяжелого течения заболевания hRSV. Иммунная реакция не предотвращает повторных заражений.

Не существует вакцины, способной предотвратить заражение hRSV. Единственным доступным на рынке лекарственным средством являются гуманизированные моноклональные антитела (Синагис® (Synagis®)), направленные против одного из гликопротеинов вируса (белка F), который используют для профилактики у детей, которые находятся в группе повышенного риска развития тяжелого инфекционного заболевания hRSV. Ограниченное применение Синагиса® имеет место, по меньшей мере, частично, из-за высокой стоимости указанного продукта. Существует отчетливая потребность в улучшенных и/или более дешевых профилактических и/или терапевтических средствах для предупреждения и или лечения заражений hRSV.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям (также называемым «аминокислотная(ые) последовательность(и) по изобретению», полипептидам (также называемым «полипептид(ы) по изобретению») и терапевтическим соединениям и композициям, которые направлены против белка F hRSV и имеют улучшенные профилактические, терапевтические и/или фармакологические свойства в дополнение к другим выгодным свойствам (таким как, например, более легкое получение и/или уменьшенная стоимость товара) по сравнению с аминокислотными последовательностями и антителами предшествующего уровня техники. Такие улучшенные и выгодные свойства станут более ясными из дальнейшего описания. Без ограничений, аминокислотные последовательности, полипептиды и терапевтические соединения и композиции по изобретению могут показывать улучшенную стабильность, меньшую иммуногенность, улучшенное связывание с белком F hRSV, улучшенную аффинность и/или авидность в отношении белка F hRSV, улучшенную эффективность и/или активность нейтрализации hRSV (как определено в данном описании), улучшенную селективность в отношении белка F hRSV, и/или они могут быть способны частично или, предпочтительно, полностью блокировать взаимодействие белка F hRSV с хозяйской клеткой-мишенью или ее мембраной. Они могут быть способны к нейтрализации hRSV путем модуляции, ингибирования и/или предотвращения инфективности hRSV, путем модуляции, ингибирования и/или предотвращения слияния hRSV с (клеточной мембраной) хозяйской клетки-мишени и/или путем модуляции, ингибирования и/или предотвращения проникновения hRSV в хозяйскую клетку-мишень (как определено в данном описании). Они могут быть перекрестно реагирующими с и/или способными к нейтрализации различных вирусных штаммов hRSV и/или различных «ускользнувших» мутантов hRSV.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к ряду тяжей из аминокислотных остатков (как определено в данном описании), которые особенно подходят для связывания со специфическим эпитопом белка F hRSV. Такие тяжи аминокислотных остатков могут присутствовать в и/или могут быть введены в аминокислотные последовательности по изобретению, в частности, таким образом, что они образуют антигенсвязывающий сайт (или его часть) аминокислотной последовательности по изобретению. Полученные аминокислотные последовательности будут способны связывать специфический эпитоп на белке F hRSV, который находится, образует часть или перекрывает (т.е. в первичной или третичной структуре) или находится в непосредственной близости к (т.е. в первичной или третичной структуре) антигенному сайту II на белке F hRSV (т.е. аминокислотным остаткам 250-275 белка F hRSV).

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

b) тяж из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 102, при условии, что

i) указанный тяж из аминокислотных остатков имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 6 (позиции 54, определенной согласно нумерации по Кабату) и

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые включают два или больше тяжей из аминокислотных остатков, один тяж из которых выбран из следующего:

a) SEQ ID NO:102;

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, которая включает указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

e) SEQ ID NO: 121; и

f) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

так что тяж из аминокислотных остатков, который соответствует одному из а) и b), должен всегда присутствовать в аминокислотной последовательности по изобретению, и так что второй тяж из аминокислотных остатков выбран из одного из с), d), e) и f).

Даже предпочтительнее, аминокислотные последовательности по изобретению включают три или больше тяжей из аминокислотных остатков, первый тяж из которых выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам; или второй тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

c)SEQ ID NO: 102;

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 102, при условии, что

и третий тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аминокислотные последовательности, включающие один или несколько таких специфических тяжей из аминокислотных остатков, проявляют улучшенные свойства, такие как, например, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанные далее в данном описании), улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV и/или улучшенной эффективности и/или активности в отношении нейтрализации hRSV.

Аминокислотная последовательность по изобретению может, в частности, представлять собой доменное антитело (или аминокислотную последовательность, которая подходит для использования в качестве доменного антитела), однодоменное антитело (или аминокислотная последовательность которая подходит для использования в качестве однодоменного антитела) «dAb» (или аминокислотную последовательность, которая подходит для использования в качестве dAb) или нанотело® (определенное в данном описании и включающее, но не ограниченное указанным, V_HH-последовательность); другие отдельные вариабельные домены или любой подходящий фрагмент любого из них.

В этом отношении аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102;

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 102, при условии, что

Такие предпочтительные гипервариабельные участки (последовательности CDR2) также называются «CDR2 по изобретению».

Предпочтительно, аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102 или

и, по меньшей мере, один из CDR1 или CDR3 выбран из

- CDR1, выбранного из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 98;

и/или

- CDR3, выбранного из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121 или

Даже предпочтительнее, аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых

- CDR1 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102 или

- CDR3 выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

В конкретном аспекте аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102. Предпочтительно, аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению включает SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Настоящее изобретение также относится к ряду гуманизированных аминокислотных последовательностей, которые, в частности, подходят для связывания белка F hRSV. Аминокислотные последовательности по настоящему изобретению проявляют уменьшенную иммуногенность при введении человеку. Кроме того, аминокислотные последовательности по настоящему изобретению проявляют другие улучшенные свойства, такие как, например, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), в отношении белка F hRSV, улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV и/или улучшенной эффективности и/или активности в отношении нейтрализации hRSV, по сравнению с соответствующими им аминокислотными последовательностями дикого типа (описанными в заявке РСТ/ЕР 2009/056975, озаглавленной «Аминокислотные последовательности, направленные на белки оболочки вируса и включающие их полипептиды для лечения вирусных заболеваний», поданной Ablynx N.V. 5 июня 2009).

Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 60-76, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату); и

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 60-76.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78 и/или аргинин (Arg, R) в позиции 83 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные аминокислотные последовательности по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 65 и 76, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 54, глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78 и/или аргинин (Arg, R) в позиции 83 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76.

a) SEQ ID NO: 146-153;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 146-153, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 146-153.

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 147, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 148, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 149, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

- SEQ ID NO: 153, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные аминокислотные последовательности по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Настоящее изобретение относится к ряду аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, оптимизированных по последовательности, которые проявляют повышенную стабильность при хранении во время исследований стабильности, и которые особенно подходят для связывания белка F hRSV. Аминокислотные последовательности по настоящему изобретению проявляют уменьшенную пироглутаматную посттрансляционную модификацию N-конца и, следовательно, имеют повышенную стабильность продукта. Кроме того, аминокислотные последовательности по настоящему изобретению проявляют другие улучшенные свойства, такие как меньшая иммуногенность, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, в виде величины IC₅₀, описанных далее в данном описании) в отношении белка F hRSV, улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV и/или улучшенной эффективности и/или активности в отношении нейтрализации hRSV, по сравнению с их соответствующими исходными аминокислотными последовательностями (описанными в заявке РСТ/ЕР 2009/056975, озаглавленной «Аминокислотные последовательности, направленные на белки оболочки вируса и включающие их полипептиды для лечения вирусных заболеваний», зарегистрированной Ablynx N.V. 5 июня 2009).

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям и/или нанотелам®, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аминокислотные последовательности и нанотела® по изобретению предпочтительно находятся в, по существу, изолированной форме (как определено в данном описании) или образуют часть белка или полипептида по изобретению (также называемых в данном описании «полипетид по изобретению» или «белок по изобретению»), которые могут включать или, по существу, состоять из одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению, и которые могут, необязательно, также содержать одну или несколько других аминокислотных последовательностей или нанотел® (все необязательно соединенные через один или несколько подходящих линкеров).

Соответственно, в другом аспекте изобретение также относится к белку или полипептиду (также называемых в данном описании «белок по изобретению» или «полипетид по изобретению», соответственно), который включает или, по существу, состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению (или их подходящих фрагментов).

Например, и без ограничения, одну или несколько аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению можно использовать в качестве связывающей единицы в таком белке или полипептиде, так что получается моновалентный, поливалентный или полипаратопный полипептид по изобретению, соответственно, все описанные в данном описании. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду, который представляет собой моновалентную конструкцию, включающую или, по существу, состоящую из аминокислотной последовательности и/или нанотела® по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду, который является поливалентным полипептидом, таким как, например, двухвалентный или трехвалентный полипептид. Настоящее изобретение также относится к полипептиду, который является полипаратопным полипептидом, таким как, например, бипаратопный или трипаратопный полипептид.

В предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению (описанных выше).

В одном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из аминокислотных последовательностей, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

1) указанный тяж из аминокислотных остатков имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 6 (позиции 54, определенной согласно нумерации по Кабату); и

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В другом аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из аминокислотных последовательностей, которые включают два или больше тяжей из аминокислотных остатков, из которых один тяж выбран из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

i) указанный тяж из аминокислотных остатков имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 6 (позиции 54, определенной согласно нумерации по Кабату); и

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121; и

так что тяж из аминокислотных остатков, который соответствует одному из а) и b), должен всегда присутствовать в аминокислотной последовательности, которая образует часть поливалентного полипептида, и так что второй тяж из аминокислотных остатков выбран из одного из с), d), е) и f).

Предпочтительные поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из аминокислотных последовательностей, которые включают три или больше тяжей из аминокислотных остатков, из которых первый тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

второй тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

и третий тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые, по существу, состоят из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102;

a) SEQ ID NO: 102 или

и, по меньшей мере, один из CDR1 или CDR3 выбран из

- CDR1, выбранного из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 98;

и/или

- CDR3, выбранного из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121 или

Предпочтительно, поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые, по существу, состоят из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых

- CDR1 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102 или

- CDR3 выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

В конкретном аспекте поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102, предпочтительно, которые включают SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

a) SEQ ID NO: 60-76;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-76.

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

a) SEQ ID NO: 60-76;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-76.

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

a) SEQ ID NO: 146-153;

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

- SEQ ID NO: 153, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 146-153;

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 148, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 149, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85;

- SEQ ID NO: 153, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению представляет собой трехвалентный полипептид, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, выбранному из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 77-79 и 158;

b) полипептиды, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одним из SEQ ID NO: 77-79 и 158, при условии, что

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78, аргинин (Arg, R) в позиции 83 и/или глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

ii) полипептид связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или полипептид имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с полипептидом без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Предпочтительные трехвалентные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из одного из SEQ ID NO: 77-79 и 158.

a) SEQ ID NO: 78 и 79;

b) полипептиды, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одним из SEQ ID NO: 78 и 79, при условии, что

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 54, глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78, аргинин (Arg, R) в позиции 83 и/или глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные трехвалентные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 78 или 79.

В другом конкретном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77. В другом конкретном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78. В другом конкретном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:

79. В другом конкретном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 158.

a) SEQ ID NO: 159-161;

b) полипептиды, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одним из SEQ ID NO: 159-161, при условии, что

Предпочтительные трехвалентные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из одного из SEQ ID NO: 159-161.

a) SEQ ID NO: 159-161;

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда полипептид имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 159, аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, предпочтительно имеют аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 160, аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, предпочтительно имеют аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 161, аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, предпочтительно имеют аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 142-145 и 162-165;

b) полипептиды, которые имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одним из SEQ ID NO: 142-145 и 162-165, при условии, что

i) первые аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные трехвалентные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из одного из SEQ ID NO: 142-145 и 162-165.

Полипептиды с указанными последовательностями проявляют выгодные свойства для применения в качестве профилактических, терапевтических и/или фармакологически активных средств, такие как улучшенная стабильность, меньшая иммуногенность, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, в виде величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV и/или улучшенной эффективности и/или активности в отношении нейтрализации hRSV.

Изобретение также относится к соединениям или конструкциям, и в частности, белкам или полипептидам (также называемым в данном описании «соединение(я) по изобретению»), которые включают или, по существу, состоят из одной или нескольких аминокислотных последовательностей, нанотел® и/или полипептидов по изобретению (или их подходящих фрагментов), и, необязательно, также включают одну или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц. Как станет яснее для специалиста из дальнейшего раскрытия, такие дополнительные группы, остатки, частицы, связывающие единицы или аминокислотные последовательности могут, или не могут, придавать дополнительную функциональность аминокислотной последовательности, нанотелу® или полипептиду по изобретению (и/или соединению или конструкции, в которых они присутствуют), и могут, или не могут, модифицировать свойства аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению.

Также в объем изобретения входит применение частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных аминокислотных последовательностей и/или полипептидов по изобретению, и/или применение белков или полипептидов, включающих или, по существу, состоящих из одной или нескольких таких частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных, до тех пор, пока они подходят для применений, предусмотренных в данном описании. Такие части, фрагменты, аналоги, мутанты, варианты, аллели и/или производные, как правило, будут содержать (по меньшей мере, частично) функциональный антигенсвязывающий сайт для связывания против антигенного сайта II на белке F hRSV; и предпочтительнее, будут способны к специфическому связыванию с антигенным сайтом II на белке F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, в виде величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), определенной в данном описании. Такие части, фрагменты, аналоги, мутанты, варианты, аллели и/или производные, как правило, также будут обладать эффективностью нейтрализации hRSV и/или активностью, как определено в данном описании. Некоторые неограничительные примеры таких частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей, производных, белков и/или полипептидов станут яснее из дальнейшего описания. Также можно получить другие фрагменты или полипептиды по изобретению путем соответствующего комбинирования (т.е. путем соединения или генетического слияния) одной или нескольких (более мелких) частей или фрагментов, описанных в данном описании.

Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам или нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислотную последовательность по изобретению, нанотело® по изобретению и/или полипептид по изобретению (или их подходящие фрагменты). Такая нуклеиновая кислота также будет называться в данном описании «нуклеиновая(ые) кислота(ы) по изобретению» и может находиться, например, в форме генетической конструкции, что также описано в данном описании. Соответственно, настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте или нуклеотидной последовательности, находящейся в форме генетической конструкции.

Изобретение также относится к хозяину или клетке-хозяину, которая экспрессирует (или которая в подходящих окружающих условиях способна экспрессировать) аминокислотную последовательность по изобретению, нанотело® по изобретению, полипептид по изобретению и/или соединение или конструкцию по изобретению; и/или которая содержит нуклеиновую кислоту по изобретению. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких хозяев или клеток-хозяев станут понятными из дальнейшего описания.

Изобретение также относится к продукту или композиции, содержащим или включающим, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность по изобретению (или ее подходящий фрагмент), по меньшей мере, одно нанотело® по изобретению, по меньшей мере, один полипептид по изобретению, по меньшей мере, одно соединение или конструкцию по изобретению, по меньшей мере, одну моновалентную конструкцию по изобретению и/или, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту по изобретению, и, необязательно, один или несколько других компонентов таких композиций, известных per se, т.е. зависящих от предполагаемого использования композиции. Такие продукт или композиция могут, например, представлять собой фармацевтическую композицию (как описано в данном описании) или ветеринарную композицию. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких продуктов или композиций станут понятными из дальнейшего описания.

Изобретение также относится к способам получения аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, описанных в данном описании.

Изобретение также относится к применениям и использованию аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов, соединений, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, описанных в данном описании, а также к способам предупреждения и/или лечения инфекции дыхательных путей, вызванной hRSV. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные применения и использование станут понятными из дальнейшего описания.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению вообще можно использовать для блокирования взаимодействия белка F hRSV с хозяйской клеткой-мишенью и/или ее мембраной для нейтрализации hRSV (различных штаммов и/или «ускользнувших» мутантов hRSV) для модуляции, ингибирования и/или предотвращения заражения hRSV (различными штаммами и/или «ускользающими» мутантами hRSV), для модуляции, ингибирования и/или предотвращения слияния (различных штаммов и/или «ускользнувших» мутантов hRSV) с хозяйской клеткой-мишенью (ее клеточной мембраной) и/или для модуляции, ингибирования и/или предотвращения проникновения hRSV (различных штаммов и/или «ускользнувших» мутантов hRSV) в хозяйскую клетку-мишень.

Как таковые, аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения и/или лечения заболеваний и расстройств, связанных с заражением hRSV. Примеры таких заболеваний и расстройств, связанных с заражением hRSV, для специалиста станут понятными из данного раскрытия и включают, например, следующие заболевания и расстройства: респираторное заболевание, инфекция верхних дыхательных путей, инфекция нижних дыхательных путей, бронхиолит (воспаление мелких дыхательных путей в легких), пневмония, одышка, кашель, (рецидивирующий) стридор и астма.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу предупреждения и/или лечения респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы, вызванных hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению или композиции по изобретению.

Изобретение также относится к применению аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и/или астмы и/или для применения в одном или нескольких способах, описанных в данном описании.

Изобретение также относится к аминокислотной последовательности по изобретению, нанотелу® по изобретению, полипептиду по изобретению, соединению или конструкции по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению для предупреждения и/или лечения респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и/или астмы.

Другие применения и использование аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и соединений и композиций по изобретению станут понятными из дальнейшего описания.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Конкурентный ELISA: Fab Синагиса® конкурируют с очищенными связывающими RSV нанотелами® и Fab Numax за связывание с белком F_TM-, как описано в примере 8. Нанотело® 202А5 представляет собой иррелевантное нанотело®, связывающее НА гриппа.

Фиг.2. Связывание моновалентных, двухвалентных и трехвалентных нанотел® с белком F_TM-, как описано в примере 10.

Фиг.3А и В. Активность (нейтрализация RSV) моновалентных, двухвалентных и трехвалентных конструкций для нейтрализации штаммов RSV Long и В-1, как описано в примере 11.

Фиг.4. Анализ нейтрализации Long RSV и «ускользнувших» мутантов R7C2/1; R7C2/11 и R7.936/4 моновалентными нанотелами® 782 (А), 15Н8 (В), NC41 (С) в интервале концентраций от примерно 2 мкМ до 6 нМ и трехвалентными нанотелами® RSV400 (D), RSV404 (Е), RSV407 (F) и RSV403 (G) в интервале концентраций от примерно 20 нМ до 100 пМ. Аппроксимирующая кривая построена только для результатов по моновалентным нанотелам®.

Фиг.5. Нейтрализация штаммов RSV Long и RSV B-1 трехвалентными нанотелами® NC41 с линкерами различной длины, как описано в примере 15.

Фиг.6. Общее схематическое представление гуманизированных остатков, введенных в выбранные варианты NC41. Точки показывают присутствие остатка дикого типа; буквы соответствуют гуманизированному остатку. Нумерация соответствует нумерации по Кабату.

Фиг.7. Выравнивание последовательностей предпочтительных гуманизированных нанотел® по изобретению.

Фиг.8. Нейтрализация штамма RSV Long и штамма RSV В-1 моновалентными и трехвалентными гуманизированными вариантами NC41. На фигуре 8А нейтрализация двумя трехвалентными гуманизированными вариантами NC41 (RSV414 и RSV426) сравнивается с нейтрализацией соответствующими моновалентными нанотелами®. Фигура 8В показывает нейтрализацию вариантами трехвалентных NC41 (RSV414. RSV426 и RSV427).

Фиг.9. Нейтрализация штаммов RSV Long и RSV B-1 RSV407 и RSV434.

Фиг.10. Испытание на эффективность (профилактическую) RSV407 на модели хлопкового хомяка, описанное в примере 21. Хомякам вводят интраназально различные концентрации RSV407 (день -1) за 24 часа до заражения RSV (день 0). Титр вируса (слева, среднее±ср.-кв.ош., n=6) и уровень вирусной РНК (справа) определяют в жидкости от промывки легких на пиковом уровне виремии, имеющем место в день 4 после заражения (*=Р<0,05 по двухстороннему критерию Стьюдента против необработанных).

Фиг.11. Испытание на эффективность (терапевтическую) RSV434 на модели хлопкового хомяка, описанное в примере 21. Хомяков инфицируют RSV (день 0) и обрабатывают 0, 1, 2, 4 и 20 мг/кг RSV434 в день 2 и 3 интраназально инстилляцией (n=6). Титр вируса в жидкости от промывки носа (А) и промывки легких (В) определяют на пиковом уровне виремии (день 4 после заражения). Горизонтальные линии показывают пределы обнаружения.

Подробное описание изобретения

В настоящем описании, примерах и формуле изобретения используются перечисленные далее термины и определения.

a) Если не указано или не определено иное, все используемые термины имеют свои обычные в технике значения, которые будут понятны специалисту. Ссылка дается, например, на стандартные руководства, упомянутые в разделе a) на странице 46 WO 08/020079.

b) Если не указано иное, термины «иммуноглобулиновая последовательность», «последовательность», «нуклеотидная последовательность» и «нуклеиновая кислота» имеют значения, описанные в разделе b) на странице 46 WO 08/020079.

c) Если не указано иное, все способы, стадии, методы и манипуляции, которые конкретно подробно не описаны, могут быть осуществлены и осуществляются так, как известно per se, что будет понятно специалисту. Например, снова можно сослаться на стандартные руководства и указанный в них общий уровень техники и на другие ссылки, цитированные в них; а также, например, на такие обзоры, как Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58(5-6):640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1):49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, в которых описываются методы белковой инженерии, такие как «созревание аффинности», и другие методы улучшения специфичности и других нужных свойств белков, таких как иммуноглобулины.

d) Аминокислотные остатки будут указываться согласно стандартному трехбуквенному или однобуквенному коду аминокислот. Ссылка дается на таблицу А-2 на странице 48 WO 08/020079.

e) Когда говорят, что нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность «включает» другую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, или «по существу, состоит из» другой нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности, это имеет значение, указанное в разделе i) на страницах 51-52 WO 08/020079.

f) Термин «в по существу изолированной форме» имеет значение, указанное для него в разделе j) на страницах 52 и 53 WO 08/020079.

g) Термины «домен» и «связывающий домен» имеют значения, указанные для них в разделе k) на странице 53 WO 08/020079.

h) Термины «антигенная детерминанта» и «эпитоп», которые в данном описании могут использоваться как взаимозаменяемые, имеют значения, указанные для них в разделе 1) на странице 53 WO 08/020079.

i) Как описано также в разделе т) на странице 53 WO 08/020079, говорят, что аминокислотная последовательность (такая как нанотело®, антитело, полипептид по изобретению или вообще антигенсвязывающий белок или полипептид или их фрагмент), которая может (специфически) связываться с, которая имеет аффинность и/или которая имеет специфичность в отношении специфических антигенной детерминанты, эпитопа, антигена или белка (или в отношении, по меньшей мере, одной его части, фрагмента или эпитопа), обозначается как «направленная на» или «направленная против» указанных детерминанты, эпитопа, антигена или белка.

j) Термин «специфичность» имеет значение, указанное для него в разделе n) на страницах 53-56 WO 08/020079; и как указано там, относится к ряду различных типов антигенов или антигенных детерминант, с которыми могут связываться определенная антигенсвязывающая молекула или антигенсвязывающий белок (такие как нанотело® или полипептид по изобретению). Специфичность антигенсвязывающего белка можно определить на основании аффинности и/или авидности, как описано на страницах 53-56 WO 08/020079 (включенной в данное описание в качестве ссылки), где также описываются некоторые предпочтительные методы измерения связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как нанотело® или полипептид по изобретению) и подходящим антигеном. Типично антигенсвязывающие белки (такие как аминокислотные последовательности, нанотела® и/или полипептиды по изобретению) будут связываться со своим антигеном с константной диссоциации (K_D) 10^-5-10^-12 моль/л или менее, и предпочтительно, 10^-7-10^-12 моль/л или менее, и предпочтительнее, 10^-8-10^-12 моль/л (т.е. с константой ассоциации (K_A) 10⁵-10¹² л/моль или более, и предпочтительно, 10⁷-10¹² л/моль или более, и предпочтительнее, 10⁸-10¹² л/моль). Любая величина K_D, превышающая 10^-4моль/л (или любая величина K_A меньше 10⁴ М^-1 (л/моль)) рассматривается как указывающая на неспецифическое связывание. Предпочтительно моновалентная иммуноглобулиновая последовательность по изобретению будет связываться с нужным антигеном с аффинностью менее 500 нМ, предпочтительно, менее 200 нМ, предпочтительнее, менее 10 нМ, такой как, например, от 10 до 5 нМ. Специфическое связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой можно определить любым подходящим способом, известным per se, включая, например, анализ по Скэтчерду и/или конкурентные-связывающие анализы, такие как радиоиммуноанализы (РИА), иммуноферментные анализы (EIA) и конкурентные сэндвич-анализы, и их различные варианты, per se известные в технике; а также другие методы, указанные в данном описании. Как будет понятно для специалиста и как описано на страницах 53-56 WO 08/020079, константа диссоциации может быть действительной или кажущейся константой диссоциации. Способы определения константы диссоциации будут понятны для специалиста и включают, например, методы, упомянутые на страницах 53-56 WO 08/020079.

k) Время полужизни аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по изобретению вообще можно определить так, как описано в разделе о) на странице 57 WO 08/020079, и как указанно там, относится ко времени, необходимому для снижения концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида в сыворотке на 50%, in vivo, например, из-за разрушения аминокислотной последовательности, соединения или полипептида и/или клиренса или секвестрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида природными механизмами. Время полужизни in vivo аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по изобретению можно определить любым способом, известным per se, таким как с помощью фармакокинетического анализа. Подходящие методы будут понятны для специалиста в данной области техники и могут, например, являться такими, какие описанные в разделе о) на странице 57 WO 08/020079. Как также упомянуто в разделе о) на странице 57 WO 08/020079, время полужизни можно выразить с использованием таких параметров, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под кривой (AUC). Ссылка дается, например, на экспериментальную часть, описанную ниже, а также на известные руководства, такие как Kenneth A. et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, и Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Также можно сослаться на «Pharmacokinetics», M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Термины «увеличение времени полужизни» или «увеличенное времени полужизни» также определены в разделе о) на странице 57 WO 08/020079 и относятся, в частности, к увеличению t1/2-бета с увеличением или без увеличения t1/2-альфа и/или AUC или обоих параметров.

1) Что касается мишени или антигена, термин «сайт взаимодействия» на мишени или антигене обозначает сайт, эпитоп, антигенную детерминанту, часть, домен или тяж из аминокислотных остатков на мишени или антигене, который представляет собой сайт для связывания с рецептором или другим партнером по связыванию, каталитический сайт, сайт расщепления, сайт для аллостерического взаимодействия, сайт, вовлеченный в полимеризацию (такую как гомомеризация или гетеродимеризация) мишени или антигена; или любой другой сайт, эпитоп, антигенную детерминанту, часть, домен или тяж из аминокислотных остатков на мишени или антигене, который вовлечен в биологическое действие или механизм мишени или антигена. В более общем значении «сайт взаимодействия» может представлять собой любой сайт, эпитоп, антигенную детерминанту, часть, домен или тяж из аминокислотных остатков на мишени или антигене, с которым аминокислотная последовательность или полипептид по изобретению может связываться так, что мишень или антиген (и/или любой путь, взаимодействие, передача сигнала, биологический механизм или биологическое действие, в которые вовлечены мишень или антиген) модулируется (как определено в данном описании).

m) Аминокислотная последовательность или полипептид обозначаются как«специфические для» первой мишени или антигена по сравнению со второй мишенью или антигеном, когда они связываются с первым антигеном с аффинностью (как описано выше и соответственно выражено в виде величины K_D, величины K_A, константы скорости K_off и/или константы скорости K_on), которая, но меньше мере, в 10 раз, такой как, по меньше мере, в 100 раз, и предпочтительно, по меньше мере, в 1000 раз и до 10000 раз или более лучше чем аффинность, с которой указанные аминокислотная последовательность или полипептид связываются со вторыми мишенью или антигеном. Например, аминокислотная последовательность или полипептид может связываться с первыми мишенью или антигеном с величиной K_D, которая, по меньшей мере, в 10 раз меньше, например, по меньшей мере, в 100 раз меньше, и предпочтительно, по меньшей мере, в 1000 раз меньше, например, в 10000 раз или даже более меньше, чем K_D, с которой указанные аминокислотная последовательность или полипептид связываются со вторыми мишенью или антигеном. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность или полипептид являются «специфическими для» первой мишени или антигена по сравнению со второй мишенью или антигеном, они направлены против (как определено в данном описании) указанной первой мишени или антигена, но не направлены против указанной второй мишени или антигена.

n) Термины «(перекрестная) блокировка», «(перекрестно) блокированный» и «(перекрестная) блокада» используются в данном описании как взаимозаменяемые для обозначения способности аминокислотной последовательности или другого связывающего агента (такого как полипептид по изобретению) препятствовать связыванию других аминокислотных последовательностей или связывающих агентов по изобретению с заданной мишенью. Предел, до которого аминокислотная последовательность или другие связывающие агенты по изобретению способны препятствовать связыванию других факторов с мишенью, и, следовательно, можно ли говорить о перекрестной блокировке по изобретению, можно определить с использованием анализов конкурентного связывания. В одном особенно подходящем количественном анализе перекрестной блокировки используют аппарат Biacore, который может измерять степень взаимодействия с использованием технологии поверхностного плазменного резонанса. В другом подходящем количественном анализе перекрестной блокады используют основанный на ELISA подход для измерения конкуренции между аминокислотными последовательностями или другими связывающими агентами в плане их связывания с мишенью.

Далее в общих чертах описывается подходящий анализ Biacore для определения того, осуществляет ли аминокислотная последовательность или другой связывающий агент перекрестную блокировку или способен ли он к перекрестной блокаде по изобретению. Следует иметь в виду, что анализ можно использовать с любыми аминокислотными последовательностями или другими связывающими агентами, описанными в данном описании. На аппарате Biacore (например, Biacore 3000) работают в соответствии с рекомендациями изготовителя. Так, в одном анализе на перекрестную блокировку белок-мишень соединяют с чипом CMS Biacore с использованием стандартной реакции сочетан6ия аминов с образованием поверхности, покрытой мишенью. Типично с чипом могут сочетаться 200-800 резонансных единиц мишени (количество, которое дает вполне измеряемые уровни связывания, но которое легко может быть насыщено используемыми концентрациями испытываемого реагента). Две испытываемые аминокислотные последовательности (обозначенные А* и В*), оцениваемые на их способность перекрестно блокировать друг друга, смешивают в молярном отношении сайтов связывания один к одному в подходящем буфере, и получают испытываемую смесь. При расчете концентрации на основе количества сайтов связывания за молекулярную массу аминокислотной последовательности принимается общая молекулярная масса аминокислотной последовательности, деленная на число сайтов связывания мишени на такой аминокислотной последовательности. Концентрация каждой аминокислотной последовательности в испытываемой смеси должна быть достаточно высокой для легкого насыщения сайтов связывания для такой аминокислотной последовательности на молекулах мишени, иммобилизованных на чипе Biacore. Аминокислотные последовательности в смеси находятся в одинаковой молярной концентрации (на основе количества связывания), и такая концентрация типично может составлять от 1,00 до 1,5 мкмоль (на основе количества сайта связывания). Также получают отдельные растворы, содержащие одну А* и одну В*. А* и В* в таких растворах должны находится в одинаковых буферах и в такой же концентрации, как в испытываемой смеси. Испытываемую смесь пропускают над поверхностью чипа Biacore, покрытого мишенью, и регистрируют общее количество связывания. Затем чип обрабатывают таким образом, чтобы удалить связанные аминокислотные последовательности без повреждения связанной с чипом мишени. Обычно это осуществляют обработкой чипа 30 мМ HCl в течение 60 секунд. Затем над поверхностью, покрытой мишенью, пропускают один раствор А*, и регистрируют количество связывания. Чип снова обрабатывают для удаления всех связанных аминокислотных последовательностей без повреждения связанной с чипом мишени. Затем над поверхностью, покрытой мишенью, пропускают один раствор В*, и регистрируют количество связывания. Затем вычисляют максимальное теоретическое связывание смеси А* и В*, и получают сумму связываний с мишенью каждой аминокислотной последовательности, когда она одна проходит над поверхностью. Если фактическое зарегистрированное связывание смесей меньше, чем такой теоретический максимум, тогда две аминокислотные последовательности являются перекрестно блокирующими друг друга. Таким образом, как правило, перекрестно блокирующая аминокислотная последовательность или другой связывающий агент по изобретению представляет собой последовательность или агент, которые будут связываться с мишенью в вышеописанном анализе перекрестного связывания Biacore, так что во время анализа и в присутствии второй аминокислотной последовательности или другого связывающего агента по изобретению зарегистрированное связывание составляет от 80% до 0,1% (например, 80%-4%) от максимального теоретического связывания, специфически, от 75% до 0,1% (например, 75%-4%) от максимального теоретического связывания, и более специфически, от 70% до 0,1% (например, 70%-4%) от максимального теоретического связывания (как только что определено выше) двух аминокислотных последовательностей или связывающих агентов в сочетании. Анализ Biacore, описанный выше, является первичным анализом, используемым для определения того, являются ли аминокислотные последовательности или другие связывающие агенты перекрестие блокирующими друг друга согласно изобретению. В редких случаях отдельные аминокислотные последовательности или другие связывающие агенты могут не связываться с мишенью, присоединенной к чипу CMS Biacore с помощью реакции сочетания аминов (это обычно имеет место, когда соответствующий сайт связывания на мишени маскируется или разрушается при связывании с чипом). В таких случаях перекрестную блокировку можно определить с использованием меченного варианта мишени например, варианта, меченного His по N-концу. В таком определенном формате к чипу Biacore будут присоединять анти-His аминокислотную последовательность, и тогда меченная His мишень может быть пропущена над поверхностью чипа и захвачена анти-His аминокислотной последовательностью. Анализ перекрестной блокировки может быть осуществлен, по существу, так, как описано выше, за исключением того, что после каждого цикла регенерации чипа нужно снова наносить новую меченную His мишень на поверхность, покрытую анти-His аминокислотной последовательностью. Кроме приведенного в качестве примера использования мишени, меченной His по N-концу, можно, с другой стороны, использовать мишень, меченную His по С-концу. Более того, для такого анализа перекрестной блокировки можно использовать различные другие метки и комбинации связывающих метки белков, которые известны в технике (например, метку НА с антителами против НА; метку FLAG с антителами против FLAG; биотиновую метку со стрептавидином).

Далее в общих чертах описывается анализ ELISA для определения того, блокируются ли перекрестно или способны ли к перекрестной блокировке (как определено в данном описании) аминокислотная последовательность или другой связывающий агент, направленные на мишень. Следует иметь в виду, что анализ можно использовать с любыми аминокислотными последовательностями (или другими связывающими агентами, такими как полипептиды по изобретению), описанными в данном описании. Основным принципом анализа является необходимость иметь аминокислотную последовательность или другой связывающий агент, которые направлены на мишень, которая нанесена на лунки планшета для ELISA. В раствор добавляют избыточное количество второй, возможно, перекрестно блокирующей, аминокислотной последовательности против мишени (т.е. не связанной с планшетом для ELISA). Затем в лунки добавляют ограниченное количество мишени. Нанесенная аминокислотная последовательность и аминокислотная последовательность в растворе конкурируют за связывание ограниченного числа молекул мишени. Планшет промывают для удаления избытка мишени, которая не связана нанесенной аминокислотной последовательностью, и также для удаления второй аминокислотной последовательности в находящейся в фазе раствора, а также любых комплексов, образовавшихся между второй аминокислотной последовательностью находящейся в растворе и мишенью. Затем измеряют количество связанной мишени с использованием реагента, который подходит для детекции мишени. Аминокислотная последовательность в растворе, которая способна перекрестно блокировать нанесенную аминокислотную последовательность, будет способна вызывать снижение числа молекул мишени, которые нанесенная аминокислотная последовательность может связывать, относительно числа молекул мишени, которые нанесенная аминокислотная последовательность может связывать в отсутствие второй аминокислотной последовательности в растворе. В случае, когда первая аминокислотная последовательность, например, Ab-Х, выбрана как иммобилизованная аминокислотная последовательность, ее наносят на лунки планшета для ELISA, после чего планшеты блокируют подходящим раствором для блокады для минимизации неспецифического связывания реагентов, которые затем добавляют. Затем в планшет для ELISA добавляют избыточное количество второй аминокислотной последовательности, т.е. Ab-Y, так что количество молей сайта связывания Ab-Y на лунку, по меньшей мере, в 10 раз превышало количество молей сайта связывания Ab-Х на лунку, которые используют при покрытии планшета для ELISA. Затем добавляют мишень так, что количество молей мишени на лунку, было по меньшей мере, в 25 раз меньше, чем количество молей сайтов связывания мишени Ab-Х, которые использовали для покрытия каждой лунки. После подходящего периода инкубации планшет для ELISA промывают, и добавляют реагент для детекции мишени для измерения количества мишени, специфически связавшейся с нанесенной аминокислотной последовательностью которая направлена на мишень (в данном случае Ab-Х). Фоновый сигнал для анализа определяют как сигнал, полученный в лунках покрытых аминокислотной последовательностью (в данном случае Ab-Х), второй аминокислотной последовательностью в растворимой фазе (в данном случае Ab-Y), только буфером для мишени (т.е. без мишени) и реагентами для детекции мишени. Положительный контрольный сигнал для анализа определяют как сигнал, полученный в лунках покрытых аминокислотной последовательностью (в данном случае Ab-Х), содержащих только буфер для второй аминокислотной последовательностью в растворимой фазе (т.е. без второй аминокислотной последовательностью в растворе), мишень и реагенты для детекции мишени. Анализ ELISA можно провести таким образом, чтобы иметь положительный контрольный сигнал, по меньшей мере, в 6 раз выше фонового сигнала. Для того, чтобы избежать любых артефактов (например, существенно различной аффинности между Ab-Х и Ab-Y в отношении мишени), вытекающих из выбора, какую аминокислотную последовательность использовать в качестве покрывающей аминокислотной последовательности и какую в качестве второй (конкурирующей) аминокислотной последовательности, анализ перекрестной блокировки можно проводить в двух форматах: 1) формат 1, когда Ab-Х представляет собой аминокислотную последовательность, которой покрывают планшет для ELISA, и Ab-Y представляет собой конкурентную аминокислотную последовательность, которая находится в растворе, и 2) формат 2, когда Ab-Y представляет собой аминокислотную последовательность, которой покрывают планшет для ELISA, и Ab-Х представляет собой конкурентную аминокислотную последовательность, которая находится в растворе. Ab-Х и Ab-Y определяют как перекрестно блокирующие, если, или в формате 1 или в формате 2, аминокислотная последовательность направленная на мишень в фазе раствора способна вызывать снижение детируемого сигнала мишени на 60-100%, в частности, на 70-100%, и в частности, на 80-100%, (т.е. количества мишени, связанной с нанесенной аминокислотной последовательностью) по сравнению с детектируемым сигналом мишени, полученным в отсутствие аминокислотной последовательности направленной на мишень в растворимой фазе (т.е. в лунках положительного контроля).

о) Аминокислотная последовательность является «перекрестно реагирующей» для двух различных антигенов или антигенных детерминант (таких как, например, сывороточный альбумин от двух различных видов млекопитающих, например, человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин макаки крабоеда (cyno), таких как, например, белок F различных штаммов hRSV, например, белок F различных «ускользнувших» мутантов hRSV), если она специфична (как определено в данном описании) для обоих таких различных антигенов или антигенных детерминант.

р) Как также описано в данном описании, общее число аминокислотных остатков в нанотеле® может находиться в интервале 110-120, предпочтительно, 112-115, и наиболее предпочтительно, составляет 113. Однако следует отметить, что части, фрагменты, аналоги или производные (как также описано в данном описании) нанотела® особо не ограничиваются как по их длине, так и/или размеру, до тех пор, пока такие части, фрагменты, аналоги или производные соответствуют другим требованиям, изложенным в данном описании, и также предпочтительно подходят для целей, описанных в данном описании.

q) Как описано также в разделе q) на страницах 58 и 59 WO 08/020079 (включенной в данное описание в качестве ссылки), аминокислотные остатки нанотела® нумеруют согласно общей нумерации для доменов V_H, предложенной Kabat et al. («Sequence of proteins of immunological interest», US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), которую применяют к доменам V_H верблюжьих в статье Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods, 2000, Jun 23; 240 (1-2): 185-195 (см., например, фигуру 2 в указанной публикации), и соответственно FR1 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 1-30, CDR1 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 31-35, FR2 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 36-49, CDR2 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 50-65, FR3 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 66-94, CDR3 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 95-102, и FR4 нанотела® включает аминокислотные остатки в позициях 103-113.

r) В контексте настоящего изобретения термин «хозяйская клетка-мишень" (для вируса) относится к определенной клетке, которая или является клеткой или получена от живого субъекта, и которая чувствительна к заражению указанным вирусом.

s) Термин «инфективность вируса», используемый в данном описании, относится к доле живых субъектов, которые, когда на них воздействует указанный вирус, фактически становятся зараженными указанным вирусом.

t) Термин «нейтрализация вируса», используемый в данном описании, относится к модуляции и/или уменьшению и/или предотвращению и/или ингибированию инфективности (определенной в данном описании) вируса путем связывания нейтрализующего соединения с вирионом, измеряемого с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (такого как, например, анализ микронейтрализации, описанный Anderson et al., 1985 (J. Clin. Microbiol., 22:1050-1052), и в 1988 (J. Virol., 62:4232-4238), модификаций указанных анализов, таких как описанные в примере 6; анализа уменьшения бляшкообразования, описанного, например, Johnson et al., 1977 (J. Int. Dis., 176:1215-1224), и его модификаций и анализов, упомянутых в данном описании). В частности, «нейтрализация вируса» может означать или модуляцию или уменьшение или предотвращение или ингибирование инфективности (определенной в данном описании) вируса, измеренные с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (такого как упомянутые в данном описании), на, по меньшей мере, 1%, предпочтительно, по меньшей мере, 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90%, по сравнению с нормальной (т.е. встречающейся в природе) инфективностью (определенной в данном описании) вируса в том же анализе в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению.

u) Термины «активность аминокислотной последовательности по изобретению», «активность нанотела® по изобретению», «активность полипептида по изобретению» и/или «активность соединения или конструкции по изобретению», используемые в данном описании, относятся к способности указанных аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению и/или соединения или конструкции по изобретению нейтрализовать определенный вирус (такой как, например, hRSV), модулировать, ингибировать и/или предотвращать инфективность вируса, модулировать, ингибировать и/или предотвращать слияние вируса с хозяйской клеткой-мишенью (ее клеточной мембраной) и/или модулировать, ингибировать и/или предотвращать проникновение вируса в хозяйскую клетку-мишень (как определено в данном описании). Активность можно измерить любым подходящим анализом, известным в технике или описанным в данном описании, таким как, например, анализы микронейтрализации, описанные в разделе «Примеры», и/или анализы, указанные выше в пункте t).

v) Термин «присоединение вируса», используемый в данном описании, означает присоединение вируса (например, hRSV) к мишени клетке-хозяину непосредственно (например, за счет взаимодействия с вирусным рецептором) или косвенно (например, путем опосредования взаимодействия с вирусным рецептором одного или нескольких других белков или молекул).

w) Термин «слияние вируса», используемый в данном описании, означает слияние вируса (например, hRSV) с хозяйской клеткой-мишенью непосредственно (например, за счет взаимодействия с соединениями мембраны мишени клетки-хозяина) или косвенно (например, путем опосредования взаимодействия одного или нескольких других белков или молекул с соединениями мембраны мишени клетки-хозяина).

х) Термин «проникновение вируса», используемый в данном описании, охватывает любой опосредуемый вирусом биологический путь, который необходим для осуществления проникновения вируса в хозяйскую клетку-мишень и/или слияния вируса с хозяйской клеткой-мишенью.

y) «Тяж из аминокислотных остатков» обозначает два или больше аминокислотных остатков, которые прилегают друг к другу, находятся или в тесной близости друг с другом, т.е. в первичной или третичной структуре аминокислотной последовательности. В контексте настоящего изобретения «тяж из аминокислотных остатков» будет (по меньшей мере, частично) ответственен за связывание аминокислотной последовательности, нанотела®, полипептида, соединения или конструкции по изобретению с антигенным сайтом II на белке F hRSV.

z) Когда сравнивают два тяжа из аминокислотных остатков (или две последовательности CDR), термин «различие по аминокислотам» относится к вставке, делении или замене одного аминокислотного остатка в позиции тяжа из аминокислотных остатков (или последовательности CDR), определенной в b), d) или f), при сравнении с тяжом аминокислотных остатков (или последовательностью CDR), соответственно, в а), с) или е); причем следует иметь в виду, что тяж из аминокислотных остатков (или последовательность CDR) в b), d) и f) может содержать одно, два или максимум три таких различия по аминокислотам по сравнению с тяжом аминокислотных остатков, соответственно, в а), с) или е).

«Различие по аминокислотам» может представлять собой любые одну, две или максимум три замены, делеции и/или вставки или их любую комбинацию, которые или улучшают свойства аминокислотной последовательности по изобретению, или которые, по меньшей мере, не слишком ухудшают нужные свойства или баланс или комбинацию нужных свойств аминокислотной последовательности по изобретению. В связи с этим, полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, связывать белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей один или несколько тяжей из аминокислотных остатков без одной, двух или максимум трех замен, делеции и/или вставок, причем указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса; и/или полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, иметь одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей один или несколько тяжей из аминокислотных остатков без одной, двух или максимум трех замен, делеции и/или вставок. Специалист в данной области сможет определить и выбрать подходящие замены, делеции и/или вставки или их подходящие комбинации на основании данного раскрытия и, необязательно, после нескольких стандартных экспериментов, которые могут включать, например, введение ограниченного числа возможных замен, делений или вставок и определение их влияния на свойства аминокислотных последовательностей, полученных таким образом.

Например, и в зависимости от организма-хозяина, используемого для экспрессии аминокислотной последовательности по изобретению, такие делеции и/или замены можно создать таким образом, что удаляются один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (например, один или несколько сайтов гликозилирования), что будет в пределах возможностей специалиста в данной области техники.

В предпочтительном аспекте изобретения «различие по аминокислотам» представляет собой замену аминокислот. Замена аминокислот может представлять собой любые одну, две или максимум три замены, которые или улучшают свойства аминокислотной последовательности по изобретению, или которые, по меньшей мере, не слишком ухудшают нужные свойства или баланс или комбинацию нужных свойств аминокислотной последовательности по изобретению. В связи с этим полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, связывать белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей один или несколько тяжей из аминокислотных остатков без одной, двух или максимум трех замен, причем указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса; и/или полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, иметь одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей один или несколько тяжей из аминокислотных остатков без одной, двух или максимум трех замен, делеции и/или вставок. Специалист в данной области сможет определить и выбрать подходящие замены на основании данного раскрытия и, необязательно, после нескольких рутинных экспериментов, которые могут включать, например, введение ограниченного числа возможных замен и определение их влияния на свойства нанотел®, полученных таким образом.

Замена аминокислоты в одном или нескольких тяжах аминокислотных остатков может представлять собой консервативную замену аминокислоты. «Консервативные» замены аминокислот, как правило, представляют собой замены аминокислот, при которых аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком схожей химической структуры, и который оказывает, или не оказывает, незначительное влияние на функцию, активность или другие биологические свойства полученной аминокислотной последовательности. Такие консервативные замены аминокислот хорошо известны в данной области техники, например, из WO 04/037999, GB-A-3357768, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; и (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен можно выбрать на основании соответствующих указаний в WO 04/037999, а также WO 98/49185 и других ссылках, цитированных в указанных работах.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одну аминокислоту из описанных далее групп (а) - (е) заменяют другим аминокислотным остатком из той же группы: (а) небольшие алифатические неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gin; (с) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; d) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Не, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

Особенно предпочтительными консервативными заменами являются следующие замены: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gin или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gin на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gin; He на Leu или на Val; Leu на Не или на Val; Lys на Arg, на Gin или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Не; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Туг; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Не или на Leu. Замена аминокислоты в одном или нескольких тяжах аминокислотных остатков может дать аминокислотную последовательность с повышенной аффинностью для связывания с белком F hRSV. Это можно осуществить такими методами, как неспецифический или сайт-направленный мутагенез, и/или другими методами созревания аффинности, известными per se, такими как, например, описанные в WO 09/004065, WO 05/003345, WO 06/023144, EP 527809, EP 397834.

Без ограничения, правила замен аминокислотных остатков в CDR (которым следуют частично или полностью) могут быть такими, как описанные далее (т.е. замена аминокислотами со схожей химией боковых цепей):

- К заменяют R;

- R заменяют К;

- А заменяют S или Т;

- S заменяют А или Т;

- Т заменяют А или S;

- I заменяют L или V;

- L заменяют I или V;

- V заменяют I или L;

- F заменяют Y;

- Y заменяют F;

- N заменяют D;

- D заменяют N;

- Q заменяют Е;

- Е заменяют Q;

- G заменяют А;

- M заменяют L;

- H, C, W и Р сохраняют неизменными.

Более того, и также без ограничения, правила замен аминокислотных остатков в CDR (которым следуют частично или полностью) могут быть, с другой стороны такими, каким следуют для замены в позициях 27-35 и позициях 50-58 (с использованием системы нумерации по Кабату), где для позиций 27-35

- исходный аминокислотный остаток в позиции 27 (использована нумерация по Кабату) заменяют F; G; R; S; 2 из F, G, R, S; 3 из F, G, R, S; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 28 (использована нумерация по Кабату) заменяют А; I; S; Т; 2 из А, I, S, Т; 3 из A, I, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 29 (использована нумерация по Кабату) заменяют F; G; L; S; 2 из F, G, L, S; 3 из F, G, L, S; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 30 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; G; S; Т; 2 из D, G, S, Т; 3 из D, G, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 31 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; I; N; S; Т; 2 из D, I, N, S, Т; 3 из D, I, N, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 32 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; N; Y; 2 из D, N, Y; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 33 (использована нумерация по Кабату) заменяют А; G; Т; V; 2 из А, G, Т, V; 3 из А, G, Т, V; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 34 (использована нумерация по Кабату) заменяют I; M; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 35 (использована нумерация по Кабату) заменяют A; G; S; 2 из A, G, S; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

и позиции 50-58, если исходная аминокислотная последовательность имеет аминокислотную последовательность в позиции 52а (использована нумерация по Кабату),

- исходный аминокислотный остаток в позиции 50 (использована нумерация по Кабату) заменяют А; С; G; S; Т; 2 из А, С, G, S, Т; 3 из А, С, G, S, Т; 4 из А, С, G, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 51 (использована нумерация по Кабату) заменяют I;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 52 (использована нумерация по Кабату) заменяют N; R; S; Т; 2 из N, R, S, Т; 3 из N, R, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 52а (использована нумерация по Кабату) заменяют R; S; Т; W; 2 из R, S, Т, W; 3 из R, S, Т, W; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 53 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; G; N; S; Т; 2 из D, G, N, S, Т; 3 из D, G, N, S, Т; 4 из D, G, N, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 54 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; G; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 55 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; G; S; 2 из D, G, S; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 56 (использована нумерация по Кабату) заменяют I; N; R; S; Т; 2 из I, N, R, S, Т; 3 из I, N, R, S, Т; 4 из I, N, R, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 57 (использована нумерация по Кабату) заменяют Т;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 58 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; H; N; S; Y; 2 из D, H, N, S, Y; 3 из D, H, N, S, Y; 4 из D, H, N, S, Y; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

и при этом для позиций 50-58, если исходная аминокислотная последовательность не имеет аминокислотной последовательности в позиции 52а (использована нумерация по Кабату),

- исходный аминокислотный остаток в позиции 50 (использована нумерация по Кабат) заменяют A; G; R; S; Т; 2 из A, G. R, S, Т; 3 из Л, G, R, S, Т; 4 из A, G, R, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 51 (использована нумерация по Кабату) заменяют I;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 52 (использована нумерация по Кабату) заменяют N; S; Т; 2 из N, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 53 (использована нумерация по Кабату) заменяют N; R; S; Т; Y; 2 из N, R, S, Т, Y; 3 из N, R, S, Т, Y; 4 из N, R, S, Т, Y; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 54 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; G; R; S; 2 из D, G, R, S; 3 из D, G, R, S; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 55 (использована нумерация по Кабату) заменяют G;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 56 (использована нумерация по Кабату) заменяют G; N; R; S; Т; 2 из D, N, R, S, Т; 3 из D, N, R, S, Т; 4 из D, N, R, S, Т; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 57 (использована нумерация по Кабату) заменяют Т;

- исходный аминокислотный остаток в позиции 58 (использована нумерация по Кабату) заменяют D; N; Т; Y; 2 из D, N, Т, Y; 3 из D, N, Т, Y; или всеми ими, предпочтительно, всеми ими,

после чего одну или несколько потенциально применимых замен (или их комбинации), определенные таким образом, можно ввести в указанную последовательность CDR (любым способом, известным per se, как описано в данном описании далее), и полученную(ые) аминокислотную(ые) последовательностей) можно испытывать на аффинность в отношении белка F hRSV и/или на другие желательные свойства, такие как, например, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV и/или улучшенной эффективности и/или активности в отношении нейтрализации hRSV. Таким образом, при ограниченном использовании метода проб и ошибок специалист может определить другие подходящие замены в CDR (или их подходящие комбинации), основываясь на описанном раскрытии. Аминокислотные последовательности, включающие тяж из аминокислотных остатков, которые имеют одну, две или максимум три замены, вставки или делеции, и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, можно получить любым способом, известным per se, например, с использованием одного или нескольких методов, указанных на страницах 103 и 104 WO 08/020079.

Полученные аминокислотные последовательности по изобретению должны предпочтительно связываться с белком F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), определенной в данном описании; и/или нейтрализовать hRSV с эффективностью и/или активностью, как определено в данном описании.

аа) Когда сравнивают две аминокислотные последовательности, термин «различие в аминокислоте» относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в позиции первой аминокислотной последовательности по сравнению со второй аминокислотной последовательностью; при этом следует иметь в виду, что такие две аминокислотные последовательности могут содержать одно, два или максимум три таких различия в аминокислоте. «Различие по аминокислотам» может представлять собой любые одну, две или максимум три замены, делеции или вставки в аминокислотной последовательности, т.е. в одном или нескольких каркасных участках или одном или нескольких CDR (которые могут находиться в CDR по изобретению (т.е. в CDR2) или в другом CDR (т.е. в CDR1, CDR2 или CDR3)), или их любое сочетание, которые или улучшают свойства аминокислотной последовательности по изобретению, или которые, по меньшей мере, не слишком ухудшают нужные свойства или баланс или комбинацию нужных свойств аминокислотной последовательности по изобретению. В связи с этим, полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, связывать белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью при сравнении с аминокислотной последовательностью без одной, двух или максимум трех замен, делеции или вставок, причем указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса; и/или полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, иметь активность, которая является одинаковой, примерно одинаковой или более высокой при сравнении с аминокислотной последовательностью без одной, двух или максимум трех замен, делеции и/или вставок. Специалист вообще сможет определить и выбрать подходящие замены, делеции или вставки или их подходящие комбинации на основании данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, которые могут включать, например, введение ограниченного числа возможных замен, делеций или вставок и определение их влияния на свойства аминокислотной последовательности, полученной таким образом.

В одном аспекте изобретения «различие по аминокислотам» представляет собой замену аминокислоты. Замена аминокислоты может представлять собой одну, две или максимум три замены в одном или нескольких каркасных участках или одном или нескольких CDR (которые могут находиться в CDR по изобретению (т.е. в CDR2) или в другом CDR (т.е. в CDR1, CDR2 или CDR3)), или их любое сочетание, которые или улучшают свойства аминокислотной последовательности по изобретению, или которые, по меньшей мере, не слишком ухудшают нужные свойства или баланс или комбинацию нужных свойств аминокислотной последовательности по изобретению. В связи с этим, полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, связывать белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью при сравнении с аминокислотной последовательностью без одной, двух или максимум трех замен, причем указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса; и/или полученная аминокислотная последовательность по изобретению должна, по меньшей мере, иметь активность, которая является одинаковой, примерно одинаковой или более высокой при сравнении с аминокислотной последовательностью без одной, двух или максимум трех замен. Специалист вообще сможет определить и выбрать подходящие замены на данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, которые могут включать, например, введение ограниченного числа возможных замен и определение их влияния на свойства аминокислотных последовательностей, полученных таким образом.

Как указано выше, замены, вставки или делеций могут находиться в одном или нескольких каркасных участках и/или одном или нескольких CDR. Как обсуждается выше (см. выше пункт z)), замена аминокислоты в одном или нескольких CDR может представлять собой любу замену, такую как «консервативная замена» (как определено в данном описании), она может производиться по некоторым правилам (как определено в данном описании), и/или она может привести к улучшенным свойствам у полученных аминокислотных последовательностей.

Когда такие замены, вставки или делеций выполняют в одном или нескольких каркасных участках, они могут быть сделаны в одном или нескольких характерных остатках (определенных, например, в WO 08/020079, таблицы А-3-А-8) и/или в одной или нескольких других позициях в каркасных участках, хотя замены, вставки или делеций в характерных остатках вообще менее предпочтительны (тем не менее, они являются подходящими гуманизирующими заменами, как описано в данном описании). Как примеры, не являющиеся ограничительными, замена может представлять собой, например, консервативную замену (как описано в данном описании), и/или аминокислотный остаток может быть заменен другим аминокислотным остатком, который встречается в природе в той же позиции в другом V_H-домене (см., например, WO 08/020079, таблицы А-5-А-8), хотя изобретение вообще этим не ограничивается.

Замены, вставки или делеции, выполненные (предпочтительно) в одном или нескольких каркасных участках, могут представлять собой гуманизирующие замены (т.е. с заменой одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности встречающейся в природе V_HH-последовательности (и предпочтительно, в каркасных последовательностях) на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующей(их) позиции(ях) в V_H-домене из обычного 4-цепочечного антитела из человеческого организма). Некоторые предпочтительные, но не ограничительные, гуманизирующие замены (и их подходящие комбинации) станут понятнее для специалиста на основании данного раскрытия. Потенциально применимые гуманизирующие замены могут быть установлены путем сравнения последовательности каркасных участков одной аминокислотной последовательности по изобретению, определенной в а), с соответствующей каркасной последовательностью одной или нескольких близко родственных V_H-последовательностей человека, после чего одну или несколько потенциально применимых гуманизирующих замен (или их комбинаций), определенных таким образом, можно вводить в указанную аминокислотную последовательность по изобретению, определенную в а) (любым способом, известным per se, а также описанным в данном описании), и полученную гуманизированную аминокислотную последовательность можно проверить на аффинность в отношении белка F hRSV, на стабильность, на легкость и уровень экспрессии и/или на другие желательные свойства, определенные в данном описании. В связи с этим, путем ограниченного использования метода проб и ошибок, специалист может определить другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие комбинации) на основе данного раскрытия.

Гуманизирующие замены следует выбирать так, чтобы полученные аминокислотная последовательность и/или нанотело® еще сохраняли благоприятные свойства нанотел®, как определено в данном описании. Специалист вообще сможет определить и выбрать подходящие гуманизирующие замены или подходящие комбинации гуманизирующих замен на основе данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, которые могут, например, включать введение ограниченного числа возможных гуманизирующих замен и определение их влияния на свойства нанотел®, полученных таким образом.

Вообще в результате гуманизации аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению могут стать более «подобными человеческим», причем в то же время все еще сохраняются благоприятные свойства нанотел® по изобретению, описанные в данном описании. В результате такие гуманизированные аминокислотная последовательность и/или нанотело® могут иметь некоторые преимущества, такие как уменьшенная иммуногенность по сравнению с соответствующим встречающимся в природе V_HH-Доменом. Вновь на основе данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, специалист сможет выбрать гуманизирующие замены или подходящие комбинации гуманизирующих замен, которые оптимизируют или достигают нужного или подходящего баланса между благоприятными свойствами, приданными гуманизирующими заменами, с одной стороны, и благоприятными свойствами встречающихся в природе V_HH-доменов, с другой стороны.

Аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению можно соответственно гуманизировать в любом(ых) каркасном(ых) остатке(ах), таком(их) как один или несколько характерных остатков (как определено в данном описании), или в одном или нескольких других каркасных остатках (т.е. нехарактерных остатках) или в их любой комбинации. Одной предпочтительной заменой для нанотел® «группы P,R,S-103» или «группы K.ERE» (как определено в WO 08/020079) является замена Q108 на L108.

В зависимости от организма-хозяина, используемого для экспрессии аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению, такие делеции и/или замены также можно создавать таким образом, что один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (таких как один или несколько сайтов гликозилирования) удаляются, насколько будет в пределах возможностей специалиста в данной области техники. С другой стороны, замены или вставки можно создавать так, чтобы ввести один или несколько сайтов для присоединения функциональных групп (как описано в данном описании), например, для создания возможности сайт-специфического пегелирования (вновь как описано в данном описании).

Как можно видеть из данных по энтропии V_HH и вариабельности V_HH, приведенных в таблицах А-5-А-8 в WO 08/020079, некоторые аминокислотные остатки в каркасных участках являются более консервативными, чем другие. Вообще, хотя изобретение в своем самом широком смысле указанным не ограничивается, любые замены, делеции или вставки предпочтительно осуществляют в позициях, которые являются менее консервативными. Также, как правило, замены аминокислот предпочтительнее делеций или вставок аминокислот. Любые замены аминокислот, применяемые к полипептидам, описанным в данном описании, также могут быть основаны на анализе частоты встречаемости различных вариантов аминокислот между гомологичными белками различных видов, разработанном Schuiz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, на анализе потенциалов структурообразования, разработанном Chou and Fasman, Biochemistry, 13:211, 1974, и Adv. Enzymol., 47:45-149, 1978, и на анализе картины гидрофобно в белках, разработанном Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:140-144, 1984; Kyte & Doolittle, J. Molec. Biol., 157:105-132, 1981, и Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem., 15:321-353, 1986; все указанные работы включены в данное описание в качестве ссылок. Сведения о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел даются в данном описании и в работах известного уровня техники, цитированных выше. Также для такой цели кристаллическая структура V_HH-домена от ламы приводится, например, в Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol.3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996), 3, 752-757; и Descanniere et al., Structure, Vol.7, 4, 361 (1999). Другие сведения о некоторых аминокислотных остатках, которые в обычных V_H-доменах образуют поверхность V_H/V_L, и возможные камелизирующие замены в таких позициях, можно найти в работах известного уровня техники, цитированных выше.

Аминокислотные последовательности и/или нанотела® с одной, двумя или максимум тремя такими заменами, вставками или делениями и кодирующие их нуклеотидные последовательности можно получить любым способом, известным per se, например, с использованием одного или нескольких методов, упомянутых на страницах 103 и 104 WO 08/020079.

Полученные аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению должны предпочтительно связываться с белком F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), определенной в данном описании; и/или нейтрализовать hRSV с эффективностью и/или активностью, как определено в данном описании.

bb) Когда сравнивают два полипептида, термин «различие по аминокислоте» относится к вставке, делеций или замене одного аминокислотного остатка в позиции первого полипептида по сравнению со вторым полипептидом; следует иметь в виду, что такие два полипептида могут содержать одно, два или максимум три таких различия по аминокислоте.

«Различие по аминокислотам» может представлять собой любые одну, две или максимум три замены, делеции или вставки в полипептиде, т.е. в одном или нескольких каркасных участках или одном или нескольких CDR (которые могут находиться в CDR по изобретению (т.е. в CDR2) или в другом CDR (т.е. в CDR1, CDR2 или CDR3)), или их любую комбинацию, которые или улучшают свойства полипептида по изобретению, или которые, по меньшей мере, не слишком ухудшают нужные свойства или баланс или комбинацию нужных свойств полипептида по изобретению. В связи с этим, полученный полипептид по изобретению должен, по меньшей мере, связывать белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью при сравнении с полипептидом без одной, двух или максимум трех замен, делеции или вставок, причем указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса; и/или полученный полипептид по изобретению должен, по меньшей мере, иметь активность, которая является одинаковой, примерно одинаковой или более высокой при сравнении с полипептидом без одной, двух или максимум трех замен, делеции и/или вставок. Полученный полипептид должен предпочтительно связывать белок F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), определенной в данном описании; и/или нейтрализовать hRSV с эффективностью и/или активностью, как определено в данном описании. Специалист в данной области сможет определить и выбрать подходящие замены, делеции или вставки или их подходящие комбинации на основании данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа стандартных экспериментов, которые могут включать, например, введение ограниченного числа возможных замен, делеции или вставок и определение их влияния на свойства полипептида, полученного таким образом.

В одном аспекте изобретения «различие по аминокислотам» представляет собой замену аминокислоты. Замена аминокислоты может представлять собой любую одну, любые две или максимум любые три замены в каркасных участках или одном или нескольких CDR (которые могут находиться в CDR по изобретению (т.е. присутствовать в CDR2) или в другом CDR (т.е. в CDR1, CDR2 или CDR3)), или их любую комбинацию, которые или улучшают свойства полипептида по изобретению, или которые, по меньшей мере, не слишком ухудшают нужные свойства или баланс или комбинацию нужных свойств полипептида по изобретению. В связи с этим, полученный полипептид по изобретению должен, по меньшей мере, связывать белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью при сравнении с полипептидом без одной, двух или максимум трех замен, делеций или вставок, причем указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса; и/или полученный полипептид по изобретению должен, по меньшей мере, иметь активность, которая является одинаковой, примерно одинаковой или более высокой при сравнении с полипептидом без одной, двух или максимум трех замен, делеций и/или вставок. Полученный полипептид должен предпочтительно связывать белок F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), определенной в данном описании; и/или нейтрализовать hRSV с эффективностью и/или активностью, как определено в данном описании. Специалист вообще сможет определить и выбрать подходящие замены на основании раскрытия в данном описании и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, которые могут включать, например, введение ограниченного числа возможных замен и определение их влияния на свойства полипептидов, полученных таким образом.

Как указано выше, замены, вставки или делеций могут находиться в одном или нескольких каркасных участках и/или одном или нескольких CDR. Как обсуждается выше (см. пункт z)), замены, вставки или делеций в CDR могут представлять собой любые возможные замены, вставки или делеций, такие как «консервативная замена» (как определено в данном описании), они могут осуществляться по определенным правилам (как определено в данном описании), и/или они могут привести к улучшенным свойствам у полученных полипептидов.

Когда такие замены, вставки или делеций выполняют в одном или нескольких каркасных участках, они могут быть сделаны в одном или нескольких характерных остатках (определенных, например, в WO 08/020079, таблицы А-3-А-8) и/или в одной или нескольких других позициях в каркасных остатках, хотя замены, вставки или делеций в характерных остатках вообще менее предпочтительны (тем не менее, они являются подходящими гуманизирующими заменами, как описано в данном описании). Как примеры, не являющихся ограничительными, замена может представлять собой, например, консервативную замену (как описано в данном описании), и/или аминокислотный остаток может быть заменен другим аминокислотным остатком, который встречается в природе в той же позиции в другом V_HH-домене (см. WO 08/020079, таблицы А-5 - А-8), хотя изобретение вообще этим не ограничивается.

Замены, вставки или делеции, выполненные (предпочтительно) в одном или нескольких каркасных участках, могут представлять собой гуманизирующие замены. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные, гуманизирующие замены (и их подходящие комбинации) станут понятнее для специалиста на основании данного раскрытия. Потенциально применимые гуманизирующие замены могут быть установлены путем сравнения последовательности каркасных участков одной из аминокислотных последовательностей, содержащихся в полипептиде по изобретению, определенных в а), с соответствующей каркасной последовательностью одной или нескольких близко родственных V_H-последовательностей человека, после чего одну или несколько потенциально применимых гуманизирующих замен (или их комбинаций), определенных таким образом, можно вводить в указанный полипептид по изобретению, определенный в а) (любым способом, известным per se, а также описанным в данном описании), и полученную последовательность полипептида можно проверить на аффинность в отношении белка F hRSV, на стабильность, на легкость и уровень экспрессии и/или на другие желательные свойства, определенные в данном описании. В связи с этим, путем ограниченного использования метода проб и ошибок, специалист может определить другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие комбинации) на основе данного раскрытия.

Гуманизирующие замены следует выбирать так, чтобы полученные гуманизированные последовательности полипептида еще сохраняли благоприятные свойства нанотел®, содержащихся в полипептиде, как определено в данном описании. Специалист вообще сможет определить и выбрать подходящие гуманизирующие замены или подходящие комбинации гуманизирующих замен на основе данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, которые могут, например, включать введение ограниченного числа возможных гуманизирующих замен и определение их влияния на свойства нанотел®, содержащихся в полипептиде, полученном таким образом.

Вообще в результате гуманизации полипептид по изобретению может стать более «подобным полипептиду человека», причем в то же время все еще сохраняются благоприятные свойства нанотел® по изобретению, содержащиеся в полипептиде, которые описаны в данном описании. В результате такие гуманизированные полипептиды могут иметь некоторые преимущества, такие как уменьшенная иммуногенность, по сравнению с полипептидами, которые содержат в себе соответствующие встречающиеся в природе V_HH-домены. Вновь на основе данного раскрытия и, необязательно, после ограниченного числа обычных экспериментов, специалист сможет выбрать гуманизирующие замены или подходящие комбинации гуманизирующих замен, которые оптимизируют или достигают нужного или подходящего баланса между благоприятными свойствами, приданными гуманизирующими заменами, с одной стороны, и благоприятными свойствами встречающихся в природе V_HH-доменов, с другой стороны.

Полипептиды по изобретению могут быть соответственно гуманизированы в любом(ых) каркасном(ых) остатке(ах), таком(их) как один или несколько характерных остатков (как определено в данном описании), или в одном или нескольких других каркасных остатках (т.е. нехарактерных остатках) или в их любой подходящей комбинации. Одной предпочтительной гуманизирующей заменой для нанотел® «группы P,R,S-103» или «группы KERE» является замена Q108 на L108.

В зависимости от организма-хозяина, используемого для экспрессии полипептида по изобретению, такие делеции и/или замены также можно создавать таким образом, что один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (таких как один или несколько сайтов гликозилирования) удаляются, как это будет в пределах возможностей специалиста в данной области техники. С другой стороны, замены или вставки можно создавать так, чтобы ввести один или несколько сайтов для присоединения функциональных групп (как описано в данном описании), например, для создания возможности сайт-специфического пегелирования (вновь как описано в данном описании).

Как можно видеть из данных по энтропии V_HH и вариабельности V_HH, приведенных в таблицах А-5-А-8 в WO 08/020079, некоторые аминокислотные остатки в каркасных участках являются более консервативными, чем другие. Вообще, хотя изобретение в своем самом широком смысле указанным не ограничивается, любые замены, делеции или вставки предпочтительно осуществляют в позициях, которые являются менее консервативными. Также, как правило, замены аминокислот предпочтительнее делений или вставок аминокислот. Любые замены аминокислот, применяемые к полипептидам, описанным в данном описании, также могут быть основаны на анализе частоты встречаемости различных вариантов аминокислот между гомологичными белками различных видов, разработанном Schuiz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, на анализе потенциалов структурообразования, разработанном Chou and Fasman, Biochemistry, 13: 211, 1974, и Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, и на анализе картины гидрофобности в белках, разработанном Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:140-144, 1984; Kyte & Doolittle, J. Molec. Biol., 157:105-132, 1981, и Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem., 15:321-353, 1986; все указанные работы включены в данное описание в качестве ссылок. Сведения о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел® приводятся в данном описании и в работах известного уровня техники, цитированных выше. Также для такой цели кристаллическая структура V_HH-домена от ламы приводится, например, в Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol.3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996), 3, 752-757; и Descanniere et al., Structure, Vol.7, 4, 361 (1999). Другие сведения о некоторых аминокислотных остатках, которые в обычных доменах V_H образуют поверхность раздела V_H/V_L, и возможные камелизирующие замены в таких позициях, можно найти в работах известного уровня техники, цитированных выше.

Полипептиды с одной, двумя или максимум тремя заменами, вставками или делениями и кодирующие их нуклеотидные последовательности можно получить любым способом, известным per se, например, с использованием одного или нескольких методов, упомянутых на страницах 103 и 104 WO 08/020079.

Полученные полипептиды по изобретению должны предпочтительно связываться с белком F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), определенной в данном описании; и/или нейтрализовать hRSV с эффективностью и/или активностью, как определено в данном описании.

cc) Фигуры, список последовательностей и экспериментальная часть/примеры приводятся только для дополнительного пояснения изобретения и никоим образом не должны интерпретироваться или истолковываться как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения, если в данном описании не указано недвусмысленно иное.

Для связывания со своим эпитопом на белке F hRSV аминокислотная последовательность обычно будет содержать, в пределах своей аминокислотной последовательности, один или несколько аминокислотных остатков или один или несколько тяжей из аминокислотных остатков (определенных в данном описании; т.е. при этом каждый «тяж» включает два или больше аминокислотных остатков, которые являются прилегающими друг к друга или находятся в тесной близости друг к другу, т.е. в первичной или третичной структуре аминокислотной последовательности), через которые аминокислотная последовательность по изобретению может связываться со своим эпитопом на белке F hRSV. Такие аминокислотные остатки или тяжи аминокислотных остатков образуют, таким образом «сайт» для связывания эпитопа на белке F hRSV (также называемого в данном описании «антигенсвязывающим сайтом», что также определено в данном описании).

Настоящее изобретение относится к ряду тяжей из аминокислотных остатков (определенных в данном описании), которые особенно подходят для связывания с антигенным сайтом II на белке F hRSV (описание антигенных сайтов в белке F hRSV дается в ссылке Lopez et al., 1998, J. Virol., 72: 6922-6928). Такие тяжи аминокислотных остатков могут присутствовать в и/или могут быть включены в аминокислотную последовательность по изобретению, в частности, таким образом, что они образуют антигенсвязывающий сайт (часть) аминокислотной последовательности по изобретению. Полученные аминокислотные последовательности будут связываться с эпитопом на белке F hRSV, который находится в, образует часть или перекрывается (т.е. в первичной или третичной структуре) или находится в непосредственной близости от (т.е. в первичной или третичной структуре) антигенного сайта II на белке F hRSV. Также полученные аминокислотные последовательности будут предпочтительно такими, что они могут конкурировать с Синагисом® за связывание с белком F hRSV; и/или такими, что они могут связываться с тем же эпитопом или сайтом связывания на белке F hRSV или с эпитопом, близким к указанному сайту связывания, и/или перекрывать указанный сайт связывания.

Настоящее изобретение относится к тяжу аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 102), который особенно подходит для связывания с белком F hRSV. Такой тяж из аминокислотных остатков (или варианты SEQ ID NO: 102, как определено в данном описании) может присутствовать в и/или может быть включен в аминокислотную последовательность по изобретению, в частности, таким образом, что он образует антигенсвязывающий сайт (часть) аминокислотной последовательности по изобретению. Тяж из аминокислотных остатков синтезирован как последовательность CDR2 тяжелоцепочечного антитела или V_HH-последовательности (NC41; SEQ ID NO: 5), которая направлена на белок F hRSV и которую далее модифицируют с помощью библиотеки для генерации гуманизированных нанотел® NC41 (как описано в разделе «Примеры»). В более частном случае глициновый остаток (Gly, G) в позиции 6 CDR2 NC41 заменяют на остаток аспарагиновой кислоты (Asp, D). Неожиданно, для аминокислотной последовательности, которая включает такой тяж из аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 102), отмечают улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), улучшенную аффинность и/или улучшенную авидность в отношении белка F hRSV и/или улучшенную эффективность и/или активность в отношении нейтрализации hRSV. Такой тяж из аминокислотных остатков (или варианты SEQ ID NO: 102, как определено в данном описании) в данном описании также называют «последовательности CDR2 по изобретению».

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121 и

a) SEQ ID NO: 98;

второй тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

и третий тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аминокислотные последовательности, включающие один или несколько вышеуказанных специфических тяжей из аминокислотных остатков, проявляют улучшенные свойства, такие как, например, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV и/или улучшенной эффективности и/или активности в отношении нейтрализации hRSV.

В более частном случае аминокислотные последовательности по изобретению, включающие один или несколько вышеуказанных специфических тяжей из аминокислотных остатков, могут связываться с белком с F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), предпочтительно, такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 15 нМ - 1 нМ или даже 10 нМ - 1 нМ меньше;

и/или такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ M^-1.c^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше;

и/или такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 от нескольких суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Некоторые предпочтительные величины IC50 для связывания аминокислотных последовательностей по изобретению с белком с F hRSV станут понятнее из дальнейшего описания и приведенных примеров.

Анализы для определения IC50 включают конкурентные анализы, такие как конкурентный ELISA (например, конкуренции с Синагисом® или его фрагментом Fab), или, предпочтительнее, анализы нейтрализации, такие как анализ микронейтрализации, описанный Anderson et al. (1985, J. Clin. MicrobioL, 22:1050-1052; 1988, J. ViroL, 62:4232-4238), модификации указанного анализа, такие как описанные в примере 6; или анализ уменьшения бляшкообразования, описанный, например, Johnson et al. (1997, J. Int. Dis., 176:1215-1224), и его модификации.

Например, в конкурентном анализе с фрагментом Fab Синагиса® аминокислотные последовательности по изобретению могут иметь величины IC50 от 1 нМ до 100 нМ, предпочтительно, от 10 нМ до 50 нМ или меньше.

Например, в анализе микронейтрализации на hRSV Long (таком, как описанный, например, в примере 6), аминокислотные последовательности по изобретению могут иметь величины IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Следует отметить, что изобретение не ограничивается ни происхождением аминокислотной последовательности по изобретению (или нуклеотидной последовательности по изобретению, используемой для ее экспрессии), ни способом, которым аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность по изобретению синтезирована или получена. Таким образом, аминокислотные последовательности по изобретению могут представлять собой аминокислотные последовательности, встречающиеся в природе (от любых подходящих видов), или синтетические или полусинтетические аминокислотные последовательности.

Следует отметить, что изобретение в своем самом широком смысле не ограничивается конкретной структурной ролью или функцией, которые указанные тяжи аминокислотных остатков могут иметь в аминокислотной последовательности по изобретению, до тех пор, пока такие тяжи аминокислотных остатков позволяют аминокислотной последовательности по изобретению связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV с определенной аффинностью и/или активностью (как определено в данном описании). Таким образом вообще изобретение в своем самом широком смысле включает аминокислотные последовательности, которые способны связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV и которые включают один или несколько тяжей из аминокислотных остатков, как определено в данном описании (и в частности, подходящую комбинацию из двух или большего числа таких тяжей из аминокислотных остатков), которые соответственно соединены друг с другом через одну или несколько других аминокислотных последовательностей, так что полная аминокислотная последовательность образует связывающий домен и/или связывающую единицу, которая способна связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV.

Такая аминокислотная последовательность может представлять собой, например, подходящий «белковый остов», который включает, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков, определенный в данном описании (т.е. как часть своего антигенсвязывающего сайта). Подходящие остовы для рассматриваемых аминокислотных последовательностей будут понятны для специалиста и включают, например, без ограничения, связывающие остовы, основанные на или образованные из иммуноглобулинов, белковые остовы, образованные из доменов белка А (таких как Affibodies™), фибронектина, липокалина, CTLA-4, Т-клеточных рецепторов, сконструированных анкириновых повторах, авимерах и доменах PDZ (Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23:1257) и связывающих группах на основе ДНК или РНК, включая, но не ограничиваясь указанным, аптамеры ДНК или РНК (Urich et al., 2006, Comb. Chem. High Throughput Screen, 9(8):619-32).

Вновь любая аминокислотная последовательность по изобретению, которая включает один или несколько тяжей из аминокислотных остатков, определенных в данном описании для аминокислотных последовательностей по изобретению, предпочтительно такова, что она может специфически связываться (как определено в данном описании) с белком F hRSV, и в более частном случае такова, что она может связываться с белком F hRSV с такой аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), какая определена в данном описании. Любая аминокислотная последовательность по изобретению, которая включает один или несколько тяжей из аминокислотных остатков, определенных в данном описании для аминокислотных последовательностей по изобретению, предпочтительно такова, что она может нейтрализовать hRSV с такой активностью (измеренной в подходящем анализе, как определено в данном описании), какая определена в данном описании.

Более того, специалисту также будет понятно, что возможно «привить» один или несколько CDR, определенных в данном описании для аминокислотных последовательностей по изобретению, на другие «остовы», включая, но не ограничиваясь указанным, человеческие остовы или неиммуноглобулиновые остовы. Подходящие остовы и методы для такой прививки CDR будут понятны для специалиста и хорошо известны в технике, см., например, US 7180370, WO 01/27160, EP 0605522, EP 0460167, US 7054297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct. 34(2):184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991, Oct. 4(7):773-783; O'Brien and Jones, Methods Mol. Biol. 2003, 207:81-100; и Skerra, J. Mol. Recognit. 2000, 13:167-187, and Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep, 23, 352(3):597-607, и другие ссылки, цитированные в указанных работах. Например, известные per se методы прививки мышиных или крысиных CDR на человеческие каркасы и остовы могут быть использованы аналогично для получения химерных белков, включающих одну или несколько последовательностей CDR, определенных в данном описании для аминокислотных последовательностей по изобретению, и один или несколько каркасных участков или последовательностей человека.

В одном конкретном, но не ограничивающем аспекте аминокислотная последовательность по изобретению может представлять собой аминокислотную последовательность, которая включает иммуноглобулиновую укладку цепи или аминокислотную последовательность, которая, в подходящих условиях (таких как физиологические условия) способна формировать иммуноглобулиновую укладку цепи (т.е. путем укладки). Среди прочего можно сослаться на обзор Halaby et al. (1999, J. Protein Eng., 12:563-71). Предпочтительно, когда уложенные должным образом так, что формируется иммуноглобулиновая укладка цепи, тяжи аминокислотных остатков могут должным образом образовывать антигенсвязывающий сайт для связывания специфического антигенного сайта II на белке F hRSV; и предпочтительнее, способны связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV с такой аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, описанных далее в данном описании), какая определена в данном описании.

В другом конкретном, но не ограничивающем аспекте аминокислотные последовательности по изобретению представляют собой иммуноглобулиновые последовательности, в частности, но без ограничения, аминокислотные последовательности по изобретению могут представлять собой аминокислотные последовательности, которые, по существу, состоят из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно); или любой подходящий фрагмент такой аминокислотной последовательности, который еще связывает антигенный сайт II на белке F hRSV.

В такой аминокислотной последовательности по изобретению каркасные последовательности могут представлять собой любые каркасные последовательности, и примеры подходящих каркасных последовательностей будут понятны для специалиста, например, на основании стандартных руководств и также раскрытия и сообщений известного уровня техники, упомянутых в данном описании.

Каркасные последовательности предпочтительно представляют собой каркасные последовательности иммуноглобулина (подходящую комбинацию) или каркасные последовательности, полученные из каркасных последовательностей иммуноглобулина (например, гуманизацией или камелизацией). Например, каркасные последовательности могут представлять собой каркасные последовательности, полученные из вариабельного домена легкой цепи (например, V_L-последовательность) и/или из вариабельного домена тяжелой цепи (например, V_H-последовательность). Когда аминокислотная последовательность по изобретению представляет собой последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, она может представлять собой последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, полученную из обычного четырехцепочечного антитела (такую как, без ограничения, V_H-последовательность, которая получена из человеческого антитела), или представлять собой так называемую V_HH-последовательность (определенную в данном описании), которая получена из так называемого «тяжелоцепочечного антитела» (определенного в данном описании). В одном особенно предпочтительном аспекте каркасные последовательности представляют собой или каркасные последовательности, полученные из V_HH-последовательности (в которой указанные каркасные последовательности могут быть, необязательно, частично или полностью гуманизированы), или обычные V_H-последовательности, которые камелизированы (как определено в данном описании).

Для общего представления о тяжелоцепочечных антителах и их вариабельных доменах обращаются, среди прочего, к работам известного уровня техники, цитированным в данном описании, а также к уровню техники, который упоминается на странице 59 WO 08/020079, и к списку ссылок, приведенному на страницах 41-43 поданной в Международное патентное ведомство заявки WO 06/040153, и указанные работы и ссылки включены в данное описание в качестве ссылок.

Каркасные последовательности предпочтительно могут быть такими, что аминокислотная последовательность по изобретению представляет собой доменное антитело (или аминокислотную последовательность, которая подходит для использования в качестве доменного антитела); представляет собой «dAb» (или аминокислотную последовательность, которая подходит для использования в качестве dAb); или представляет собой нанотело® (включая, но не ограничиваясь указанным, V_HH-последовательность). Вновь подходящие каркасные последовательности будут понятны для специалиста, например, па основе стандартных руководств и также раскрытия и работ известного уровня техники, упомянутых в данном описании.

В частности, каркасные последовательности, присутствующие в аминокислотных последовательностях по изобретению, могут содержать один или несколько характерных остатков (определенных в WO 08/020079 (таблицы А-3-А-8)), так что аминокислотная

последовательность по изобретению представляет собой нанотело®. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких каркасных последовательностей (их подходящих комбинаций) станут понятны из дальнейшего раскрытия (см., например, таблицу А-6). Вообще нанотела® (в частности, V_HH-последовательности и частично гуманизированные нанотела®) могут, в частности, характеризоваться присутствием одного или нескольких «характерных остатков» в одной или нескольких каркасных последовательностях (как, например, также описано в WO 08/020079, страница 61, строка 24 - страница 98, строка 3).

Как уже описано в данном описании, аминокислотную последовательность и структуру нанотела® можно рассматривать, однако, не ограничиваясь этим, как включающую четыре каркасных участка или «FR», которые называются в технике и в данном описании как «каркасный участок 1» или «FR1», как «каркасный участок 2» или «FR2», как «каркасный участок 3» или «FR3» и как «каркасный участок 4» или «FR4», соответственно, и указанные каркасные участки прерываются тремя гипервариабельными участками или «CDR», которые называются в технике как «гипервариабельный участок 1» или «CDR1», как «гипервариабельный участок 2» или «CDR2» и «гипервариабельный участок 3» или «CDR3», соответственно. Некоторые предпочтительные каркасные последовательности и CDR (и их комбинации), которые присутствуют в нанотелах® по изобретению, описаны в данном описании.

Таким образом, вообще, нанотело® можно определить как аминокислотную последовательность (общей) структуры

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным участкам 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам, соответственно, и в которой присутствуют один или несколько характерных остатков, как описано в данном описании далее.

В связи с этим аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), в которых CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102;

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Такие предпочтительные гипервариабельные участки (последовательности CDR2) также называют «CDR2 по изобретению».

Предпочтительно аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), в которых CDR2 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один из CDR1 или CDR-3 выбран из

- CDR1, выбранного из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 98;

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

и/или

- CDR3, выбранного из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

- CDR1 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

И) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

- CDR3 выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

В конкретном аспекте аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

В другом конкретном аспекте аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

a) SEQ ID NO: 98;

c) SEQ ID NO: 121;

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Предпочтительно аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, два тяжа из аминокислотных остатков (последовательности CDR), из которых один тяж выбран из группы, состоящей из тяжей из аминокислотных остатков, определенных в а) и Ь), и из которых другой тяж выбран из группы, состоящей из тяжей из аминокислотных остатков, определенных в с) и d).

Предпочтительно аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению включают SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Предпочтительные комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 также показаны в таблице А-6.

Аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, которая получена из обычного четырехцепочечного антитела, или могут, по существу, состоять из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, которая получена из тяжелоцепочечного антитела. Аминокислотные последовательности по изобретению могут, по существу, состоять из доменного антитела (или аминокислотной последовательности, которая подходит для использования в качестве доменного антитела), однодоменного антитела (или аминокислотной последовательности, которая подходит для использования в качестве однодоменного антитела) или «dAb» (или аминокислотной последовательности, которая подходит для использования в качестве dAb) или нанотела®.

Для общего представления об (одно)доменных антителах обращаются к работам известного уровня техники, цитированным в данном описании, а также к ЕР 0368684. В случае термина «dAb» следует обратиться, например, к Ward et al., (1989, Nature, 341:544-6), к Holt et al., 2003, Trends Biotechnol., 21:484-490, а также, например, к WO 06/0302220, WO 06/003388 и другим опубликованным заявкам на патент Domantis Ltd. Также следует отметить, будучи менее предпочтительными в контексте настоящего изобретения из-за того, что они происходят не от млекопитающих, однодоменные антитела или одновариабельные домены могут быть получены от некоторых видов акул (например, так называемые «домены IgNAR», см., например, WO 05/18629).

В частности, аминокислотная последовательность по изобретению может, по существу, состоять из или может представлять собой нанотело® (определенное в данном описании) или его подходящий фрагмент. [Примечание: нанотело®, нанотела® и наноклон® являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V.]

Нанотело® можно определить как аминокислотную последовательность (общей) структуры

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным участкам 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам, соответственно, и в которой один или несколько характерных остатков являются такими, как они определены в WO 08/020079 (таблицы А-3-А-8).

В более частном случае нанотело® может представлять собой аминокислотную последовательность (общей) структуры

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным участкам 1-4, соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к гипервариабельным участкам, соответственно, и которая

i) имеет, по меньшей мере, 80% идентичность по аминокислотам с, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157 (см, таблицу А-4), в которых в целях определения степени идентичности по аминокислотам аминокислотные остатки, которые образуют последовательности CDR, не принимают во внимание; в связи с этим также обращаются к таблице А-6, в которой дается список каркасных последовательностей 1 (SEQ ID NO: 81-97 и 166), каркасных последовательностей 2 (SEQ ID NO: 99-100), каркасных последовательностей 3 (SEQ ID NO: 103-120 и 167-168) и каркасных последовательностей 4 (SEQ ID NO: 123 и 169) нанотел® SEQ ID NO: 60-76,138-141 и 146-157 (см. таблицу А-4);

и в которой

ii) предпочтительно один или несколько аминокислотных остатков в позициях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 согласно нумерации по Кабату выбраны из характерных остатков, указанных в таблицах А-3-А-8 в WO 08/020079.

Также для общего представления о нанотелах® обращаются к работам известного уровня техники, цитированных в данном описании, например, к описанию в WO 08/020079 (страница 16).

Такие нанотела® можно получить любым подходящим способом из любого подходящего источника, и они могут например, представлять собой встречающиеся в природе V_HH-последовательности (т.е. от подходящего вида верблюжьих) или синтетические или полусинтетические аминокислотные последовательности.

Вновь такие нанотела® можно получить любым подходящим способом из любого подходящего источника, и они могут например, представлять собой встречающиеся в природе V_HH-последовательности (т.е. от подходящего вида верблюжьих) или синтетические или полусинтетические аминокислотные последовательности, включая, но не ограничиваясь указанным, «гуманизированные» (как определено в данном описании) нанотела®, «камелизированные» (как определено в данном описании) иммуноглобулиновые последовательности (и в частности, камелизированные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи), а также нанотела®, которые получены такими методами, как «созревание аффинности» (например, исходя из синтетических, случайных или встречающихся в природе иммуноглобулиновых последовательностей), прививка CDR, изменение поверхности, объединение фрагментов, полученных из различных иммуноглобулиновых последовательностей, сборка с помощью ПЦР (PCR) с использованием перекрывающихся праймеров, и подобными методами создания иммуноглобулиновых последовательностей, хорошо известными специалисту; или любым подходящим сочетанием любых вышеуказанных способов, описанных далее в данном описании. Также, когда нанотело® включает V_HH-последовательность, указанное нанотело® можно соответственно гуманизировать, как описано далее в данном описании, так что получают одно или несколько дополнительно (частично или полностью) гуманизированных нанотел® по изобретению. Подобным образом, когда нанотело® включает синтетическую или полусинтетическую последовательность (такую как частично гуманизированная последовательность), указанное нанотело® можно, необязательно, соответствующим образом гуманизировать далее, вновь как описано в данном описании, и вновь так, что получают одно или несколько дополнительно (частично или полностью) гуманизированных нанотел® по изобретению.

В частности, гуманизированные нанотела® могут представлять собой аминокислотные последовательности, которые вообще определены как нанотело® в предыдущих абзацах, но в которых присутствует, по меньшей мере, один аминокислотный остаток (и в частности, по меньшей мере, один из каркасных остатков), который является и/или соответствует гуманизирующей замене (как определено в данном описании). Некоторые предпочтительные, но не ограничительные, гуманизирующие замены (и их подходящие комбинации) станут понятны для специалиста на основании данного раскрытия. Кроме того, или с другой стороны, можно установить другие потенциально применимые гуманизирующие замены, сравнивая последовательность каркасных участков встречающейся в природе V_HH-последовательности с соответствующей каркасной последовательностью одной или нескольких близкородственных человеческих V_H-последовательностей, после чего одну или несколько потенциально применимых гуманизирующих замен (или их комбинаций), определенных таким образом, можно ввести в V_HH-последовательность (любым способом, известным per se), и полученные гуманизированные V_HH-последовательности можно проверить на аффинность в отношении мишени, на стабильность, на легкость и уровень экспрессии и/или на другие нужные свойства. В связи с этим на основании данного раскрытия путем ограниченного использования метода проб и ошибок специалист может определить другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие комбинации). Также на основании вышеописанного нанотело® (каркасные участки) можно гуманизировать частично или полностью.

В связи с этим некоторые предпочтительные нанотела® по изобретению представляют собой нанотела®, которые специфически связывают (как описано далее в данном описании) белок F hRSV и которые

i) представляют собой гуманизированный вариант аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 (см. таблицу А-1); и/или

ii) имеют, по меньшей мере, 80% идентичность по аминокислотам с, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5 (см. таблицу А-1) и/или с, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157 (см. таблицу А-4), в которых в целях определения степени идентичности по аминокислотам аминокислотные остатки, которые образуют последовательности CDR, не принимают во внимание;

и в которых

iii) предпочтительно один или несколько аминокислотных остатков в позициях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 согласно нумерации по Кабату выбраны из характерных остатков, указанных в таблицах А-3-А-8 в WO 08/020079.

Настоящее изобретение относится к ряду гуманизированных и/или аминокислотных последовательностей с оптимизированной последовательностью и/или нанотел®, которые особенно подходят для связывания белка F hRSV. Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям и/или нанотелам®, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 60-76, при условии, что

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 60-76.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям и/или нанотелам®, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76, при условии, что

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению выбирают из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

i) аминокислотная последовательность имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78 и аргинин (Arg, R) в позиции 83 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям и/или нанотелам®, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 65 и 76, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 54, глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин.(Leu, L) в позиции 78 и/или аргинин (Arg, R) в позиции 83 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению выбирают из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

i) аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 54, глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78 и аргинин (Arg, R) в позиции 83 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительно, аминокислотная последовательности и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 65. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательности и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 76.

Настоящее изобретение также относится к ряду гуманизированных и/или с оптимизированной последовательностью аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 146-153, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-153.

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® выбирают из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85;

- SEQ ID NO: 153, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Аминокислотные последовательности и/или нанотела® по настоящему изобретению проявляют уменьшенную иммуногенность при введении человеку. Кроме того, аминокислотные последовательности и/или нанотела® по настоящему изобретению проявляют улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании) в отношении белка F hRSV, no сравнению с соответствующими им исходными аминокислотными последовательностями (как описано в заявке РСТ РСТ/ЕР 2009/056975, озаглавленной «Аминокислотные последовательности, направленные на белки оболочек вируса, и включающие их полипептиды для лечения вирусных заболеваний», зарегистрированной Ablynx N.V. 5 июня 2009).

Во время получения нанотел по изобретению методом ОФ-ВЭЖХ на аминоконце обнаруживают высокий уровень пироглутамата (pGlu). Уровни pGlu свыше 15% детектируют после ферментации, и уровень pGlu постоянно возрастал при хранении во время исследований стабильности. Такая модификация ведет к неоднородности конечного продукта, и ее необходимо избежать. Поэтому регулирование/предупреждение образования pGlu критично для сохранения терапевтических белков с присущими им характеристиками. Специфические составы жидкостей и/или условия хранения необходимы для белков с N-концевой глутаминовой кислотой, причем таким образом минимизируется образование пироглутаминовой кислоты.

В настоящем изобретении возможность посттрансляционной модификации pGlu N-конца устраняют путем замены N-концевой глутаминовой кислоты (Е) [НООС-(СН2)2-белок] на аспарагиновую кислоту (D) [НООС-СН2-белок], что ведет к повышенной стабильности продукта. Соответственно, настоящее изобретение также относится к аминокислотным последовательностям и нанотелам, описанным выше, в которых глутаминовая кислота в позиции 1 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату) заменена на аспарагиновую кислоту.

Настоящее изобретение относится к ряду оптимизированных по последовательности аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые проявляют повышенную стабильность при хранении во время исследований стабильности. Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям и/или нанотелам®, выбранным из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157, при условии, что

1) аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой в позиции 1 Glu заменен на Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 62, в которой в позиции 1 Glu заменен на Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 65, в которой в позиции 1 Glu заменен на Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 76, в которой в позиции 1 Glu заменен на Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-153, в которой в позиции 1 Glu заменен на Asp.

Предпочтительно, аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 138. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 139. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 140. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 141. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность и/или нанотело® по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 154-157.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и при этом в позиции 1 Glu заменен на Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и при этом в позиции 1 Glu заменен на Asp.

В другом аспекте аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala18Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и при этом в позиции 1 Glu заменен на Asp.

Предпочтительно аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln и Glnl08Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu. Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аминокислотные последовательности и/или нанотела® по настоящему изобретению проявляют улучшенные свойства, такие как, например, улучшенная стабильность, уменьшенная иммуногенность, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании), улучшенной аффинности и/или улучшенной авидности в отношении белка F hRSV, и/или улучшенной эффективности и/или активности для нейтрализации hRSV по сравнению с соответствующими им аминокислотными последовательностями дикого типа (как описано в заявке РСТ РСТ/ЕР 2009/056975, озаглавленной «Аминокислотные последовательности, направленные на белки оболочки вируса, и включающие их полипептиды для лечения вирусных заболеваний», зарегистрированной Ablynx N.V. 5 июня 2009).

В более частном случае аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению могут связываться с белком F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании), предпочтительно, такой, что они

и/или такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ M^-1.c^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ M^-1.c^-1 или больше;

и/или такой, что они

Анализы для определения IC50 включают конкурентные анализы, такие как конкурентный ELISA (например, конкуренции с Синагисом® или его фрагментом Fab), или, предпочтительнее, анализы нейтрализации, такие как анализ микронейтрализации, описанный Anderson et al. (1985, J. Clin. MicrobioL, 22: 1050-1052; 1988, J. ViroL, 62:4232-4238), модификации указанного анализа, такие как описанные в примере 6; или анализ уменьшения бляшкообразования, описанный, например, Johnson et al. (1997, J. Int. Dis., 176:1215-1224), и его модификации.

Аминокислотные последовательности и нанотела® по изобретению предпочтительно находятся в, по существу, изолированной форме (как определено в данном описании) или образуют часть полипептида по изобретению (также называемого в данном описании «полипептид по изобретению» или «конструкция по изобретению»; оба термина используются как взаимозаменяемые), которые могут включать или, по существу, состоять из одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению, и которые могут, необязательно, также включать одну или несколько других аминокислотных последовательностей или нанотел® (все необязательно соединенные через один или несколько более подходящих линкеров).

Соответственно, в другом аспекте изобретение относится к полипептиду (также называемому в данном описании «полипептид по изобретению»), который включает или, по существу, состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению (или их подходящих фрагментов).

Способ создания/отбора и/или получения полипептида по изобретению, исходя из аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению, также в данном описании называется «форматированием» указанных аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению, и об аминокислотной последовательности или нанотеле® по изобретению, которые становятся частью полипептида по изобретению, говорят, что они «форматированы» или находятся «в формате» указанного полипептида по изобретению. Примеры путей, которыми аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению могут быть форматированы, и примеры таких форматов будут понятны для специалиста на основании данного раскрытия; и такие форматированные аминокислотные последовательности или нанотела® по изобретению образуют дополнительный аспект изобретения.

Например, и без ограничения, одну или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению можно использовать в качестве связывающей единицы в таком полипептиде, который может, необязательно, содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут служить в качестве связывающей единицы (т.е. против того же или другого эпитопа на белке F hRSV и/или против одного или нескольких антигенов, белков или мишеней, отличных от белка F hRSV), так что получается моновалентный, поливалентный, полипаратопный или полиспецифический полипептид по изобретению, соответственно, все описанные в данном описании. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду, который является моновалентным полипептидом или конструкцией, включающей или, по существу, состоящей из аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду, который представляет собой поливалентный полипептид или конструкцию, такой как, например, двухвалентные или трехвалентные полипептид или конструкция. Настоящее изобретение также относится к полипептиду, который представляет собой полиспецифический полипептид или конструкцию, такой как, например, биспецифические или триспецифические полипептид или конструкция. Настоящее изобретение также относится к полипептиду, который представляет собой полипаратопный полипептид или конструкцию, такой как, например, бипаратропные или трипаратропные полипептид или конструкция.

Соответственно, в предпочтительном, но не ограничительном аспекте аминокислотные последовательностей или нанотела® по изобретению включают, по меньшей мере, одну дополнительную аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению, так что получается полипептид по изобретению, который включает, по меньшей мере, две, например, две, три, четыре, пять или больше аминокислотных последовательностей или нанотел®, где указанные аминокислотные последовательности или нанотела® могут необязательно соединяться через одну или несколько линкерных последовательностей (определенных в данном описании). Полипептиды по изобретению, которые включают две или больше аминокислотных последовательностей или нанотел®, из которых, по меньшей мере, одна, и предпочтительно, все представляют собой аминокислотные последовательности или нанотела® по изобретению, также будут называться в данном описании «поливалентными» полипептидами по изобретению, и аминокислотные последовательности или нанотела®, присутствующие в таких полипептидах, также будут называться в данном описании как находящиеся в «поливалентном формате». Например, «двухвалентный» полипептид по изобретению включает две аминокислотные последовательности и/или нанотела®, необязательно соединенные через линкерную последовательность, в то время как «трехвалентный» полипептид по изобретению включает три аминокислотные последовательности и/или нанотела®, необязательно соединенные через две линкерные последовательности, и т.д., при этом, по меньшей мере, одна из аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, присутствующих в полипептиде, и другие, до всех, аминокислотные последовательности и/или нанотела®, присутствующие в полипептиде, представляет(ют) собой аминокислотные последовательности и/или нанотела® по изобретению.

В поливалентном полипептиде по изобретению две или больше аминокислотных последовательностей и/или нанотел® могут быть одинаковыми или различными и могут быть направлены против одного и того же антигена или антигенной детерминанты (например, против одной(их) и той(тех) же части(ей) или эпитопа(ов) или против различных частей или эпитопов) или, с другой стороны, могут быть направлены против различных антигенов или антигенных детерминант или их любой подходящей комбинации. Например, двухвалентный полипептид по изобретению может включать (а) две идентичные аминокислотные последовательности или нанотела®; (b) первые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против первой антигенной детерминанты белка или антигена, и вторые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против той же антигенной детерминанты указанного белка или антигена, которые отличаются от первых аминокислотной последовательности или нанотела®, (с) первые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против первой антигенной детерминанты белка или антигена, и вторые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против другой антигенной детерминанты указанного белка или антигена; или (d) первые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против первой антигенной детерминанты белка или антигена, и вторые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго белка или антигена (т.е. отличающегося от указанного первого антигена). Подобным образом, трехвалентный полипептид по изобретению может, например и без ограничения указанным, включать (а) три идентичные аминокислотные последовательности или нанотела®; (b) две идентичные аминокислотные последовательности или нанотела® против первой антигенной детерминанты антигена и третьи аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против другой антигенной детерминанты того же антигена; (с) две идентичные аминокислотные последовательности или нанотела® против первой антигенной детерминанты антигена и третьи аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена, отличающегося от указанного первого антигена; (d) первые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против первой антигенной детерминанты первого антигена, вторые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второй антигенной детерминанты указанного первого антигена, и третьи аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена, отличающегося от указанного первого антигена; или (е) первые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против первого антигена, вторые аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена, отличающегося от указанного первого антигена, и третьи аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против третьего антигена, отличающегося от указанных первого и второго антигена.

В предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению (описанных выше).

В одном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из аминокислотных последовательностей, которые включают, мо меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121 и

f) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

a) SEQ ID NO: 98;

второй тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

и третий тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

f) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В еще одном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые, по существу, состоят из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102;

В еще одном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые, по существу, состоят из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 102 или

и, по меньшей мере, один из CDR1 или CDR3 выбран из

- CDR1, выбранного из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 98;

- CDR3, выбранного из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121 или

- CDR1 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102 или

- CDR3 выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

В другом конкретном аспекте поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121;

Предпочтительные поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, два тяжа из аминокислотных остатков (последовательности CDR), из которых один тяж выбран из группы, состоящей из тяжей из аминокислотных остатков, определенных в с) и d), и из которых другой тяж выбран из группы, состоящей из тяжей из аминокислотных остатков, определенных в е) и f).

В конкретном аспекте поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды могут включать или, по существу, состоять из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) или, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранных из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121; или аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению (описанных выше). В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению (описанных выше). В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению (описанных выше).

Изобретение также относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или пан отел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

И) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Изобретение также относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105; так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из, по меньшей мере, двух идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- A1al4Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

a) SEQ ID NO: 60-76;

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Изобретение также относится к поливалентному, предпочтительно, трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105; так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из, по меньшей мере, трех идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Argl05Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Изобретение также относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, описанному выше, в котором глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В этом отношении изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, выбранной из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена па аспарагиновую кислоту.

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu. Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению представляет собой двухвалентный полипептид и включает или, по существу, состоит из двух идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 60-76.

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Изобретение также относится к двухвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению представляет собой двухвалентный полипептид и включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 146-153.

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105; так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из двух аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Изобретение также относится к двухвалентному полипептиду, описанному выше, в котором глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В этом отношении изобретение также относится к двухвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gm108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к двухвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к поливалентному, предпочтительно, двухвалентному или трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

a) SEQ ID NO: 60-76;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению представляет собой трехвалентный полипептид и включает или, по существу, состоит из трех идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 60-76.

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Изобретение также относится к трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению представляет собой трехвалентный полипептид и включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех идентичных аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 146-153.

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

1) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105; так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

- SEQ ID NO: 153, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Предпочтительные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей или нанотел®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 62. Другой предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 65. Другой предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 76. Другой предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 75. Другой предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 147. Другой предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 149. Другой предпочтительный поливалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей или нанотел® с SEQ ID NO: 153.

Изобретение также относится к трехвалентному полипептиду, описанному выше, в котором глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В этом отношении изобретение также относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности или нанотела®, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

a) SEQ ID NO: 77-79 и 158;

В предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, выбранному из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 77-79 и 158;

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78, аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 78 и 79;

ii) полипептид связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или полипептид имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с полипептидом без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

a) SEQ ID NO: 78 и 79; или

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 54, глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78, аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Предпочтительные трехвалентные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 78. Другие предпочтительные трехвалентные полипептиды по изобретению включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 79.

a) SEQ ID NO: 159-161;

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 159-161;

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда полипептид имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному, полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu:

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 158-161.

Во время получения полипептидов по изобретению методом ОФ-ВЭЖХ на аминоконце обнаруживают высокий уровень пироглутамата (pGlu). Уровни pGlu свыше 15% детектируют после ферментации, и уровень pGlu постоянно возрастает при хранении во время исследований стабильности. Такая модификация ведет к неоднородности конечного продукта, и ее необходимо избежать. Поэтому регулирование/предупреждение образования pGlu критично для сохранения терапевтических белков с присущими им характеристиками. Специфические составы жидкостей и/или условия хранения необходимы для белков с N-концевой глутаминовой кислотой, причем таким образом минимизируется образование пироглутаминовой кислоты.

В настоящем изобретении возможность посттрансляционной модификации pGlu N-конца устраняют путем замены N-концевой глутаминовой кислоты (Е) [НООС-(СН2)2--белок] на аспарагиновую кислоту (D) [НООС-СН2-белок], что ведет к повышенной стабильности продукта. Соответственно, настоящее изобретение также относится к полипептидам, описанным выше, в которых глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Настоящее изобретение относится к ряду полипептидов, оптимизированных по последовательности, которые проявляют повышенную стабильность при хранении во время исследований стабильности. Соответственно, изобретение относится к трехвалентному полипептиду, описанному выше, в котором первая аминокислота (глутаминовая кислота) заменена на аспарагиновую кислоту.

В одном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, выбранному из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 142-145 и 162-165;

b) полипептиды, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одним из SEQ ID NO: 142-145 и 162-165, при условии, что

i) первая аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1; и

Предпочтительный трехвалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 142. Другой предпочтительный трехвалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 143. Другой предпочтительный трехвалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 144. Другой предпочтительный трехвалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 145. Другой предпочтительный трехвалентный полипептид по изобретению включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 162-165.

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 53, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 77, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 78, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 79, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 158, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 159, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 160, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту(Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 161, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту(Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту(Glu1Asp).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к трехвалентному полипептиду, включающему или, по существу, состоящему из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту (Glu1Asp).

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 142. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 143. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 144. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:

145. В другом предпочтительном аспекте полипептид по изобретению, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 162-165.

Полипептиды с аминокислотными последовательностями и последовательности полипептидов, описанные выше, проявляют выгодные для использования в качестве профилактических, терапевтических и/или фармакологически активных средств свойства, такие как, например, улучшенная стабильность, меньшая иммуногенность, улучшенные характеристики связывания (соответственно измеренные и/или выраженные в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании), улучшенную аффинность и/или улучшенную авидность в отношении белка F hRSV и/или улучшенную эффективность и/или улучшенную активность для нейтрализации F hRSV.

В более частном случае такие полипептиды и соединения по изобретению могут связываться с белком F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании), предпочтительно, такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константной диссоциации (K_D) 100 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительно, 10 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительнее, 1 нМ - 0,1 нМ или меньше;

и/или такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше;

и/или такой, что они

- связываются с белком с F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1, предпочтительнее, от 5×10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1, или ниже.

Некоторые предпочтительные величины IC50 для связывания полипептидов по изобретению с белком F hRSV станут понятнее из дальнейшего описания и примеров в данном описании.

Анализы для определения IC50 включают конкурентные анализы, такие как конкурентный ELISA (например, конкуренции с Синагисом® или его фрагментом Fab), или, предпочтительнее, анализы нейтрализации, такие как анализ микронейтрализации, описанный Anderson et al. (1985, J. Clin. Microbiol., 22:1050-1052), модификации указанного анализа, такие как описанные в примере 6; или анализ уменьшения бляшкообразования, описанный Johnson et al. (1997, J. Int. Dis., 176:1215-1224), и его модификации.

Например, в конкурентном анализе с Синагисом® полипептиды по изобретению могут иметь величины IC50 от 1 нМ до 100 нМ, предпочтительно, от 10 нМ до 50 нМ или меньше.

Например, в анализе микронейтрализации штамма hRSV Long (таком, как описанный, например, в примере 6), полипептиды по изобретению могут иметь величины IC50 от 10 пМ до 1000 пМ, предпочтительно, от 10 пМ до 250 пМ, предпочтительнее, от 50 пМ до 200 пМ, или меньше. В анализе микронейтрализации полипептиды по изобретению могут иметь величины IC50, которые, по меньшей мере, такие же, и предпочтительно, лучше, по меньшей мере, в десять раз лучше, предпочтительно, в двадцать раз лучше, предпочтительнее, в пятьдесят раз лучше, даже предпочтительнее, в шестьдесят, семьдесят, восемьдесят или больше раз лучше при сравнении с величиной IC50, полученной с Синагисом®.

Изобретение также относится к моновалентному полипептиду или конструкции (также называемым «моновалентным полипептидом по изобретению» или «моновалентной конструкцией по изобретению»), включающим или, по существу, состоящим из одной аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению. Предпочтительные моновалентные конструкции по изобретению включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 60-76, такой как одна из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76, такой как, например, SEQ ID NO: 65 или 75; одной из SEQ ID NO: 138-141; одной из SEQ ID NO: 146-153 или одной из SEQ ID NO: 154-157. Такие моновалентные конструкции, а также аминокислотные последовательности или нанотела® по изобретению можно использовать для получения полипептида по изобретению, такого как, например, поливалентные полипептиды по изобретению, описанные выше.

Полипептиды по изобретению вообще можно получить способом, который включает, по меньшей мере, стадию соответственного соединения аминокислотной последовательности, нанотела® или моновалентной конструкции по изобретению с одной или несколькими другими аминокислотными последовательностями, нанотелами® или моновалентными конструкциями по изобретению, необязательно, через один или несколько подходящих линкеров, так, что получают полипептид по изобретению. Полипептиды по изобретению также можно получить способом, который вообще включает, по меньшей мере, стадии получения нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по изобретению, экспрессии указанной нуклеиновой кислоты подходящим способом и извлечение экспрессированного полипептида по изобретению. Такие способы можно осуществлять приемами, известными per se, которые будут ясны для специалиста, например, на базе способов и методов, описанных в данном описании далее.

Способ получения поливалентных, полипаратопных и/или полиспецифических аминокислот или полипептидов по изобретению может включать, по меньшей мере, стадии соединения двух или большего числа моновалентных аминокислотных последовательностей или моновалентных конструкций по изобретению и, например, одного или нескольких линкеров подходящим образом. Моновалентные конструкции (и линкеры) можно соединять способом, известным в технике, а также описанным в данном описании далее. Предпочтительные методы включают соединение нуклеотидных последовательностей, которые кодируют моновалентные конструкции (и линкеры), для получения генетической конструкции, которая экспрессирует поливалентные, полипаратопные и/или полиспецифические аминокислотную последовательность или полипептид. Методы соединения аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей будут ясны для специалиста, и снова даются ссылки на стандартные руководства, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанные выше, а также на примеры, приведенные ниже.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению аминокислотной последовательности, нанотела® или моновалентной конструкции по изобретению при получении поливалентного полипептида по изобретению. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности, нанотела® или моновалентной конструкции по изобретению с, по меньшей мере, одной другой аминокислотной последовательностью, нанотелом® или моновалентной конструкцией по изобретению, необязательно, через один или несколько линкеров. Кроме того, аминокислотную последовательность, нанотело® или моновалентную конструкцию используют в качестве связывающего домена или связывающей единицы при предоставлении и/или получении поливалентного полипептида, включающего две (например, в двухвалентном полипептиде), три (например, в трехвалентном полипептиде) или больше (например, в поливалентном полипептиде) связывающих единиц. В этом отношении аминокислотную последовательность, нанотело® или моновалентную конструкцию по изобретению можно использовать в качестве связывающего домена или связывающей единицы при предоставлении и/или получении поливалентного полипептида, и предпочтительно, двухвалентного или трехвалентного полипептида по изобретению, включающего две, три или больше связывающих единиц. Предпочтительно связывающие домены или связывающие единицы соединяют через линкер, так что поливалентный полипептид, предпочтительно, показывает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием. Также предпочтительно поливалентный полипептид может одновременно связываться с двумя или всеми тремя сайтами связывания на белке F hRSV.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению (описанных выше) при получении поливалентного полипептида. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению с, по меньшей мере, одной другой аминокислотной последовательностью или нанотелом® по изобретению, необязательно, через один или несколько линкеров.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, выбранной из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

при получении поливалентного полипептида. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение указанной аминокислотной последовательности с, по меньшей мере, одной другой аминокислотной последовательностью, необязательно, через один или несколько линкеров.

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 60-76.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, выбранной из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76; или

и) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит, из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76.

a) SEQ ID NO: 146-153;

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, при получении поливалентного полипептида.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, выбранной из описанных выше, в которой аминокислота (глутаминовая кислота) в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В этом отношении настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, выбранной из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

i) аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1 (указанная позиция определены согласно нумерации по Кабату); и

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 138. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 139. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 140. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 141. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении поливалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 154-157.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении поливалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении поливалентного полипептида.

Настоящее изобретение также относится к применению двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению (описанных выше) при получении двухвалентного полипептида. Способ получения двухвалентного полипептида будет включать соединение аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению, необязательно, через линкер.

Соответственно, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению двух (предпочтительно, идентичных), аминокислотных последовательностей, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO; 60-76, при условии, что

при получении двухвалентного полипептида. Способ получения двухвалентного полипептида будет включать соединение указанных аминокислотных последовательностей друг с другом, необязательно, через линкер.

В предпочтительном аспекте две аминокислотные последовательности, используемые при получении двухвалентного полипептида, включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 60-76.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

a) SEQ ID NO: 62,65. 67, 68, 75 и 76;

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

a) SEQ ID NO: 146-153;

при получении двухвалентного полипептида. Способ получения двухвалентного полипептида будет включать соединение указанной аминокислотной последовательности с, по меньшей мере, одной другой аминокислотной последовательностью, необязательно, через один или несколько линкеров.

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности, используемые при получении двухвалентного полипептида, включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-153.

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении двухвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении двухвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, при получении двухвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению двух (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, при получении двухвалентного полипептида.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении двухвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, выбранной из описанных выше, в которой аминокислота (глутаминовая кислота) в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении двухвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 138. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении двухвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 139. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении двухвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 140. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении двухвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 141. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении двухвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 154-157.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении двухвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении двухвалентного полипептида.

Настоящее изобретение также относится к применению трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению (описанных выше) при получении трехвалентного полипептида. Способ получения трехвалентного полипептида будет включать соединение аминокислотных последовательностей и/или нанотел® по изобретению, необязательно, через один или два линкера.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

при получении трехвалентного полипептида. Способ получения трехвалентного полипептида будет включать соединение указанных аминокислотных последовательностей друг с другом, необязательно, через один или два линкера.

В предпочтительном аспекте три аминокислотные последовательности, используемые при получении трехвалентного полипептида, включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 60-76.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68,75 и 76;

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

В предпочтительном аспекте три аминокислотные последовательности, используемые при получении трехвалентного полипептида, включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 65. В другом предпочтительном аспекте три аминокислотные последовательности, используемые при получении трехвалентного полипептида, включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 76.

a) SEQ ID NO: 146-153;

при получении трехвалентного полипептида. Способ получения трехвалентного полипептида будет включать соединение указанной аминокислотной последовательности с, по меньшей мере, одной другой аминокислотной последовательностью, необязательно, через один или два линкера.

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности, используемые при получении трехвалентного полипептида, включают или, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-153.

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и/или лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105, так что когда аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению трех (предпочтительно, идентичных) аминокислотных последовательностей, которые включают или, по существу, состоят из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, при получении трехвалентного полипептида.

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 62 при получении SEQ ID NO: 77. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 62 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 62 через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 65 при получении SEQ ID NO: 78. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 65 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 65 через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 76 при получении SEQ ID NO: 79. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 76 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 76 через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 75 при получении SEQ ID NO: 158. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 75 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 75 через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 147 при получении SEQ ID NO: 159. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 147 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 147 через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 149 при получении SEQ ID NO: 160. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 149 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 149 через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 153 при получении SEQ ID NO: 161. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 153 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 153 через линкер 15GS (SEQ ID NO:128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, выбранной из описанных выше, в которой аминокислота (глутаминовая кислота) в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

при получении трехвалентного полипептида. Способ получения трехвалентного полипептида будет включать соединение указанной аминокислотной последовательности с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями, необязательно, через один или несколько линкеров.

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении трехвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 138. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении трехвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 139. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении трехвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 140. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении трехвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 141. В другом предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность, используемая при получении трехвалентного полипептида, включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 154-157.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению при получении трехвалентного полипептида аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, которая включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении трехвалентного полипептида.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 138 при получении SEQ ID NO: 142. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 138 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 5) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 139 при получении SEQ ID NO: 143. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 139 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 62) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 140 при получении SEQ ID NO: 144. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 140 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 65) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 154 при получении SEQ ID NO: 162. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO; 154 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 75) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 155 при получении SEQ ID NO: 163. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 155 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 147) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 156 при получении SEQ ID NO: 164. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 156 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 149) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению SEQ ID NO: 157 при получении SEQ ID NO: 165. Способ получения поливалентного полипептида будет включать соединение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 157 с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями (предпочтительно, SEQ ID NO: 153) через линкер 15GS (SEQ ID NO: 128).

Полипептиды по изобретению, которые содержат, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела®, из которых, по меньшей мере, одна аминокислотная последовательность или нанотело® направлены против первого антигена (т.е. против белка F hRSV) и, по меньшей мере, одна аминокислотная последовательность или нанотело® направлены против второго антигена (т.е. отличающегося от белка F hRSV), также будут назваться «полиспецифическими» полипептидами по изобретению, и аминокислотные последовательности или нанотела®, присутствующие в таких полипептидах, также будут назваться в данном описании как находящиеся в «полиспецифическом формате». Так, например, «биспецифический» полипептид по изобретению представляет собой полипептид, который включает, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению, направленные против первого антигена (т.е. белка F hRSV), и, по меньшей мере, одну другую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена (т.е. отличающегося от белка F hRSV), в то время как «триспецифический» полипептид по изобретению представляет собой полипептид, который включает, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению, направленные против первого антигена (т.е. белка F hRSV), по меньшей мере, одну другую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена (т.е. отличающегося от белка F hRSV), и, по меньшей мере, одну другую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против третьего антигена (т.е. отличающегося как от белка F hRSV, так и от второго антигена); и т.д.

Соответственно, в своей самой простой форме биспецифический полипептид по изобретению представляет собой двухвалентный полипептид по изобретению (как определено в данном описании), включающий первую аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению, направленные против белка F hRSV, и вторую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена, в котором указанные первая и вторая аминокислотная последовательность или нанотело® могут необязательно соединяться через линкерную последовательность (как определено в данном описании); в то время как триспецифический полипептид по изобретению в своей самой простой форме представляет собой трехвалентный полипептид по изобретению (как определено в данном описании), включающий первую аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению, направленные против белка F hRSV, вторую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против второго антигена, и третью аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против третьего антигена, в котором указанные первая, вторая и третья аминокислотная последовательность или нанотело® могут соединяться, необязательно, через одну или несколько, и в частности, две, линкерные последовательности.

В конкретном аспекте полипептид по изобретению представляет собой трехвалентный биспецифический полипептид. Трехвалентный биспецифический полипептид по изобретению в своей самой простой форме может представлять собой трехвалентный полипептид по изобретению (как определено в данном описании), включающий две идентичные аминокислотные последовательности или нанотела® против белка F hRSV и третью аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против другого антигена, в котором указанные первая, вторая и третья аминокислотная последовательность или нанотело® могут соединяться, необязательно, через одну или несколько, и в частности, две, линкерные последовательности.

Предпочтительный, но не ограничительный пример полиспецифического полипептида по изобретению включает, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению и, по меньшей мере, одно нанотело®, которое обеспечивает повышенное время полужизни. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких нанотел® включают нанотела®, направленные против сывороточных белков, таких как человеческий сывороточный альбумин, тироксинсвязывающий белок, (человеческий) трансферрин, фибриноген, иммуноглобулин, такой как IgG, IgE или IgM, или один из других сывороточных белков, перечисленных в WO 04/003019.

Например, в экспериментах на мышах могут быть использованы нанотела® против мышиного сывороточного альбумина (MSA), в то время как для фармацевтического применения можно использовать нанотела®, направленные против человеческого сывороточного альбумина.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет собой полипептидную конструкцию, описанную выше, при этом указанный, по меньшей мере, один (человеческий) сывороточный белок представляет собой любой белок из (человеческого) сывороточного альбумина, (человеческого) сывороточного иммуноглобулина, (человеческого) тироксинсвязывающего белка, (человеческого) трансферрина, (человеческого) фибриногена, и т.д.

Соответственно, в конкретном аспекте полипептид по изобретению представляет собой биспецифический полипептид, включающий первую аминокислотную последовательность или нанотело® по изобретению против белка F hRSV и вторую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против (человеческого) сывороточного альбумина, в котором указанные первая и вторая аминокислотная последовательность или нанотело® могут соединяться необязательно через линкерную последовательность.

В другом конкретном аспекте полипептид по изобретению представляет собой трехвалентный биспецифический полипептид, включающий две идентичные аминокислотные последовательности или нанотела® по изобретению против белка F hRSV и третью аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против (человеческого) сывороточного альбумина, в котором указанные первая, вторая и третья аминокислотная последовательность или нанотело® могут соединяться необязательно через одну или несколько, и в частности две, линкерные последовательности.

В другом конкретном аспекте полипептид по изобретению представляет собой четырехвалентный биспецифический полипептид, включающий три идентичные аминокислотные последовательности или нанотела® по изобретению против белка F hRSV и четвертую аминокислотную последовательность или нанотело®, направленные против (человеческого) сывороточного альбумина, в котором указанные первая, вторая, третья и четвертая аминокислотная последовательность или нанотело® могут соединяться необязательно через одну или несколько, и в частности две или три, линкерные последовательности.

Согласно конкретному, но не ограничительному аспекту изобретения полипептиды по изобретению содержат, кроме одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению, по меньшей мере, одно нанотело® против человеческого сывороточного альбумина. Такие нанотела® против человеческого сывороточного альбумина могут быть такими, какие в общих чертах описаны в заявках Ablynx N.V., цитированных выше (см., например, WO 04/062551). В частности, некоторые предпочтительные нанотела®, обеспечивающие повышенное время полужизни, и которые можно использовать в полипептидах по изобретению, включают нанотела® ALB-1-ALB-10, раскрытые в WO 06/122787 (см. таблицы II и III), из которых особенно предпочтительны ALB-8 (SEQ ID NO: 62 в WO 06/122787).

В другом аспекте изобретение относится к соединению или конструкции, и в частности, белку или полипептиду (также называемым в данном описании как «соединение по изобретению»), которые включают или, по существу, состоят из одной или нескольких аминокислотных последовательностей, нанотел® и/или полипептидов по изобретению (или их подходящих фрагментов) и, необязательно, также включают одну или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц. Как будет понятно специалисту из дальнейшего раскрытия, такие другие группы, остатки, частицы, связывающие единицы или аминокислотные последовательности могут, или не могут, придавать дополнительную функциональность аминокислотной последовательности, нанотелу® и/или полипептиду по изобретению (и/или соединению, конструкции или полипептиду, в которых присутствуют) и могут, или не могут, модифицировать свойства аминокислотной последовательности, нанотела® и/или полипептида по изобретению.

Такие группы, остатки, частицы или связывающие единицы могут представлять собой, например, химические группы, остатки, частицы, которые сами по себе могут, или не могут быть биологически и/или фармакологически активными. Например, и без ограничения, такие группы могут соединяться с одной или несколькими аминокислотными последовательностями, нанотелами® и/или полипептидами по изобретению, так что образуется «производное» аминокислотной последовательности, нанотела® и/или полипептида по изобретению, как описано далее в данном описании.

Также в объем настоящего изобретения входят соединения или конструкции, которые включают или, по существу, состоят из одного или нескольких производных, как описано в данном описании, и, необязательно, также включают одну или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, соединенных необязательно через один или несколько линкеров. Предпочтительно, указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой аминокислотные последовательности.

В соединениях, конструкциях или полипептидах, описанных выше, одна или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел® и/или полипептидов по изобретению и одна или несколько групп, остатков, частиц или связывающих единиц могут быть соединены непосредственно друг с другом и/или через один или несколько подходящих линкеров или спейсеров. Например, когда одна или несколько групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой аминокислотные последовательности, линкеры также могут представлять собой аминокислотные последовательности, так что полученное соединение, конструкция или полипептид представляет собой слитый белок или слитый полипептид.

Соединение или конструкция по изобретению может включать аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, которые слиты по своему аминоконцу, по своему карбоксиконцу или как по своему аминоконцу, так и по своему карбоксиконцу с, по меньшей мере, одной другой аминокислотной последовательностью, т.е. так, что получается слитый белок, включающий указанную аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению и одну или несколько других аминокислотных последовательностей.

Одна или несколько других аминокислотных последовательностей могут представлять собой любые подходящие и/или нужные аминокислотные последовательности. Другие аминокислотные последовательности могут, или не могут, заменять, изменять или иначе влиять на (биологические) свойства аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению и могут, или не могут, не добавлять дополнительную функциональность аминокислотной последовательности, нанотелу® или полипептиду по изобретению. Предпочтительно другая аминокислотная последовательность является такой, что она придает одно или больше нужных свойств или функциональностей аминокислотной последовательности, нанотелу® или полипептиду по изобретению.

Примеры таких аминокислотных последовательностей будут ясны для специалиста и могут, вообще, включать все аминокислотные последовательности, которые используются при слиянии пептидов на основе обычных антител и их фрагментов (включая, но не ограничиваясь указанным, ScFv и однодоменные антитела). Дается ссылка на обзор Holliger and Hadson, Nature Biotechnology, 23, 9,1126-1136 (2005).

Например, такая аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность, которая повышает время полужизни, растворимость или абсорбцию, уменьшает иммуногенность или токсичность, или ослабляет нежелательные побочные действия и/или придает другие полезные свойства соединению и/или устраняет или ослабляет нежелательные свойства соединений по изобретению при сравнении с аминокислотной последовательностью, нанотелом® или полипептидом по изобретению самими по себе. Некоторыми неограничительными примерами таких аминокислотных последовательностей являются сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный белок (см., например, WO 00/27435) или гаптеновые молекулы (например, гаптены, которые узнаются антителами в кровотоке, см., например, WO 98/22141).

Другая аминокислотная последовательность также может представлять собой второй сайт связывания, который может быть направлен против любого нужного белка, полипептида, антигена, антигенной детерминанты или эпитопа (включая, но не ограничиваясь указанным, те же белок, полипептид, антиген, антигенную детерминанту или эпитоп, на которые направлены аминокислотная последовательность или нанотело® по изобретению, или другие белок, полипептид, антиген, антигенную детерминанту или эпитоп). Например, другая аминокислотная последовательность может предоставить второй сайт связывания, который направлен на сывороточный белок (такой как, например, человеческий сывороточный альбумин или другой сывороточный белок, такой как IgG), с тем, чтобы обеспечить повышенное время полужизни в сыворотке. Такие аминокислотные последовательности включают, например, нанотела®, а также небольшие пептиды и связывающие белки, описанные в WO 91/01743, WO 01/45746 и WO 02/076489, и dAb, описанные в WO 03/002609 WO 04/00319. Также можно сослаться на Harmsen et al., Vaccine, 23(41), 4926-42, 2005, также на ЕР 0368684, а также на WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822, Albynx N.V., и на WO 08/06280.

Такие аминокислотные последовательности могут быть направлены, в частности, против сывороточного альбумина (и в более частном случае, человеческого сывороточного альбумина) и/или против IgG (и в более частном случае, человеческого IgG). Например, такие аминокислотные последовательности могут представлять собой аминокислотные последовательности, которые направлены против (человеческого) сывороточного альбумина, и аминокислотные последовательности, которые могут связываться с аминокислотными остатками на (человеческом) сывороточном альбумине, которые не вовлечены в связывание сывороточного альбумина с FcRn (см., например, WO 06/0122787), и/или аминокислотные последовательности, которые способны связываться с аминокислотными остатками на сывороточном альбумине, которые не составляют часть домена III сывороточного альбумина (вновь см., например, WO 06/0122787);

аминокислотные последовательности, которые имеют или могут обеспечить повышенное время полужизни (см., например, WO 08/028977); аминокислотные последовательности против человеческого сывороточного альбумина, которые являются перекрестно реагирующими с сывороточным альбумином от, по меньшей мере, одного вида млекопитающих, и в частности, от, по меньшей мере, одного вида приматов (такого как, без ограничения, обезьяны рода макак (такие как, в частности, собакоголовые обезьяны (Масаса fascicularis) и/или макаки-резуса (Масаса mulatta)) и павианов (Papio ursinus), вновь ссылка дается на WO 08/028977); аминокислотные последовательности, которые могут связываться с сывороточным альбумином независимо от рН (см., например, WO 08/043821), и/или аминокислотные последовательности, которые представляют собой условные связующие (см., например, WO 08/043822).

Согласно другому воплощению, одна или несколько других аминокислотных последовательностей могут включать одну или несколько частей, фрагментов или доменов обычных 4-цепочечных антител (и в частности, человеческих антител) и/или тяжелоцепочечных антител. Например, хотя, как правило, менее предпочтительно, аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению могут соединяться с обычным (предпочтительно, человеческим) V_H- или V_L-домсном или с природным или синтетическим аналогом V_H- или V_L-домена, вновь необязательно через линкерную последовательность (включая, но не ограничиваясь указанным, другие (одно)доменные антитела, такие как dAb, описанные Ward et al.).

Соответственно, в соединении или конструкции по изобретению указанные одна или несколько групп, остатков, частиц или связывающих единиц могут быть выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменных антител, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменных антител, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®.

В одном конкретном аспекте изобретения соединение, конструкция или полипептид по изобретению, включающие, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, могут иметь повышенное время полужизни при сравнении с соответствующими аминокислотной последовательностью, нанотелом® или полипептидом по изобретению. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких соединений, конструкций и полипептидов станут понятны для специалиста из дальнейшего раскрытия и, например, включают аминокислотные последовательности, нанотела® или полипептиды по изобретению, которые химически модифицированы для повышения их времени полужизни (например, путем пегилирования); или соединения по изобретению, которые включают, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, которые соединены с, по меньшей мере, одной частицей (и в частности, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательностью), которая повышает время полужизни аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению. Примеры таких соединений по изобретению, которые включают такие удлиняющие время полужизни частицы, станут понятны для специалиста из дальнейшего раскрытия и, например, включают без ограничения, соединения, в которых одна или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению соответственно соединены с одним или несколькими сывороточными белками или их фрагментами (такими как сывороточный альбумин или его подходящие фрагменты) или с одной или несколькими связывающими единицами, которые могут связываться с сывороточными белками (такими как, например, нанотела® или (одно)доменные антитела, которые могут связываться с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин, сывороточные иммуноглобулины, такие как IgG, или трансферрин); соединения, в которых аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению соединены с белком Fc (таким как человеческий Fc) или его подходящими частью или фрагментом; или соединения, в которых одна или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению соответственно соединены с одним или несколькими небольшими белками или пептидами, которые связываться с сывороточными белками (такими как, без ограничения, белки и пептиды, описанные в WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489).

По меньшей мере, одна аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению также может соединяться с одним или несколькими (предпочтительно, человеческими) C_H1-, C_H2- и/или C_H3-доменами, необязательно, через линкерную последовательность. Например, аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, соединенные с подходящим C_H1-доменом, могут, например, использоваться - вместе с подходящими легкими цепями - для создания фрагментов/структур антител, аналогичных обычным фрагментам F(ab')₂, но в которых один или (в случае фрагмента F(ab')₂) один или оба V_H-домена заменены аминокислотной последовательностью, нанотелом® или полипептидом по изобретению. Также две аминокислотные последовательности или два нанотела® по изобретению могут соединяться с C_H3-доменом (необязательно через линкер) с предоставлением конструкции с повышенным временем полужизни in vivo.

Согласно одному конкретному аспекту, одна или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению могут быть соединены (необязательно через подходящий линкер или шарнирный участок) с одним или несколькими константными доменами (например, 2 или 3 константными доменами, которые можно использовать как часть/для образования части Fc), с частью Fc и/или одной или несколькими частями, фрагментами или доменами антител, которые придают одну или несколько эффекторных функций аминокислотной последовательности, нанотелу® или полипептиду по изобретению, и/или могут придать способность связываться с одним или несколькими рецепторами Fc. Например, для такой цели, и без ограничения указанным, одна или несколько других аминокислотных последовательностей могут включать один или несколько C_H2- и/или C_H3-доменов антитела, таких как из тяжелоцепочечного антитела (как описано в данном описании), и предпочтительнее, из обычного человеческого 4-цепочечного антитела; и/или могут образовывать (часть) участка Fc, например, из IgG (например, из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), из IgE или из другого человеческого Ig, такого как IgA, IgD или IgM. Например, в WO 94/04678 описываются тяжелоцепочечные антитела, включающие V_HH-домен верблюжьих или его гуманизированное производное (т.е. нанотело®), в которых C_H2-и/или C_H3-домен верблюжьих заменен человеческими C_H2- и C_H3-доменами, с тем, чтобы получить иммуноглобулин, который состоит из 2 тяжелых цепей, каждая из которых включает нанотело® и человеческие Сн2- и Сн3-домены (но не C_H1 -домен), и такой иммуноглобулин может функционировать без наличия каких-либо легких цепей. Другие аминокислотные последовательности, которые могут быть подходящим образом соединены с аминокислотными последовательностями, нанотелами® или полипептидами по изобретению так, чтобы обеспечить эффекторную функцию, будут ясны для специалиста и могут быть выбраны на основании нужной(ых) эффекторной(ых) функции(й). Ссылаются, например, на WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 и WO 05/017148, а также па обзор Holliger and Hudson, цитировано выше, и на WO 09/068628. Сочетание аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению с частью Fc также может привести к повышенному времени полужизни при сравнении с соответствующими аминокислотной последовательностью, нанотелом® или полипептидом по изобретению. Для некоторых применений также подходящим или даже предпочтительным может быть использование части Fc и/или константных доменов (т.е. С_Н2- и/или С_Н3-доменов), которые придают повышенное время полужизни без какой-либо биологически значимой эффекторной функции. Другие подходящие конструкции, включающие одну или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению и один или несколько константных доменов с повышенным временем полужизни in vivo, будут ясны для специалиста и могут, например, включать аминокислотные последовательности, нанотела® или полипептиды, соединенные с Сн3-доменом, необязательно, через линкерную последовательность. Вообще слитый белок или производные с повышенным временем полужизни предпочтительно будут иметь молекулярную массу свыше 50 кД - пороговая величина для ренальной абсорбции.

В другом конкретном, но не ограничительном аспекте для того, чтобы образовать соединение по изобретению, одну или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению можно соединить (необязательно через подходящий линкер или шарнирный участок) с встречающимися в природе, синтетическими или полусинтетическими константными доменами (или их аналогами, вариантами, мутантами, частями или фрагментами), которые имеют ослабленную склонность (или не имеют ее) к самоассоциации в димеры (т.е. при сравнении с константными доменами, которые встречаются в природе в обычных 4-цепочечных антителах). Такие мономерные (т.е. несамоассоциирующиеся) варианты цепи Fc или их фрагменты будут ясны для специалиста. Например, Helm et al., J. Biol. Chem., 1996, 271 7494, описывают мономерные варианты цепи Fc, которые можно использовать в полипептидных цепях по изобретению.

Также такие мономерные варианты цепи Fc являются предпочтительно такими, что они еще способны к связыванию с комплементом или релевантным(и) рецептором(ами) Fc (в зависимости от части Fc, из которой они образованы) и/или они все еще обладают некоторыми или всеми эффекторными функциями той части Fc, из которой они образованы (или они имеют пониженный уровень этих функций который все еще подходят для предполагаемого использования). С другой стороны, в такой полипептидной цепи по изобретению мономерную цепь Fc можно использовать для придания повышенного времени полужизни полипептидпой цепи в случае, когда мономерная цепь Fc также может не иметь, или по существу не иметь, эффекторных функций.

Вообще аминокислотные последовательности, нанотела® или полипептиды по изобретению (или соединения или конструкции, включающие их) с повышенным временем полужизни предпочтительно имеют время полужизни, которое, по меньшей мере, в 1,5 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 5 раз, например, по меньшей мере, в 10 раз или более чем в 20 раз больше, чем время полужизни соответствующих аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению самих по себе. Например, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции или полипептиды по изобретению с повышенным временем полужизни имеют время полужизни, которое повышено более чем на 1 час, предпочтительно, более чем на 2 часа, предпочтительнее, более чем на 6 часов, например, более чем на 12 часов или даже более чем на 24,48 или 72 часа, по сравнению с временем полужизни соответствующих аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению самих по себе.

В предпочтительном, но не ограничительном аспекте изобретения такие аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции или полипептиды по изобретению обнаруживают время полужизни в сыворотке человека, по меньшей мере, примерно 12 часов, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 24 часа, предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 48 часов, даже предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 72 часа или более. Например, соединения или полипептиды по изобретению могут иметь время полужизни, по меньшей мере, 5 суток (такое как от примерно 5 до 10 суток), предпочтительно, по меньшей мере, 9 суток (такое как от примерно 9 до 14 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 10 суток (такое как от примерно 10 до 15 суток), или, по меньшей мере, примерно 11 суток (такое как от примерно 11 до 16 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 12 суток (такое как от примерно 12 до 18 суток или более), или более 14 суток (такое как от примерно 14 до 19 суток).

Другие аминокислотные последовательности также могут образовывать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет секрецию аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению из клетки-хозяина после синтеза (например, для предоставления пре-, про- или препроформы полипептида по изобретению, в зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии полипептида по изобретению).

Другие аминокислотные последовательности также могут образовывать последовательность или сигнал, которые позволяют аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению направляться к и/или проникать или входить в определенные органы, ткани, клетки или части или компартменты клеток, и/или которые позволяют аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению проникать сквозь или пересекать биологический барьер, такой как клеточная мембрана, и клеточный слой, такой как слой эпителиальных клеток. Подходящие примеры таких аминокислотных последовательностей будут ясны для специалиста и, например, включают, но не ограничиваются указанным, векторы «пептраны», упомянутые выше, последовательности, описанные Cardinale et al., и аминокислотные последовательности и фрагменты антител, известные per se, которые могут быть использованы для экспрессии или выработки нанотел® и полипептидов по изобретению как так называемые «интратела», например, описанные в WO 94/02610, WO 95/22618, US 7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1512696; и в Cattaneo, A. & Biocca S. (1997), Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; и в Kontermann, Method, 34, (2004), 163-170, и других ссылках, указанных в этих работах.

Так, белок, полипептид, соединение или конструкция также могут находиться в, по существу, изолированной форме (как определено в данном описании).

Соединения или полипептиды по изобретению вообще можно получить способом, который включает, по меньшей мере, стадию соответствующего соединения одной или нескольких аминокислотных последовательностей, нанотел®, моновалентных конструкций и/или полипептидов по изобретению с одной или несколькими другими группами, остатками, частицами или связывающими единицами, необязательно, через один или несколько подходящих линкеров, с тем, чтобы предоставить соединение или полипептид по изобретению. Полипептиды по изобретению также можно получить способом, который вообще включает, по меньшей мере, стадии предоставления нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по изобретению, экспрессии указанной нуклеиновой кислоты подходящим способом и извлечения экспрессированного полипептида по изобретению. Такие способы можно осуществлять путем, известным per se, который будет ясен специалисту, например, на основе способов и методов, описанных в данном описании далее.

Подходящие спейсеры или линкеры для использования в поливалентных и/или полиспецифических полипептидах или конструкциях будут ясны для специалиста и могут, вообще, представлять собой любые линкеры или спейсеры, используемые в технике для соединения аминокислотных последовательностей. Предпочтительно указанный линкер или спейсер подходит для использования при конструировании белков или полипептидов, которые предполагаются для фармацевтического применения.

Некоторые особенно предпочтительные спенсеры включают спейсеры и линкеры, которые используют в технике для соединения фрагментов или доменов антител. Они включают линкеры, упоминаемые в данном описании в цитированных работах при описании общего уровня техники, а также, например, линкеры, которые используют в технике для конструирования диател или фрагментов ScFv (однако в этом отношении следует отметить, что в то время как в диателах или фрагментах ScFv используемая линкерная последовательность должна иметь длину, степень жесткости и другие свойства, которые позволяют подходящим V_H- и V_L-доменам сближаться для образования полного антигенсвязывающего сайта, не существует особых ограничений по длине или жесткости линкера, используемого в полипептиде по изобретению, так как каждая аминокислотная последовательность или нанотело сами образуют полный антигенсвязывающий сайт).

Например, линкер может представлять собой подходящую аминокислотную последовательность, и в частности, аминокислотные последовательности с 1-50, предпочтительно, 1-30, как например, с 1-10 аминокислотными остатками. Некоторые предпочтительные примеры таких аминокислотных последовательностей включают линкеры gly-ser, например, типа (gly_xser_y)_z, такие как (например, (gly₄ser₂)₃, описанные в WO 99/42077, шарнирно-подобные участки встречающихся в природе тяжелоцепочечных антител или подобные последовательности (такие как описанные в WO 94/04678).

Некоторые другие особенно предпочтительные линкеры представляют собой полиаланин (такой как ААА), а также линкеры, указанные в таблице А-7, из которых особенно предпочтителен GS15.

Другие подходящие линкеры вообще включают органические соединения или полимеры, в частности, подходящие для использования в белках для фармацевтического применения. Например, частицы полиэтиленгликоля используют для связывания доменов антител, см., например, WO 04/081026.

В объеме изобретения заключается, что длина, степень жесткости и/или другие свойства используемого(ых) линкера(ов) (хотя некритические, как это обычно в случае линкеров, используемых во фрагментах ScFv) могут оказывать некоторое влияние на свойства конечного полипептида по изобретению, включая, но без ограничения, аффинность, специфичность или авидность в отношении белка F hRSV или в отношении одного или нескольких других антигенов. На основании данного раскрытия специалист сможет определить оптимальный(е) линкер(ы) для использования в конкретном полипептиде по изобретению, необязательно, после нескольких рутинных экспериментов.

Также в объеме изобретения заключается, что используемый(ые) линкер(ы) придает(ют) полипептидам по изобретению одно или несколько других благоприятных свойств или функциональностей и/или обеспечивает(ют) один или несколько сайтов для образования производных и/или для присоединения функциональных групп (например, как описано в данном описании для производных аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений и полипептидов по изобретению). Например, линкеры, содержащие один или несколько заряженных аминокислотных остатков, могут обеспечить улучшенные гидрофильные свойства, в то время как линкеры, которые образуют или содержат небольшие эпитопы или метки, могут быть использованы в целях детекции, идентификации и/или очистки. Вновь на основании данного раскрытия специалист сможет определить оптимальные линкеры для использования в конкретных полипептидах по изобретению, необязательно, после нескольких рутинных экспериментов.

Наконец, когда в полипептидах по изобретению используют два или больше линкеров, такие линкеры могут быть одинаковыми или различными. Вновь на основании данного раскрытия специалист сможет определить оптимальные линкеры для использования в конкретных полипептидах по изобретению, необязательно, после нескольких рутинных экспериментов.

Как правило, для облегчения экспрессии и выработки полипептид по изобретению будет представлять собой линейный полипептид. Однако изобретение в своем самом широком смысле этим не ограничивается. Например, когда полипептид по изобретению включает три или больше аминокислотных последовательностей или нанотел®, возможно соединение их между собой путем использования линкера с тремя или большим числом «плечей», причем каждое «плечо» соединяется с аминокислотной последовательностью или нанотелом® так, что обеспечивается «звездообразная» конструкция. Также возможно, хотя, как правило, менее предпочтительно, использование кольцеобразных конструкций.

Как также будет понятно из данного раскрытия, в объем изобретения также входит применение частей или фрагментов или комбинаций из двух или большего числа частей или фрагментов аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению, как определено в данном описании, и в частности, частей или фрагментов аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157 или полипептидов SEQ ID NO: 77-79, 142-145 и 158-165. Таким образом, согласно одному воплощению изобретения, термины «аминокислотная последовательность по изобретению», «нанотело® по изобретению» и «полипептид по изобретению» в их самом широком смысле перекрывают такие части или фрагменты.

Вообще такие части или фрагменты аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению (включая их варианты, как определено в данном описании) имеют аминокислотные последовательности, в которых, по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующей полноразмерной аминокислотной последовательности или нанотела® по изобретению, один или несколько аминокислотных остатков в N-конце, один или несколько аминокислотных остатков в С-конце, один или несколько смежных внутренних аминокислотных остатков или любая их комбинация делегированы и/или удалены.

Части или фрагменты предпочтительно таковы, что они могут связываться с антигенным сайтом II белка F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании), определенной в данном описании.

В частности, аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды и части и фрагменты предпочтительно таковы, что они

- связываются с белком с F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше;

и/или таковы, что они

- связываются с белком с F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ M^-1.c^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше;

и/или таковы, что они

Аффинность частей или фрагментов против белка F hRSV можно определить способом, известным per se, например, с использованием анализа, описанного в данном описании.

Такие части и фрагменты, как правило, также будут обладать эффективностью и/или активностью нейтрализации hRSV, как описано в данном описании.

Любые часть или фрагмент предпочтительно являются такими, что включают, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков контига, предпочтительнее, по меньшей мере, 30 аминокислотных остатков контига, например, по меньшей мере, 40 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению.

Также любые часть или фрагменты являются такими, что включают, по меньшей мере, один из CDR (и предпочтительно, по меньшей мере, CDR3 или его часть) и, по меньшей мере, один другой CDR (например, CDR1 или CDR2) или, по меньшей мере, его часть. Предпочтительнее, любые часть или фрагменты являются такими, что включают, по меньшей мере, один из CDR (и предпочтительно, по меньшей мере, CDR3 или его часть) и, по меньшей мере, два оставшихся CDR, вновь предпочтительно соединенных подходящей(ими) каркасной(ыми) последовательностью(ими) или, по меньшей мере, ее(их) частью(ями).

Согласно другому особенно предпочтительному, но не ограничительному воплощению, такие часть или фрагмент включают, по меньшей мере, CDR3, такой как FR3, CDR3 и FR4 соответствующего полноразмерного нанотела® по изобретению, т.е., как описано, например, в поданной в Международное патентное ведомство заявке WO 05/050531 (Lasters et al.).

Как уже упоминалось выше, также возможно комбинировать две или больше таких частей или фрагментов (т.е. из одной и той же или различных аминокислотных последовательностей или нанотел® по изобретению), т.е. предоставлять другие части или фрагменты (как определено в данном описании) аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению. Например, также возможно комбинировать одну или несколько частей или фрагментов аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению с одной или несколькими частями или фрагментами человеческого V_H-домена.

Согласно одному предпочтительному воплощению части или фрагменты имеют степень идентичности по аминокислотам, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, предпочтительнее, по меньшей мере, 70%, даже предпочтительнее, по меньшей мере, 80%, такую как, например, по меньшей мере, 90%, 95% или 99% или больше, с одной из аминокислотных последовательностей или нанотел® SEQ ID NO: 60-76,138-141 и 146-157 или с одним из полипептидов SEQ ID NO: 77-79, 142-145 и 158-165.

Части и фрагменты и кодирующие их нуклеотидные последовательности могут быть предоставлены и, необязательно, объединены любым способом, известным в технике per se. Например, такие части или фрагменты можно получить путем встраивания стоп-кодона в нуклеиновую кислоту, которая кодирует полноразмерную аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, и затем экспрессировать полученную таким образом нуклеиновую кислоту способом, известным per se (например, как описано в данном описании). С другой стороны, нуклеиновые кислоты, кодирующие такие части или фрагменты, можно получить соответственной рестрикцией нуклеиновой кислоты, которая кодирует полноразмерную аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, или синтезом такой нуклеиновой кислоты способом, известным per se. Части или фрагменты также можно получить с использованием методов пептидного синтеза, известных per se.

Изобретение в его самом широком смысле также включает производные аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению. Такие производные можно вообще получить модификацией, и в частности, химической и/или биологической (например, ферментативной) модификацией аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или полипептидов по изобретению, и/или одного или нескольких аминокислотных остатков, которые образуют аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или полипептиды по изобретению.

Примеры таких модификаций, а также примеры аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, последовательности нанотела®, последовательностях соединения или полипептида, которые можно модифицировать таким способом (т.е. любые в остове белка, но предпочтительно, в боковой цепи), способы и методы, которые можно использовать для введения таких модификаций и возможные применения и преимущества таких модификаций будут понятны для специалиста.

Например, такая модификация может вовлекать введение (например, путем ковалентного соединения или другим подходящим способом), внутрь или на поверхность, одной или нескольких функциональных групп, остатков или частиц в аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению, и в частности, одной или нескольких функциональных групп, остатков или частиц, которые придают одно или несколько нужных свойств или функциональностей аминокислотной последовательности, нанотелу®, соединению или полипептиду по изобретению. Примеры таких функциональных групп будут ясны для специалиста.

Например, такая модификация может включать введение (например, с помощью ковалентной связи или другого подходящего способа) одной или нескольких функциональных групп, которые повышают время полужизни, растворимость и/или абсорбцию аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению, которые уменьшают иммуногенность и/или токсичность аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению, которые устраняют или ослабляют любые нежелательные побочные действия аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению, и/или которые придают другие выгодные свойства и/или ослабляют нежелательные свойства аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению; или дают любую комбинацию из вышеуказанного. Примеры таких функциональных групп и методы их введения будут понятны специалисту и могут вообще включать все функциональные группы и методы, упомянутые при описании уровня техники в данном описании выше, а также функциональные группы и методы, известные per se для модификации фармацевтических белков, и в частности, для модификации антител или фрагментов антител (включая ScFv и однодоменные антитела), в случае которых ссылка делается, например, на Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^thed., Mack Publishing Co., Easton. PA (1980). Такие функциональные группы могут соединяться с аминокислотной последовательностью, нанотелом®, соединением или полипептидом по изобретению, например, непосредственно (например, ковалентно) или, необязательно, через подходящий линкер или спейсер, что вновь будет понятно для специалиста.

Один из наиболее широко используемых методов повышения времени полужизни и/или уменьшения иммуногенности фармацевтических белков включает присоединение подходящего фармакологически приемлемого полимера, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG) или его производные (такие как метоксиполиэтиленгликоль или мПЭГ (mPEG)). Вообще, можно использовать любую подходящую форму пегилирования, такую как пегелирование, используемое в технике для антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь указанным, доменные антитела и ScFv); дается ссылка, например, на Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003), и на WO 04/060965. Различные реагенты для пегилирования белков также коммерчески доступны, например, от Nektar Therapeutics, США.

Предпочтительно используют сайт-направленное пегилирование, в частности, по цистеиновому остатку (см., например, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Например, для такой цели ПЭГ можно присоединить к цистеиновому остатку, который встречается в природе в аминокислотной последовательности, нанотеле®, соединении или полипептиде по изобретению, аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению можно модифицировать так, чтобы соответственно ввести один или несколько цистеиновых остатков для присоединения ПЭГ, или аминокислотную последовательность, включающую один или несколько цистеиновых остатков для присоединения ПЭГ, можно слить по N- и/или С-концу с аминокислотной последовательностью, нанотелом®, соединением или полипептидом по изобретению, все с использованием методов белковой инженерии, per se известных специалисту.

Предпочтительно для аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или полипептидов по изобретению используют ПЭГ с молекулярной массой свыше 5000, такой как более 10000 и менее 200000, такой как менее 100000, например, в интервале 20000-80000.

Другая, как правило, менее предпочтительная, модификация включает N- или O-гликозилирование, обычно, как часть котрансляционной и/или посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению.

Еще одна модификация может включать введение одной или нескольких детектируемых меток или других генерирующих сигнал групп или частиц, в зависимости от предполагаемого использования меченных аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению. Подходящие метки и методы их присоединения, использования и детекции будут ясны для специалиста и, например, включают, но не ограничиваются указанным, флуоресцентные метки (такие как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталальдегид и флуорескамин и флуресцирующие металлы, такие как ¹⁵²Eu или другие металлы из ряда лантаноидов), фосфоресцирующие метки, хемилюминесцентные метки или биолюминесцентные метки (такие как люминал, изолюминол, тероматический эфир акридиния, имидазол, соли акридиния, оксалат эфир, диоксетан или GEP и его аналоги), радиоизотопы (такие как H, ¹²⁵I, ³²Р, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁹Fe и ⁷⁵Se), металлы, хелаты металлов или катионы металлов (например, катионы таких металлов, как ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga и ⁶⁸Ga, или другие металлы или катионы металлов, которые подходят, в частности, для использования при диагностике in vivo, in vitro или in situ и получении изображения, например, ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr ⁵⁶Fe, а также хромофоры и ферменты (такие как малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-V-стероидная изомераза, дрожжевая алкоголь дегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатдегидрогеназа, биотинавидин-пероксидаза, пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, β-галоктозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-VI-фосфат-дегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза). Другие подходящие метки будут ясны для специалиста и, например, включают частицы, которые можно обнаружить с использованием ЯМР- и ЭСР-спектроскопии.

Такие меченные аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или полипептиды по изобретению можно использовать, например, для анализов in vivo, in vitro или in situ (включая иммуноанализы, известные per se, такие как ELISA, РИА, EIA и другие «сэндвич-анализы», и т.д.), а также для целей диагностики и получения изображения in vivo, в зависимости от выбора конкретной метки.

Как будет понятно специалисту, другая модификация может включать введение хелатирующей группы, например, для образования хелата одного из металлов или катионов металлов, указанных выше. Подходящие хелатирующие группы включают, например, без ограничения, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) или этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).

Еще одна модификация может включать введение функциональной группы, которая является частью специфической связывающей пары, такой как связывающая пара биотин-(стрепт)авидин. Такую функциональную группу можно использовать для соединения аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению с другим белком, полипептидом или химическим соединением, которые связаны с другой половиной связывающей пары, т.е. через образование связывающей пары. Например, аминокислотная последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению можно конъюгировать с биотином и соединить с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, конъюгированным с авидином или стрептавидином. Например, такие конъюгированные аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению можно использовать в качестве репортера, например, в диагностической системе, где детектируемое подающее сигнал вещество конъюгировано с авидином или стрептавидином. Такие связывающие пары также можно использовать, например, для связывания аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению с носителем, включая носители для фармацевтических целей. Одним неограничительным примером являются липосомные композиции, описанные Cao and Suresh, Journal of Drug Targeting, 8, 4, 257 (2000). Такие связывающие пары также можно использовать для соединения терапевтически активного средства с аминокислотной последовательностью, нанотелом®, соединением или полипептидом по изобретению.

Для специалиста будут понятны другие возможные химические и ферментативные модификации. Такие модификации также можно вводить для исследовательских целей (например, для изучения соотношений функция-активность). Дается ссылка на Lundblad and Bradshaw, Biotecnol. Appl. Biochem., 26, 143-151.

Предпочтительно производные являются такими, что они связываются с белком F hRSV с аффинностью (соответственно измеренной и/или выраженной в виде величины K_D (действительной или кажущейся), величины K_A (действительной или кажущейся), константы скорости k_on и/или константы скорости k_off или, с другой стороны, величины IC₅₀, как описано далее в данном описании), определенной в данном описании (т.е. определенной для аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов или соединений per se). Такие производные, как правило, также будут иметь эффективность и/или активность нейтрализации hRSV, как определено в данном описании.

Как упоминалось выше, изобретение также относится к белкам или полипептидам, которые, по существу, состоят из или включают, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению. «По существу, состоит из» означает, что аминокислотная последовательность белка или полипептида по изобретению точно такая же, как аминокислотная последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению или соответствует аминокислотной последовательности, нанотелу®, соединению или полипептиду по изобретению, которые имеют ограниченное число аминокислотных остатков, такое как 1-20 аминокислотных остатков, например, 1-10 аминокислотных остатков, и предпочтительно, 1-6 аминокислотных остатков, такое как 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков, присоединенных к аминоконцу, к карбоксиконцу или как к аминоконцу, так и карбоксиконцу аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида.

Указанные аминокислотные остатки могут, или не могут, заменять, изменять и/или иначе влиять на (биологические) свойства аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида по изобретению и могут, или не могут, добавлять другую функциональность аминокислотной последовательности, нанотелу®, соединению или полипептиду. Например, такие аминокислотные остатки могут иметь признаки, указанные далее.

a) Могут включать N-концевой остаток Met, например, в результате экспрессии в гетерологичной клетке-хозяине или организме-хозяине.

b) Могут образовывать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет секрецию аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида из клетки-хозяина после синтеза. Подходящие секреторные лидерные пептиды будут ясны для специалиста и могут быть такими, как описано в данном описании далее. Как правило, такая лидерная последовательность будет соединяться с N-концом аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида, хотя изобретение в его самом широком смысле этим не ограничивается.

c) Могут образовывать последовательность сигнала, который позволяет аминокислотной последовательности, нанотелу®, соединению или полипептиду направляться к и/или проникать или входить в определенные органы, ткани, клетки или части или компартменты клеток, и/или который позволяет аминокислотной последовательности, нанотелу®, соединению или полипептиду проникать сквозь или пересекать биологический барьер, такой как клеточная мембран, клеточный слой, такой как слой эпителиальных клеток, опухоль, включая солидные опухоли, или гематоэнцефалический барьер. Примеры таких аминокислотных последовательностей будут ясны для специалиста. Некоторыми неограничительными примерами являются небольшие пептидные векторы (векторы «пептраны»), описанные в WO 03/026700 и в Temsamani et al. Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani and Vigal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (2004), и в Roussele J., Pharmacol. Exp.Ther., 296, 124-131 (2001), и последовательность мембранного транслокатора, описанная Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). С-Концевые и N-концевые аминокислотные последовательности для внутриклеточного нацеливания фрагментов антител описаны, например, в Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Другие подходящие методы внутриклеточного нацеливания включают экспрессию и/или использование так называемых «интрател», включающих аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или полипептид по изобретению, как указано ниже.

d) Могут образовывать «метку», например, аминокислотную последовательность или остаток, которые допускают или облегчают очистку аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или полипептида, например, с использованием аффинных методов, направленных на указанные последовательности или остатки. Затем указанные последовательность или остаток можно удалить (например, химическим или ферментативным гидролизом) и получить аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или полипептид (для такой цели метка может быть соединена, необязательно, с аминокислотной последовательностью, нанотелом®, соединением или полипептидом через линкерную последовательность, поддающуюся гидролизу, или содержать поддающийся гидролизу мотив). Некоторыми предпочтительными, но не ограничительными примерами таких остатков являются гистидиновые остатки, глутатионовые остатки и метка туе, такая как AAAEQKLISEEDLNGAA (SEQ ID NO: 111).

e) Могут представлять собой один или несколько аминокислотных остатков, которые функционализированы и/или которые могут служить в качестве сайта для присоединения функциональных групп. Подходящие аминокислотные остатки и функциональные группы будут ясны для специалиста и включают, но не ограничиваются указанным, аминокислотные остатки и функциональные группы, упомянутые в данном описании для производных аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или полипептидов по изобретению.

Изобретение также относится к способам получения аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов, соединений, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, описанных в данном описании.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить способами, известными per se, что будет ясно для специалиста из дальнейшего описания. Например, аминокислотные последовательности, нанотела® и полипептиды по изобретению можно получить любым способом, известным per se для получения антител и, в частности, для получения фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь указанным, (одно)доменные антитела и фрагменты ScFv). Некоторые предпочтительные, но не ограничительные способы получения аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и нуклеиновых кислот включают способы и методы, описанные в данном описании.

Способ получения аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению может включать следующие стадии:

- экспрессии в подходящей клетке-хозяине или организме-хозяине (также называемых в данном описании «хозяин по изобретению») или в другой подходящей экспрессирующей системе нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанные аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению (также называемой в данном описании «нуклеиновая кислота по изобретению»),

необязательно, с последующими

- выделением и/или очисткой полученных таким образом аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению. В частности, такой способ может включать стадии

- культивирования и/или поддержания хозяина по изобретению в условиях, которые являются такими, что указанный хозяин по изобретению экспрессирует и/или вырабатывает, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, нанотело® и/или полипептид по изобретению,

необязательно, с последующими

- выделением и/или очисткой полученных таким образом аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте или нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность, нанотело®, полипептид или моновалентную конструкцию по изобретению (также называемым в данном описании «нуклеиновая кислота по изобретению» или «нуклеотидная последовательность по изобретению»). Нуклеиновая кислота по изобретению может находиться в форме одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, и предпочтительно, находится в форме двухцепочечной ДНК. Например, нуклеотидные последовательности по изобретению могут представлять собой геномную ДНК, кДНК или синтетическую ДНК (такую как ДНК с использованием кодона, который специфически адаптирован для экспрессии в предполагаемых клетке-хозяине или организме-хозяине).

Согласно одному воплощению изобретения нуклеиновая кислота по изобретению находится, по существу, в изолированной форме, как определено в данном описании. Нуклеиновая кислота по изобретению также может находиться в форме, присутствовать в и/или представлять собой часть вектора, такого как, например, плазмида, космида или YAC, которые вновь могут находиться, по существу, в изолированной форме.

Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить способом, известным per se, на основании сведений об аминокислотных последовательностях, нанотелах® и/или полипептидах по изобретению, приведенных в данном описании, и/или можно выделить из подходящего природного источника. Также, что будет понятно для специалиста, для того, чтобы получить нуклеиновую кислоту по изобретению, также несколько нуклеотидных последовательностей, таких как, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность или нанотело®, и, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько линкеров, можно соединить вместе подходящим образом.

Способы создания нуклеиновых кислот по изобретению будут понятны для специалиста и могут, например, включать, но не ограничиваться указанным, автоматизированный синтез ДНК; сайт-направленный мутагенез; объединение двух или большего числа встречающихся в природе и/или синтетических последовательностей (или двух или большего числа их частей), введение мутаций, которые ведут к экспрессии укороченного продукта экспрессии; введение одного или нескольких сайтов рестрикции (например, для создания кассет и/или участков, которые могут быть легко гидролизованы и/или лигированы с использованием подходящих рестрикционных ферментов) и/или введение мутаций с помощью реакции ПЦР с использованием одного или нескольких «ошибочных» праймеров. Указанные и другие методы будут понятны для специалиста, и снова следует обращаться к стандартным руководствам, таким как Sambrook et al., и Ausubel et al., упомянутым выше, а также к примерам, приведенным ниже.

Нуклеиновая кислота по изобретению также может находиться в форме, присутствовать в и/или представлять собой часть генетической конструкции, что также будет понятно для специалиста. Такие генетические конструкции вообще включают, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту по изобретению, которая, необязательно, соединяется с одним или несколькими элементами генетической конструкции, известными per se, такими как, например, один или несколько подходящих регуляторных элементов (таких как подходящий(е) промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы) и т.д.), и другими элементами генетической конструкции, относящимися к данному случаю. Такие генетические конструкции, включающие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту по изобретению, также будут называться в данном описании «генетические конструкции по изобретению».

Генетические конструкции по изобретению могут представлять собой ДНК или РНК, и предпочтительно представляют собой двухцепочечную ДНК. Генетические конструкции по изобретению также могут находиться в форме, подходящей для трансформации предполагаемых клетки-хозяина или организма-хозяина, в форме, подходящей для интеграции в геномную ДНК предполагаемой клетки-хозяина, или в форме, подходящей для независимой репликации, поддержания и/или наследования в предполагаемом организме-хозяине. Например, генетические конструкции по изобретению могут находиться в форме вектора, такого как, например, плазмида, космида, YAC, вирусный вектор или транспозон. В частности, вектор может представлять собой экспрессирующий вектор, т.е. вектор, который может обеспечить экспрессию in vitro и/или in vivo (например, в подходящей клетке-хозяине, организме-хозяине и/или экспрессирующей системе).

В предпочтительном, но не ограничительном воплощении генетическая конструкция по изобретению включает

a) по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту по изобретению, функционально соединенную с

b) одним или несколькими регуляторными элементами, такими как промотор, и, необязательно, подходящим терминатором;

и также необязательно,

c) с одним или несколькими другими элементами генетических конструкций, известными per se;

где термины «регуляторный элемент», «промотор», «терминатор» и «функционально соединенная» имеют их обычные значения в технике (как описано в данном описании далее); и где указанные «другие элементы», присутствующие в генетических конструкциях, могут представлять собой, например, 3'- или 5'-UTR-последовательности, лидерные последовательности, маркеры селекции, маркеры экспрессии/репортерные гены и/или элементы, которые могут облегчить или усилить трансформацию или интеграцию (их эффективность). Указанные и другие подходящие элементы для генетических конструкций будут ясны для специалиста и могут, например, зависеть от типа используемой конструкции, предполагаемых клетки-хозяина или организма-хозяина, способа, которым нуклеотидные последовательности по изобретению, представляющие интерес, должны быть экспрессированы (например, через конститутивную, транзиторную или индуцибельную экспрессию), и/или используемого метода трансформации. Например, по существу, аналогично могут использоваться регуляторные последовательности, промоторы и терминаторы, известные per se для экспрессии и выработки антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь указанным, (одно)доменные антитела и фрагменты ScFv).

Предпочтительно, в генетических конструкциях по изобретению указанная, по меньшей мере, одна нуклеиновая кислота по изобретению и указанные регуляторные элементы и, необязательно, указанные один или несколько других элементов «функционально соединены» друг с другом, что обычно означает, что они находятся в функциональном соотношении друг с другом. Например, промотор считают «функционально соединенным» с кодирующей последовательностью, если указанный промотор способен инициировать или иначе контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию кодирующей последовательности (где, как следует понимать, кодирующая последовательность находится «под контролем» указанного промотора). Вообще, когда две нуклеотидные последовательности являются функционально соединенными, они будут находиться в одинаковой ориентации и, как правило, также в одной и той же рамке считывания. Как правило, они также будут представлять собой, по существу, контиг, хотя это также может не требоваться.

Предпочтительно регуляторные и другие элементы генетических конструкций по изобретению являются такими, что они способны обеспечивать свою предполагаемую биологическую функцию в предполагаемых клетке-хозяине или организме-хозяине.

Например, промотор, энхансер или терминатор должен быть «функциональным» в предполагаемых клетке-хозяине или организме-хозяине, что означает, что (например) указанный промотор должен быть способен к инициации или иному контролированию/регулированию транскрипции и/или экспрессии нуклеотидной последовательности - например, кодирующей последовательности - с которой он функционально соединен (как определено в данном описании).

Некоторые особенно предпочтительные промоторы включают, но не ограничиваются указанным, известные per se промоторы для экспрессии в клетках-хозяевах, указанных в данном описании; и, в частности, промоторы для экспрессии в бактериальных клетках, таких как указанные в данном описании и/или используемые в примерах.

Маркер селекции должен быть таким, чтобы он позволял - т.е. в соответствующих условиях отбора - клеткам-хозяевам и/или организмам-хозяевам, которые (успешно) трансформированы нуклеотидной последовательностью по изобретению, отличаться от клеток/организмов-хозяев, которые не были (успешно) трансформированы. Некоторыми предпочтительными, но не ограничительными примерами таких маркеров являются гены, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам (таких как канамицин или ампициллин), гены, которые обеспечивают теплоустойчивость, или гены, которые дают возможность клетке-хозяину или организму-хозяину сохраняться в отсутствие некоторых факторов, соединений и/или (питательных) компонентов в среде, которые являются существенными для выживания нетрансформированных клеток или организмов.

Лидерная последовательность должна быть такой, чтобы - в предполагаемых клетке-хозяине или организме-хозяине - она создавала возможность для нужных посттрансляционных модификаций, и/или такой, чтобы она направляла транскрибированную мРНК к нужной части или органелле клетки. Лидерная последовательность также может создавать возможность для секреции продукта экспрессии из указанной клетки. Как таковая, лидерная последовательность может представлять собой любую про-, пре- или препропоследовательность, функционирующую в клетке-хозяине или организме-хозяине. Лидерные последовательности могут не требоваться для экспрессии в бактериальной клетке. Например, известные per se лидерные последовательности для экспрессии и выработки антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь указанным, однодоменные антитела и фрагменты ScFv) могут быть использованы, по существу, аналогичным способом.

Маркер экспрессии или репортерный ген должен быть таким, чтобы - в клетке-хозяине или организме-хозяине - он давал возможность детекции экспрессии (гена или присутствующей нуклеотидной последовательности) генетической конструкции. Маркер экспрессии также, необязательно, может создавать возможность для локализации экспрессированного продукта, например, в определенной части или органелле клетки и/или в определенной(ых) клетке(ах), ткани(ях), органе(ах) или части(ях) многоклеточного организма. Такие репортерные гены также могут экспрессироваться в виде слитого белка с аминокислотной последовательность, нанотелом® или полипептидом по изобретению. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры включают флуоресцентные белки, такие как GFP.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры подходящих промоторов, терминаторов и других элементов включают те из них, которые можно использовать для экспрессии в клетках-хозяевах, упомянутых в данном описании, и в частности, те, которые подходят для экспрессии в бактериальных клетках, таких как упомянутые в данном описании, и/или используемые в примерах, приведенных ниже. В отношении некоторых (других) неограничительных примеров промоторов, маркеров селекции, лидерных последовательностей, маркеров экспрессии и других элементов, которые могут присутствовать/использоваться в генетических конструкциях по изобретению, таких как терминаторы, энхансеры транскрипции и/или трансляции и/или факторы интеграции, можно обратиться к общим руководствам, таким как Sambrook et al., и Ausubel et al., упомянутым выше, а также к примерам, которые приводятся в WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-7207410, US-A- 5693492 и ЕР 1085089. Другие примеры будут ясны для специалиста. Также можно обратиться к работам известного уровня техники, цитированным выше, и также к ссылкам, цитированным в указанных работах.

Генетические конструкции по изобретению вообще могут быть получены соответствующим соединением нуклеотидной(ых) последовательности(ей) по изобретению с одним или несколькими другими элементами, описанными выше, например, с использованием методов, описанных в общих руководствах, таких как Sambrook et al., и Ausubel et al., упомянутых выше.

Обычно генетические конструкции по изобретению будут получать путем встраивания нуклеотидной последовательности по изобретению в подходящий (экспрессирующий) вектор, известный per se. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры подходящих экспрессирующих векторов представляют собой векторы, используемые в приведенных ниже примерах, а также векторы, упомянутые в данном описании.

Нуклеиновые кислоты по изобретению и/или генетические конструкции по изобретению можно использовать для трансформации клетки-хозяина или организма-хозяина, т.е. для экспрессии и/или продуцирования аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению. Подходящие хозяева или клетки-хозяева будут ясны для специалиста и могут представлять собой, например, любую подходящую грибную, клетку прокариот или эукариот или клеточную линию, или любой подходящий организм выбранный из грибов, прокариот или эукариот, например,

- бактериальный штамм, включая, не ограничиваясь указанным, грамотрицательные штаммы, такие как штаммы Escherichia coli; Proteus, например, Proteus mirabilis; Pseudomonas, например, Pseudomonas fluorescens; и грамположительные штаммы, такие как штаммы Bacillus, например. Bacillus subtilis или Bacillus brevis; Streptomyces, например, Streptomyces lividans; Staphylococcus, например, Staphylococcus carnosus; и Lactococcus, например, Lactococcus lactis;

- клетку гриба, включая, не ограничиваясь указанным, клетки видов Trichoderma, например, Trichoderma reesei; Neurospora, например, Neurospora crassa; Sordaria, например, Sordaria macrospora; Aspergillus, например, Aspergillus niger или Aspergillus sojae; или других мицелиальных грибов;

- дрожжевую клетку, включая, не ограничиваясь указанным, клетки вида Saccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae; Schizosaccharomyces, например, Schizosaccharomyces pombe; Pichia, например, Pichia pastoris или Pichia methanolica; Hansenula, например, Hansenula polymorpha; Kluyveromyces, например, Kluyveromyces lactis; Arxula, например, Arxula adeninivorans; Yarrowia, например, Yarrowia lipolytica;

- клетку или клеточную линию амфибии, такие как Xenopus oocytes;

- клетку или клеточную линию, полученную от насекомого, такие как клетки/клеточные линии, полученные от чешуекрылых, включая, не ограничиваясь указанным, Spodoptera SF9 и Sf21 или клетки/клеточные линии, полученные от Drosophila, такие как клетки Schneider и Кс;

- растение или растительную клетку, например, растение табака; и/или

- клетку или клеточную линию млекопитающего, например, клетку или клеточную линию, полученную от человека, клетку или клеточную линию млекопитающего, включая, не ограничиваясь указанным, клетки СНО, клетки ВНК (например, клетки ВНК-21) и человеческие клетки или клеточные линии, такие как HeLa, COS (например, COS-7) и клетки PER.C6; а также других хозяев или другие клетки-хозяева, известные per se для экспрессии и выработки антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь указанным, (одно)доменные антитела и фрагменты ScFv), которые будут ясны для специалиста. Также дается ссылка на общие руководства известного уровня техники, цитированные в данном описании выше, а также, например, на WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), цит.выше; Riechmann and Muyldermans, (1999), цит. выше; van der Linden, (2000), цит. выше; Thomassen et al., (2002), цит. выше; Joosten et al., (2003), цит. выше; Joosten et al., (2005), цит. выше; и другие ссылки, цитированные в данном описании.

Аминокислотные последовательности, нанотела® и полипептиды по изобретению также можно ввести и экспрессировать в одной или нескольких клетках, тканях или органах многоклеточного организма, например, для профилактических и/или терапевтических целей (например, в виде генной терапии). Для такой цели нуклеотидные последовательности по изобретению можно ввести в клетки или ткани любым подходящим путем, например, как таковые (например, с использованием липосом) или после того, как они встроены в подходящий генотерапевтический вектор (например, образованный из ретровирусов, таких как аденовирус, или паравирусов, таких как аденоассоциированный вирус). Что также будет понятно специалисту, такую генную терапию можно выполнять in vivo и/или in situ в организме пациента путем введения пациенту нуклеиновой кислоты по изобретению или подходящего генотерапевтического вектора, кодирующего ее, или в определенные клетки или определенную ткань или орган пациента; или подходящие клетки (обычно взятые из организма пациента, которого лечат, например, эксплантированные лимфоциты, аспираты костного мозга или образцы биопсии ткани) можно обработать in vitro нуклеотидной последовательностью по изобретению и затем подходящим путем (повторно) ввести в организм пациента. Все указанное можно осуществлять с использованием генотерапевтических векторов, методов и систем доставки, хорошо известных специалисту, и, например, описанных в Culver К. W., "Gene Therapy", 1994, р. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y); Giordano, Nature F Medicine, 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res., 79 (1996), 911-919; Anderson, Science, 256 (1992), 808-813; Verma, Nature, 389 (1994), 239; Isner, Lancet, 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res., 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood, 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther., 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci., 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther., 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine, 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5580859; US 5589466; или в Schaper, Current Opinion in Biotechnology, 7 (1996), 635-640. Например, в технике описана экспрессия in situ фрагментов ScFv (Afanasieva et al. Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) и диантител (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)).

В случае экспрессии аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов в клетке их также можно экспрессировать в виде так называемых «интрател», как описано, например, в WO 94/02610, WO 95/22618 и US-A-7004940; WO 03/014960; в Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997), Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; и в Kontermann, Methods, 34, (2004), 163-170.

Аминокислотные последовательности, нанотела® и полипептиды по изобретению также можно получить, например, в молоке трансгенных млекопитающих, например, в молоке кроликов, коров, коз или овец (см., например, US 6741957, US 6304489 и US 6849952 об общих методах введения трансгенов млекопитающим), в растениях или частях растений, включая, но не ограничиваясь указанным, их листья, цветы, плоды, корни или клубни (например, в табаке, маисе, сое или люцерне), или, например, в куколках тутового шелкопряда Bombix mori).

Кроме того, аминокислотные последовательности, нанотела® и полипептиды по изобретению также можно экспрессировать и/или продуцировать в бесклеточных экспрессирующих системах, и подходящие примеры таких систем будут ясны для специалиста. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры включают экспрессию в системе зародышей пшеницы, в лизатах кроличьих ретикулоцитов или в системе Е. coli Zubay.

Как упомянуто выше, одним из преимуществ использования нанотел® является то, что полипептиды на их основе можно получить через экспрессию в подходящей бактериальной системе, и подходящие бактериальные экспрессирующие системы, векторы, клетки-хозяева, регуляторные элементы и т.д. будут ясны для специалиста, например, из ссылок, цитированных выше. Однако необходимо отметить, что изобретение в его самом широком смысле не ограничивается экспрессией в бактериальных системах.

Предпочтительно, в изобретении используют экспрессирующие (in vivo или in vitro) системы, такие как бактериальная экспрессирующая система, которые дают полипептиды по изобретению в форме, которая подходит для фармацевтического применения, и вновь такие экспрессирующие системы будут ясны для специалиста. Что также будет ясно для специалиста, полипептиды по изобретению, подходящие для фармацевтического применения, можно получить с использованием методов пептидного синтеза.

В случае получения в промышленном масштабе предпочтительные гетерологичные хозяева для (промышленной) выработки нанотел® или нанотело®-содержащих белковых терапевтических средств включают штаммы Е.coli, Pichia pastoris, S.cerevisiae, которые подходят для крупномасштабной экспрессии/выработки/ферментации, и в частности, для крупномасштабной фармацевтической экспрессии/выработки/ферментации. Подходящие примеры таких штаммов будут ясны для специалиста. Такие штаммы и продуцирующие/экспрессирующие системы также доступны от таких кампаний, как Biovitrum (Uppsala, Швеция).

С другой стороны, для крупномасштабной экспрессии/выработки/ферментации, и в частности, крупномасштабной фармацевтической экспрессии/выработки/ферментации, можно использовать клеточные линии млекопитающих, в частности, клетки яичника китайского хомячка (СНО). Вновь такие экспрессирующие/продуцирующие системы также доступны от некоторых компаний, упомянутых выше.

Выбор конкретной экспрессирующей системы будет зависеть, в частности, от потребности в определенных посттрансляционных модификациях, конкретнее, гликозилировании. Выработка нанотело®-содержащего рекомбинантного белка, для которого гликозилирование желательно или требуется, может потребовать использования экспрессирующих хозяев относящихся к млекопитающим, которые имеют способность гликозилировать экспрессированный белок. В этом отношении специалисту будет понятно, что полученный паттерн гликозилирования (т.е. вид, число и позиция присоединенных остатков) будет зависеть от клетки или клеточной линии, которую используют для экспрессии. Предпочтительно используют или человеческую клетку или клеточную линию (т.е. ведущую к белку, который, по существу, имеет паттерн гликозилирования у человека) или клетку или клеточную линию другого млекопитающего, которая может обеспечить паттерн гликозилирования, которая, по существу и/или функционально, такая же, как гликозилирование у человека, или, по меньшей мере, имитирует гликозилирование у человека. Вообще хозяева прокариоты, такие как Е. coli, не имеют способности гликозилировать белки, а использование низших эукариот, таких как дрожжи, обычно ведет к паттерну гликозилирования, которая отличается от гликозилирования у человека. Тем не менее, следует иметь в виду, что все вышеуказанные клетки-хозяева и экспрессирующие системы можно использовать в изобретении, в зависимости от желательных получаемых аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида.

Таким образом, согласно одному неограничительному воплощению изобретения аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению гликозилируют. Согласно другому неограничительному воплощению изобретения аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению являются негликозилированными.

Согласно одному предпочтительному неограничительному воплощению изобретения аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению получают в бактериальной клетке, подходящей для крупномасштабной выработки фармацевтического продукта, такой как клетки штаммов, указанных выше.

Согласно другому предпочтительному неограничительному воплощению изобретения аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению получают в дрожжевой клетке, в частности, дрожжевой клетке, подходящей для крупномасштабной выработки фармацевтического продукта, такой как клетки видов, указанных выше.

Согласно еще одному предпочтительному неограничительному воплощению изобретения аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению получают в клетке млекопитающего, в частности, в человеческой клетке или в клетке человеческой клеточной линии, и в более частном случае, в человеческой клетке или в клетке человеческой клеточной линии, подходящей для крупномасштабной выработки фармацевтического продукта, такой как клеточные линии, указанные выше.

Когда для получения аминокислотных последовательностей, нанотел® и полипептидов по изобретению используют экспрессию в клетке-хозяине, аминокислотную последовательность, нанотело® и полипептид по изобретению можно получить или внутриклеточно (например, в цитозоле, в параплазме или в тельцах включения) и затем извлечь из клеток-хозяев и, необязательно, дополнительно очистить, или их можно получить внеклеточно (например, в среде, в которой клетки-хозяева культивируются) и затем извлечь из культуральной среде и, необязательно, дополнительно очистить. Когда используются клетки-хозяева относящиеся к эукариотам, то, как правило, предпочтительно внеклеточное получение, так как это значительно облегчает дальнейшее извлечение и последующую обработку полученных аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и белков. Бактериальные клетки, такие как штаммы Е. coli, упомянутые выше, как правило, не секретируют белки внеклеточно, за исключением нескольких классов белков, таких как токсины и гемолизин, и секреторная продукция в Е.coli включает транслокацию белков через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство. Периплазматическая продукция дает некоторые преимущества над цитоплазматической продукцией. Например, N-концевая аминокислотная последовательность секретированного продукта может быть идентична природному генному продукту после отщепления сигнальной последовательности секреции специфической сигнальной пептидазой. Также оказывается, что протеазная активность значительно ниже в периплазме, чем в цитоплазме. Кроме того, очистка белка более простая из-за меньшего загрязнения белков в периплазме. Другим преимуществом является то, что могут образоваться правильные дисульфидные связи, поскольку периплазма обеспечивает более сильную окислительную среду, чем цитоплазма. Белки, сверхэкспрессированные в Е.coli, часто обнаруживают в нерастворимых агрегатах, так называемых тельцах включения. Такие тельца включения могут локализоваться в цитозоле или периплазме; для извлечения биологически активных белков из таких телец включения требуется процесс денатурации/повторной укладки. Многие рекомбинантные белки, включая терапевтические белки, извлекают из телец включения, С другой стороны, что будет понятно специалисту, можно использовать рекомбинантные штаммы бактерий, которые генетически модифицированы с тем, чтобы секретировать нужный белок, и в частности, аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению.

Таким образом, согласно одному неограничительному воплощению изобретения аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению представляют собой аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид, которые выработаны внутриклеточно и которые выделены из клетки-хозяина, и в частности, из бактериальной клетки или из тельца включения в бактериальной клетке. Согласно другому неограничительному воплощению изобретения аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению представляют собой аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид, которые выработаны внеклеточно и которые выделены из среды, в которой культивируют клетку-хозяина.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные промоторы для использования с клетками-хозяевами включают

- для экспрессии в Е.coli: промотор lac (и его производные, такие как промотор lacUVS); арабинозный промотор; лево- (PL) и правоповоротный (PR) промотор фага-лямбда; промотор оперона; гибридные lac/tr промоторы (tac и trc); Т7-промотор (специфичнее, который из гена 10 Т7-фага) и другие Т-фаговые промоторы; промотор гена устойчивости к тетрациклину Tn10; сконструированные варианты вышеуказанных промоторов, которые включают одну или больше копий дополнительной последовательности регуляторного оператора;

- для экспрессии в S. cerevisiae: конститутивные - ADH1 (спиртовая дегидрогеназа 1), ENO (энолаза), CYC1 (цитохром с изо-1), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), PGK.1 (фосфоглицераткиназа), PYK1 (пируваткиназа); регулируемые - GAL1.10,7 (ферменты метаболизма галактозы), ADH2 (спиртовая дегидрогеназа 2), PHOS (кислая фосфатаза), CUP1 (металлотионеин меди); гетерологичные - CaMV (промотор вируса мозаики цветной капусты 355);

- для экспрессии в Pichia pastoris: промотор АОХ1 (спиртовая оксидаза 1);

- для экспрессии в клетках млекопитающих: немедленно-ранний энхансер/промотор цитомегаловируса человека (hCMV); вариант немедленно-раннего промотора цитомегаловируса человека (hCMV), который содержит две последовательности тетрациклинового оператора, так что промотор может регулироваться репрессором Tet; промотор тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса; энхансер/промотор длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (RSV LTR); промотор фактора элонгации la (hEF-1α) от человека, шимпанзе, мыши или крысы; ранний промотор SV40; промотор длинного концевого повтора ВИЧ-1; β-актиновый промотор.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные векторы для использования с указанными клетками-хозяевами включают

- векторы для экспрессии в клетках млекопитающих: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и 1ZD35 (ATCC 37565), а также экспрессирующие системы на основе вирусов, такие как на основе аденовируса;

- векторы для экспрессии в бактериальных клетках: векторы рЕТ (Novagen) и векторы pQE (Qiagen);

- векторы для экспрессии в дрожжевых клетках или клетках других грибов: pYES2 (Invitrogen) и экспрессирующие векторы Pichia (Invitrogen);

- векторы для экспрессии в клетках насекомых: pBlueBacll (Invitrogen) и другие бакуловирусные векторы;

- векторы для экспрессии в растениях или клетках растений: например, векторы на основе вируса мозаики цветной капусты или вируса табачной мозаики, подходящие штаммы Agrobacterium или векторы на основе Ti-плазмиды.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные секреторные последовательности для использования с указанными клетками-хозяевами включают

- для использования в бактериальных клетках, таких как Е.coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, и т.п.; сигнальный пептид TAT, С-концевой сигнал секреции гемолизина;

- для использования в дрожжевых клетках: препропоследовательность фактора α-спаривания, фосфататазу (phol), инвертазу (Sue), и т.д.;

- для использования в клетках млекопитающих: эндогенный сигнал в случае белка-мишени происходящего из эукариот; сигнальный пептид κ-цепи мышиного Ig V-J2-C; и т.д.

Подходящие методы для трансформации хозяина или клетки-хозяина по изобретению будут понятны специалисту и могут зависеть от предполагаемых клетки-хозяина/организма-хозяина и генетической конструкции, которую используют. Снова дается ссылка на руководства и заявки на патент, упомянутые выше.

После трансформации можно выполнить стадию детекции и отбора тех клеток-хозяев или организмов-хозяев, которые успешно трансформированы нуклеотидной последовательностью/генетической конструкцией по изобретению. Это может быть, например, стадия отбора на основе селектируемого маркера, присутствующего в генетической конструкции по изобретению, или стадия, включающая детекцию аминокислотной последовательности по изобретению, например, с использованием специфических антител.

Трансформированная клетка-хозяин (которая может находиться в форме устойчивой клеточной линии) или трансформированные организмы-хозяева (которые могут находиться в форме устойчивых линии мутантов или штаммов) также составляют аспекты настоящего изобретения.

Предпочтительно, такие клетки-хозяева или организмы-хозяева являются такими, что они экспрессируют или (по меньшей мере) способны экспрессировать (например, в подходящих условиях) аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению (и в случае организма-хозяина, по меньшей мере, в одной клетке, части, ткани или органе). Изобретение также включает последующие поколения, потомство и/или потомков клетки-хозяина или организма-хозяина по изобретению, которые можно получить, например, делением клеток или половым или бесполым размножением.

Для того, чтобы получить экспрессию аминокислотных последовательностей, нанотел® или полипептидов по изобретению, трансформированную клетку-хозяина или трансформированный организм-хозяин можно вообще выдерживать, сохранять и/или культивировать в таких условиях, что аминокислотная последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению экспрессируется или вырабатывается. Подходящие условия будут понятны специалисту и обычно будут зависеть от используемых клетки-хозяина/организма-хозяина, а также от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию (релевантной) нуклеотидной последовательности по изобретению. Вновь делается ссылка на руководства и заявки на патент, упомянутые выше в абзацах о генетических конструкциях по изобретению.

Вообще подходящие условия могут включать использование подходящей среды, наличие подходящего источника питания и/или подходящих питательных веществ, использование подходящей температуры и, необязательно, наличие подходящего индуцирующего фактора или соединения (например, когда нуклеотидные последовательности по изобретению находятся под контролем индуцибельного промотора); которые все могут быть выбраны специалистом. Вновь в таких условиях аминокислотные последовательности по изобретению могут быть экспрессированы конститутивно, временно или только когда соответственно индуцированы.

Специалисту также будет понятно, что аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению можно (сначала) получать в незрелой форме (как указано выше), которую затем можно подвергнуть посттрансляционной модификации в зависимости от используемых клетки-хозяина/организма-хозяина. Также аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению можно гликозилировать, снова в зависимости от используемых клетки-хозяина/организма-хозяина.

Затем аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению можно выделить из клетки-хозяина/организма-хозяина и/или из среды, в которой указанные клетка-хозяин или организм-хозяин культивированы, с использованием методов выделения белков и/или очистки белков, известных per se, таких как методы (препаративной) хроматографии и/или электрофореза, методы дифференцированного осаждения, аффинные методы (например, с использованием специфической способной к отщеплению аминокислотной последовательности, слитой с аминокислотной последовательностью, нанотелом® или полипептидом по изобретению) и/или препаративных иммунологических методов (т.е. с использованием антител против аминокислотных последовательностей, которые выделяют).

Изобретение также относится к продукту или композиции, содержащим или включающим, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность по изобретению (или ее подходящий фрагмент), по меньшей мере, одно нанотело® по изобретению, по меньшей мере, один полипептид по изобретению, по меньшей мере, одно соединение или конструкцию по изобретению, по меньшей мере, одну моновалентную конструкцию по изобретению и/или, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту по изобретению и, необязательно, один или несколько других компонентов таких композиций, известных per se, т.е. в зависимости от предполагаемого использования композиции. Такие продукт или композиция могут представлять собой, например, фармацевтическую композицию (описанную в данном описании), ветеринарную композицию или продукт или композицию для диагностического использования (также как описано в данном описании). Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких продуктов или композиций станут яснее из дальнейшего описания.

Вообще для фармацевтического применения аминокислотные последовательности, нанотела® и полипептиды по изобретению могут быть подготовлены в виде фармацевтического препарата или композиций, включающих, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и, необязательно, один или несколько других фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Как неограничительные примеры, такая композиция может находиться в форме, подходящей для перорального введения, для парентерального введения (такого как внутривенная, внутримышечная или подкожная инъекция или внутривенная инфузия), для местного введения, для введения ингаляцией, с помощью кожного пэтча, имплантата, суппозитория и т.д. Такие подходящие для введения формы, которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими, в зависимости от способа введения, а также способы и носители для применения в их препаратах будут ясны специалисту и также описаны в данном описании.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность по изобретению, по меньшей мере, одно нанотело® по изобретению, по меньшей мере, одно соединение или конструкцию по изобретению, по меньшей мере, один полипептид по изобретению и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант (т.е. подходящий для фармацевтического применения) и, необязательно, один или несколько других фармацевтически активных веществ.

Вообще, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению могут быть включены в композиции и введены любым подходящим способом, известным per se, в отношении чего дается ссылка, например, на общее руководство в технике, цитированное выше (и в частности, на WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 и WO 08/020079), а также на стандартные руководства, такие как Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); или the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (см., например, ее. 252-255).

Например, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению могут быть включены в композиции и введены любым подходящим способом, известным per se для условных антител и фрагментов антител (включая фрагменты ScFv и диатела) и других фармацевтически активных белков. Такие композиции и способы их получения будут ясны для специалиста и включают, например, препараты, подходящие для парентерального введения (например, внутривенного, интраперитонеального, подкожного, внутримышечного, интралюминального, интраартериального или интратекального введения) или для местного (например, трансдермального или интрадермального) введения.

Препараты для парентерального введения могут представлять собой, например, стерильные растворы, суспензии, дисперсии или эмульсии, которые подходят для инфузии или инъекции. Подходящие носители или разбавители для таких препаратов включают, например, без ограничения, носители и разбавители, упомянутые на с.143 WO 08/020079. Как правило, предпочтительными будут водные растворы или суспензии.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению также можно вводить с использованием методов генотерапии для доставки. См., например, патент США №5399346, который включен в данное описание в качестве ссылки. С использованием генотерапевтических методов доставки в первичные клетки, трансфицированные геном, кодирующим аминокислотную последовательность, нанотело® или полипептид по изобретению, можно дополнительно трансфицировать тканеспецифическими промоторами для нацеливания на определенные органы, ткань, трансплантаты, опухоли или клетки и можно дополнительно трансфицировать сигнальными или стабилизирующими последовательностями для субклеточно локализованной экспрессии.

Таким образом, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению можно вводить системно, например, перорально, в комбинации с фармацевтически приемлемой средой, такой как инертный разбавитель или усвояемый съедобный носитель. Их можно заключить в твердые или мягкие желатиновые капсулы, можно спрессовать в таблетки или можно вводить непосредственно с пищей в рационе пациента. Для перорального терапевтического введения аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению можно объединить с одними или несколькими эксципиентами и использовать в форме таблеток, которые глотают, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Такие композиции и препараты должны содержать, по меньшей мере, 0,1% аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения, конструкции или полипептида по изобретению. Их процентное содержание в композициях и препаратах, конечно, может изменяться и обычно может составлять от примерно 2 до примерно 60 мас.% данной стандартной лекарственной формы. Количество аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения, конструкции или полипептида по изобретению в таких терапевтически применимых композициях таково, что будет получен эффективный уровень дозировки.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п. также могут содержать связующие вещества, эксципиенты, вещества, способствующие рассыпанию, смазывающие вещества и подслащивающие вещества или отдушки, например, такие, какие указаны на страницах 143-144 WO 08/020079. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, кроме материалов указанного выше типа, жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Могут присутствовать различные другие материалы, например, образующие покрытие или иначе модифицирующие физическую форму твердой стандартной лекарственной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и т.п. Сироп или эликсир могут содержать аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению, сахарозу или фруктозу в качестве подслащивающего вещества, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, такой как вишневая или апельсиновая отдушка. Конечно, любой материал, используемый при получении любой стандартной лекарственной формы, должен быть фармацевтически приемлемым и, по существу, нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению могут быть включены в препараты и устройства с пролонгированным высвобождением.

Препараты и композиции для перорального введения также могут предоставляться с энтеросолюбильным покрытием, что позволяет конструкциям по изобретению сопротивляться внутрижелудочной среде и проходить в кишечник. В более общем случае препараты и композиции для перорального введения могут быть соответственно составлены для доставки в нужную часть желудочно-кишечного тракта. Кроме того, для доставки в желудочно-кишечный тракт можно использовать подходящие суппозитории.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению также можно вводить внутривенно или интраперитонеально инфузией или инъекцией, что также описано на страницах 144 и 145 WO 08/020079.

Для местного введения аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению можно применять в чистой форме, т.е. когда они представляют собой жидкости. Однако вообще будет желательно вводить их в кожу в виде композиций или препаратов в сочетании с дерматологически приемлемым носителем, который может представлять собой жидкое или твердое вещество, что также описано на странице 145 WO 08/020079.

Вообще, концентрация аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и полипептидов по изобретению в жидкой композиции, такой как лосьон, будет составлять примерно 0,1-25 мас.%, предпочтительно, примерно 0,5-10 мас.%. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, будет составлять примерно 0,1-5 мас.%, предпочтительно, примерно 0,5-2,5 мас.%.

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и/или полипептиды по изобретению и/или композиции, включающие их, вводят в легочную ткань. В контексте настоящего изобретения «легочная ткань» для целей данного изобретения эквивалентна легочной ткани или легкому. Легкое включает 2 различные зоны: зону, в которой не происходит газообмен, и дыхательную зону, в пределах которой находятся дыхательные и полости сосудов (см., например, «Pulmonary Drug Delivery», Edited by Karoline Bechtold-Peters and Henrik Luessen, 2007, ISBN 978-3-87193-322-6, pages 16-28).

Для доставки в легкие аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и полипептиды по изобретению можно применять в чистой форме, т.е. когда они представляют собой жидкости или сухой порошок. Однако будет предпочтительно вводить их в легочную ткань в виде композиции или препарата, включающих аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение, конструкцию и/или полипептид по изобретению и носитель, подходящий для доставки в легкие. Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение, конструкцию и/или полипептид по изобретению и носитель, подходящий для доставки в легкие. Носители, подходящие для доставки в легкие, известны в технике.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и/или полипептиды по изобретению также можно вводить в виде микро- или наночастиц чистых лекарственных средств с частицами размером и распределением, благоприятными для доставки в легкие.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтическому устройству, подходящему для доставки в легкие аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и/или полипептидов по изобретению, и подходящему при применении композиции, включающей их. Такое устройство может представлять собой ингалятор для жидкостей (например, суспензии твердых частиц или капель), включающих аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение, конструкцию и/или полипептид по изобретению. Предпочтительно такое устройство представляет собой аэрозоль, включающий аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение, конструкцию и/или полипептид по изобретению. Устройство также может представлять собой ингалятор для сухого порошка, включающего аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение, конструкцию и/или полипептид по изобретению в форме сухого порошка.

В предпочтительном способе введение в легочную ткань выполняют путем ингаляции аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и/или полипептидов по изобретению и/или композиции, включающей их, в аэрозольном облаке. Согласно изобретению, ингаляцию аэрозольного облака можно выполнять с помощью устройства для ингаляции. Устройство должно генерировать из композиции, включающей аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и/или полипептиды по изобретению (и/или композиции, включающей их), аэрозольное облако из частиц нужного размера (распределения) в соответствующий момент цикла ингаляции для млекопитающего, содержащее правильную дозу аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и/или полипептидов по изобретению («Pulmonary drug delivery», Bechtold-Peters and Luessen, eds., ISBN 978-3-87193-322-6, page 125).

В контексте настоящего изобретения «аэрозоль» обозначает суспензию тонких твердых частиц или капель жидкости (или их сочетания) в газе, при этом для целей данного изобретения частицы и/или капли включают аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и/или полипептиды по изобретению.

Устройство должно генерировать из композиции аэрозольное облако частиц нужного размера (распределения) в соответствующий момент цикла ингаляции для млекопитающего, содержащее правильную дозу аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и/или полипептидов по изобретению. Необходимо учитывать перечисленные далее 4 требования (композиция, размер частиц, время и доза) («Pulmonary Drug Delivery», Bechtold-Peters and Luessen, eds., цит. выше, сс.125 и 126).

- Композиции, которые используют в устройствах, могут меняться от водных растворов или суспензий, используемых в распылителях, до растворов или суспензий на основе пропеллентов в ингаляторе с дозиметром или даже специально созданных порошкообразных смесей для порошковых ингаляторов. Все указанные различные препараты требуют различных принципов для генерации аэрозоля, что подчеркивает взаимозависимость устройства и препарата.

- Так как место осаждения аэрозольных частиц зависит от их (аэродинамического) размера и скорости, нужный размер частиц аэрозольного облака изменяется в зависимости от желательного места осаждения в легких, что связано с терапевтической задачей введения.

- Так как аэрозольное облако может быть приспособлено к высвобождению в различные моменты во время цикла ингаляции, генерируемого млекопитающим, предпочтительно, чтобы в случае средств по изобретению (осаждаемых на периферические части легкого) аэрозоль высвобождался в начале цикла ингаляции.

- Дозы могут изменяться значительно и могут, например, изменяться, например, для человека, от нескольких микрограммов до нескольких сотен микрограммов или даже миллиграммов, например, до примерно 10-100 миллиграммов.

Различные системы ингаляции описаны, например, на страницах 129-148 в обзоре («Pulmonary Drug Delivery», Bechtold-Peters and Luessen, eds., цит. выше) и включают, но не ограничиваются указанным, распылители, ингаляторы с дозиметром, жидкостные ингаляторы с дозиметром и порошковые ингаляторы. Также могут быть использованы устройства, принимающие в расчет оптимизированную и индивидуализированную картину дыхания, для приемов регулируемой ингаляции (см. технологию AKITA® на странице 157 «Pulmonary Drug Delivery», Bechtold-Peters and Luessen, eds., цит. выше).

Однако не только устройство важно для доставки в легкие аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и/или полипептидов по изобретению, но также подходящий препарат является критичным для достижения эффективной доставки. Это может быть достижимо в принципе с использованием следующих подходов:

- введение водных растворов или суспензий, включающих аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и/или полипептиды по изобретению (например, капель в нос), в носовые полости;

- распыление водных растворов или суспензий, включающих аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения, конструкции и/или полипептиды по изобретению;

- атомизация с помощью сжиженных пропеллентов и

- диспергирование сухих порошков.

Поэтому препараты аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и/или полипептидов по изобретению должны быть адаптированы и подобраны для устройства, выбранного для ингаляции. Соответствующие композиции, т.е. эксципиенты в дополнение к аминокислотным последовательностям, нанотелам®, соединениям, конструкциям и/или полипептидам по изобретению, описаны, например в главе IV «Pulmonary Drug Delivery», Bechtold-Peters and Luessen, eds., цит. выше. В этом отношении дается ссылка на предварительную заявку на патент США №US 61/303447, озаглавленную «Способы и композиции для получения аэрозолей», зарегистрированную Ablynx N.V. 12 февраля 2010.

Количество аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и полипептидов по изобретению, требуемое для использования при лечении, будет меняться не только в связи с выбранными аминокислотной последовательностью, нанотелом®, соединениями, конструкциями или полипептидом, но также со способом введения, природой состояния, от которого лечат, и возрастом и состоянием пациента, и будет, в конечном счете, предписано лечащим врачом или практикующим врачом. Также дозировка аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений, конструкций и полипептидов по изобретению изменяется в зависимости от мишени клетки-хозяина, опухоли, ткани, трансплантата или органа.

Нужная доза может для удобства присутствовать в одной дозе или в раздельных дозах, вводимых с соответствующими интервалами, например, два, три, четыре или больше раз в сутки. Сама субдоза также может быть разделена, например, на ряд отдельных свободных введений, таких как несколько ингаляций из инсуффлятора или внесение нескольких капель в глаза.

Схема введения может включать длительное ежедневное лечение. «Длительное» означает, по меньшей мере, две недели, и предпочтительно, продолжительностью в несколько недель, месяцев или лет. Необходимые модификации в указанном дозировочном интервале может определить рядовой специалист в данной области техники с использованием только обычных экспериментов, приведенных в указаниях в данном описании. См. Remington's Parmaceutical Sciences (Martin E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Дозировку также может отрегулировать отдельный врач в случае любого осложнения.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению можно вообще использовать для блокировки взаимодействия белка F hRSV с хозяйской клеткой-мишенью и/или ее мембраной, для нейтрализации hRSV (различных штаммов hRSV и/или «ускользнувших» мутантов), для модуляции, ингибирования и/или предотвращения инфективности hRSV (различных штаммов hRSV и/или «ускользнувших» мутантов), для модуляции, ингибирования и/или предотвращения слияния (различных штаммов hRSV и/или «ускользнувших» мутантов) с хозяйской клеткой-мишенью (ее клеточной мембраной) и/или для модуляции, ингибирования и/или предотвращения проникновения hRSV (различных штаммов hRSV и/или «ускользнувших» мутантов) в хозяйскую клетку-мишень.

В одном аспекте аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению могут блокировать взаимодействие белка F hRSV с хозяйской клеткой-мишенью и/или ее мембраной, по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с взаимодействием белка F hRSV с хозяйской клеткой-мишенью и/или ее мембраной в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению, при измерении любым подходящим способом, известным per se, например, с использованием одного из анализов, описанных в данном описании.

В другом аспекте аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению нейтрализуют инфективность hRSV, по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с нейтрализацией hRSV в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению, при измерении любым подходящим способом, известным per se, например, с использованием одного из анализов, описанных в данном описании.

В контексте настоящего изобретения «модуляция» или «модулировать» вообще означают или уменьшение или предупреждение или ингибирование инфективности вируса, слияния и/или проникновения вируса, и/или уменьшение или предупреждение или ингибирование биологических путей, которые опосредуются белком F hRSV, при измерении с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (таких, какие упомянуты в данном описании). В частности, «модуляция» или «модулировать» могут означать любое уменьшение, предупреждение или ингибирование инфективности вируса, слияния и/или проникновения вируса, и/или уменьшение или предупреждение или ингибирование биологических путей, которые опосредуются белком F hRSV, при измерении с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (таких, какие упомянуты в данном описании), по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% иди, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с нормальными (т.е. встречающимися в природе) инфективностью вируса, слиянием и/или проникновением вируса и/или нормальными (т.е. встречающимися в природе) биологическими путями, которые опосредуются белком F hRSV, в том же анализе в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению,

В одном аспекте аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению могут модулировать, ингибировать и/или предупреждать инфективность hRSV, по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с инфективностью в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела® или полипептида по изобретению, при измерении любым подходящим способом, известным per se, например, с использованием одного из анализов, описанных в данном описании.

Термин «проникновение вируса», используемый в данном описании, охватывает любой опосредуемый вирусом путь, который необходим для выполнения присоединения вириона к хозяйской клетке-мишени и/или слияния вируса с хозяйской клеткой-мишенью. В настоящем изобретении это заключается в том, что проникновение вируса в хозяйскую клетку-мишень, которое может представлять собой любой опосредуемый вирусом путь, который необходим для выполнения присоединения вириона к хозяйской клетке-мишени и/или слияния вируса с хозяйской клеткой-мишенью, может быть модулирован и/или уменьшен и/или предотвращен и/или ингибирован путем специфического связывания аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и/или соединений по изобретению, при измерении с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (таких, какие упомянуты в данном описании). В частности, проникновение вируса, которое может быть опосредовано белком F hRSV, может быть модулировано, уменьшено, предупреждено или ингибировано путем специфического связывания аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и/или соединений по изобретению с белком F hRSV, при измерении с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (таких, какие упомянуты в данном описании), по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с нормальным (т.е. встречающимся в природе) проникновением вируса (как определено в данном описании), которое может быть опосредовано белком F hRSV, в том же анализе в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела®, полипептида и/или соединения по изобретению. Таким образом, также заключается, что присоединение вируса и/или слияние вируса может быть модулировано и/или уменьшено и/или предупреждено и/или ингибировано путем специфического связывания аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и/или соединений по изобретению с белком F hRSV, при измерении с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (таких, какие упомянуты в данном описании). В частности, присоединение вируса и/или слияние вируса, которое может быть опосредовано белком F hRSV, может быть модулировано, уменьшено, предупреждено или ингибировано путем специфического связывания аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов и/или соединений по изобретению с белком F hRSV, при измерении с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа или анализа in vivo (таких, какие упомянуты в данном описании), по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с нормальным (т.е. встречающимся в природе) присоединением вируса и/или слиянием вируса, которое может быть опосредовано белком F hRSV, в том же анализе в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела®, полипептида и/или соединения по изобретению.

В этом отношении аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения или композиции по настоящему изобретению могут модулировать, ингибировать и/или предотвращать проникновение hRSV в хозяйскую клетку-мишень, по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении с проникновением в хозяйскую клетку-мишень в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела®, полипептида и/или соединения по изобретению, например, при измерении с использованием одного из анализов, описанных в данном описании.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению могут модулировать, ингибировать и/или предотвращать слияние hRSV с хозяйской клеткой-мишенью (ее клеточной мембраной), по меньшей мере, на 1%, предпочтительно, по меньшей мере, на 5%, например, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 25%, например, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или 90% или больше при сравнении со слиянием hRSV с хозяйской клеткой-мишенью (ее клеточной мембраной) в тех же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела®, полипептида и/или соединения по изобретению, при измерении любым способом, известным per se, например, с использованием одного из анализов, описанных в данном описании.

Поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды по изобретению проявляют улучшенную аффинность и/или улучшенную перекрестную реактивность в отношении различных генотипов, подтипов, вирусных «ускользнувших» мутантов и/или штаммов hRSV при сравнении с моновалентной аминокислотной последовательностью или нанотелом®. В одном аспекте поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды по изобретению могут связывать различные штаммы RSV (такие как Long, A-2 и/или В-1). В еще одном аспекте поливалентные (такие как двухвалентные или трехвалентные) полипептиды по изобретению могут связывать различные «ускользнувшие» мутанты hRSV (такие, как описанные в Lopez et al., 1998, J. Virol, 72: 6922-6928) и/или «ускользнувшие» мутанты, специфические для антигенного сайта II, антигенного сайта IV-VI или комбинации обоих антигенных сайтов.

Соответственно, изобретение также относится к применению поливалентного (например, трехвалентного, двухвалентного) полипептида по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей такой полипептид, для связывания и/или нейтрализации различных штаммов hRSV. В предпочтительном аспекте используют двухвалентное гуманизированное и/или оптимизированное по последовательности нанотело® NC41 (такое как, например, двухвалентный полипептид, включающий два нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В другом предпочтительном аспекте используют трехвалентное гуманизированное и/или оптимизированное по последовательности нанотело® NC41 (такое как, например, трехвалентный полипептид, включающий три нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В другом предпочтительном аспекте используют один из SEQ ID NO: 77-79,142-145 и 158-165.

Изобретение также относится к применению поливалентного (например, трехвалентного, двухвалентного) полипептида по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей такой полипептид, для связывания и/или нейтрализации одного или нескольких «ускользнувших» мутантов hRSV. В предпочтительном аспекте используют двухвалентное гуманизированное нанотело® NC41 (такое как, например, двухвалентный полипептид, включающий два нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В другом предпочтительном аспекте используют трехвалентное гуманизированное нанотело® NC41 (такое как, например, трехвалентный полипептид, включающий три нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В другом предпочтительном аспекте используют один из SEQ ID NO: 77-79, 142-145 и 158-165.

Изобретение также относится к способу предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного вирусного заболевания, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их.

Как таковые, аминокислотные последовательности, нанотела®, полипептиды, соединения и композиции по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения и/или лечения заболеваний и расстройств, связанных с заражением hRSV. Примеры таких заболеваний и расстройств, связанных с заражением hRSV, будут ясны для специалиста на основании данного раскрытия и включают, например, следующие заболевания и расстройства: респираторную болезнь, инфекцию верхних дыхательных путей, инфекцию нижних дыхательных путей, брохиолит (воспаление мелких дыхательных путей в легких), пневмонию, одышку, кашель, (возвратный) стридор и астму.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу предупреждения и/или лечения респираторной болезни, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, брохиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (возвратного) стридора и/или астмы, вызванных hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению или композиции по изобретению.

Изобретение также относится к применению аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения респираторной болезни, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, брохиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (возвратного) стридора и/или астмы, и/или для применения в одном или нескольких способах, описанных в данном описании.

Изобретение также относится к аминокислотной последовательности по изобретению, нанотелу® по изобретению, полипептиду по изобретению, соединению или конструкции по изобретению или моновалентной конструкции по изобретению для предупреждения и/или лечения респираторной болезни, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, брохиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (возвратного) стридора и/или астмы.

В контексте настоящего изобретения термин «предупреждение и/или лечение» включает не только предупреждение и/или лечение заболевания, но также включает вообще предупреждение начала заболевания, замедление или реверсию развития заболевания, предупреждение или замедление начала одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение и/или ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение тяжести и/или длительности заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, и/или предупреждение дальнейшего повышения тяжести заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, предупреждение, уменьшение или реверсию любого физиологического повреждения, вызванного заболеванием, и вообще любое фармакологическое действие, которое благоприятно для пациента, которого лечат.

Субъект, которого лечат, может представлять собой любое теплокровное животное, но в частности, млекопитающее, и в более частном случае, человека. Как будет понятно специалисту, субъект, которого лечат, будет, в частности, представлять собой личность, страдающую от или находящуюся в опасности приобрести заболевания и расстройства, упомянутые в данном описании.

В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества поливалентного (например, трехвалентного или двухвалентного) полипептида или соединения по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их. В более частном случае настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества двухвалентного соединения или полипептида по изобретению. В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества двухвалентного гуманизированного и/или оптимизированного по последовательности нанотела® NC41 (такого как, например, двухвалентный полипептид, включающий два нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества трехвалентного соединения или полипептида по изобретению. В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества трехвалентного гуманизированного нанотела® NC41 (такого как, например, трехвалентный полипептид, включающий три нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества одного из SEQ ID NO: 77-79,142-145 и 158-165.

В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их.

В другом аспекте изобретение относится к способу иммунотерапии, и в частности, пассивной иммунотерапии, включающему введение субъекту, страдающему от или находящемуся в опасности приобрести заболевания и расстройства, упомянутые в данном описании, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их.

В вышеуказанных способах аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептиды по изобретению и/или композиции, включающие их, можно вводить любым подходящим способом, в зависимости от используемых конкретного фармацевтического препарата или композиции. Таким образом, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептиды по изобретению и/или композиции, включающие их, можно вводить, например, перорально, интраперитонеально (например, внутривенно, подкожно, внутримышечно или любым другим путем введения, который обходит желудочно-кишечный тракт), интраназально, трансдермально, местно, с помощью суппозитория, ингаляцией, вновь в зависимости от используемых конкретного фармацевтического препарата или композиции. Практикующий врач сможет выбрать подходящий путь введения и подходящий фармацевтический препарат или композицию для использования в таком введении, в зависимости от заболевания или расстройства, от которого предохраняют или лечат, и других факторов, хорошо известных врачу.

Таким образом, как правило, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептиды по изобретению и/или композиции, включающие их, можно вводить любым подходящим способом, например, но без ограничения, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и полипептиды по изобретению и композиции, включающие их, можно вводить интраназально и/или путем ингаляции и/или другой подходящей формы доставки в легкие; способы доставки в легкие и/или интраназальной доставки и/или доставки ингаляцией нанотела®, аминокислотной последовательности, соединения или конструкции и/или полипептида по изобретению будут известны специалисту и описаны, например, в руководстве «Drug Delivery: Principles and Applications» (2005), Binghe Wang, Teruna Siahaan and Richard Soltero (Eds. Wiley Interscience (John Wiley & Sons)); в заявке, поданной в Международное патентное ведомство WO 08/049897, Ablynx N.V., озаглавленной «Интраназальная доставка полипептидов и белков»; в «Pharmacology PreTest™ Self-Assessment and Review» (11^th Edition), Rosenfeld G.C., Loose-Mitchell D.S.; и в «Pharmacology» (3^rd Edition), Lippincott Williams & Wilkins, New York; Shiafer M. McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York; Yang K.Y., Graff L.R., Caughey A.B. Blueprints Pharmacology, Blackwell Publishing.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу введения эффективного количества аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептида по изобретению и/или композиции, включающей их, включающему стадию введения аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептида и/или композиции, включающей их, в легочную ткань. В таком способе аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или конструкцию и/или полипептид и/или композицию, включающую их, можно вводить любым способом, известным в технике для доставки в легкие, таким как, например, путем использования ингалятора или устройства для интраназальной доставки или аэрозоля.

В предпочтительном аспекте изобретения аминокислотная последовательность, нанотело®, соединение или конструкция и/или полипептид будет связывать и/или нейтрализовать вирус, присутствующий в легочной ткани. Предпочтительно в таком способе для доставки в легкие, по меньшей мере, 5%, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, предпочтительнее, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, и даже предпочтительнее, по меньшей мере, 80% или больше аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептида по изобретению устойчивы в легочной ткани в течение, по меньшей мере, 24 часов, предпочтительно, по меньшей мере, 48 часов, предпочтительнее, по меньшей мере, 72 часов.

Неожиданно обнаружено, что аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептиды по изобретению имеют длительную стабильность в легочной ткани. Например, обнаружено, что нанотело®, направленное против hRSV, остается функциональным в легком в течение, по меньшей мере, 48 часов (см. РСТ7ЕР2009/056975, озаглавленную «Аминокислотные последовательности, направленные против оболочечных белков вируса, и включающие их полипептиды для лечения вирусных заболеваний», зарегистрированную Ablynx N.V. 5 июня 2009). Таким образом, в воплощениях изобретения указывается, что интервалы при лечении, такие как один раз в сутки, один раз каждые 2-е, 3-и, 4-е, 5-е, 6-е сутки или один раз каждую неделю, возможно принять за оцененную длительную стабильность аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или конструкций и/или полипептидов по изобретению.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу доставки аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептида по изобретению в легочную ткань субъекта без их инактивации, причем указанный способ включает стадию введения в легкое указанного субъекта указанных аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептида по изобретению.

Изобретение также относится к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их.

В более частном случае изобретение относится к способу предупреждения и/или лечения респираторной болезни, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, брохиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (возвратного) стридора и/или астмы, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности по изобретению, нанотела® по изобретению, полипептида по изобретению, соединения или конструкции по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их.

В более частном случае настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества поливалентного (например, трехвалентного или двухвалентного) полипептида или соединения по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их. В более частном случае настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества двухвалентного соединения или полипептида по изобретению. В более частном случае настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества двухвалентного гуманизированного нанотела® NC41 (такого как, например, двухвалентный полипептид, включающий два нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В более частном случае настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества трехвалентного соединения или полипептида по изобретению. В более частном случае настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества трехвалентного гуманизированного нанотела® NC41 (такого как, например, трехвалентный полипептид, включающий три нанотела®, выбранные из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157). В более частном случае, настоящее изобретение может относиться к способу предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества одного из SEQ ID NO: 77-79,142-145 и 158-165.

Также, например, но без ограничения указанным, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и полипептиды по изобретению и композиции, включающие их, можно вводить внутримышечно и/или с помощью любой подходящей формы доставки в головной мозг, такой как любая подходящая форма доставки, которая позволяет аминокислотным последовательностям, нанотелам®, полипептидам, соединениям или конструкциям и композициям, включающим их, проходить через гематоэнцефалический барьер. Такие способы внутримышечной доставки и/или любой подходящей формы доставки в головной мозг нанотела®, аминокислотной последовательности и/или полипептида по изобретению будут известны специалисту и описаны, например, в руководстве «Drug Delivery: Principles and Applications" (2005), Binghe Wang, Teruna Siahaan and Richard Soltero (Eds. Wiley Interscience (John Wiley & Sons)); в «Pharmacology PreTest™ Self-Assessment and Review» (11^th Edition), Rosenfeld G.C., Loose-Mitchell D.S.; и в «Pharmacology» (3^rd Edition), Lippincott Williams & Wilkins, New York; Shiafer M. McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York; Yang K.Y., Graff L.R., Caughey A.B. Blueprints Pharmacology, Blackwell Publishing.

Аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и/или полипептиды по изобретению и/или композиции, включающие их, вводят согласно схеме лечения, которая подходит для предупреждения и/или лечения заболевания или расстройства, от которого предупреждают или лечат. Практикующий врач вообще сможет определить подходящую схему лечения в зависимости от таких факторов, как заболевание или расстройство, от которого предупреждают или лечат, тяжесть заболевания, от которого лечат и/или тяжесть его симптомов, конкретные используемые аминокислотная последовательность, нанотело®, соединение или конструкция или полипептид по изобретению, конкретный способ введения и используемый фармацевтический препарат или композиция, возраст, пол, масса, питание, общее состояние пациента, и подобных факторов, хорошо известных практикующему врачу.

Вообще схема лечения будет включать введение одной или нескольких аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или конструкций и/или полипептидов по изобретению или одной или нескольких композиций, включающих их, в одном или нескольких фармацевтически эффективных количествах или дозах. Конкретное(ые) вводимое(ые) количество(а) или дозы может определить практикующий врач вновь па основании факторов, перечисленных выше.

Вообще для предупреждения и/или лечения заболеваний и расстройств, упомянутых в данном описании, и в зависимости от конкретного заболевания или расстройства, от которого лечат, активности конкретных используемых аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и полипептида по изобретению, конкретного способа введения и используемого фармацевтического препарата или композиции, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и полипептиды по изобретению вообще будут вводиться в количестве 1 грамм-1 микрограмм на кг массы тела в сутки, предпочтительно, 0,1 грамма-10 микрограммов на кг массы тела в сутки, наиболее предпочтительно, 0,01 грамма-100 микрограммов на кг массы тела в сутки, например, примерно 0,1, 0,5, 1, 2, 5 или 10 миллиграммов на кг массы тела в сутки, или непрерывно (например, инфузией), или в виде однократной дозы или в виде нескольких раздельных доз в течение дня. Аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и полипептиды по изобретению, которые содержат частицу, удлиняющую время полужизни, можно вводить в количестве от 1 миллиграмма до 100 миллиграммов на кг массы тела в сутки, предпочтительно, от 1 миллиграмма до 50 миллиграммов на кг массы тела в сутки, например, примерно 10, 15, 20 или 30 миллиграммов на кг массы тела в сутки один или два раза в месяц. Практикующий врач вообще сможет определить подходящую суточную дозу в зависимости от факторов, упомянутых в данном описании. Также будет понятно, что в конкретных случаях практикующий врач может отступить от указанных количеств, например, на основании факторов, перечисленных выше, и собственного мнения. Вообще некоторым руководством по вводимым количествам могут быть обычно вводимые количества сравнимых обычных антител или фрагментов антител против той же мишени, вводимые, по существу, тем же способом, однако, с учетом различий в аффинности/авидности, эффективности, биораспределения, времени полужизни и подобных факторов, хорошо известных специалисту.

Когда аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или конструкцию и/или полипептид и/или композицию, включающую их, вводят в легочную ткань, схема лечения может представлять собой введение один или два раза ежедневно, предпочтительно, один раз ежедневно, или один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней.

Как правило, в описанном выше способе будут использовать единственную аминокислотную последовательность, нанотело®, соединение или конструкцию или полипептид по изобретению. Однако в объем изобретения входит использование в комбинации двух или больше аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или конструкций и/или полипептидов по изобретению.

Нанотела®, аминокислотные последовательности, соединения или конструкции и полипептиды по изобретению также можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями или элементами, т.е. в виде схемы комбинированного лечения, которая может, или не может, привести к синергическому эффекту. Вновь практикующий врач сможет выбрать такие другие соединения или элементы, а также подходящую схему комбинированного лечения на основании факторов, перечисленных выше, и своего мнения.

В частности, аминокислотные последовательности, нанотела®, соединения или конструкции и полипептиды по изобретению можно использовать в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или элементами, которые могут быть использованы для предупреждения и/или лечения заболеваний и расстройств, перечисленных выше, в результате чего можно получить синергический эффект или не получить. Примеры таких соединений и элементов, а также путей, способов и фармацевтических препаратов или композиций для их введения будут ясны для практикующего врача.

Когда как часть комбинированной схемы лечения необходимо использовать два или больше веществ или элементов, их можно вводить одним и тем же способом введения или различными способами введения, по существу, в одно и то же время или в различные моменты времени (например, по существу, одновременно, последовательно или согласно альтернативной схеме). Когда вещества или элементы следует вводить одновременно одним и тем же путем введения, их можно вводить в виде различных фармацевтических препаратов или композиций или в виде части комбинированного фармацевтического препарата или композиции, что будет понятно специалисту.

Также, когда два или больше активных веществ или элементов должны использоваться как часть комбинированной схемы лечения, каждое из веществ или элементов можно вводить в том же количестве и согласно той же схеме, какие используют, когда активное вещество или элемент используют самостоятельно, и такое комбинированное использование может, или не может, привести к синергическому эффекту. Однако, когда комбинированное использование двух или больше активных веществ или элементов ведет к синергическому эффекту, также может оказаться возможным уменьшение количества одного, нескольких или всех вводимых веществ или элементов, причем в то же время все еще достигается нужное терапевтическое действие. Это можно применить, например, для ослабления, ограничения или уменьшения нежелательного побочного действия, которое ассоциируется с использованием одного или нескольких веществ или элементов, когда их используют в их обычных количествах, причем в то же время все еще получают нужный фармацевтический или терапевтический эффект.

Эффективность схемы лечения, используемой согласно изобретению, можно определить и/или следовать ей любым способом, известным per se для соответствующего заболевания или расстройства, что будет понятно практикующему врачу. Практикующий врач также сможет, на соответствующей и практической основе, изменить или модифицировать определенную схему лечения с тем, чтобы добиться нужного терапевтического эффекта, избежать, ограничить или уменьшить нежелательное побочное действие и/или добиться соответствующего баланса между достижением нужного терапевтического эффекта, с одной стороны, и избегания, ограничения или уменьшения нежелательного побочного действия, с другой стороны.

Вообще схеме лечения можно будет следовать до тех пор, пока достигается нужный терапевтический эффект, и/или так долго, пока нужный терапевтический эффект должен сохраняться. Вновь это может определить практикующий врач.

В другом аспекте изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции или полипептида по изобретению при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного вирусного заболевания и/или для применения а одном или нескольких способах лечения, упомянутых в данном описании.

Изобретение также относится к применению аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции или полипептида по изобретению при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или расстройства, которое можно предупредить и/или лечить путем введения пациенту аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции или полипептида по изобретению.

В более частном случае изобретение относится к применению аминокислотной последовательности, нанотела®, соединения или конструкции или полипептида по изобретению при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения вирусных заболеваний, и в частности, для предупреждения и лечения одного или нескольких заболеваний и расстройств, перечисленных в данном описании.

Вновь в такой фармацевтической композиции одну или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел®, соединений или конструкций или полипептидов по изобретению также можно соответственно объединить с одним или несколькими другими активными элементами, такими как упомянутые выше.

Другие применения аминокислотных последовательностей, нанотел®, полипептидов, нуклеиновых кислот, генетических конструкций и хозяев или клеток-хозяев по изобретению будут ясны для специалиста на основании данного раскрытия. Например, и без ограничения, аминокислотные последовательности по изобретению можно соединить с подходящим носителем или твердой основой с тем, чтобы получить среду, которую можно использовать способом, известным per se, для выделения в чистом виде белка оболочки вируса из композиций и препаратов, включающих его. Производные аминокислотных последовательностей по изобретению, которые включают подходящую детектируемую метку, также можно использовать в качестве маркеров для определения (качественного или количественного) присутствия белка оболочки вируса в композиции или препарате или в качестве маркера для селективной детекции присутствия белка оболочки вируса на поверхности клетки или ткани (например, в комбинации с подходящими методами клеточного сортинга).

Теперь изобретение будет описываться далее с помощью следующих неограничительных аспектов, примеров и фигур.

Все ссылки (включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные заявки на патент и одновременно рассматриваемые заявки на патент), цитированные в данном описании, включены в него в качестве ссылок.

Аспекты

Аспект А-1. Аминокислотные последовательности, которые направлены против и/или специфически связывают белок F hRSV, и которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO:102;

Аспект А-2. Аминокислотная последовательность согласно аспекту А-1, которая включает два или больше тяжей из аминокислотных остатков, один тяж из которых выбран из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121 и

Аспект А-3. Аминокислотная последовательность согласно аспекту А-1 или А-2, которая включает три или больше тяжей из аминокислотных остатков, первый тяж из которых выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

второй тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

и третий тяж из аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аспект А-4. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-3, которая специфически связывает антигенный сайт II на белке F hRSV, и/или которая конкурирует с Синагисом® за связывание с белком F hRSV.

Аспект А-5. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-4, которая представляет собой аминокислотную последовательность, встречающуюся в природе (от любого подходящего вида), или синтетическую или полусинтетическую аминокислотную последовательность.

Аспект А-6. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-5, которая включает иммуноглобулиновую складку или которая в подходящих условиях способна образовывать иммуноглобулиновую складку.

Аспект А-7. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-6, которая представляет собой иммуноглобулиновую последовательность.

Аспект А-8. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-7, которая представляет собой иммуноглобулиновую последовательность, встречающуюся в природе (от любого подходящего вида), или синтетическую или полусинтетическую иммуноглобулиновую последовательность.

Аспект А-9. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-8, которая представляет собой гуманизированную иммуноглобулиновую последовательность, камелизированную иммуноглобулиновую последовательность или иммуноглобулиновую последовательность, которая получена такими методами, как созревание аффинности.

Аспект А-10. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-9, которая, по существу, состоит из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (например, V_H-последовательности).

Аспект А-11. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-10, которая, по существу, состоит из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, полученной из обычного четырехцепочечного антитела, или которая, по существу, состоит из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, полученной из тяжелоцепочечного антитела.

Аспект А-12. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-11, которая, по существу, состоит из доменного антитела (или аминокислотной последовательности, которая подходит для использования в качестве доменного антитела), из однодоменного антитела (или аминокислотной последовательности, которая подходит для использования в качестве однодоменного антитела), из «dAb» (или аминокислотной последовательности, которая подходит для использования в качестве dAb) или нанотела® (включая, но не ограничиваясь указанным, V_HH-последовательность).

Аспект А-13. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-12, которая, по существу, состоит из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102;

Аспект А-14. Аминокислотная последовательность согласно аспекту А-13, которая, по существу, состоит из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых CDR2 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 102 или

и, по меньшей мере, один из CDR1 или CDR3 выбран из

- CDR1, выбранного из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 98;

и/или

- CDR3, выбранного из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аспект А-15. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-13 или А-14, которая состоит из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1-CDR3, соответственно), из которых

- CDR1 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

- CDR3 выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аспект А-16. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-15, которая включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

Аспект А-17. Аминокислотная последовательность согласно аспекту А-16, которая включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

a) SEQ ID NO: 98;

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект А-18. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-16 или А-17, которая включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и последовательность CDR1, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98 и

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

и последовательность CDR3, выбранную из

c) SEQ ID NO: 121 и

Аспект А-19. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-16-А-18, которая включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121.

Аспект А-20. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-16-А-19, которая включает SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Аспект А-21. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-20, которая, по существу, состоит из нанотела®, которое

a) имеет, по меньшей мере, 80% идентичность по аминокислотам с, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157, где для целей определения степени идентичности по аминокислотам аминокислотные остатки из последовательности CDR не принимают во внимание;

и в которой

b) предпочтительно, один или несколько аминокислотных остатков в позициях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 согласно нумерации по Кабату выбраны из характерных остатков, упомянутых в таблице А-3-таблице А-8 WO 08/020079.

Аспект А-22. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-21, которая, по существу, состоит из гуманизированного нанотела®.

Аспект А-23. Аминокислотная последовательность согласно аспекту 22, которая, по существу, состоит из гуманизированного нанотела®, которое может связываться (как определено далее в данном описании) с белком F hRSV, и которое

i) представляет собой гуманизированный вариант аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 (см. таблицу А-1); и/или

ii) имеет, по меньшей мере, 80% идентичность по аминокислотам с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 (см. таблицу А-1) и/или с, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157 (см. таблицу А-4), где для целей определения степени идентичности по аминокислотам аминокислотные остатки из последовательности CDR не принимают во внимание;

и в которой

in) предпочтительно, один или несколько аминокислотных остатков в позициях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 согласно нумерации по Кабату выбраны из характерных остатков, упомянутых в таблице А-3-таблице А-8 WO 08/020079.

Аспект А-24. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-23, которая, по существу, находится в изолированной форме.

Аспект А-25. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-24 для введения субъекту, при этом указанная аминокислотная последовательность у указанного субъекта в природе не встречается.

Аспект А-26. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-25, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект А-27. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-26, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ M^-1.c^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект А-28. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-27, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект А-29. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-28, которая может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Аспект В-1. Нанотело®, которое направлено против и/или которое специфически связывает белок F hRSV, в котором CDR2 выбран из

a) SEQ ID NO: 102;

И) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект В-2. Нанотело® согласно аспекту В-1, в котором CDR2 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 102 или

и, по меньшей мере, один из CDR1 или CDR3 выбран из

- CDR1, выбранного из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 98;

и/или

- CDR3, выбранного из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аспект В-3. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1 или В-2, в котором

- CDR1 выбран из группы, состоящей из

a) SEQ ID NO: 98;

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

- CDR3 выбран из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

Аспект В-4. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-3, которое включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

Аспект В-5. Нанотело® согласно аспекту В-4, которое включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, одну последовательность CDR, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98;

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект В-6. Нанотело® согласно любому из аспектов В-4 или В-5, которое включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и последовательность CDR1, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98 и

и последовательность CDR3, выбранную из

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект В-7. Нанотело® согласно любому из аспектов В-4-В-6, которое включает, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, одну последовательность CDR, выбранную из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121.

Аспект В-8. Нанотело® согласно любому из аспектов В-4-В-7, которое включает SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Аспект В-9. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-8, которое, по существу, находится в изолированной форме.

Аспект В-10. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-9, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект В-11. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-10, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ M^-1.c^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с-¹, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект В-12. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-11, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2, несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект В-13. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-12, которое может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Аспект В-14. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-13, которое представляет собой нанотело®, встречающееся в природе (от любого подходящего вида), или синтетическое или полусинтетическое нанотело®.

Аспект В-15. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-14, которое представляет собой V_HH-последовательность, частично гуманизированную V_HH-последовательность, полностью гуманизированную V_HH-последовательность, камелизированный вариабельный домен тяжелой цепи или нанотело®, которое получено такими методами, как созревание аффинности.

Аспект В-16. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-15, которое представляет собой частично гуманизированное нанотело®.

Аспект В-17. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-16, которое представляет собой полностью гуманизированное нанотело®.

Аспект В-18. Нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-17, которое, по существу, состоит из гуманизированного нанотела®, которое может связываться (как описано в данном описании далее) с белком F hRSV, и которое

и) имеет, по меньшей мере, 80% идентичность по аминокислотам с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 (см. таблицу А-1) и/или с, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157 (см. таблицу А-4), где для целей определения степени идентичности по аминокислотам аминокислотные остатки из последовательности CDR не принимают во внимание;

и в котором

ii) предпочтительно, один или несколько аминокислотных остатков в позициях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 согласно нумерации по Кабату выбраны из характерных остатков, упомянутых в таблице А-3-таблице А-8 WO 08/020079.

Аспект С-1. Аминокислотная последовательность, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект С-2. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-1, которая включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект С-3. Аминокислотная последовательность, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65,67, 68, 75 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект С-4. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-3, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68,75 и 76;

Аспект С-5. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-3 или С-4,которая включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68,75 и 76,

Аспект С-6. Аминокислотная последовательность, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект С-7. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-6, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект С-8. Аминокислотная последовательность, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

Аспект С-9. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-8, которая включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект С-10. Аминокислотная последовательность, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект С-11. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-10, которая выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект С-12. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-10 или С-11, которая включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Аспект С-13. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-14. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-13, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы два или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln,

Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-15. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-14, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы три или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-16. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-15, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы четыре или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-17. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-16, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы пять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-18. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-17, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы шесть или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-19. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-18, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы семь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-20. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-19, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы восемь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-21. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-20, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы девять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-22. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-21, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы десять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект C-23. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-22, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект С-24. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-13, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект С-25. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-13, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект С-26. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-25, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект С-27. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект С-28. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект С-29. Аминокислотная последовательность согласно аспекту С-8, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект С-30. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 62.

Аспект С-31. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 65.

Аспект С-32. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 76.

Аспект С-33. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из любой из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект С-34. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-1-С-33, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект С-3 5. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-1-С-34, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект С-3 6. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-1-С-3 5, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект С-37. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-1-С-36, которая может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Аспект С-38. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов С-1-С-37, которая специфически связывает антигенный сайт II на белке F hRSV и/или которая конкурирует с Синагисом® за связывание с белком F hRSV.

Аспект D-1. Нанотело®, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

Аспект D-2. Нанотело® согласно аспекту D-1, которое включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект D-3. Нанотело®, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект D-4. Нанотело® согласно аспекту D-3, которое выбрано из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект D-5. Нанотело® согласно любому из аспектов D-3 или D-4, которое включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект D-6. Нанотело®, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект D-7. Нанотело® согласно аспекту D-6, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект D-8. Нанотело®, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

Аспект D-9. Нанотело согласно аспекту D-8, которое включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект D-10. Нанотело, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект D-11. Нанотело согласно аспекту D-10, которое выбрано из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект D-12. Нанотело согласно любому из аспектов D-10 или D-11, которое включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Аспект D-13. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO:

5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-14. Нанотело® согласно аспекту D-13, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы два или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-15. Нанотело® согласно аспекту D-14, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы три или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-16. Нанотело® согласно аспекту D-15, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы четыре или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-17. Нанотело® согласно аспекту D-16, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы пять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-18. Нанотело® согласно аспекту D-17, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы шесть или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-19. Нанотело® согласно аспекту D-18, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы семь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-20. Нанотело® согласно аспекту D-19, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы восемь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-21. Нанотело® согласно аспекту D-20, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы девять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-22. Нанотело® согласно аспекту D-21, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы десять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-23. Нанотело® согласно аспекту D-22, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект D-24. Нанотело® согласно аспекту D-13, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект D-25. Нанотело® согласно аспекту D-8, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект D-26. Нанотело® согласно аспекту D-20, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект D-27. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект D-28. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект D-29. Нанотело® согласно аспекту D-13, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg. Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект D-30. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 62.

Аспект D-31. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 65.

Аспект D-32. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 76.

Аспект D-33. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из любой из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект D-34. Нанотело® согласно любому из аспектов D-1- D-33, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект D-35. Нанотело® согласно любому из аспектов D-1-D-34, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект D-36. Нанотело® согласно любому из аспектов D-l - D-35, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект D-37. Нанотело® согласно любому из аспектов D-1-D-36, которое может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Аспект D-38. Нанотело® согласно любому из аспектов D-1-D-37, которое специфически связывает антигенный сайт II на белке F hRSV и/или которое конкурирует с Синагисом® за связывание с белком F hRSV.

Аспект W-1. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29 и С-1-С-18, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, при этом аминокислотная последовательность имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату).

Аспект W-2. Аминокислотная последовательность, которая направлена против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранная из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

Аспект W-3. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-2, которая включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект W-4. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-5. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-6. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-7. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-8. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-9. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-10. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-11. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-12. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-13. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-12, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы два или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-14. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-13, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы три или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-15. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-14, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы четыре или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-16. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-15, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы пять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-17. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-16, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы шесть или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-18. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-17, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы семь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-19. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-18, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы восемь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-20. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-19, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы девять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-21. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-20, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы десять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-22. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-21, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-23. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-12, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-24. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-12, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-25. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-24, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-26. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-27. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект W-28. Аминокислотная последовательность согласно аспекту W-2 или W-3, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект W-29. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 138.

Аспект W-30. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 139.

Аспект W-31. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 140.

Аспект W-32. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из SEQ ID NO: 141.

Аспект W-33. Аминокислотная последовательность, включающая или, по существу, состоящая из любой из SEQ ID NO: 154-157.

Аспект W-34. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов W-1-W-33, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект W-35. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов W-1-W-34, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект W-36. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов W-1-W-35, которая может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект W-37. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов W-1-W-36, которая может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Аспект W-38. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов W-1-W-37, которая специфически связывает антигенный сайт II на белке F hRSV и/или которая конкурирует с Синагисом® за связывание с белком F hRSV.

Аспект Х-1. Нанотело, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, согласно любому из аспектов В-1-В-18 и D-1-D-38, при этом нанотело имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 1 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату).

Аспект Х-2. Нанотело®, которое направлено против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранное из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

Аспект Х-3. Нанотело® согласно аспекту Х-2, которое включает или, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект Х-4. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-5. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-6. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-7. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-8. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-9. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-10. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-11. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-12. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Alal4Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-13. Нанотело® согласно аспекту Х-12, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы два или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Alal4Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-14. Нанотело® согласно аспекту Х-13, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы три или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-15. Нанотело® согласно аспекту Х-14, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы четыре или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-16. Нанотело® согласно аспекту Х-15, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы пять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-17. Нанотело® согласно аспекту Х-16, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы шесть или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-18. Нанотело® согласно аспекту Х-17, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы семь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-19. Нанотело® согласно аспекту Х-18, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы восемь или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-20. Нанотело® согласно аспекту Х-19, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы девять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-21. Нанотело® согласно аспекту Х-20, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутировапы десять или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-22. Нанотело® согласно аспекту Х-21, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-23. Нанотело® согласно аспекту Х-12, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-24. Нанотело® согласно аспекту Х-12, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-25. Нанотело® согласно аспекту Х-24, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-26. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-27. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или больше аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu. Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Х-28. Нанотело® согласно аспекту Х-2, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Х-29. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 138.

Аспект Х-30. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 139.

Аспект Х-31. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 140.

Аспект Х-32. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из SEQ ID NO: 141.

Аспект Х-33. Нанотело®, включающее или, по существу, состоящее из любой из SEQ ID NO: 154-157.

Аспект Х-34. Нанотело® согласно любому из аспектов Х-1-Х-33, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект Х-35. Нанотело® согласно любому из аспектов Х-1-Х-34, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект Х-36. Нанотело® согласно любому из аспектов Х-1-Х-35, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 c^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 c^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект Х-37. Нанотело® согласно любому из аспектов Х-1-Х-36, которое может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 100 нМ до 1000 нМ, предпочтительно, от 100 нМ до 500 нМ или меньше.

Аспект Х-38. Нанотело® согласно любому из аспектов Х-1-Х-37, которое специфически связывает антигенный сайт II на белке F hRSV и/или которое конкурирует с Синагисом® за связывание с белком F hRSV.

Аспект Е-1. Полипептид, который включает или, по существу, состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 и/или одного или нескольких нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, и, необязательно, также включает одну или несколько других аминокислотных связывающих единиц, необязательно соединенных через один или несколько пептидных линкеров.

Аспект Е-2. Полипептид согласно аспекту Е-1, в котором указанные одна несколько других связывающих единиц представляют собой иммуноглобулиновые последовательности.

Аспект Е-3. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1 или Е-2, в котором указанные одна несколько других связывающих единиц выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®.

Аспект Е-4. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-3, в котором указанные одна несколько аминокислотных последовательностей представляют собой иммуноглобулиновые последовательности.

Аспект Е-5. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-4, в котором указанные одна несколько аминокислотных последовательностей выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®.

Аспект Е-6. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-5, который включает или, по существу, состоит из одного или нескольких нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, и в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц представляют собой нанотела®.

Аспект Е-7. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-6, который представляет собой поливалентную конструкцию.

Аспект Е-8. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-7, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей согласно любому из аспектов А-1-А-29 и С-1-С-38 и/или нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18 и D-1-D-38 и/или, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов W-1-W-38 и/или, по меньшей мере, одного нанотела® согласно любому из аспектов Х-1-Х-38.

Аспект Е-9. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-8, в котором указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-10. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

Аспект Е-11. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-10, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121 и

Аспект Е-12. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7 - Е-11, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 98;

b) тяж из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

второй тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

и третий тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

e)SEQ ID NO:121;

Аспект Е-13. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-12, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

Аспект Е-14. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-13, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO:

102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

a) SEQ ID NO: 98;

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-15. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-14, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и последовательность CDR1, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98;

и последовательность CDR3, выбранную из

c) SEQ ID NO: 121;

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-16. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-15, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-17. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-16, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-18. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-17, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-19. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

b) аминокислотные последовательности, которые имеют не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с одной из SEQ ID NO: 60-76, при условии, что

i) аминокислотная последовательность имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанная позиция определена согласно нумерации по Кабату) и

Аспект Е-20. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-19, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-21. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-20, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект Е-22. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

i) аминокислотная последовательность имеет глутамип (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78 и/или аргинин (Arg, R) в позиции 83 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-23. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-22, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект Е-24. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-22 или Е-23, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-25. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-24, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект Е-26. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект Е-27. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-26, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект Е-28. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-26 или Е-27, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-29. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-28, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 65 и 76.

Аспект Е-30. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

Аспект Е-31. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-30, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-32. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-31, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект Е-33. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-34. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-33, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-35. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-33 или Е-34, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-36. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-35, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 и 153.

Аспект Е-37. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

Аспект Е-38. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-37, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект Е-39. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-37, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-40. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-37, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-41. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-40, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-42. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект Е-43. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект Е-44. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-37, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-45. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-7, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 и/или нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38.

Аспект Е-46. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-45, в котором указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-47. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

Аспект Е-48. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

e) SEQ ID NO: 121; и

Аспект Е-49. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 98; и

второй тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102 и

и третий тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121 и

Аспект Е-50. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45-Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

Аспект Е-51. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45-Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

a) SEQ ID NO: 98;

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-52. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45-Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и последовательность CDR1, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98 и

и последовательность CDR3, выбранную из

c) SEQ ID NO: 121 и

Аспект Е-53. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45-Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-54. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45-Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-55. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-47-Е-53, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-56. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

Аспект Е-57. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-56, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-58. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-57, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект Е-59. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект Е-60. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-59, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект Е-61. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-59 или Е-60, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-62. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-61, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект Е-63. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-64. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-63, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-65. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-63 или Е-64, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-66. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-65, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 65 и 76.

Аспект Е-67. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

1) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-68. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-67, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-69. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-68, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект Е-70. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-45 или Е-46, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-71. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-70, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-72. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-70 или Е-71, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-73. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-72, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 и 153.

Аспект Е-74. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

Аспект Е-75. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-74, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект Е-76. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-74, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-77. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-74, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-78. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-77, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-79. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект Е-80. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект Е-81. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-74, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln. Аспект Е-82. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-7-Е-9,

включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной

последовательности и/или нанотела®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

Аспект Е-83. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-82, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект Е-84. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-85. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту,

Аспект Е-86. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-87. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-88. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-89. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-90, Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-91. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-92. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-93. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-92, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-94. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-92, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нан отела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-95, Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-92, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-96. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-95, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-97. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-98. Поливалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена па аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-99. Поливалентный полипептид согласно аспекту Е-92, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-100. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-7, который включает или, по существу, состоит из двух аминокислотных последовательностей согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 и/или нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38.

Аспект Е-101. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-100, в котором указанные две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-102. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

Аспект Е-103. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121 и

Аспект Е-104. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 98;

второй тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102;

и третий тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121;

f) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-105. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

Аспект Е-106. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

a) SEQ ID NO: 98;

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-107. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO:

102 и последовательность CDR1, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98 и

и последовательность CDR3, выбранную из

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-108. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-109. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-110. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-102 - Е-109, при этом указанные, по меньшей мере, две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-111. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

Аспект Е-112. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-111, при этом указанные две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-113. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-112, который включает или, по существу, состоит из двух идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект Е-114. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект Е-115. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-114, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68,75 и 76;

Аспект Е-116. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-114 или Е-115, при этом указанные две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-117. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-116, который включает или, по существу, состоит из двух идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект Е-118. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект Е-119. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-118, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект Е-120. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-118 или Е-119, при этом указанные две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-121. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-120, который включает или, по существу, состоит из двух идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 65 и 76.

Аспект Е-122. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

Аспект Е-123. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-122, при этом указанные две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-124. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-123, который включает или, по существу, состоит из двух идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект Е-125. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-126. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-125, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, Е) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-127. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-125 или Е-126, при этом указанные две аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-128. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-127, который включает или, по существу, состоит из двух идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 и 153.

Аспект Е-129. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

Аспект Е-130. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-129, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект Е-131. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-129, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-132. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-129, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-133. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-132, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-134. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект Е-135. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект Е-13 6. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-129, включающий или, по существу, состоящий из двух аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-13 7. Двухвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-100 или Е-101, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

Аспект Е-138. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-13 7, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект Е-139. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-140. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-141. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-142. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-143. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-144. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-145. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-146. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-147. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-148. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-147, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-149. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-147, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-150. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-147, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-151. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-150, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-152. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-153. Двухвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего:

AlaMPro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-154. Двухвалентный полипептид согласно аспекту Е-147, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-155. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-7, который включает или, по существу, состоит из трех аминокислотных последовательностей согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 и/или нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38.

Аспект Е-156. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-155, в котором указанные три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-157. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

Аспект Е-158. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 102;

и, по меньшей мере, один тяж выбран из

c) SEQ ID NO: 98;

e) SEQ ID NO: 121 и

Аспект Е-159. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, тяж из аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO: 98; и

b) тяж из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

второй тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

c) SEQ ID NO: 102 и

ii) аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

и третий тяж из аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из

e) SEQ ID NO: 121 и

f) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-160. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102.

Аспект Е-161. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из

a) SEQ ID NO: 98;

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-162. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и последовательность CDR1, выбранную из

a) SEQ ID NO: 98 и

b) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 98, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам;

и последовательность CDR3, выбранную из

c) SEQ ID NO: 121 и

d) тяжа из аминокислотных остатков, который имеет не более 3, предпочтительно, не более 2, предпочтительнее, не более 1 различия по аминокислотам с SEQ ID NO: 121, при условии, что аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазменного резонанса), и/или аминокислотная последовательность, включающая указанный тяж из аминокислотных остатков, имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью, включающей указанный тяж из аминокислотных остатков без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-163. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают, по меньшей мере, SEQ ID NO: 102 и, по меньшей мере, один тяж из аминокислотных остатков (последовательность CDR), выбранный из SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-164. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, которые включают SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 121.

Аспект Е-165. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-157 - Е-164, при этом указанные, по меньшей мере, три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-166. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

Аспект Е-167. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-166, при этом указанные три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-168, Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-167, который включает или, по существу, состоит из трех идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект Е-169. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект Е-170. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-169, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

Аспект Е-171. Поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-169 или Е-170, при этом указанные три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-172. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-171, который включает или, по существу, состоит из трех идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект Е-173. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-15 6, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект Е-174. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-173, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

Аспект Е-175. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-173 или Е-174, при этом указанные три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-176. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-175, который включает или, по существу, состоит из трех идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из SEQ ID NO: 65 и 76.

Аспект Е-177. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

Аспект Е-178. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-177, при этом указанные три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-179. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-178, который включает или, по существу, состоит из трех идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект Е-180. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-181. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-180, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-182. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-180 или Е-181, при этом указанные три аминокислотные последовательности и/или нанотела® являются идентичными.

Аспект Е-183. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-182, который включает или, по существу, состоит из трех идентичных аминокислотных последовательностей и/или нанотел®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75,76,147,149 и 153.

Аспект Е-184. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

Аспект Е-185. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-184, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект Е-186. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-184, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-187. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-184, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-188. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-187, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-189. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект Е-190. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект Е-191. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-184, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-192. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 62.

Аспект Е-193. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 65.

Аспект Е-194. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 76.

Аспект Е-195. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 5.

Аспект Е-196. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 147.

Аспект Е-197. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 149.

Аспект Е-198. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из трех аминокислотных последовательностей и/или нанотел® с SEQ ID NO: 153.

Аспект Е-199. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-155 или Е-156, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела®, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

Аспект Е-200. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-199, который включает или, по существу, состоит из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела®, выбранных из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект Е-201. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-202. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-203. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-204. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-205. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-206. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-207. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-208. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-209. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu. Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gm, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-210. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-209, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-211. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-209, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-212. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-209, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-213. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-212, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-214. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-209, включающий или, по существу, состоящий из, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности и/или нанотела® с SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln HGln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-215. Трехвалентный полипептид, который направлен против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранный их следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 77-79 и 158;

Аспект Е-216. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-215, выбранный из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 77-79 и 158;

1) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78, аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

и) полипептид связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или полипептид имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с полипептидом без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам.

Аспект Е-217. Трехвалентный полипептид, который направлен против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранный их следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 78 и 79;

Аспект Е-218. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-217, выбранный из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 78 и 79; или

i) аминокислотная последовательность или нанотело®, содержащиеся в указанном полипептиде, имеют аспарагиновую кислоту (Asp, D) в позиции 54, глутамин (Gin, Q) в позиции 105, лейцин (Leu, L) в позиции 78, аргинин (Arg, R) в позиции 83 и глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-219. Трехвалентный полипептид, который направлен против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранный их следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 159-161;

Аспект Е-220. Трехвалентный полипептид согласно аспекту Е-219, выбранный из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 159-161;

Аспект Е-221. Трехвалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-219 или Е-220, выбранный из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 159-161;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

Аспект Е-222. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего; Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg. Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

Аспект Е-223. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

Аспект Е-224. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-225. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-226. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D.

Аспект Е-227. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu.

Аспект Е-228. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu.

Аспект Е-229. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

Аспект Е-230. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 77.

Аспект Е-231. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 78.

Аспект Е-232. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 79.

Аспект Е-233. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из одной из SEQ ID NO: 159-161.

Аспект Е-234. Трехвалентный полипептид, который направлен против и/или специфически связывает белок F hRSV, выбранный из следующих полипептидов:

a) SEQ ID NO: 142-145 и 162-165;

Аспект Е-235. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-236. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 77, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-237. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 78, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-238. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 79, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-239. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 158, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-240. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 159, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-241. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 160, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-242. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 161, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-243. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-244. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu. Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-245. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-246. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-247. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-248. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-249. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-250. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой, по меньшей мере, в одном (предпочтительно, в двух, предпочтительнее, во всех трех) нанотеле®/нанотелах®, которое(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln, и в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

Аспект Е-251. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 142.

Аспект Е-252. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 143.

Аспект Е-253. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 144.

Аспект Е-254. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из SEQ ID NO: 145.

Аспект Е-255. Трехвалентный полипептид, включающий или, по существу, состоящий из одной из SEQ ID NO: 162-165.

Аспект Е-256. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-255, который может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 100 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительно, 10 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительнее, 1 нМ - 0,1 нМ или меньше.

Аспект Е-257. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-256, который может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект Е-258. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-257, который может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1(t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект Е-259. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-258, который может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50 от 10 пМ до 1000 пМ, предпочтительно, от 10 пМ до 250 пМ, предпочтительнее, от 50 пМ до 200 пМ или меньше.

Аспект Е-260. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-259, который может нейтрализовать hRSV (например, при измерении в анализе микронейтрализации на hRSV Long (как описано, например, в примере 6)) с величиной IC50, которая, по меньшей мере, такая же, и предпочтительно, лучше, по меньшей мере, в десять раз, предпочтительно, в двадцать раз лучше, предпочтительнее, в пятьдесят раз лучше, даже предпочтительнее, в шестьдесят, семьдесят, восемьдесят или больше раз лучше при сравнении с величиной IC50, полученной с Синагисом®.

Аспект Е-261. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-260, который представляет собой полиспецифическую конструкцию.

Аспект F-1. Моновалентная конструкция, включающая или, по существу, состоящая из одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 и/или нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18,D-1-D-38 и X-1-X-38.

Аспект F-2. Моновалентная конструкция согласно аспекту F-1, в которой указанная аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®.

Аспект F-3. Моновалентная конструкция, включающая или, по существу, состоящая из одного нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и X-1-Х-38.

Аспект F-4. Моновалентная конструкция, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-76, SEQ ID NO: 138-141 и SEQ ID NO: 146-157.

Аспект F-5. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 при получении поливалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-1 -Е-261.

Аспект F-6. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-5, при этом моновалентную конструкцию используют в качестве связывающего домена или связывающей единицы при получении поливалентной конструкции, включающей две или больше связывающих единиц.

Аспект F-7. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5 или F-6 при получении поливалентного полипептида, который предпочтительно обнаруживает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием.

Аспект F-8. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-7 в качестве связывающего домена или связывающей единицы при получении поливалентной конструкции, при этом связывающие домены или связывающие единицы соединяются через линкер, так что поливалентный полипептид предпочтительно обнаруживает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием, и/или поливалентный полипептид может одновременно связывать весь сайт связывания на белке F hRSV.

Аспект F-9. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-10. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-9, при этом моновалентной конструкция, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект F-11. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-12. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-11, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76; или

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-13. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-11 или F-12, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит, из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект F-14. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-15. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-14, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-16. Применение моновалентной конструкции, по существу, состоящей из SEQ ID NO: 62, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-17. Применение моновалентной конструкции, по существу, состоящей из SEQ ID NO: 65, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-18. Применение моновалентной конструкции, по существу, состоящей из SEQ ID NO: 76, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-19. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-20. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-19, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект F-21. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-22. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-21, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-23. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-21 или F-22, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Аспект F-24. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-25. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-24, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-26. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-24, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-27. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-24, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-28. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-27, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-29. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-30. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5 - F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-31. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-24, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu. Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-32. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-33. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект F-34. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-35. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-36. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-37. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-38. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-39. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-40. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-41. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-42. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентпая конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-43. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-42, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, GInlOSLeu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-44. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-42, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-45. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-42, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-46. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-42, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-47. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-48. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-5-F-8, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-49. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-42, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении поливалентного полипептида.

Аспект F-50. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-1-F-4 при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-51. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-50 при получении двухвалентной конструкции, которая предпочтительно обнаруживает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием.

Аспект F-52. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-51 в качестве связывающего домена или связывающей единицы при получении двухвалентного полипептида, при этом связывающие домены или связывающие единицы соединяются через линкер, так что двухвалентный полипептид предпочтительно обнаруживает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием, и/или двухвалентный полипептид может одновременно связывать оба сайта связывания на белке F hRSV.

Аспект F-53. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-54. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-53, при этом две моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-55. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспектам F-53 или F-54, при этом две моновалентные конструкции, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект F-56. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-57. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-56, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76; или

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-58. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспектам F-56 или F-57, при этом две моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-59. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-58, при этом две моновалентные конструкции, по существу, состоят, из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект F-60. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-61. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-60, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-62. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспектам F-60 или F-61, при этом две моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-63. Применение двух моновалентных конструкций, по существу, состоящих из SEQ ID NO: 62, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-64. Применение двух моновалентных конструкций, по существу, состоящих из SEQ ID NO: 65, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-65. Применение двух моновалентных конструкций, по существу, состоящих из SEQ ID NO: 76, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-66. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-67. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-66, при этом две моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-68. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспектам F-66 или F-67, при этом две моновалентные конструкции, по существу, состоят из одной из SEQIDNO: 146-153.

Аспект F-69. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50 - F-52, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-70. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-69, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-71. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспектам F-69 или F-70, при этом две моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-72. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-71, при этом две моновалентные конструкции, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Аспект 73. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-74. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-73, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-75. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-73, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-76. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-73, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-77. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-76, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-78. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-79. Применение двух моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-80. Применение двух моновалентных конструкций согласно аспекту F-73, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-81. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция выбрана из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-82. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-81, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект F-83. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-84. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-85. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-86. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-87. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-88. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-89. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-90. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-91. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-92. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-91, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-93. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-91, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-94. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-91, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-95. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-94, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-96. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-97. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-50-F-52, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-98. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-91, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-99. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-1-F-4 при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-100. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-99 при получении трехвалентной конструкции, которая предпочтительно обнаруживает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием.

Аспект F-101. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-100 в качестве связывающего домена или связывающей единицы при получении трехвалентного полипептида, при этом связывающие домены или связывающие единицы соединяются через линкер, так что трехвалентный полипептид предпочтительно обнаруживает внутримолекулярное связывание по сравнению с межмолекулярным связыванием, и/или трехвалентный полипептид может одновременно связывать все три сайта связывания на белке F hRSV.

Аспект F-102. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 60-76;

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-103. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-102, при этом три моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-104. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспектам F-102 или F-103, при этом три моновалентные конструкции, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 60-76.

Аспект F-105. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-106. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-105, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76; или

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-107. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспектам F-105 или F-106, при этом три моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-108. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-107, при этом три моновалентные конструкции, по существу, состоят, из одной из SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 и 76.

Аспект F-109. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-110. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-109, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 65 и 76;

ii) аминокислотная последовательность связывает белок F hRSV с одинаковой, примерно одинаковой или более высокой аффинностью (указанную аффинность измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или аминокислотная последовательность имеет одинаковую, примерно одинаковую или более высокую активность (как определено в данном описании) при сравнении с аминокислотной последовательностью без 3, 2 или 1 различия по аминокислотам,

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-111. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспектам F-109 или F-110, при этом три моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-112. Применение трех моновалентных конструкций, по существу, состоящих из SEQ ID NO: 62, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-113. Применение трех моновалентных конструкций, по существу, состоящих из SEQ ID NO: 65, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-114. Применение трех моновалентных конструкций, по существу, состоящих из SEQ ID NO: 76, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-115. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-153;

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-116. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-115, при этом три моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-117. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспектам F-115 или F-116, при этом три моновалентные конструкции, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-153.

Аспект F-118. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

i) аминокислотная последовательность имеет пролин (Pro, P) в позиции 14, аргинин (Arg, R) в позиции 19, лейцин (Leu, L) в позиции 20 и лейцин (Leu, L) в позиции 108 и, кроме того, аргинин (Arg, R) в позиции 83, глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85 и/или глутамин (Gin, Q) в позиции 105 (указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-119. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-118, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 146-149 и 151-153;

- SEQ ID NO: 146, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутамин (Gin, Q) в позиции 105;

- SEQ ID NO: 151, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет аргинин (Arg, R) в позиции 83;

- SEQ ID NO: 152, аминокислотная последовательность предпочтительно имеет глутаминовую кислоту (Glu, E) в позиции 85;

(указанные позиции определены согласно нумерации по Кабату); и

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-120. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспектам F-118 или F-119, при этом три моновалентные конструкции являются идентичными.

Аспект F-121. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-120, при этом три моновалентные конструкции, по существу, состоят из одной из SEQ ID NO: 146-149 и 151-153.

Аспект 122. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-123. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-122, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-124. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-122, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-125. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-122, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-126. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-125, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-127. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gin 108 Leu, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-128. Применение трех моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-129. Применение трех моновалентных конструкций согласно аспекту F-122, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Gly54Asp;

- Ala14Pro, Ser19Arg. Ile20Leu и Gln108Leu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-130. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 62 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 77, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 62 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 62 через линкер 15GS.

Аспект F-131. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 65 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 78, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 65 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 65 через линкер 15GS.

Аспект F-132. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 76 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 79, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 76 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 76 через линкер 15GS.

Аспект F-133. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 75 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 158, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 75 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 75 через линкер 15GS.

Аспект F-134. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 147 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 159, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 147 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 147 через линкер 15GS.

Аспект F-135. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 149 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 160, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 149 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 149 через линкер 15GS.

Аспект F-136. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 153 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 161, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 153 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательности с SEQ ID NO: 153 через линкер 15GS.

Аспект F-137. Применение моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентные конструкции выбраны из следующего:

a) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-138. Применение моновалентных конструкций согласно аспекту F-137, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157.

Аспект F-139. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-140. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 62, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-141. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 65, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-142. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 76, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-143. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 75, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-144. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 147, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-145. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 149, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-146. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 153, в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-147. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-148. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-147, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-149. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-147, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ser19R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-150. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-147, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре или пять) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-151. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-150, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54D, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении двухвалентного полипептида.

Аспект F-152. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три или четыре) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-153. Применение моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-99-F-101, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь) аминокислотных остатков, выбранных из следующего: Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu, и в которой глутаминовая кислота в позиции 1 заменена на аспарагиновую кислоту, при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-154. Применение моновалентной конструкции согласно аспекту F-147, при этом моновалентная конструкция, по существу, состоит из SEQ ID NO: 5, в которой мутированы следующие аминокислотные остатки:

- Glu1Asp;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;

- Glu1Asp и Gly54Asp;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или

- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln,

при получении трехвалентного полипептида.

Аспект F-155. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 138 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 142, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 138 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 5 через линкер 15GS.

Аспект F-156. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 139 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 143, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 139 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 62 через линкер 15GS.

Аспект F-157. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 140 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 144, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 140 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 65 через линкер 15GS.

Аспект F-158. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 141 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 145, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 141 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 76 через линкер 15GS.

Аспект F-159. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 154 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 162, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 154 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 75 через линкер 15GS.

Аспект F-160. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 155 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 163, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 155 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 147 через линкер 15GS.

Аспект F-161. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 156 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 164, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 156 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 149 через линкер 15GS.

Аспект F-162. Применение аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 157 при получении трехвалентного полипептида с SEQ ID NO: 165, при этом аминокислотная последовательность с SEQ ID NO: 157 соединяется с, по меньшей мере, двумя другими аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 153 через линкер 15GS.

Аспект Е-262. Полипептид согласно любому из аспектов Е-1 - Е-261, который имеет повышенное время полужизни по сравнению с соответствующими аминокислотной последовательностью согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотелом® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самим по себе, соответственно.

Аспект Е-263. Полипептид согласно аспекту Е-262, в котором одна или несколько других связывающих единиц обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни по сравнению с соответствующими аминокислотной последовательностью согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотелом® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самим по себе, соответственно.

Аспект Е-264. Полипептид согласно аспектам Е-262 или Е-263, в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из сывороточных белков или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточными белками, части Fc и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками.

Аспект Е-265. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262 - Е-264, в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина или его фрагментов.

Аспект Е-266. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262 - Е-265, в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточным альбумином (таким как человеческий сывороточный альбумин) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Аспект Е-267. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262 - Е-266, в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®, которые могут связываться с сывороточным альбумином (таким как человеческий сывороточный альбумин) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Аспект Е-268. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262-Е-267, в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни, представляет собой нанотело®, которое может связываться с сывороточным альбумином (таким как человеческий сывороточный альбумин) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Аспект Е-269. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262-Е-268, который имеет время полужизни в сыворотке, которое, по меньшей мере, в 1,5 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 5 раз, например, по меньшей мере, в 10 раз или больше, чем в 20 раз больше времени полужизни соответствующих аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самого по себе, соответственно.

Аспект Е-270. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262-Е-269, который имеет время полужизни в сыворотке, которое повышено более чем на 1 час, предпочтительно, более чем на 2 часа, предпочтительнее, более чем на 6 часов, например, более чем на 12 часов или даже более чем на 24, 48 или 72 часа, по сравнению с временем полужизни соответствующих аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самого по себе, соответственно.

Аспект Е-271. Полипептид согласно любому из аспектов Е-262 - Е-270, который имеет время полужизни в сыворотке человека, по меньшей мере, примерно 12 часов, предпочтительно, по меньшей мере, 24 часа, предпочтительнее, по меньшей мере, 48 часов, даже предпочтительнее, по меньшей мере, 72 часа или более, например, по меньшей мере, 5 суток (такое как примерно 5-10 суток), предпочтительно, по меньшей мере, 9 суток (такое как примерно 9-14 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 10 суток (такое как примерно 10-15 суток), или, по меньшей мере, примерно 11 суток (такое как примерно 11-16 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 12 суток (такое как примерно 12-18 суток или более), или более 14 суток (такое как примерно 14-19 суток).

Аспект G-1. Соединение или конструкция, которые включают или, по существу, состоят из одной или нескольких аминокислотных последовательностей согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 и/или нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 и/или одного или нескольких полипептидов согласно любому из аспектов Е-1-Е-271 и, необязательно, также включают одну или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, соединенных, необязательно, через один или несколько линкеров.

Аспект G-2. Соединение или конструкция согласно аспекту G-1, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой аминокислотные последовательности.

Аспект G-3. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1 или G-2, в которых указанные один или несколько линкеров, если присутствуют, представляют собой аминокислотные последовательности.

Аспект G-4. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-3, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой иммуноглобулиновые последовательности.

Аспект G-5. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-4, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®.

Аспект G-6. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-5, в которых указанные одна или несколько аминокислотных последовательностей по изобретению представляют собой иммуноглобулиновые последовательности.

Аспект G-7. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-6, в которых указанные одна или несколько аминокислотных последовательностей по изобретению выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®.

Аспект G-8. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-7, которые включают или, по существу, состоят из одного или нескольких нанотел® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, и в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой нанотела®.

Аспект G-9. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-8, которые представляют собой поливалентные конструкции.

Аспект G-10. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-9, которые представляют собой полиспецифичные конструкции.

Аспект G-11. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-10, которые имеют повышенное время полужизни по сравнению с соответствующими аминокислотной последовательностью согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотелом® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самим по себе, соответственно.

Аспект G-12. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-11, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц дают соединение или конструкцию с повышенным временем полужизни по сравнению с соответствующими аминокислотной последовательностью согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотелом® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самим по себе, соответственно.

Аспект G-13. Соединение или конструкция согласно аспекту G-12, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, которые дают соединение или конструкцию с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из сывороточных белков или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточными белками, части Fc и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками.

Аспект G-14. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-12 или G13, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, которые дают соединение или конструкцию с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина или его фрагментов.

Аспект G-15. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-12-G14, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, которые дают соединение или конструкцию с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточным альбумином (таким как человеческий сывороточный альбумин) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Аспект G-16. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-12-G-15. в которых указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые дают соединение или конструкцию с повышенным временем полужизни, выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для использования в качестве dAb, или нанотел®, которые могут связываться с сывороточным альбумином (таким как человеческий сывороточный альбумин) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Аспект G-17. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-12-G-16. в которых указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают полипептид с повышенным временем полужизни, представляют собой нанотело®, которое может связываться с сывороточным альбумином (таким как человеческий сывороточный альбумин) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Аспект G-18. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-11-G-17. которые имеют время полужизни в сыворотке, которое, по меньшей мере, в 1,5 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 5 раз, например, по меньшей мере, в 10 раз или больше, чем в 20 раз больше времени полужизни соответствующих аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самого по себе, соответственно.

Аспект G-19. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-11-G-18. которые имеют время полужизни в сыворотке, которое повышено более чем на 1 час, предпочтительно, более чем на 2 часа, предпочтительнее, более чем на 6 часов, например, более чем на 12 часов или даже более чем на 24, 48 или 72 часа, по сравнению с временем полужизни соответствующих аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе или нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самого по себе, соответственно.

Аспект G-20. Соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-11-G-19, которые имеют время полужизни в сыворотке человека, по меньшей мере, примерно 12 часов, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 24 часа, предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 48 часов, даже предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 72 часа или более, например, по меньшей мере, 5 суток (такое как примерно 5-10 суток), предпочтительно, по меньшей мере, 9 суток (такое как примерно 9-14 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 10 суток (такое как примерно 10-15 суток), или, по меньшей мере, примерно 11 суток (такое как примерно 11-16 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 12 суток (такое как примерно 12-18 суток или более), или более 14 суток (такое как примерно 14-19 суток).

Аспект М-1. Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые являются такими, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4.

Аспект М-2. Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность согласно аспекту М-1, которая находится в форме генетической конструкции.

Аспект М-3. Применение нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности согласно аспекту М-1, которая кодирует моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4, для получения генетической конструкции, которая кодирует поливалентный полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271.

Аспект М-4. Применение нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности согласно аспекту М-2, при этом генетическая конструкция кодирует поливалентную (такую как двухвалентная) конструкцию.

Аспект N-1. Хозяин или клетка-хозяин, который экспрессирует, или который в подходящих условиях способен к экспрессии аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые таковы, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4; и/или которые включают нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность согласно аспектам М-1 или М-2.

Аспект Q-1. Композиция, включающая, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4 или нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность согласно аспектам М-1 или М-2.

Аспект Q-2. Композиция согласно аспекту Q-1, которая представляет собой фармацевтическую композицию.

Аспект Q-3. Композиция согласно аспектам Q-1 или Q-2, которая представляет собой фармацевтическую композицию, которая также включает, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант, и которая необязательно включает одни или несколько других фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

Аспект Р-1. Способ получения аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые таковы, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 или композиции согласно любому из аспектов Q-1-Q-3, причем указанный способ включает, по меньшей мере, стадии

a) экспрессии в подходящих клетке-хозяине или организме-хозяине или другой подходящей экспрессирующей системе нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности согласно аспектам М-1 или М-2,

необязательно, с последующим

b) выделением и/или очисткой аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые таковы, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 или композиции согласно любому из аспектов Q-1-Q-3, полученных таким образом.

Аспект Р-2. Способ получения аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые таковы, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 или композиции согласно любому из аспектов Q-1-Q-3, причем указанный способ включает, по меньшей мере, стадии

a) культивирования и/или сохранения хозяина или клетки-хозяина согласно аспекту N-1 в условиях, которые таковы, что указанные хозяин или клетка-хозяин экспрессирует и/или вырабатывает, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые таковы, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4, или композицию любому из аспектов Q-1-Q-3, необязательно, с последующим

b) выделением и/или очисткой аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1- Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, которые таковы, что могут быть получены экспрессией нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, кодирующей их, или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 или композиции согласно любому из аспектов Q-1-Q-3, полученных таким образом.

Аспект Р-3. Способ получения двухвалентного или трехвалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261, причем указанный способ включает, по меньшей мере, стадии соединения двух или больше аминокислотных последовательностей или моновалентных конструкций согласно любому из аспектов F-1-F-4 и, например, одного или нескольких линкеров.

Аспект Р-4. Способ согласно аспекту Р-3, включающий стадии

a) соединения двух или больше нуклеотидных последовательностей согласно аспекту М-1, кодирующих моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4 (и также, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей один или нескольких линкеров и также один или нескольких других элементов генетической конструкции, известных per se) для получения генетической конструкции согласно аспекту М-2;

b) экспрессии в подходящих клетке-хозяине или организме-хозяине или другой экспрессирующей системе генетической конструкции, полученной в а), необязательно, с последующим

c) выделением и/или очисткой двухвалентного или трехвалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261, полученного таким образом.

Аспект O-1. Способ скрининга аминокислотных последовательностей, направленных против белка F hRSV, причем указанный способ включает, по меньшей мере, стадии

a) предоставления набора, коллекции или библиотеки нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности;

b) скрининга указанных набора, коллекции или библиотеки нуклеотидных последовательностей на нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, которая может связываться с и/или имеет аффинность к белку оболочки вируса, и которая перекрестно блокирует или является перекрестно блокирующей нанотело® по изобретению, например, одно из SEQ ID NO: 60-76, 138-141 и 146-157 (таблица А-4), или полипептид или конструкцию, включающие, по меньшей мере, одно нанотело® по изобретению, например, полипептид или конструкцию, включающие, по меньшей мере, одну из SEQ ID NO: 77-99, 142-145 и 158-165 (см. таблицу 5); и

c) выделения нуклеотидной последовательности с последующей экспрессией указанной аминокислотной последовательности.

Аспект R-1. Способ предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции согласно аспектам Q-1-Q-3.

Аспект R-2. Способ предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания из респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции согласно аспектам Q-1-Q-3.

Аспект R-3. Способ предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или расстройства, которое можно предотвратить и/или лечить путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции согласно аспектам Q-1-Q-3, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции согласно аспектам Q-1-Q-3.

Аспект R-4. Способ иммунотерапии, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции согласно аспектам Q-1-Q-3.

Аспект R-5. Применение аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции согласно аспектам Q-1-Q-3 при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения заражения hRSV и/или для применения в одном или нескольких способах согласно аспектам R-1-R-4.

Аспект R-6. Аминокислотная последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1 - Е-271, соединение или конструкция согласно любому из аспектов G-1-G-20, моновалентная конструкция согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиция согласно аспектам Q-1-Q-3 для предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания из респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы.

Аспект S-1. Часть или фрагмент аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 и/или полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271.

Аспект S-2. Часть или фрагмент согласно аспекту S-1, которые могут специфически связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV и/или конкурируют с Синагисом® за связывание белка F hRSV.

Аспект S-3. Часть или фрагмент согласно любому из аспектов S-1-S-2, которые могут специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 1000 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительно, 100 нМ - 1 нМ или меньше, предпочтительнее, 10 нМ - 1 нМ или меньше.

Аспект S-4. Часть или фрагмент согласно любому из аспектов S-2-S-3, которые могут специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ M^-1.c^-1до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект S-5. Часть или фрагмент согласно любому из аспектов S-2-S-4, которые могут специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1(t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект S-6. Соединение или конструкция, которые включают или, по существу, состоят из одной или нескольких частей или фрагментов любому из аспектов S-1-S-5, и, необязательно, также включают одну или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, соединенных необязательно через один или несколько линкеров.

Аспект S-7. Соединение или конструкция согласно аспекту S-6, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой аминокислотные последовательности.

Аспект S-8. Соединение или конструкция согласно аспектам S-6 или S-7, в которых указанные один или несколько линкеров, если присутствуют, представляют собой одну или несколько аминокислотных последовательностей.

Аспект S-9. Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, которая кодирует часть или фрагмент согласно любому из аспектов S-1-S-5 или соединение или конструкцию согласно любому из аспектов S-6-S-8.

Аспект S-10. Композиция, включающая, по меньшей мере, одну часть или фрагмент согласно любому из аспектов S-1-S-5, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов S-6-S-8 или нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность согласно аспекту S-9.

Аспект Т-1. Производное аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 или нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38.

Аспект Т-2. Производное согласно аспекту Т-1, которое может специфически связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV и/или конкурирует с Синагисом® за связывание белка F hRSV.

Аспект Т-3. Производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-2, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 100 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительно, 10 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительнее, 1 нМ - 0,1 нМ или меньше.

Аспект Т-4. Производное согласно любому из аспектов Т-2-Т-3, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ M^-1.c^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект Т-5. Производное согласно любому из аспектов Т-2-Т-4, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект Т-6. Производное соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 или полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271.

Аспект Т-7. Производное согласно аспекту Т-6, которое может специфически связываться с антигенным сайтом II на белке F hRSV и/или конкурирует с Синагисом® за связывание белка F hRSV.

Аспект Т-8. Производное согласно любому из аспектов Т-6-Т-7, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константной диссоциации (K_D) 100 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительно, 10 нМ - 0,1 нМ или меньше, предпочтительнее, 1 нМ - 0,1 пМ или меньше.

Аспект Т-9. Производное согласно любому из аспектов Т-6-Т-8, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_on от 10⁴ М^-1.с^-1 до примерно 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительно, от 10⁵ М^-1.с^-1 до 10⁷ М^-1.с^-1, предпочтительнее, примерно 10⁶ М^-1.с^-1 или больше.

Аспект Т-10. Производное согласно любому из аспектов Т-6-Т-9, которое может специфически связываться с белком F hRSV с константой скорости k_off от 10^-2 с^-1 (t_1/2=0,69 с) до 10^-4 с^-1 (что дает почти необратимый комплекс с t_1/2 несколько суток), предпочтительно, от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1 или ниже.

Аспект Т-11. Производное согласно любому из аспектов Т-6-Т-10, которое может нейтрализовать hRSV, например, в анализе микронейтрализации hRSV Long (как описано, например, в примере 6) с величиной IC50 от 10 пМ до 1000 пМ, предпочтительно, от 10 пМ до 250 пМ, предпочтительнее, от 50 пМ до 200 пМ или меньше.

Аспект Т-12. Производное согласно любому из аспектов Т-6-Т-11, которое может нейтрализовать hRSV, например, в анализе микронейтрализации hRSV Long (как описано, например, в примере 6) с величиной IC50, которая, по меньшей мере, такая же, и предпочтительно, лучше, по меньшей мере, в десять раз, предпочтительно, в двадцать раз лучше, предпочтительнее, в пятьдесят раз лучше, даже предпочтительнее, в шестьдесят, семьдесят, восемьдесят или больше раз лучше при сравнении с величиной IC50, полученной с Синагисом®.

Аспект Т-13. Производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-12, которое имеет время полужизни в сыворотке, которое, по меньшей мере, в 1,5 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 5 раз, например, по меньшей мере, в 10 раз или больше, чем в 20 раз больше времени полужизни соответствующих аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самого по себе, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-261 самого по себе, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 самой по себе или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 самой по себе, соответственно.

Аспект Т-14. Производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-13, которое имеет время полужизни в сыворотке, которое повышено более чем на 1 час, предпочтительно, более чем на 2 часа, предпочтительнее, более чем на 6 часов, например, более чем на 12 часов или даже более чем на 24, 48 или 72 часа, по сравнению с временем полужизни соответствующих аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38 самой по себе, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38 самого по себе, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-261, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 самой по себе или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 самой по себе, соответственно.

Аспект Т-15. Производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-14, которое имеет время полужизни в сыворотке человека, по меньшей мере, примерно 12 часов, предпочтительно, по меньшей мере, 24 часа, предпочтительнее, по меньшей мере, 48 часов, даже предпочтительнее, по меньшей мере, 72 часа или более, например, по меньшей мере, 5 суток (такое как примерно 5 до 10 суток), предпочтительно, по меньшей мере, 9 суток (такое как примерно 9-14 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 10 суток (такое как примерно 10-15 суток), или, по меньшей мере, примерно 11 суток (такое как примерно 11-16 суток), предпочтительнее, по меньшей мере, примерно 12 суток (такое как примерно 12-18 суток или более), или более 14 суток (такое как примерно 14-19 суток).

Аспект Т-16. Производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-15, которое представляет собой пегилированное производное.

Аспект Т-17. Соединение или конструкция, которые включают или, по существу, состоят из одного или нескольких производных согласно любому из аспектов Т-1-Т-16 и, необязательно, также содержат одну или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц, соединенных необязательно через один или несколько линкеров.

Аспект Т-18. Соединение или конструкция согласно аспекту Т-17, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, частиц или связывающих единиц представляют собой аминокислотные последовательности.

Аспект Т-19. Соединение или конструкция согласно аспектам Т-17 или Т-18, в которых указанные один или несколько линкеров, если присутствуют, представляют собой одну или несколько аминокислотных последовательностей.

Аспект Т-20. Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, которая кодирует производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-16 или соединение или конструкцию согласно любому из аспектов Т-17-Т-19.

Аспект Т-21. Композиция, включающая, по меньшей мере, одно производное согласно любому из аспектов Т-1-Т-16, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов Т-17-Т-19 или нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность согласно аспекту Т-20.

Аспект U-1. Способ введения эффективного количества аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции, включающей их, при этом указанный способ включает стадию введения аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции, включающей их, в легочную ткань.

Аспект U-2. Способ согласно аспекту U-1, при этом аминокислотную последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции, включающую их, вводят с использованием ингалятора, прибора для интраназальной доставки или аэрозоля.

Аспект U-3. Способ согласно любому из аспектов U-1 или U-2, при этом, по меньшей мере, 5%, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, предпочтительнее, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, и даже предпочтительнее, по меньшей мере, 80% или больше аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции, включающей их, устойчиво в легочной ткани в течение, по меньшей мере, 24 часов, предпочтительно, по меньшей мере, 48 часов, предпочтительнее, по меньшей мере, 72 часов.

Аспект U-4. Способ согласно любому из аспектов U-1-U-3, при этом аминокислотную последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-X-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции, включающую их, применяют в чистой форме, т.е. когда они представляют собой жидкости или сухие порошки.

Аспект U-5. Способ согласно любому из аспектов U-1-U-3, при этом аминокислотную последовательность согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-X-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или композиции, включающую их, вводят в легочную ткань в виде композиции или препарата, включающих аминокислотную последовательность согласно любому из пунктов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из пунктов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из пунктов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из пунктов F-1-F-4, и носитель, подходящий для доставки в легкие.

Аспект U-6. Фармацевтическая композиция, включающая аминокислотную последовательность согласно любому из пунктов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из пунктов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из пунктов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из пунктов F-1-F-4, и носитель, подходящий для доставки в легкие.

Аспект U-7. Фармацевтическое устройство, подходящее для доставки в легкие аминокислотной последовательности согласно любому из пунктов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из пунктов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-X-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из пунктов G-1-G-20 и/или моновалентной конструкции согласно любому из пунктов F-1-F-4 и/или подходящей при применении композиции, включающей их.

Аспект U-8. Фармацевтическое устройство согласно аспекту U-7, которое представляет собой ингалятор для жидкостей (например, суспензии тонких твердых частиц или капель), включающих аминокислотную последовательность согласно любому из пунктов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из пунктов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из пунктов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из пунктов F-1-F-4.

Аспект U-9. Фармацевтическое устройство согласно аспекту U-7, которое представляет собой аэрозоль, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пунктов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из пунктов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из пунктов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из пунктов F-1-F-4.

Аспект U-10. Фармацевтическое устройство согласно аспекту U-7, которое представляет собой ингалятор для сухого порошка, включающего аминокислотную последовательность согласно любому из пунктов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотело® согласно любому из пунктов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептид согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединение или конструкцию согласно любому из пунктов G-1-G-20 и/или моновалентную конструкцию согласно любому из пунктов F-1-F-4 в форме сухого порошка.

Аспект U-11. Способ предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или фармацевтической композиции, включающей их.

Аспект U-12. Способ предупреждения и/или лечения респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы, причем указанный способ включает введение в легочную ткань субъекта, нуждающегося в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности согласно любому из аспектов А-1-А-29, С-1-С-38 и W-1-W-38, нанотела® согласно любому из аспектов В-1-В-18, D-1-D-38 и Х-1-Х-38, полипептида согласно любому из аспектов Е-1-Е-271, соединения или конструкции согласно любому из аспектов G-1-G-20 и/или моновалентной конструкции согласно любому из аспектов F-1-F-4 и/или фармацевтической композиции, включающей их.

Аспект V-1. Способ предупреждения и/или лечения заражения hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества поливалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей его.

Аспект V-2. Применение поливалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей его, для связывания и/или нейтрализации hRSV.

Аспект V-3. Применение поливалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей его, для связывания и/или нейтрализации различных штаммов hRSV.

Аспект V-4. Применение поливалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей его, для связывания и/или нейтрализации одного или нескольких «ускользнувших» мутантов вируса.

Аспект V-5. Способ или применение согласно любому из аспектов V-1-V-4, при этом поливалентный полипептид является двухвалентным.

Аспект V-6. Способ или применение согласно любому из аспектов V-1-V-4, при этом поливалентный полипептид является трехвалентным.

Аспект V-7. Способ или применение согласно любому из аспектов V-1-V-6, при этом указанный поливалентный полипептид вводят согласно любому из способов пунктов U-1-U-5 и/или U-11-U-12.

Аспект V-8. Способ предупреждения и/или лечения заражения вирусом hRSV, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества поливалентного полипептида согласно любому из аспектов Е-7-Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей его.

Аспект V-9. Способ согласно аспекту V-8, при этом поливалентные соединение или конструкция выбраны из таблицы А-4 (SEQ ID NO: 77-79, 138-141 и 146-157).

Аспект V-10. Способ согласно любому из аспектов V-8 или V-9, при этом лечат от заражения одним или несколькими «ускользнувшими» мутантами RSV.

Аспект V-11. Способ согласно аспекту V-10, при этом «ускользнувший» мутант представляет собой «ускользнувший» мутант, специфический для антигенного сайта II.

Аспект V-12. Применение поливалентных соединения или конструкции согласно любому из аспектов Е-7-Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей их, для связывания и/или нейтрализации одного или нескольких различных «ускользнувших» мутантов вируса.

Аспект V-13. Применение согласно аспекту V-12, при этом «ускользнувший» мутант представляет собой «ускользнувший» мутант, специфический для антигенного сайта II.

Аспект V-14. Способ согласно любому из аспектов V-8 или V-9, при этом лечат от заражения одним или несколькими штаммами hRSV.

Аспект V-15. Способ согласно аспекту V-14, при этом штаммом RSV является Long.

Аспект V-16. Способ согласно аспекту V-14, при этом штаммом RSV является А-2.

Аспект V-17. Способ согласно аспекту V-14, при этом штаммом RSV является В-1.

Аспект V-18. Способ согласно аспекту V-14, при этом поливалентный полипептид связывает и/или нейтрализует штаммы RSV Long и А-2.

Аспект V-19. Способ согласно аспекту V-14, при этом поливалентный полипептид связывает и/или нейтрализует штаммы RSV Long и В-1.

Аспект V-20. Способ согласно аспекту V-14, при этом поливалентный полипептид связывает и/или нейтрализует штаммы RSV В-1 и А-2.

Аспект V-21. Способ согласно аспекту V-14, при этом поливалентный полипептид связывает и/или нейтрализует штаммы RSV Long, А-2 и В-1.

Аспект V-22. Применение поливалентных соединения или конструкции согласно любому из аспектов Е-7 - Е-261 и/или фармацевтической композиции, включающей их, для связывания и/или нейтрализации различных штаммов hRSV.

Аспект V-23. Применение согласно аспекту V-22, при этом штаммы RSV представляют собой Long и А-2.

Аспект V-24. Применение согласно аспекту V-22, при этом штаммы RSV представляют собой Long и В-1.

Аспект V-25. Применение согласно аспекту V-22, при этом штаммы RSV представляют собой А-1 и В-1.

Аспект V-26. Применение согласно аспекту V-22, при этом штаммы RSV представляют собой А-2 и В-1.

Примеры

Пример 1. Иммунизации

Двух лам (156 и 157) иммунизируют согласно стандартным протоколам 6 бустерными дозами F_TM-hRSV (мембранонесвязывающая форма слитого белка, 70 кД; Corral Т. et al., 2007, ВМС BiotechnoL, 7: 17). Кровь собирают от указанных животных через 7 дней после бустерной дозы 6 и через 10 дней после бустерной дозы 6.

Двух лам (212 и 213) иммунизируют внутримышечно в шею 1 мг РНК-инактивированного штамма RSV long A (Hytest, Турку, Финляндия, №8RSV79) и затем 4 бустерными дозами по 0,5 мг RSV в режиме раз в две недели. Двух лам (206 и 207) иммунизируют внутримышечно 1 мг РНК-инактивированного штамма RSV long А с бустерной дозой 0,25 мг RSV через две недели с последующими 3 бустерными дозами с 50 мкг рекомбинантного F_TM-NN hRSV (мембранонесвязывающая форма слитого белка, 70 кД; Corral Т. et а1., 2007, ВМС Biotechnol., 7: 17) в режиме раз в две недели. В случае всех иммунизации получают антигены в виде PBS-масляных эмульсий со стимуном (Stimune) в качестве адъюванта. Кровь от указанных животных собирают через 4 дня и 10 дней после четвертой иммунизации, в то время как также берут образцы лимфоузлов для биопсии через 4 дня после четвертой иммунизации. Для наноклон-процедуры берут 100 мл крови через 11 дней после последней бустерной дозы у лам 206 и 207.

Пример 2. Конструирование библиотеки

Мононуклеарные клетки периферической крови из образцов крови получают с использованием фиколл-гипака согласно инструкциям изготовителя. Затем экстрагируют тотальную РНК из таких клеток, а также из клеток лимфоузлов и используют в качестве исходного материала для ОФ-ПЦР для амплификации нанотела®, кодирующего фрагменты гена. Такие фрагменты клонируют в фагмидный вектор, полученный из pUC119, который содержит промотор LacZ, последовательность, кодирующую белок колифага рIII, ген устойчивости к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и лидерную последовательность gen3. В рамке с нанотело®-кодирующей последовательностью вектор кодирует С-концевую метку с-myc и метку (His)6. Фаг получают согласно стандартным способам и хранят при 4ºС для дальнейшего использования, получая фаговые библиотеки 156, 157, 206, 207, 212 и 213.

Пример 3. Отбор нанотела® с помощью белка F hRSV

Для того, чтобы идентифицировать нанотела®, узнающие слитый белок RSV, используют библиотеки 156, 157, 206, 207, 212 и 213 для отбора на F_TM-NN (мембранонесвязывающая форма слитого белка Long, 70 кД; Corral Т. et al., 2007, ВМС Biotechnol., 7: 17). Белок F_TM- (25 нг/лунка) иммобилизуют на планшетах для ELISA Nunc Maxisorp. Контроль включает 0 мг/мл F_TM-. Связанные фаги элюируют из F_TM- с использованием трипсина и Синагиса® (Palivizumab, Medimmune, гуманизированное моноклональное антитело, описанное в Zao and Sullender, 2005, J. Virol., 79:3962) в первом и втором цикле отбора. В качестве контроля для Синагиса® используют ремикад (Infliximab, анти-TNF; Centocor). Используют 100-молярный избыток Синагиса® для того, чтобы идентифицировать нанотела®, специфически связывающиеся в сайте связывания Синагиса® на RSV. Продукты из первых циклов отбора, элюированные с Синагисом®, используют для второго цикла отбора.

Кроме того, отбор осуществляют с использованием инактивированного штамма hRSV Long (Hytest #8RSV79). Белок F_TM-NN (25 нг/лунка) или RSV (5-50 мг/лунка) иммобилизуют на планшетах для ELISA Nunc Maxisorp, с контролем 0 мг/мл антигена. Связанные фаги элюируют из F_TM-nn с использованием трипсина и Синагиса® (Palivizumab, Medimmune, гуманизированное моноклональное антитело, описанное в Zao and Sullender, 2005, J. Virol., 79:396) или 101F Fab (WO 06/050280, гуманизированное моноклональное антитело) в первом цикле отбора. Продукты из первого цикла отбора, элюированные с Синагисом® или 101F Fab, используют для второго цикла отбора с использованием для элюирования или Numax Fab (Motavizumab или MEDI-524, продукт гуманизированное моноклональное антитело третьего поколения, развившееся из palivizumab; WO 06/050166), или Синагиса® или 101F Fab. В качестве контроля для Синагиса® используют ремикад (Infliximab, анти-TNF; см. также WO 09/068625), в то время как Omnitarg Fab (анти-Her2; получено Заявителем) служит в качестве контроля для Numax Fab и 101F Fab. Используют 100-молярный избыток Синагиса®, Numax Fab или 101F Fab для того, чтобы идентифицировать нанотела®, специфически связывающиеся с антигенными сайтами II или эпитопами IV-VI на белке F RSV. Для того, чтобы получить нанотела®, специфические для антигенного сайта IV-VI, выполняют второй цикл отбора с использованием двух биотинилированных пептидов: во-первых, пептида, включающего остатки 422-436 белка F (Long) (Abgent, Сан-Диего, СА), содержащего в себе связывающий эпитоп 101F (Wu et aL, 2007, J. Gen. Virol., 88:2719-2723), во-вторых, пептида, имитирующего эпитоп Mabl9 (HWSISKPQ-PEG4-K-биотин) (Chargelegue et aL, 1998, J. Virol., 72:2040-2056).

Продукты обоих циклов отбора анализируют на фактор обогащения (присутствие фагов в элюате относительно контролей). На основании таких параметров выбирают наилучшие отборы для дальнейшего анализа. Индивидуальные колонии отбирают и выращивают в 96-луночных планшетах с глубокими лунками (объем 1 мл) и индуцируют для экспрессии нанотела® добавлением IPTG. Периплазматические экстракты (объем ~80 мкл) получают согласно стандартным способам.

Для испытания отобранных клонов в анализах нейтрализации RSV Периплазматические экстракты из 10-мл культур частично очищают с использованием IMAC PhyTips (Phynexus Inc., San Jose, СА). Для этого по 800 мкл периплазматических экстрактов загружают в колонки Phytips+, предварительно заполненные смолой для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, с последующим элюированием меченных His нанотел в 30 мкл смеси 0,1 М глицин-НС1/0,15 М Nad (pH 3), после чего элюаты нейтрализуют 5 мкл 0,5 М трис-HCl, pH 8,5.

Пример 4. Отбор нанотела® с помощью F_TM-NN RSV с использованием технологии наноклонов

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС)были получены из образцов крови с использованием фиколл-гипака согласно инструкциям изготовителя. Антиген-специфические В-клетки, экспрессирующие тяжелоцепочечные антитела на их поверхности, выделяют из РВМС через сортинг FACS (для описания технологии наноклонов дается ссылка на WO 06/079372). Для этого белок F_TM-NN метят красителем Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. №А20000) и затем обессоливают для удаления оставшегося неконъюгированного красителя Alexa Fluor 488 согласно инструкциям изготовителя.

Преиммунные (контроль фона) и иммунные РВМС ламы окрашивают флуоресцентным красителем, конъюгированным с IgGI (обычные иммуноглобулины, содержащие тяжелые и легкие цепи), IgG2 и IgG3 (классы тяжелоцепочечных иммуноглобулинов) специфическими мышиными моноклональными антителами, флуоресцентно меченным антителом DH59B (CD172a) (VMRD, Inc Pullman, WA; кат. №DH598; Davis et al., 1987, Vet. Immunol. Immunopathol., 15:337-376) и антигеном, меченным Alexa 488. Включают TOPR03 как краситель-детектор живых/погибших клеток. IgGI+В-лимфоциты, моноциты, нейтрофилы и погибшие клетки отвергаются и поэтому исключаются из сортинга. Антиген-специфические (А488+) IgG2- или IgG3-положительные В-клетки являются единственными клетками, сортированными по отдельности в лунки сепараторного планшета, содержащие буфер для ОФ-ПЦР.

В случае ламы 206 получено 1,9% антиген-положительных клеток от общего количества IgG2/IgG3-положительных живых клеток (1% в преиммунном образце), в случае ламы 207 получено 4,2% положительных клеток (0,7% в преиммунном образце). Гены вариабельного участка тяжелой цепи амплифицируют непосредственно из таких В-клеток одноклеточной ОФ-ПЦР и «гнездовой» ПЦР. Затем продукты ПЦР клонируют в ТОРО-адаптированный экспрессирующий вектор, полученный из pUC119, который содержит промотор LacZ, ген устойчивости к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и лидерную последовательность gen3. В рамке с нанотело®-кодирующей последовательностью вектор кодирует С-концевую метку с-myc и метку (His)6. Клонированные конструкции трансформируют в клетки Escherichia coli ТОР10 высокоэффективной электропорацией. Отдельные клоны выращивают в 96-луночных планшетах с глубокими лунками (объем 1 мл) и индуцируют для экспрессии нанотела® добавлением IPTG. Периплазматические экстракты (объем ~80 мкл) получают осмотическим шоком и анализируют на связывание с F_TM- в ELISA на связывание.

Коротко, 2 мкг/мл F_TM- иммобилизуют непосредственно на титрационных микропланшетах Maxipor (Nunc). Свободные сайты связывания блокируют с использованием 4% Marvel в PBS. Затем создают возможность 10 мкл периплазматического экстракта, содержащего нанотело® различных клонов в 100 мкл 2% Marvel в PBS, связываться с иммобилизованным антигеном. После инкубации и стадии промывки обнаруживают связывание нанотела® с использованием вторичного кроличьего антитела против VHH (для периплазматических фракций). После стадии промывки нанотело® в периплазматических фракциях детектируют антикроличьим козьим антителом, конъюгированным с HPR. Специфичность связывания определяют на основании величин OD при сравнении с контролем, не получавшим нанотело®.

В целом из 52 клонов VHH получают 8 агентов, связывающих F_TM-NN (4 от ламы 206, 4 от ламы 207).

Пример 5. Скрининг на нанотела®, которые связываются с антигенным сайтом II или IV-VI

Периплазматические экстракты, содержащие отдельные нанотела®, анализируют на связывание с антигенным сайтом II или IV-VI с использованием анализа Alphascreen® (Perkin Elmer; Waltham, MA) (Garcia-Barreno et al., 1989, J. Virol., 63:925-932; Lopeze et al., 1998, J. Virol., 72:6922-6928). В такой системе F_TM-NN одновременно связывается Fab Синагиса® и Fab F101, что создает возможность детекции нанотел®, которые препятствуют связыванию каждого из соответствующих антигенных сайтов II и IV-VI. В данном случае Периплазматические экстракты добавляют к белку F_TM-NN (0,3 нМ) и инкубируют в течение 15 минут. Затем добавляют биотинилированные Fab Синагиса® (0,3 нМ) и Fab F101, конъюгированные с гранулами акцептора (10 мкг/мл), и полученную смесь инкубируют в течение 1 часа. Наконец, добавляют гранулы донора, покрытые стрептавидином (10 мкг/мл), и после 1-часовой инкубации планшет считывают на аппарате для прочтения планшетов Evision. Периплазматические экстракты разводят 25 раз, что соответствует конечной концентрации приблизительно 40 нМ. Анализ подтверждают титрованием известных конкурентов Синагиса® mab 1882 (Argene, Varilhes, Франция, 18042 N1902) и 2F7 (Abeam, Cambridge. UK; ab43812). Также анализируют Fab Синагиса®, Fab Numax и Fab F101, причем Fab Numax имеют наименьшую величину IC50 (8,6 Е-11 М), затем следуют Fab Синагиса® (5,97 Е-10 М) и Fab F101 (1,12 Е-9 М). Для скрининга периплазматических экстрактов (при разведении 1/25) как Fab Numax (40 нМ), так и Fab F101 (40 нМ) используют в качестве положительного контроля, в то время как несоответствующие периплазматические экстракты служат в качестве отрицательного контроля. Клоны, которые препятствуют связыванию белка F_TM-NN в Alphascreen® более, чем на 75% относительно отрицательного контроля, идентифицируют как подходящие (хиты). В целом идентифицируют 341 хит из 1856 клонов, полученных от 6 лам, но большинство исходит от лам 206 и 207. Кроме того, из 8 клонов, полученных при отборе наноклонов, 3 клона проявляют конкуренцию.

Проводят деконволюцию корректного антигенного сайта (II или IV-VI) конкурентов посредством конкурентного ELISA с биотинилированными Fab Синагиса® (2 нМ) или биотинилированными Fab F101 (3 нМ) за связывание с белком F_TM-NN (1 мкг/мл). Коротко, белок F_TM-NN иммобилизуют на титрационных микропланшетах Maxipor (Nunc), и свободные сайты связывания блокируют с использованием 4% Marvel в PBS. Периплазматические экстракты перед связыванием с иммобилизованным белком F_TM-NN разводят 1/10 и смешивают с биотинилированными Fab. Включают контрольные периплазматические фракции, отобранные против других белков оболочки вируса. Конкурирующим антителам создают возможность связываться с иммобилизованным антигеном с или без нанотела®. После инкубации и стадии промывки осуществляют детекцию с помощью вторичных антител, конъюгированных с экстравидином-HPR (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО; кат. №Е2886). Специфичность связывания определяют на основании величин OD при сравнении с контролем, не получавшим нанотело®.

Все хиты подвергают анализу последовательностей и классифицируют в семейства согласно их последовательностям CDR3 (см. таблицу С-4 и А-1 в заявке РСТ/ЕР2009/056975, озаглавленной «Аминокислотные последовательности, направленные против белков оболочки вируса и включающие их полипептиды для лечения вирусных заболеваний», зарегистрированной Ablynx N.V. 5 июня 2009).

Пример 6. Скрининг на нанотела®, нейтрализующие RSV

Из всех шести библиотек hRSV 163 уникальные библиотеки (160, идентифицированные из фаговых библиотек, 3, полученные из наноклонов) анализируют на способность нейтрализовать RSV Long в анализе микронейтрализации в виде частично очищенных белков. Клетки Нер2 высевают в концентрации 1,5×10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) с добавлением пенициллина и стрептомицина (100 Е/мл и 100 мкг/мл, соответственно), и инкубируют в течение 24 часов при 37ºС в атмосфере с 5% СО₂. Используемый штамм вируса называется штамм hRSV long. Long LM-2 и Long M-2 (используются как взаимозаменяемые) и представляет собой штамм вируса, полученный из АТСС, VR-26, последовательность белка F которого соответствует Р12568 или М22643. Штамм вируса от АТСС пересевают несколько раз. Подтверждают, что последовательность белка F идентична Р12568 (см. пример 9). Стандартное количество штамма hRSV Long LM-2 предварительно инкубируют с серийными разведениями фиксированного объема нанотел®, очищенных Phytips (20 мкл), в общем объеме 50 мкл в течение 30 минут при 37ºС. Среду клеток Нер2 заменяют премиксом для возможности заражения в течение 2 часов, после чего добавляют 0,1 мл среды для анализа. Анализ осуществляют в среде DMEM с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки и пенициллина и стрептомицина (100 Е/мл и 100 мкг/мл, соответственно). Клетки инкубируют еще в течение 72 часов при 37ºС в атмосфере с 5% CO₂, после чего клетки дважды промывают 0,05% твином-20 в PBS и один раз одним PBS, после чего клетки фиксируют 80% холодным ацетоном (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) в PBS (100 мкл/лунка) в течение 20 минут при 4ºС и оставляют для полного высыхания. Затем детектируют наличие белка F на клеточной поверхности в анализе типа ELISA. Для этой цели фиксированные клетки Нер2 блокируют 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре и затем инкубируют в течение 1 часа с Синагисом® (2 мкг/мл). Для детекции используют козий античеловеческий IgG, HRP-специфический Fcy-фрагмент (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), после чего проводят ELISA согласно стандартным процедурам.

Кроме идентифицированных ранее RSV-нейтрализующих нанотел® 191D3 (SEQ ID NO: 9) и 192С4 (SEQ ID NO: 11), которые при скрининге включают в качестве положительного контроля, 5 клонов антигенного сайта II проявляют сильную активность нейтрализации RSV Long: 1E4 (также называемый 207D1; SEQ ID NO: 1), 7 В2 (SEQ ID NO: 2), NC23 (SEQ ID NO: 3) и два члена того же семейства 15Н8 (SEQ ID NO: 4) и NC41 (SEQ ID NO: 5) (таблица А-1). Ни одно из нанотел®, специфических для антигенного сайта IV-VI, не показало в отношении штамма hRSV Long LM-2 активность нейтрализации большую, чем очень слабая.

Пример 7. Продуцирование нанотел® против hRSV

Кроме идентифицированных ранее RSV-нейтрализующих нанотел® 191D3 (SEQ ID NO: 9) и 191E4 (SEQ ID NO: 10), которые при скрининге включают в качестве положительного контроля, пять новых нейтрализующих нанотел®, отобранных при описанном выше скрининге (1E4, 782, 15Р8, NC23 и NC41) а также 1 антитело к антигенному сайту (IV-VI) (15 В3; SEQ ID NO: 7) экспрессируют, очищают и характеризуют дополнительно. Для этой цели кодирующие последовательности клонируют повторно в экспрессирующем векторе, полученном из pUC119, который содержит промотор LacZ, ген устойчивости к канамицину, сайт множественного клонирования и сигнальную пептидную последовательность ОтрА. В рамке с последовательностью, кодирующей нанотело, вектор кодирован для С-концевой метки с-myc и метки (His)6.

Экспрессию осуществляют в клетках Е.coli TG-1 как экспрессию c-myc, His6-меченных белков в культуральном объеме 1 л. Экспрессию индуцируют добавлением 1 мМ IPTG и продолжают в течение 3 часов при 37°С. После центрифугирования клеточных культур получают периплазматические экстракты замораживанием-оттаиванием осадков и ресуспендированием в dPBS. Полученные экстракты используют в качестве исходного материала для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC) с использованием исходных колонок с Histrap FF (GE healthcare, Uppsala, Швеция). Нанотела® элюируют из колонки 250 мМ имидазолом и затем обессоливают против dPBS.

Пример 8. Характеризация нанотел® против hRSV

Связывание с белком F в ELISA

Показано, что все очищенные нанотела® связываются в ELISA на связывание с белком F с белком F_TM-NN и hRSV. Результаты для связывания hRSV приводятся в таблице В-1. Коротко, 1 мкг/мл F_TM-NN или 5 мкг/мл hRSV (Hytest Turku, Финляндия) иммобилизуют непосредственно на титрационных микропланшетах Maxisorp.Свободные сайты связывания блокируют 1% казеином. Серийным разведениям очищенных нанотел® позволяют связываться с антигеном в течение 1 часа. Связывание нанотела® обнаруживают с использованием кроличьих вторичных антител против VHH и конечной детекции с козьими антикроличьими антителами, конъюгированными с HRP. Специфичность связывания определяют на основании величин OD при сравнении с контролем несоответствующими нанотелами®.

Связывание с белком F в Biacore

Для того, чтобы определить аффинности связывания очищенных нанотел®, выполняют кинетический анализ с использованием анализа методом поверхностного плазменного резонанса на белке F_TM-NN. Для предварительной инкубации Sensorchip CMS и 10 мкг/мл белка hRSV F_TM-NN оставляют на 120 секунд. Для иммобилизации аминосочетанием используют EDC/NHS для активации и гидрохлорид этаноламина для дезактивации (Biacore, набор для аминосочетания). Добавляют 100 нМ Синагиса® и затем 100 нМ нанотел. Оценку констант скорости k_off выполняют путем подбора модели взаимодействия 1:1 (модель связывания по Ленгмюру) с помощью программы Biacore Т100, v1.1. Константы скорости k_off и константы аффинности приводятся в таблице В-1.

Конкуренция с Синагисом®

Способность очищенных нанотел® конкурировать с Mab Синагисом® или биотинилированными Fab Синагиса® за связывание с F_TM-NN определяют в конкурентном ELISA, следуя процедуре, по существу, описанной в примере 5. Фигура 1 показывает характерный пример конкурентного ELISA, в котором очищенные нанотела® конкурируют с биотинилированными Fab Синагиса® за связывание с F_TM-NN. Величины ЕС50 сведены в таблице В-1.

Пример 9. Микронейтрализация различных штаммов hRSV in vitro

Активность очищенных нанотел® при нейтрализации различных штаммов hRSV типа А и В проверяют анализом микронейтрализация in vitro (см. пример 6). Исходные вирусные штаммы RSV Long LM-2 (инвентарный №Р12568; АТСС VR-26), RSV А-2 (АТСС VR-1540; партия №3199840) и RSV В-1 (АТСС VR-1580, партия №5271356) получают в клетках Нер2 и затем титруют для определения оптимальной инфицирующей дозы для использования в анализе микронейтрализации. Результаты активности нейтрализации различных очищенных нанотел® приводятся в таблице В-1. Хотя все шесть нанотел®, которые узнают эпитоп Синагиса®, могут эффективно нейтрализовать штаммы Long типа А и А-2, они не в состоянии нейтрализовать заражение штаммом В-1 или делают это при концентрациях >1 мкМ. Конкуренты 101F 1583 и 191 Е4 проявляют очень слабую активность нейтрализации на штамме В-1 только когда введены в мкМ концентрациях.

Последовательности соответствующих белков F различных штаммов RSV подтверждают посредством ПЦР с обратной транскриптазой и последующим анализом последовательностей. Коротко, из инфицированных RSV клеток Нер2 выделяют тотальную РНК с использованием миникита RNeasy (Qiagen, Venio, Нидерланды), после чего получают комплементарную ДНК с использованием набора обратных транскриптаз Superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA). Белок F штаммов RSV А амплифицируют и секвенируют с использованием праймеров, описанных Kimura et al., 2004 (Antiviral Research, 61:165-171). Для амплификации белка F штамма RSV В-1 используют следующие праймеры: FB1_outer_for: cttagcagaaaaccgtga (SEQ ID NO: 13); FB1_outer_rev: tgggttgatttgggattg (SEQ ID NO: 14); FB1_seq_1 123-for: ggactgatagaggatggta (SEQ ID NO: 15); FB1_seq_1526-rev: gctgacttcacttggtaa (SEQ ID NO: 16). Последовательность штамма RSV В-1 соответствует номеру доступа PI 3843 с дополнительной точечной мутацией Ser540Leu. Последовательность для штамма RSV Long LM-2 полностью соответствует описанной последовательности (инвентарный №М22643). Последовательность штамма RSV A-2 соответствует номеру доступа №M11486. См. также таблицу А-2.

Пример 10. Конструирование, получение и характеризация поливалентных нанотел® против hRSV

Поливалентные конструкции нанотел®, соединенных линкерами Gly-Ser, различной длины и состава генерируют посредством отдельных реакций ПЦР (1 для N-концевой, для серединной (в случае трехвалентной конструкции) и 1 для С-концевой субъединицы нанотела®) с использованием различных наборов праймеров, включающих специфические сайты рестрикции. Подобным образом получают поливалентные конструкции, соединенные линкером Ala-Ala. Все конструкции клонируют в экспрессирующий вектор, полученный из pUCl 19, который содержит промотор LacZ, ген устойчивости к канамицину, сайт множественного клонирования и сигнальную пептидную последовательность OmpA. В рамке с последовательностью, кодирующей нанотело®, вектор кодирован для С-концевой метки с-myc и метки (His)6. В случае, когда в поливалентной конструкции присутствует линкер 35 Gly-Ser, используют экспрессирующий вектор, полученный из pUCl 19, который содержит промотор LacZ, ген устойчивости к канамицину, сайт множественного клонирования и сигнальную пептидную последовательность OmpA. Непосредственно ниже сигнального пептида присутствует сайт множественного клонирования для встраивания нанотела®, затем линкер 35 Gly-Ser, кодирующий последовательность ДНК, и второй сайт множественного клонирования для клонирования второй последовательности нанотела®. В рамке с полученной кодирующей последовательностью нанотело®-35 Gly-Ser-нанотело® вектор кодирует С-концевую метку с-myc и метку (His)6. В таблице В-2 перечисляются поливалентные конструкции, полученные с нанотелами® против RSV. Последовательности поливалентных конструкций приводятся в таблице А-3.

Поливалентные конструкции нанотел® против RSV экспрессируют, очищают и затем характеризуют. Продуцирование осуществляют в клетках Е.coli TG1 с последующей очисткой из периплазматической фракции через метку His IMAC и обессоливанием, по существу, так, как описано в примере 7. В случае некоторых трехвалентных конструкций (например, RSV401, RSV404, RSV406) Продуцирование осуществляют в Р. pastoris с последующей очисткой из фракции среды. Все трехвалентные нанотела® подвергают гель-фильтрации как конечной стадии для удаления возможных двухвалентных и моновалентных продуктов разрушения.

Связывание очищенных поливалентных нанотел® с белком F hRSV подтверждают в ELISA как на белке F_TM-, так и на hRSV (см. пример 8). Для большинства нанотел форматирование в двухвалентные и трехвалентные конструкции приводит к четкому, но ограниченному (повышение до 10 раз) эффекту авидности, за исключением поливалентных 782 и NC23, которые показывают величины ЕС50, схожие с их моновалентными аналогами (как показано для 782 на фигуре 2).

Пример 11. Активность двух- и трехвалентных конструкций для нейтрализации hRSV

Активность конструкций нанотел® оценивают в анализе нейтрализации RSV на различных штаммах RSV (см. примеры 6 и 9). Двухвалентные нанотела®, связывающие антигенный сайт II, проявляют заметное возрастание активности в 100-1000 раз (т.е. намного больше, чем возрастание аффинности) при нейтрализации Long относительно своих моновалентных аналогов, с величинами IC50 в интервале 50-380 пМ, что лучше или схоже с Fab Numax. Однако для штамма RSV B-1 активность возрастает значительно меньше, и ни одна димерная конструкция не является более активной, чем Синагис®. Что неожиданно, это можно преодолеть путем получения трехвалентных конструкций, как видно на фигуре 3. Трехвалентные конструкции с тремя нанотелами®, связывающими антигенный сайт II, по меньшей мере, в 1000 раз более активно нейтрализуют штаммы RSV B-1, чем их моновалентные аналоги.

Пример 12. Реактивность моновалентных нанотел® в отношении «ускользнувших» мутантов штамма Long

Ряд «ускользнувших» мутантов, описанных в Lopez et al., 1988 (J. ViroL, 72:6922-6928) и специфических для антигенного сайта II (R47F/4, R47F/7, RAK13/4, R7C2/11, R7C2/1) или IV-VI (R7.936/1, R7.936/4, R7.936/6, R7.432/1) или сочетания обоих (RRA3), отбирают для испытания их реактивности с 10 моновалентными нанотелами®, включая нанотело® 191С7 (SEQ ID NO: 8), идентифицированное ранее как несвязывающееся с антигенными сайтами II или IV-VI.

Такой анализ выполняют согласно Lopez et al., 1988 (J. ViroL, 72:6922-6928). Коротко, каждое нанотело® проверяют, при 0,2 мкг/мл, в ELISA с использованием экстрактов антигенов клеток Нер2, инфицированных различными «ускользнувшими» мутантами. Результаты по поглощению нормализуют в отношении реактивности к эталонному штамму вируса (дикий тип Long), а также к контрольному нанотелу 191С7. Результаты приводятся в таблице В-3.

Реактивность >75% показывают в виде темных сплошных квадратов, густо заштрихованные квадраты соответствуют реактивности от 75 до 50%, менее заштрихованные квадраты соответствуют реактивности 25-50%, и реактивность менее 25% показана пустыми квадратами. Как правило, обнаруживают, что нанотела®, уже идентифицированные ранее как связывающие антигенный сайт II (192С4, 191D3, 191F2, NC23, 15Н8, 7 В2 и NC41), чувствительны к типичным мутациям в антигенном сайте II, в то время как другие нанотела®, уже идентифицированные как связывающие антигенный сайт IV-VI, действительно чувствительны к мутациям в указанных сайтах.

Пример 13. Реактивность поливалентных нанотел® в отношении «ускользнувших» мутантов штамма Long

Затем анализируют ряд поливалентных конструкций для оценки связывания в отношении ограниченной панели «ускользнувших» мутантов. Такой анализ выполняют согласно Lopez et al., 1988 (J. Virol., 72:6922-6928). Коротко, каждое нанотело® проверяют, при 0,1 мкг/мл для моновалентных нанотел® и 0,05 мкг/мл для двух- или трехвалентных нанотел®, в ELISA с использованием экстрактов антигенов клеток Нер2, инфицированных различными «ускользнувшими» мутантами. Результаты по поглощению нормализуют в отношении реактивности к эталонному штамму вируса (дикий тип Long), a также к контрольному нанотелу 191С7. Результаты приводятся в таблице В-4.

Реактивность >75% показывают в виде темных сплошных квадратов, густо заштрихованные квадраты соответствуют реактивности от 75 до 50%, менее заштрихованные квадраты соответствуют реактивности 25-50%, и реактивность менее 25% показана пустыми квадратами. Примечательно, что поливалентные конструкции проявляют улучшенное связывание с мутантом вируса R7C2/11 по сравнению с их моновалентными аналогами. Кроме того, бипаратопная конструкция не чувствительна к любому из мутантов.

Пример 14. Нейтрализация «ускользнувших» мутантов штамма Long поливалентными нанотелами®

В примерах 12 и 13 описывается связывание моновалентных нанотел® с типичными «ускользнувшими» мутантами антигенного сайта II и/или IV-VI RSV. Связывание нанотел®, специфически узнающих такие антигенные сайты, почти полностью утрачивается или существенно уменьшается. Форматирование таких нанотел® в двух- или трехвалентные конструкции частично восстанавливает связывающую активность, но не в отношении всех трех вирусов «ускользнувших» мутантов. Связывание с «ускользнувшим» мутантом R7C2/1 (мутация К272Е в антигенном сайте II) остается на уровне ниже 25% для любой двух- или трехвалентной конструкции, состоящей только из нанотел®, связывающих антигенный сайт II. Нанотела® 1583 и 191Е4, которые связываются с антигенным сайтом IV-VI, являются единственными нанотелами® (как таковые или в бипаратопной конструкции), способными связываться с указанным мутантом на уровне 75% или больше.

Более подробный анализ результатов показывает, что связывание с R7C2/1 несколько возрастает, когда возрастает валентность нанотела®. Связывание конструкций 7 В2 составляет 0, 4,4 и 13% соответственно для моновалентного, двухвалентного (RSV106) и трехвалентного (RSV400) форматов. Ожидается, что такой низкий уровень остаточного связывания приведет к весьма сильной потере активности нейтрализации RSV.

Активность нейтрализации нанотел оценивают на том же выбранном наборе «ускользнувших» мутантов, который описан в примере 13. Для такой цели моновалентные нанотела® 7 В2, 15Н8 и NC41 сравнивают с их соответствующими трехвалентными аналогами RSV400, RSV 404 и RSV 407. Следует заметить, что в примере 13 только RSV400 оценивают на связывание указанных «ускользнувших» мутантов. Кроме того, также анализируют бипаратопную молекулу RSV 493 (7В2-15В3-7В2) на ее нейтрализующую способность.

Выполняют анализ микронейтрализации hRSV, по существу, так, как описано в примере 6. Коротко, клетки Нер2 высевают в концентрации 1,5×10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) с добавлением пенициллина и стрептомицина (100 Е/мл и 100 мкг/мл, соответственно), и инкубируют в течение 24 часов при 37ºС в атмосфере с 5% CO₂. В клетках Нер2 получают исходные штаммы различных вирусов и затем титруют для определения оптимальной инфицирующей дозы для использования в анализе микронейтрализации. Стандартное количество определенного штамма hRSV предварительно инкубируют с серийными разведениями очищенных нанотел® в общем объеме 50 мкл в течение 30 минут при 37ºС. Среду клеток Нер2 заменяют премиксом для возможности заражения в течение 2 часов, после чего добавляют 0,1 мл среды для анализа. Анализ осуществляют в среде DMEM с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки и пенициллина и стрептомицина (100 Е/мл и 100 мкг/мл, соответственно). Клетки инкубируют еще в течение 72 часов при 37ºС в атмосфере с 5% CO₂, после чего клетки дважды промывают 0,05% твином-20 в PBS и один раз одним PBS, после чего клетки фиксируют 80% холодным ацетоном (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) в PBS (100 мкл/лунка) в течение 20 минут при 4ºС и оставляют для полного высыхания. Затем детектируют наличие белка F на клеточной поверхности в анализе типа ELISA. Для этой цели фиксированные клетки Нер2 блокируют 5% раствором свиного сывороточного альбумина в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре и затем инкубируют в течение 1 часа с поликлональной кроличьей сывороткой против белка F (Corral et al., 2007, BMC BiotechnoL, 7:17) или с Синагисом® (2 мкг/мл). Для детекции используют козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с HRP, или козий античеловеческий IgG, HRP-специфический Fcy-фрагмент (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), после чего проводят ELISA согласно стандартным процедурам.

Как видно на фигурах 4А-С, моновалентные нанотела® почти не имеют нейтрализующего потенциала в отношении антигенного сайта II вирусов «ускользнувших» мутантов RC7C2/11 и RC7C2/1. Активность нейтрализации антигенного сайта IV-VI варианта R7.936/4 сравнима с активностью нейтрализации штамма Long дикого типа. Такие результаты соответствуют результатам по связыванию в примере 12 и картированию эпитопов, описанному для указанных нанотел® в примере 5.

Однако конструкции трехвалентных нанотел активно нейтрализуют все 3 «ускользнувшие» мутанта (фигуры 4 D-G). Максимальное ингибирование наблюдают при таких низких концентрациях, как примерно 20 нМ, в то время как такой уровень ингибирования для моновалентных конструкций не наблюдают при концентрациях до 2 мкМ. Активная нейтрализация RC7C2/1, почти эквивалентная нейтрализации RC7C2/11, является самой большой неожиданностью, так как в примере 13 показана весьма существенная потеря активности для трехвалентной молекулы RSV400, которая, как ожидалось, приведет к весьма высокой потери активности нейтрализации. Двухвалентный Palivizumab IgG Синагис®, также узнающий антигенный сайт II, не способен существенно блокировать репликацию RC7C2/1 или RC7C2/11 при концентрациях примерно 0,2 мкМ. При такой концентрации IC50 не достигается, в то время как R7.936/4 и вирус Long дикого типа нейтрализуются с IC50 в несколько нМ (данные не приводятся).

Пример 15. Анализ влияния длины линкера на активность трехвалентных NC41

Для того, чтобы определить влияние длины линкера трехвалентных NC41, получают различные конструкции с линкерами в интервале от 3Ala, 9G5, 15GS до 20 GS (RSV408, RSV409, RSV407 и RSV410, соотв.). Все четыре трехвалентные конструкции NC41 также способны полностью нейтрализовать штаммы RSV как В-1, так и Long (фигура 5). Не наблюдают влияния длины линкера на нейтрализацию RSV Long, так как все конструкции являются равнозначно активными. Напротив, конструкции с линкерами 9G5 и 3Ala имеют повышенные величины IC50 в отношении штамма В-1, показывая, что для максимальной активности требуется линкер минимальной длины 9G5. Это можно объяснить с помощью такого наблюдения, что уже двухвалентные конструкции NC41 являются весьма активными нейтрализаторами, в то время как в отношении штамма В-1 различие в активности между двухвалентным и трехвалентным NC41 является значительно большим (см. пример 11). В RSV408 и RSV409 удобство применения среднего нанотела® может быть менее оптимальным.

Пример 16. Гуманизация нанотела® NC41

Последовательность нанотела® NC41 выравнивают с человеческой зародышевой VH3-23 для возможности отбора остатков, подходящих для дальнейшей гуманизации последовательности нанотела®. Кроме того, осуществляют анализ in silico для идентификации остатков, которые потенциально предрасположены к посттрансляционным модификациям, таким как изомеризация Asp, и для идентификации мутаций, которые могут улучшить химическую стабильность. Участки CDR и так называемые характерные остатки, которые известны как существенные для стабильности и активности нанотел®, исключаются для модификации.

Для NC41 выбирают в целом 11 позиций для мутации до соответствующего человеческого остатка: одновременно вводят четыре мутации (Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gln108Leu), так как не ожидается, что указанные остатки существенно повлияют па функцию нанотела® (на основании данных о других нанотелах®). В таком базовом варианте семь остатков, о которых неизвестно, допускается ли мутация до человеческого аналога (Ser19Arg, Ile201eu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln), мутируют с использованием подхода с библиотекой, допускающего дикий тип или соответствующую аминокислоту человека в каждой позиции. Полученную библиотеку, 128 с теоретическим различием, генерируют путем использования набором генов с использованием перекрывающихся олигонуклеотидных последовательностей, с вырожденными кодонами, и затем клонируют в экспрессирующий вектор, полученный из pUC119, который содержит промотор LacZ, ген устойчивости к канамицину, сайт множественного клонирования и сигнальную лидерную последовательность OmpA. В рамке с кодирующей последовательностью нанотело® вектор кодирует С-концевую метку с-myc и метку (His)6. Нанотела® получают в периплазме Т.coli (см. пример 7). Различие библиотек подтверждают анализом последовательностей.

Получают периплазматические экстракты из 368 отдельных вариантов NC41 и NC41 дикого типа и подвергают воздействию системы функционального скрининга для идентификации наилучшего гуманизированного варианта NC41 в плане как активности, так и стабильности. На первой стадии определяют в ELISA связывание RSV гуманизированных вариантов NC41 с RSV Long (Hytest, Turku, Финляндия; #8RSV79) (см. пример 8).

Затем положительные связывающие варианты анализируют на связывание с клетками Нер2, инфицированными штаммами RSV B-1. Для такой цели клетки Нер2 высевают в 96-луночные планшеты и инфицируют штаммом RSV B-1, по существу, следуя процедуре, описанной для анализа нейтрализации (см. пример 6). Через трое суток клетки фиксируют холодным ацетоном, и планшеты используют в анализе ELISA с использованием периплазматических экстрактов в различных разведениях. Нанотело®, связывающееся с клетками Нер2, инфицированными В-1, детектируют с использованием кроличьих поликлональных анти-VHH антител и затем козьих антикроличьих антител, конъюгированных с HRP, после чего проводят ELISA согласно стандартным процедурам.

Кроме того, для того, чтобы подтвердить, влияют ли введенные мутации на температурную стабильность, периплазматические экстракты всех связывающих вариантов греют при 74ºС в течение 2 часов, что на 5ºС выше температуры плавления NC41 дикого типа. Анализируют в ELISA связывание с RSV long до и после нагревания, и отношение сигнала связывания после нагревания к сигналу связывания до нагревания принимают за меру температурной устойчивости.

Наконец, определяют кинетические константы скорости k_off вариантов в анализе Biacore на белке F_TM-NN, как описано в примере 8.

Все связывающие варианты секвенируют и выстраивают в ряд в соответствии с их способностью связывать белок F RSV. Когда анализируют последовательности самых сильных связывающих вариантов, во всех классах наблюдают четкое предпочтение Gln105 (человеческий остаток). В то время как мутация Ile20Leu оказывается недостаточно представленной, для всех других позиций нет четкого предпочтения в отношении последовательности дикого типа или человеческой последовательности, причем варианты содержат до 10 мутаций по сравнению с NC41 дикого типа. Примечательно, в одном варианте наблюдают дополнительную точечную мутацию (Gly54Asp) в участке CDR2. Этот вариант - вариант 6 NC41 показывает самый низкий k_off из всех вариантов и NC41 дикого типа, приводящий к повышению аффинности.

На основании последовательности и функциональных данных отбирают 18 вариантов (таблица А-1) для дальнейшей характеризации как очищенных белков (фигуры 6 и 7). Все варианты получают и очищают, и определяют активность нейтрализации RSV Long и В-1 в анализе микронейтрализации. Хотя большинство вариантов проявляют активность, весьма схожую с NC41 дикого типа, некоторые варианты проявляют повышенную активность в отношении как Long (2-кратную), так и В-1 (6-кратную), причем самыми сильными нейтрализаторами являются варианты NC41 6, 8, 9, 17 и 18. Особенно, вариант 18 максимально гуманизирован в 11 позициях с дополнительным введением Asp54 в участок CDR2. Варианты 10 и 11 более активны при нейтрализации штамма В-1, чем NC41, но не штамма Long.

Для выбранной панели вариантов NC41 определяют кинетические параметры связывания в анализе Biacore на белке F_TM-NN (таблица В-5), как описано в примере 8. Не наблюдают существенного различия в расчетных данных для NC41 и гуманизированных вариантов NC41 6, 8 и 17. Следует отметить, что константы скорости on всех вариантов NC41 при детекции ограничены прибором, но константы скорости off можно выстроить в ряд v06<v17<NC41<v08. Влияние мутации Gly на Asp в CDR2 (позиция 54) можно четко показать при сравнении v17 и v18, так как это является единственным различием в таких максимально гуманизированных вариантах. Нейтрализацию как штамма Long, так и штамма В-1 проверяют в двух независимых анализах при сравнении с NC41 дикого типа, как показано в таблице В-5. В обоих анализах NC41v18 является более активным, чем NC41 для обоих вирусов, и в обоих анализах NC41v18 является более активным, чем NC41v17 для штамма Long. Улучшенную нейтрализацию NC41vl8 также наблюдают для штамма В-1 во втором анализе.

Все варианты NC41 подвергают вызываемому теплом разворачиванию для оценки действия введенных мутаций на стабильность белка. С этой целью определяют температуру плавления (Т_пл) ступенчатым повышением температуры в присутствии Sypro Orange - красителя, который связывается с остатками Trp, которые становятся доступными для воздействия после разворачивания белка. Все варианты показывают повышенную Т_пл относительно NC41 дикого типа (69ºС) до 9ºС в случае варианта 18.

Пример 17. Дополнительная оптимизация последовательности NC41 для экспрессии

Последовательность нанотела® NC41 также анализируют с помощью оптимизации экспрессии в Pichia pastoris. Варианты NC41 19-26 создают, комбинируя гуманизированные позиции, которые, как показано, разрешены без потери активности в анализе микронейтрализации (пример 16). Одновременно вводят четыре мутации (Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu), в то время как три мутации проверяют как по отдельности, так и в каждой возможной комбинации (Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln) (см. таблицу А-4). Все конструкции клонируют в экспрессирующий вектор и вводят в штамм Pichia pastoris XL-33, после чего оценивают число включений в геном Pichia количественной ПЦР в реальном времени. Из каждой конструкции отбирают один клон с 1-2 копиями и один с четырьмя или больше копиями для получения в небольшом масштабе, и оценивают выход экспрессии вариантов NC41 относительно дикого типа гель-электрофорезом в гелях для SDS-PAGE. Варианты NC41 20, 22, 24, 25 и 26 показывают наивысшую экспрессию с уровнями экспрессии, схожими с NC41 дикого типа уже при малом числе копий.

Варианты NC41 22 и 26 повторно клонируют в экспрессирующий вектор для получения в Е.coli и очистки нанотел, меченных Myc-His (см. пример 7). Активность обоих вариантов для нейтрализации RSV Long проверяют в анализе микронейтрализации, как описано в примере 6. Оба варианта равно эффективны с NC41 дикого типа (IC50 126 и 310 нМ для v22 и v26, соответственно).

Пример 18. Оптимизация последовательности RSV407 для химической стабильности

Во время получения нанотел и полипептидов по изобретению на аминоконце наблюдают пироглутамат (pGlu) (через ОФ-ПЦР). Уровни pGlu свыше 15% детектируют после ферментации, и уровень pGlu устойчиво повышается при хранении во время изучения стабильности. Поэтому N-концевой глутамат (Е) заменяют на аспартат (D). Это может устранить возможность посттрансляционных модификаций N-конца до pGlu и, следовательно, ведет к повышенной стабильности продукта.

Аминокислотная последовательность варианта нанотела®, оптимизированного по последовательности, приводится, соответственно, в таблице А-5 (RSV434; SEQ ID NO: 142). Для получения такого нанотела® разрабатывают систему экспрессии в Pichia на основе коммерчески доступной системы от Invitrogen с использованием Х-33 в качестве штамма-хозяина. В системе используется промотор АОХ1 для управления продуцированном нанотела® и используется альфа-пептид секреции при спаривании для секреции нанотела® в среду.

Оптимизированный по последовательности RSV434 анализируют на уровни экспрессии через ОФ-ВЭЖХ, SE-ВЭЖХ и сравнивают с исходной молекулой (RSV407) в отношении нейтрализации RSV.

Не имеется существенных различий в уровне экспрессии при сравнении с RSV407, и клоны как с низким, так и высоким числом копий образуются больше, чем 1 г/л осветленной среды (бесклеточной).

В колонку с 1 мл МЕР Hypercel вносят образцы в один мл, элюируют и анализируют SE-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. Анализ SE-ВЭЖХ показывает мономерный материал, в то время как анализ ОФ-ВЭЖХ, как и ожидалось, ясно показывает отсутствие пост-пика pGlu.

RSV434 также очищают от среды, вносят в МЕР Hypercel и окончательно очищают анионообменной хроматографией.

Анализ микронейтрализации hRSV выполняют, по существу, так, как описано в примере 6. Фигура 9 показывает нейтрализацию штаммов RSV как Long, так и В-1 как RSV407, так и его оптимизированным по последовательности вариантом RSV434.

Пример 19. Получение поливалентных конструкций гуманизированного и/или оптимизированного по последовательности нанотела® NC41 Гуманизированные варианты NC41 из примера 16 форматируют в виде трехвалентных конструкций с использованием линкеров 15GS (последовательности показаны в таблице А-5). Трехвалентные конструкции получают и очищают так, как описано в примере 10. Фигура 8А показывает нейтрализацию штаммов RSV как Long, так и В-1 двумя трехвалентными гуманизированными вариантами NC41 с их соответствующими моновалентными нанотелами®. Фигура 8В показывает нейтрализацию штаммов RSV как Long, так и В-1 трехвалентными вариантами NC41. Величины IC50 для нейтрализации штаммов RSV Long и В-1 трехвалентными вариантами NC41 приводятся в таблице В-7. Подобно исходному NC41 трехвалентный NC41 (RSV407) и трехвалентные гуманизированные варианты NC41 нейтрализуют Long примерно в 60 раз эффективнее, чем Синагис®. На штамме В-1 трехвалентные конструкции являются более активными нейтрализаторами, чем синагис, но в данном случае также незначительно усиленными по сравнению с трехвалентным исходным NC41 RSV407 в следующем порядке: RSV427>RSV426>RSV414. Таким образом оказывается, что повышенная активность моновалентных вариантов для В-1 должна привести к несколько улучшенным трехвалентным конструкциям.

На основании дополнительной оптимизации последовательности, показанной в примерах 17 и 18, получают ряд других трехвалентных конструкций (таблица 6). Все конструкции клонируют в экспрессирующий вектор Pichia pastoris, переносят в Pichia и подвергают ферментации для проверки уровня экспрессии, стабильности и активности. Как при экспрессии в небольшом масштабе при встряхивании в колбе, так и при ' ферментации RSV440 (вариант 26) и RSV441 (вариант 22) показывают высокие уровни экспрессии.

Пример 20. Эффективность поливалентных конструкций in vitro Нейтрализующую способность нанотела RSV434 и синагиса оценивают в анализе уменьшения бляшкообразования против клинических изолятов 31 RSV/A и 30 RSV/B. Оба анти-RSV соединения, а также синагис испытывают в одной концентрации 40 мкг/мл.

Синагис и RSV434 - оба проявляют хорошую эффективность, причем соответственно 87% и 97% штаммов уменьшается в титрах вирусов, по меньшей мере, в 100 раз по сравнению с контролем PBS (таблица В-8). RSV434 показывает большую нейтрализующую способность по сравнению с синагисом. Большинство штаммов RSV (84%) полностью ингибируются RSV434, в то время как синагисом полностью ингибируется значительно меньше штаммов (20%) (таблица В-8).

Пример 21. Эффективность поливалентных конструкций in vivo Модель хлопкового хомяка является отличной классической моделью для RSV. В этой модели хлопковых хомяков инфицируют штаммом RSV/Tracy (день 0), и через 4 дня после заражения оценивают вирусные титры и вирусную РНК при лаваже легких и в носовых смывах. При профилактической постановке наблюдают существенное и зависящее от дозы снижение вирусной нагрузки после интраназального введения RSV407 за 24 часа до заражения RSV (фигура 10).

Кроме того, используют терапевтический подход, при котором зараженных хлопковых хомяков обрабатывают нанотелами через 24 часа или 48 час после заражения, причем посредством этого имитируют ситуацию заражения RSV людей. В обоих случаях наблюдают существенное ингибирование вирусной репликации (таблица В-9 и фигура 11).

Во всех исследованиях, выполненных на сегодняшний день, нанотела доставляют интраназально как имитацию доставки в легкие. С использованием такого способа введения 9-41% нанотела поступает в легкие по оценке ELISA при бронхиальном лаваже, проведенном вскоре после введения.

В попытке преодоления возможного влияния остаточного нанотела при лаваже легких детекцию вирусов откладывают на день 7 после инокуляции. Отдельное фармакокинетическое исследование, выполненное на крысах Sprague Dawley, позволяет оценить время полужизни нанотела в легких как составляющее примерно 10,8. В день 7, который является 5-6 днем после последнего введения, нанотела в достаточной степени удаляются из легких и долее не влияют на анализ. Вирусная нагрузка у положительных контрольных животных падает с 10Е5 до 10Е2 бое/мл. Тем не менее, все еще возможно показать уменьшение примерно на 0,6 log за счет обработки RSV407 (таблица В-9).

Как альтернативный подход, проводят ПЦР для обнаружения вирусной РНК. Как в профилактических, так и терапевтических экспериментах наблюдают существенное снижение РНК RSV (таблица В-9).

Пример 22. Образование «ускользнувших» мутантов RSV

Для того, чтобы идентифицировать остатки, критические для контакта с белком F, анализируют образование ускользнувших» мутантов RSV Long после культивирования в присутствии нанотел при их концентрации, примерно соответствующей IC50. Используют как моновалентное NC41 (при 5 мкг/мл), так и его трехвалентную конструкцию RSV407 (при 2,5 нг/мл), а также биспецифический трехвалентный вариант RSV414 (NC41-15B3-NC41) для того, чтобы убедиться, будет ли конструкция, которая узнает два различных эпитопа, влиять на временную рамку появления «ускользнувшего» вируса. После 12 пассажей последовательной инкубации Long на клетках Нер2 в присутствии нанотел наблюдают рост без вируса в условиях с моновалентным NC41, но, неожиданно, не с трехвалентными нанотелами. Очищают отдельные штаммы вирусов из бляшек для повторных циклов, после чего можно определить последовательность белка F возможного «ускользнувшего» варианта. Идентифицируют два различных «ускользнувших» варианта для NC41 - NC41 /13 с мутацией N262Y и NC41/17, содержащий мутацию N276Y.

Таблицы

Таблица А-1
Последовательности моновалентных нанотел®, которые связывают белок F RSV
Нанотело®	SEQ ID NO:	Последовательность
1Е4	1
207D1
7 В2	2
NC23	3
15Н8	4
19С4
NC41	5
NC39	6
15В3	7
191С7	8
191D3	9
1G3
191Е4	10
1В2
192С4	11
192F2	12

Таблица А-2
Последовательности белка F
Белок F	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV LONG	17
М-2
RSV A-2	18
RSV B-1	19

Таблица А-3
Аминокислотные последовательности поливалентных конструкций, которые связывают hRSV
Конструкция	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV101	20
RSV102	21
RSV103	22
RSV104	23
RSV105	24
RSV106	25
RSV107	26
RSV108	27
RSV109	28

Таблица А-3
Продолжение
Конструкция	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV110	29
RSV113	30
RSV114	31
RSV115	32
RSV116	33
RSV201	34
RSV202	35
RSV203	36
RSV204	37

Таблица А-3
Продолжение
Конструкция	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV205	38
RSV206	39
RSV207	40
RSV301	41
RSV302	42
RSV303	43
RSV305	44
RSV306	45

Таблица А-3
Продолжение
Конструкция	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV400	46
RSV401	47
RSV402	48
RSV403	49
RSV404	50
RSV405	51

Таблица А-3
Продолжение
Конструкция	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV406	52
RSV407	53
RSV408	54
RSV409	55
RSV410	56

Таблица А-3
Продолжение
Конструкция	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV411	57
RSV412	58
RSV413	59

Таблица А-4
Последовательности гуманизированных и/или оптимизированных по последовательности вариантов NC41
Нанотело	SEQ ID	Последовательность
NC41v01	60
NC41v02	61
NC41v03	62
NC41v04	63
NC41v05	64
NC41v06	65
NC41v07	66
NC41v08	67
NC41v09	68
NC41v10	69
NC41v11	70
NC41vl2	71
NC41v13	72
NC41v14	73
NC41v15	74
NC41v17	75
NC41v18	76
NC41v19	146

Таблица А-4
Продолжение
Нанотело®	SEQ ID	Последовательность
NC41v20	147
NC41v21	148
NC41v22	149
NC41v23	150
NC41v24	151
NC41v25	152
NC41v26	153
NC41 E1D	138
NC41v03 E1D	139
NC41v06 E1D	140
NC41vl8 E1D	141
NC41vl7 E1D	154
NC41v21 E1D	155
NC41v22 E1D	156
NC41v26 E1D	157

Таблица A-5
Аминокислотные последовательности поливалентных гуманизированных и/или оптимизированных по последовательности конструкций, которые связывают hRSV
Нанотело	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV414	77
RSV426	78
RSV427	79
RSV442	158
RSV436	159
RSV438	160

Таблица А-5
Продолжение
Нанотело®	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV439	161
RSV434	142
RSV443	143
RSV444	144
RSV445	145
RSV435	162

Таблица А-5
Продолжение
Нанотело®	SEQ ID NO:	Последовательность
RSV437	163
RSV441	164
RSV440	165

Таблица А-7
Линкерные последовательности
Линкер	SEQ ID NO:	Последовательность
5GS	124	GGGGS
7GS	125	SGGSGGS
9GS	126	GGGGSGGGS
10GS	127	GGGGSGGGGS
15GS	128	GGGGSGGGGSGGGGS
18GS	129	GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS	130	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS	131	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS	132	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS	133	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1 шарнирный участок	134	EPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1 шарнирный участок	135	GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
G3 шарнирный участок	136	ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCP
3Ala	137	ААА

Таблица В-1
Характеристики нанотел®, которые связывают белок F RSV
Клон	Семейство	Эпитоп	Связывание hRSV	Конкуренция Fab Синагиса®	Кинетический анализ	IC50 нейтрализации RSV (нМ)(n=2)
			EC50	EC50	ka (1/Ms)	kd(1/s)	KD	Long	A-2	B1
191D3	LG 3sub2	II	1.5E-10	5.9E-09	1.5E+06	2.8E-03	1.9E-09	253	227	-
1Е4	LG 3sub2	II	6.6E-11	4.5E-09	8.0E+05	1.3E-03	1.6E-09	380	298	ND
7В2	16	II	9.0E-11	1.9E-09	5.7E+05	6.5E-04	1.1E-09	91	177	2690
NC23	34	II	1.0E-10	2.3E-09	8.0E+05	7.4E-04	9.2E-10	144	109	-
15Н8	29	II	8.3E-10	3.9E-08	1.2E+06	2.1E-02	1.6E-08	200	218	2340
NC41	29	II	4.1E-10	3.2E-08	8.2E+05	6.7E-03	8.1E-09	58	26	4000
15В3	4sub1	IV-VI	5.8E-11	-	4.1E+05	2.7E-04	6.7E-10	-	-	1274
191Е4	LG21	IV-VI	8.3E-11	-	5.7E+05	1.5E-04	2.7E-10	-	-	4327
Synagis®		II			2.8E+05	1.8E-04	6.4E-10	4	2.5	1.7

Таблица В-2
Номенклатура конструкций поливалентных нанотел®, направленных против белка F hRSV
Тип	Название	Конструкция	SEQ ID NO
Двухвалентная	RSV101	191D3-15GS-191D3	20
	RSV102	191D3-25GS-191D3	21
	RSV103	191D3-35GS-191D3	22
	RSV104	191D3-9GS-191D3	23
	RSV105	7B2-9GS-7B2	24
	RSV106	7B2-15GS-7B2	25
	RSV107	15H8-9GS-15H8	26
	RSV108	15H8-15GS-15H8	27
	RSV109	NC23-9GS-NC23	28
	RSV110	NC23-15GS-NC23	29
	RSV113	15B3-15GS-15B3	30
	RSV114	NC39-20GS-NC39	31
	RSV115	191E4-18GS-191E4	32
	RSV116	NC41-15GS-NC41	33

Бипаратопная	RSV201	191D3-9GS-191E4	34
	RSV202	191D3-15GS-191E4	35
	RSV203	191D3-25GS-191E4	36
	RSV204	7B2-15GS-15H8	37
	RSV205	7B2-15GS-15B3	38
	RSV206	15H8-15GS-15B3	39
	RSV207	15H8-15GS-7B2	40
	RSV301	191E4-9GS-191D3	41
	RSV302	191E4-15GS-191D3	42
	RSV303	191E4-25GS-191D3	43
	RSV305	15B3-15GS-7B2	44
	RSV306	15B3-15GS-15H8	45

Трехвалентная	RSV400	7B2-15GS-7B2-15GS-7B2	46
	RSV401	7B2-15GS-7B2-15GS-15B3	47
	RSV402	15B3-15GS-7B2-15GS-7B2	48
	RSV403	7B2-15GS-15B3-15GS-7B2	49
	RSV404	15H8-15GS-15H8-15GS-15H8	50
	RSV405	191D3-15GS-191D3-15GS-191D3	51
	RSV406	NC23-15GS-NC23-15GS-NC23	52
	RSV407	NC41-15GS-NC41-15GS-NC41	53
	RSV408	NC41 -AAA-NC41 -AAA-NC41	54
	RSV409	NC41-9GS-NC41-9GS-NC41	55
	RSV410	NC41 -20GS-NC41 -20GS-NC41	56
	RSV411	NC41-15GS-NC41-15GS-15B3	57
	RSV412	15B3-15GS-NC41-15GS-NC41	58
	RSV413	NC41-15GS-15B3-15GS-NC41	59

Таблица В-5
Нейтрализация и кинетические параметры связывания в Biacore на белке F_TM-NN для отобранных вариантов NC41
Название	IC50 нейтрализации (нМ)	Biacore (Fim. NN)
Long	B1	Long	B1	ka(1/Mc)	Kd(1/c)	KD(M)
NC41	202	4707	122	3291	1.7E+06	6.70E-03	4.00E-09
NC41v03	255	1507	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
NC41v06	111	806	н.о.	н.о.	2.0E+06	4.80E-03	2.50E-09
NC41vl7	249	677	149	346	1.9E+06	6.90E-03	3.20E-09
NC41vl8	116	728	98	194	н.о.	н.о.	н.о.
Синагис	7.3	2.1	6.0	2.9

Таблица В-6
Трехвалентные гуманизированные и/или оптимизированные по последовательности варианты NC41
Название	Конструкция	SEQ ID NO
RSV414	NC41v03-15GS-NC41v03-15GS-NC41v03	77
RSV426	NC41v06-15GS-NC41v06-15GS-NC41v06	78
RSV427	NC41v18-15GS-NC41v18-15GS-NC41v18	79
RSV434	NC41^E1D-15GS-NC41-15GS-NC41	142
RSV435	NC41v17^E1D-15GS-NC41v17-15GS-NC41v17	162
RSV436	NC41v20-15GS-NC41v20-15GS-NC41v20	159
RSV437	NC41v20^E1D-15GS-NC41v20-15GS-NC41v20	163
RSV438	NC41v22-15GS-NC41v22-15GS-NC41v22	160
RSV439	NC41v26-15GS-NC41v26-15GS-NC41v26	161
RSV440	NC41v26^E1D-15GS-NC41v26-15GS-NC41v26	165
RSV441	NC41v22^E1D-15GS-NC41v22-15GS-NC41v22	164
RSV442	NC41v17-15GS-NC41v17-15GS-NC41v17	158
RSV443	NC41v03^E1D-15GS-NC41v03-15GS-NC41v03	143
RSV444	NC41v06^E1D-15GS-NC41v06-15GS-NC41v06	144
RSV445	NC41v18^E1D-15GS-NC41v18-15GS-NC41v18	145

Таблица В-7
Нейтрализация Long и В-1 трехвалентными вариантами NC41
ID Трехвалентный	Long	В-1
IC50 [M]	Отношение к Синагису	IC50 [M]	Отношение к Синагису
RSV407	NC41	9,41Е-11	59	6,6Е-10	3
RSV414	NC41v03	7,81Е-11	72	1,61Е-10	11
RSV426	NC41v06	8,98Е-11	63	9,32Е-11	20
RSV427	NC41vl8	9,13Е-11	62	4,61Е-11	40

Таблица В-9
Обзорная таблица всех экспериментов, выполненных на хлопковых хомяках, показывающая как детекцию репликации компетентного вируса, так и вирусной РНК в день 4 после инокуляции (в эксперименте 3 детекцию также выполняют в день 7)
	Доза нанотела	Схема обработки	Различие вирусной нагрузки с контролем (log₁₀ бое)	Уменьшение складок вирусной РНК (2^∆CT)
Эксп.	RSV407
1	5 мг/кг	Профилактическая,	-2,59*	286,7*
		день -1	-2,88*	4,4*
		Терапевтическая, день	-2,83*	4,6*
		+1, 2, +3
		Терапевтическая, день
+2, +3
Эксп.	RSV407
2	5 мг/кг	Профилактическая,	-3,01*	79,2*
	1 мг/кг	день -1	-2,37*	61,3*
	0,2 мг/кг		-1,43*	28,1*
0,04 мг/кг		-0,37	11,7*
Эксп.	RSV407
3	5 мг/кг	Терапевтическая, день	-2,04*	2,9*
		+1	(0,63*)	(1,8)
		(считано в день 7)	-2,47*	2,5*
		Терапевтическая, день	(0,57)	(4,5*)
		+1, +2
(считано в день 7)
Эксп.	RVS407
4	0,2 мг/кг	Профилактическая,	-0,75*	29,8*
	RSV503	день -1
	1 мг/кг		-1,27*	31,4*
	0,2 мг/кг		-0,71*	30,4*
0,04 мг/кг	-0,22*	15,5*
Эксп.	RSV434
5	20 мг/кг	Терапевтическая, день	-2,89*	10,2*
	4 мг/кг	+2, +3	-1,76*	1,9
	2 мг/кг		-1,81*	5,5*
1 мг/кг		-1,66*	3,9*
Эксп.	RSV434
6	5 мг/мл	Терапевтическая, день	-3,15*	10*
6	20 мг/мл	+2, +3	-2,64*	2,4*
80 мг/мл		-3,30*	4,3*
* р<0,05

1. Полипептид, который специфически связывается с белком F hRSV и содержит или по существу состоит из трех одиночных вариабельных доменов, которые специфически связывают белок F hRSV, и при этом каждый одиночный вариабельный домен выбран из следующего от а) до f):
a) SEQ ID NO: 60-76;
b) одиночных вариабельных доменов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, более предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 60-76 при условии, что
i) указанный одиночный вариабельный домен содержит глютамин (Glu, Q) в положении 105 (указанное положение определено согласно нумерации по Кабату); и
ii) указанный одиночный вариабельный домен связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 15 нМ до 1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или указанный одиночный вариабельный домен имеет значение IC₅₀ между 100 нМ и 500 нМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long);
c) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;
d) одиночных вариабельных доменов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157 при условии, что
i) одиночный вариабельный домен содержит аспарагиновую кислоту (Asp, D) в положении 1 (указанное положение определено согласно нумерации по Кабату); и
ii) одиночный вариабельный домен связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 15 нМ до 1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или одиночный вариабельный домен имеет значение IC₅₀ между 100 нМ и 500 нМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long);
e) SEQ ID NO: 146-153;
f) одиночных вариабельных доменов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 146-153 при условии, что
i) одиночный вариабельный домен содержит пролин (Pro, Р) в положении 14, аргинин (Arg, R) в положении 19, лейцин (Leu, L) в положении 20 и лейцин (Leu, L) в положении 108 (указанные положения определены согласно нумерации по Кабату); и
ii) одиночный вариабельный домен связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 15 нМ до 1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или одиночный вариабельный домен имеет значение IC₅₀между 100 нМ и 500 нМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long).

2. Полипептид по п. 1, который содержит или по существу состоит из трех одиночных вариабельных доменов с SEQ ID NO: 5, в которых мутированы один или несколько аминокислотных остатков, выбранные из следующих: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D.

3. Полипептид по п. 1, который содержит или по существу состоит из трех одиночных вариабельных доменов с SEQ ID NO: 5, в которых мутированы следующие аминокислотные остатки:
- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;
- Gly54Asp;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Glu1Asp;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Arg105Gln;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

4. Полипептид по п. 1, который специфически связывает белок F hRSV, выбранный из следующих полипептидов от а) до f):
a) SEQ ID NO: 77-79 и 158;
b) полипептидов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 77-79 и 158 при условии, что
i) одиночные вариабельные домены, заключенные в указанном полипептиде, содержат глутамин (Gln, Q) в положении 105, лейцин (Leu, L) в положении 78, аргинин (Arg, R) в положении 83 и/или глутаминовую кислоту (Glu, Е) в положении 85 (указанные положения определены согласно нумерации по Кабату); и
ii) полипептид связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 1 нМ до 0.1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или полипептид имеет значение IC₅₀ между 50 пМ и 200 пМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long);
c) SEQ ID NO: 142-145 и 162-165;
d) полипептидов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 142-145 и 162-165 при условии, что
i) первый одиночный вариабельный домен, заключенный в указанном полипептиде, имеет аспарагиновую кислоту (Asp, D) в положении 1; и
ii) полипептид связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 1 нМ до 0.1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или полипептид имеет значение IC₅₀ между 50 пМ и 200 пМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long);
e) SEQ ID NO: 159-161;
f) полипептидов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 159-161 при условии, что
i) одиночные вариабельные домены, заключенные в указанном полипептиде, содержат пролин (Pro, Р) в положении 14, аргинин (Arg, R) в положении 19, лейцин (Leu, L) в положении 20 и лейцин (Leu, L) в положении 108 (указанные положения определены согласно нумерации по Кабату); и
ii) полипептид связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 1 нМ до 0.1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или полипептид имеет значение IC₅₀ между 50 пМ и 200 пМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long).

5. Полипептид по п. 4, содержащий или по существу состоящий из SEQ ID NO: 53, в которой первая глутаминовая кислота заменена на аспарагиновую кислоту.

6. Полипептид по п. 4 или 5, содержащий или по существу состоящий из SEQ ID NO: 53, в котором в по меньшей мере одном (предпочтительно в двух, предпочтительнее во всех трех) одиночном вариабельном домене, который(ые) образует(ют) часть SEQ ID NO: 53, мутированы один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать) аминокислотных остатков, выбранные из следующих: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp.

7. Полипептид по п. 4, содержащий или по существу состоящий из SEQ ID NO: 53, в котором в по меньшей мере одном одиночном вариабельном домене, который образует часть SEQ ID NO: 53, мутирован(ы) следующий(ие) аминокислотный(ые) остаток(тки):
- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;
- Gly54Asp;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Glu1Asp;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Arg105Gln;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

8. Полипептид по п. 4, содержащий или по существу состоящий из одной из SEQ ID NO: 142-145 и 162-165.

9. Одиночный вариабельный домен, который специфически связывает белок F hRSV, выбранный из следующих от а) до h):
a) SEQ ID NO: 60-76;
b) одиночных вариабельных доменов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, более предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 60-76 при условии, что
i) указанный одиночный вариабельный домен содержит глютамин (Glu, Q) в положении 105 (указанное положение определено согласно нумерации по Кабату); и
ii) указанный одиночный вариабельный домен связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 15 нМ до 1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или значение IC₅₀ между 100 нМ и 500 нМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long);
c) SEQ ID NO: 138-141 и 154-157;
d) одиночных вариабельных доменов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 138-141 и 154-157 при условии, что
i) одиночный вариабельный домен содержит аспарагиновую кислоту (Asp, D) в положении 1 (указанное положение определено согласно нумерации по Кабату); и
ii) одиночный вариабельный домен связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 15 нМ до 1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или одиночный вариабельный домен имеет значение IC₅₀между 100 нМ и 500 нМ или менее (как определено в анализе микронейтрализации на hRSV Long);
e) SEQ ID NO: 146-153;
f) одиночных вариабельных доменов, которые имеют не более 3, предпочтительно не более 2, предпочтительнее не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO: 146-153 при условии, что
i) одиночный вариабельный домен содержит пролин (Pro, Р) в положении 14, аргинин (Arg, R) в положении 19, лейцин (Leu, L) в положении 20 и лейцин (Leu, L) в положении 108 (указанные положения определены согласно нумерации по Кабату); и
ii) одиночный вариабельный домен связывает белок F hRSV с константой диссоциации (K_D) от 15 нМ до 1 нМ или менее (при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса) и/или одиночный вариабельный домен имеет значение IC₅₀между 100 нМ и 500 нМ или менее (как определено анализе микронейтрализациина hRSV Long);
g) одиночных вариабельных доменов с SEQ ID NO: 5, в которых мутированы один или несколько аминокислотных остатков, выбранные из следующих: Val5Leu, Ala14Pro, Ser19R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54D;
h) одиночных вариабельных доменов с SEQ ID NO: 5, в которых мутированы следующие аминокислотные остатки:
- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gln108Leu;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln, Gln108Leu и Gly54Asp;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln и Gly54Asp;
- Gly54Asp;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln;
- Glu1Asp;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu и Gln108Leu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Ala83Arg;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Asp85Glu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu и Arg105Gln;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg и Asp85Glu;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Arg105Gln;
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Asp85Glu и Arg105Gln; или
- Glu1Asp, Ala14Pro, Ser19Arg, Ile20Leu, Gln108Leu, Ala83Arg, Asp85Glu и Arg105Gln.

10. Применение одиночного вариабельного домена по п. 9 для получения полипептида по любому из пп. 4-8.

11. Нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид по любому из пп. 1-8.

12. Нуклеиновая кислота, которая кодирует одиночный вариабельный домен по п. 9.

13. Применение нуклеиновой кислоты по п. 12, которая кодирует одиночный вариабельный домен по п. 9, для получения генетической конструкции, которая кодирует полипептид по любому из пп. 1-8.

14. Клетка-хозяин, которая экспрессирует или которая в подходящих условиях способна экспрессировать полипептид по любому из пп. 1-8, одиночный вариабельный домен по п. 9, и которая содержит нуклеиновую кислоту по любому из пп. 11 или 12.

15. Организм-хозяин, выбранный из кролика, коровы, козы, овцы, растения или тутового шелкопряда, который экспрессирует или который в подходящих условиях способен экспрессировать полипептид по любому из пп. 1-8, одиночный вариабельный домен по п. 9, и который содержит нуклеиновую кислоту по любому из пп. 11 или 12.

16. Композиция для профилактики и/или лечения инфекции hRSV, содержащая эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-8, одиночного вариабельного домена по п. 9 или нуклеиновой кислоты по любому из пп. 11 или 12.

17. Композиция по п. 16, которая представляет собой фармацевтическую композицию.

18. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения инфекции hRSV, содержащая эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-8, одиночного вариабельного домена по п. 9 и носитель, подходящий для доставки в легкие.

19. Способ получения полипептида по любому из пп. 1-8 или одиночного вариабельного домена по п. 9, включающий, по меньшей мере, стадии:
a) экспрессии в подходящих клетке-хозяине или организме-хозяине или бесклеточной системе экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп. 11-12,
или
культивирования и/или поддержания организма-хозяина по п. 15 или клетки-хозяина по п. 14 в условиях, которые таковы, что указанные организм-хозяин или клетка-хозяин экспрессируют и/или продуцируют полипептид по любому из пп. 1-8 или одиночный вариабельный домен по п. 9, необязательно, с последующим
b) выделением и/или очисткой полипептида по любому из пп. 1-8, одиночного вариабельного домена по п. 9, полученных таким образом.

20. Способ получения композиции по любому из пп. 16-18, включающий, по меньшей мере, стадии:
a) экспрессии в подходящих клетке-хозяине, или организме-хозяине, или бесклеточной системе экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп. 11-12,
или
культивирования и/или поддержания организма-хозяина по п. 15 или клетки-хозяина по п. 14 в условиях, которые таковы, что указанные организм-хозяин или клетка-хозяин экспрессируют и/или продуцируют полипептид по любому из пп. 1-8, одиночный вариабельный домен по п. 9 или композицию по любому из пп. 16-18,
b) выделение и/или очистка полипептида по любому из пп. 1-8, одиночного вариабельного домена по п. 9, полученных таким образом;
с последующим
c) составлением фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один полипептид по любому из пп. 1-8 или одиночный вариабельный домен по п. 9 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и, необязательно, один или более дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

21. Способ получения полипептида по любому из пп. 5-8, включающий, по меньшей мере, стадии соединения трех одиночных вариабельных доменов по п. 9 и одного или нескольких линкеров.

22. Способ профилактики и/или лечения заражения hRSV, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества полипептида по любому из пп. 1-8, одиночного вариабельного домена по п. 9 и/или композиции по любому из пп. 16-18.

23. Способ профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания, выбранного из респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества полипептида по любому из пп. 1-8, одиночного вариабельного домена по п. 9 и/или композиции по любому из пп. 16-18.

24. Полипептид по любому из пп. 1-8 для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания, выбранного из респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы.

25. Одиночный вариабельный домен по п. 9 для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания, выбранного из респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы.

26. Композиция по любому из пп. 16-18 для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания, выбранного из респираторного заболевания, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, бронхиолита (воспаления мелких дыхательных путей в легких), пневмонии, одышки, кашля, (рецидивирующего) стридора и астмы.

27. Фармацевтическое устройство для доставки в легкие полипептида по любому из пп. 1-8 или одиночного вариабельного домена по п. 9, содержащее полипептид по любому из пп. 1-8, одиночный вариабельный домен по п. 9 и/или композицию, включающую их.

28. Фармацевтическое устройство по п. 27, которое представляет собой ингалятор для жидкостей (например, суспензии тонких твердых частиц или капель), аэрозоль или ингалятор для сухого порошка, включающее полипептид по любому из пп. 1-8 или одиночный вариабельный домен по п. 9.

Предложенное изобретение относится к иммунологии. Предложены варианты антител, нейтрализующих инфекцию субтипа группы 1 и субтипа группы 2 вируса гриппа А.

Новый птичий астровирус // 2547589

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к новому птичьему астровирусу; к антителам и их фрагментам, направленным против указанного нового вируса; к антигенным препаратам, белкам и ДНК-молекулам нового птичьего астровируса; к вакцинам на основе указанного нового вируса или к его антигенным препаратам, белку или ДНК; к способам получения таких вакцин и к диагностическим наборам.

Молекула, специфически связывающаяся с rsv // 2540020

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны антитела и их функциональные эквиваленты, способные специфически связываться с RSV.

Способ нейтрализации вируса гепатита с, полностью человеческое моноклональное антитело против вируса гепатита с (варианты), композиция полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с и гибридная мышь/человек клеточная линия - продуцент полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с (варианты) // 2539770

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты способы и технологии нейтрализации вируса гепатита С, а также антитела против вируса гепатита С.

Противовирусное однодоменное мини-антитело, нуклеотидная последовательность, экспрессирующий рекомбинантный вирусный вектор, фармацевтическая композиция и способ профилактики или терапии гриппа типа а // 2536956

Настоящее изобретение относится к вирусологии и предполагает использование однодоменных мини-антител для профилактики и терапии гриппа. Заявлено однодоменное мини-антитело, специфически связывающееся с определенным эпитопом гемагглютинина вируса гриппа типа A (H5N2) и подавляющее инфекцию вируса гриппа типа A (H5N2).

Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. cchfv vd-1-продуцент моноклонального антитела 4g4/b6 к вирусу крым-конго геморрагической лихорадки // 2535982

Изобретение относится к биотехнологии. Описывается штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L.

Тримеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с гликопротеином g вируса бешенства, нейтрализующее вирус бешенства // 2533802

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вирусологии и предполагает использование антител, представляющих собой тримеризованные однодоменные антитела, для профилактики и терапии бешенства.

Рсв-специфичные связывающие молекулы и средства для их получения // 2527067

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Представлены выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональная часть, способные специфически связывать F-антиген респираторно-синцитиального вируса, которые включают: вариабельную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDR1 NYIIN (SEQ ID NO:1), CDR2 GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO:2), CDR3 ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO:3), и вариабельную последовательность легкой цепи, содержащую CDR1 QASQDIVNYLN (SEQ ID NO:4), CDR2 VASNLET (SEQ ID NO:5), CDR3 QQYDNLP (SEQ ID NO:6); а также нуклеотидная последовательность, кодирующая указанное антитело.

Мономерный домен vhh, полученный из анти-vp6-антител верблюдовых, димерный домен, способ иммунизации, способ выявления ротавирусов, композиция, способы профилактики и лечения ротавирусных инфекций // 2490275

Антитела против вируса гепатита с // 2462475

Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты гуманизированных антител и их фрагменты, которые связываются с белком Е2 вируса гепатита С. .

Бензо[1,2,4]тиадиазиновые ингибиторы репликации вируса гепатита в и фармацевтическая композиция для лечения гепатита в // 2574397

Изобретение относится к новым ингибиторам репликации вируса гепатита В, представляющим собой 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-оны общей формулы 1, их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты.

Лекарственное средство для предотвращения и/или лечения гепатоклеточной карциномы // 2574009

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой Фармацевтическое средство для ингибирования рецидива гепатоклеточной карциномы после ее лечения, содержащее перетиноин в сочетании с L-изолейцином, L-лейцином и L-валином.

Производные (4-метилсульфониламинофенил)-хинолина, полезные при лечении гепатита с // 2572835

Изобретение относится к области органической химии, а именно к соединению, выбранному из группы N-{4-[7-трет-бутил-8-метокси-5-(2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-хинолин-2-ил]-фенил}-метансульфон-амида; N-{4-[7-трет-бутил-8-метокси-5-(6-метил-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-хинолин-2-ил]-фенил}-метансульфонамида; и N-{4-[7-трет-бутил-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2H-пиримидин-1-ил)-8-метокси-хинолин-2-ил]-фенил}-метансульфонамида; или к его фармацевтически приемлемой соли.

Противовирусные гетероциклические соединения // 2572558

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I), которые обладают свойствами ингибитора HCV NS5B РНК-полимеразы. Соединения могут быть использованы для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV). В формуле (I) : X представляет собой СН или N, R1 выбран из группы, состоящей из R1a, R1c: где R1a возможно замещен C1-6алкилом, C1-6алкокси или гидрокси, и где R1c возможно замещен C1-6алкилом; R2 представляет собой (а) арил, выбранный из фенила, или (б) NRaRb, где указанный арил возможно замещен (CH2)nNRcRd; Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, представляют собой 5-членный циклический амин, замещенный группой (CH2)nNRcRd, где n означает число от нуля до двух; Rc и Rd независимо представляют собой водород, O2SR4, где R4 представляет собой C16алкил; R3 представляет собой CR4aR4bR4c, где: 1) R4a, R4b и R4c независимо выбраны из С1-3алкила.

Противовирусные соединения и их применения // 2571662

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I) и их фармацевтически приемлемым солям, которые, inter alia, ингибируют гепатотропный вирус HCV и могут быть использованы при лечении вируса гепатита С.

Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с // 2568872

Изобретение относится к области медицины и генной инженерии и предназначено для лечения вирусного гепатита С (ВГС). Предложено лекарственное средство, содержащее модифицированные псевдовирионы фага MS2, оболочка которых создана белками «А» и «В» фага MS2, а часть геномной РНК, кодирующая «репликазу», заменена РНК, способной селективно уничтожать клетки, зараженные вирусом гепатита С или его РНК репликоном, при этом геном модифицированного псевдовириона фага MS2 характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO 1.

Нуклеозидные ингибиторы рнк-полимеразы hcv ns5b, способы их получения и применения // 2567854

Изобретение относится к С3алкиловым эфирам (S)-2-{[(2R,3R,5R)-5-(4-амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-4,4-дифтор-3-гидрокси-тетрагидрофуран-2-илметокси]фенокси-фосфориламино}-пропионовой кислоты общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемым солям.

Конструкция // 2565537

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Раскрыта конструкция, которая, при экспрессии в клетке-хозяине, является способной продуцировать пустые вирусные капсиды.

Способ лечения детей с ротавирусной инфекцией // 2564899

Изобретение относится к медицине, в частности к лечению в условиях стационара детей раннего возраста с таким распространенным заболеванием, как ротавирусная инфекция.

Адъюванты-разбавители для живых вакцин от болезней свиней // 2557968

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для борьбы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней (PRRS). Способ включает вакцинирование свиней с PRRS с обеспечением уменьшения длительности гипертермии и защиты целостности легких.

Рекомбинантный иммунотоксин, специфичный к клеткам, экспрессирующим рецептор her2 // 2576232

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается рекомбинантного иммунотоксина, специфичного к клеткам, экспрессирующим рецептор HER2. Рекомбинантный иммунотоксин содержит направляющий модуль в виде антитела формата scFv, включающего вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального гуманизированного HER2-специфичного антитела, соединенные между собой линкером, и токсический модуль в виде фрагмента псевдомонадного экзотоксина А ЕТА.