Способ удаления пеногасителя из культуральной жидкости после ферментации


 


Владельцы патента RU 2577146:

Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Способ удаления пеногасителя из культуральной жидкости после ферментации микроорганизмов-продуцентов полезных веществ предусматривает удаление из культуральной жидкости биомассы микроорганизмов - продуцентов полезных веществ и введение в культуральную жидкость солей фосфорной кислоты до достижения концентрации в культуральной жидкости от 100 мМ до 200 мМ. Полученный осадок комплекса силиконового пеногасителя и соли фосфорной кислоты удаляют центрифугированием. Изобретение позволяет успешно проводить стадию ультрафильтрации полученного супернатанта, содержащего целевое вещество. 7 з.п. ф-лы, 1 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к способам обработки культуральных жидкостей после ферментации при получении полезных биологических веществ при культивировании в питательных средах микроорганизмов, продуцирующих такие вещества.

Описание предшествующего уровня техники

При культивировании в питательных средах микроорганизмов, продуцирующих полезные вещества, часто используют различные пеногасители.

Одними из наиболее часто используемых пеногасителей при получении полезных биологических веществ, например белков, таких ферменты, антитела и т.п., являются силиконовые пеногасители, поскольку они превосходят органические аналоги по пеногасящей способности, работают эффективнее, действуют дольше, отличаются экономичностью (расход от 0,00001 до 1 вес.%). Силиконовые пеногасители химически инертны к большинству веществ, действуют независимо от компонентов, вызывающих вспенивание, применяются в широком диапазоне температур (от -40°С до +250°С), отличаются малой токсичностью, нелетучестью, способностью работать в различных средах, пожаро-взрывобезопасностью.

Однако, указанные пеногасители, оставаясь в культуральной жидкости после ферментации, затрудняют последующие стадии очистки целевого продукта, замедляют процесс фильтрации, засоряют мембраны и фильтры, использующиеся на стадии очистки, негативно влияют на качество целевого продукта, так как, находясь в окружении белковой глобулы, могут непредсказуемо менять степень аффинности молекул белка к тому или иному носителю на стадиях хроматографии, искажать диэлектрические, гидратационные свойства белка при растворении, осаждении, фазовых переходах молекул и т.п., затрудняя тем самым отработку и стандартизацию методики получения искомого продукта.

В качестве наиболее близкого аналога можно привести способ удаления пеногасителя в ходе обработки культуральных жидкостей, полученных после ферментации микроорганизмов, описанный в патенте США 4,931,397. При этом способе удаление силиконового пеногасителя из культуральной жидкости осуществляют путем внесения в указанную культуральную жидкость, после удаления из нее биомассы микроорганизма-продуцента, минеральной глины, в частности бентонита, с последующим отделением комплекса силиконового пеногасителя с глиной из культуральной жидкости в виде осадка.

Следует заметить, что применение бентонита хоть и позволяет перевести пеногаситель в нерастворимую фазу за счет высокой сорбционной способности монтмориллонита Al2[Si4O10](OH)2·nH2O, входящего в состав бентонита (55-70%), но может также приводить к существенным потерям белка за счет высокой сорбционной активности алюмосиликатов и их способности к сильному набуханию. Введение же бентонита в виде суспензии не решает проблемы сильной сорбции белка, лишь немного ее уменьшая, но только увеличивает реакционный объем, что тоже нежелательно при проектировании техпроцессов в промышленности. Кроме того, после осаждения бентонитом пеногасителя, в некоторых случаях может потребоваться деалюминизация супернатанта, что приводит к утяжелению техпроцесса и дополнительным потерям целевого продукта.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является создание простого и эффективного способа удаления силиконовых пеногасителей из культуральных жидкостей после ферментации микроорганизмов - продуцентов полезных биологических веществ для облегчения и улучшения последующей очистки этих веществ.

Оптимальным подходом к удалению пеногасителя из раствора является не его растворение и перевод в органическую фазу, а осаждение его из раствора.

Поставленная задача была решена путем обнаружения того факта, что при добавлении в культуральную жидкость фосфатов раствор мутнеет, а после центрифугирования полученной смеси образуется белесо-желтый, маслянистый осадок. После такой обработки полученный супернатант, содержащий полезное вещество, успешно проходил стадию ультрафильтрации.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ удаления силиконового пеногасителя из культуральной жидкости, образовавшейся после ферментации микроорганизмов - продуцентов полезных веществ, включающий стадии внесения в указанную культуральную жидкость, после удаления из нее биомассы микроорганизма-продуцента, солей фосфорной кислоты, и отделение осадка комплекса силиконового пеногасителя с солью фосфорной кислоты из культуральной жидкости.

Настоящее изобретение также предоставляет способ, в котором указанным силиконовым пеногасителем является полимер силоксана, выбранный из группы, включающей полиметилсилоксан, полидиметилсилоксан и их смесь.

Настоящее изобретение также предоставляет способ, в котором указанным полезным веществом является белок, выбранный из группы, включающей ферменты, антитела, белковые факторы, а также их фрагменты и производные.

Настоящее изобретение также предоставляет способ, в котором указанной солью фосфорной кислоты является фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат или их смесь.

Настоящее изобретение также предоставляет способ, в котором указанную соль фосфорной кислоты вводят до достижения ее концентрации в диапазоне от 100 мМ до 200 мМ в культуральной жидкости.

Настоящее изобретение также предоставляет способ, в котором после внесения в культуральную жидкость солей фосфорной кислоты устанавливают pH раствора, оптимальный для целевого продукта при таком составе раствора.

Настоящее изобретение также предоставляет способ, в котором отделение осадка комплекса силиконового пеногасителя с солью фосфорной кислоты осуществляют центрифугированием.

Таким образом, настоящее изобретение позволяет реализовать технологию получения различных полезных веществ с высокой степенью эффективности, в частности, при использовании методов ультрафильтрации на стадии очистки целевого продукта.

Подробное описание настоящего изобретения

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось разработка эффективного способа удаления силиконового пеногасителя из культуральной жидкости, что позволило бы эффективно использовать метод ультрафильтрации на стадии очистки целевого продукта, а также избежать потенциальных артефактов в процессе выделения при стандартизации метода.

Поставленная задача была решена путем обнаружения того факта, что при добавлении в культуральную жидкость фосфатов раствор мутнеет, а после центрифугирования полученной смеси образуется белесо-желтый, маслянистый осадок. После такой обработки полученный супернатант, содержащий полезное вещество, успешно проходил стадию ультрафильтрации.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ удаления силиконового пеногасителя из культуральной жидкости, образовавшейся после ферментации микроорганизмов - продуцентов полезных веществ, включающий стадии введения солей фосфорной кислоты в указанную культуральную жидкость после удаления из нее биомассы микроорганизма-продуцента и отделение осадка комплекса силиконового пеногасителя с солью фосфорной кислоты из культуральной жидкости.

Силиконовые пеногасители включают полимерные соединения общей формулы [R2SiO]n, где R = органическая группа (например, метильная, этильная, фенильная и т.д.). Конкретными примерами силиконовых пеногасителей являются полиметилсилоксан, полидиметилсилоксан, но не ограничиваются ими.

Культуральной жидкостью называют водную суспензию, образующуюся в ходе ферментации микроорганизмов в питательной среде, содержащую биомассу микроорганизмов, целевой продукт, произведенный указанными микроорганизмами, остатки питательного бульона и других компонентов, необходимых для размножения микроорганизмов в ходе ферментации и т.п.

К полезным веществам, которые могут быть получены в результате ферментации микроорганизмов, относятся различные белки, например ферменты, антитела, белковые факторы, гормоны (например, инсулин и человеческий гормон роста), а также их фрагменты и производные. Пептиды также включены в термин «белок» согласно настоящему изобретению. В рамках настоящего изобретения термины «полезное вещество» и «целевой продукт» являются синонимами.

Соли фосфорной кислоты включают фосфаты, гидрофосфаты и дигидрофосфаты. В качестве противоиона может быть использован ион щелочного металла, например калия или натрия, ион аммония, другие подходящие ионы. Предпочтительно вводить соли фосфорной кислоты в количестве, создающем концентрацию соли в диапазоне от 100 мМ до 200 мМ в культуральной жидкости.

После введения соли фосфорной кислоты предпочтительно установить pH раствора, оптимальный для целевого продукта. Необходимое значение pH устанавливают путем добавления в раствор кислоты или щелочи в зависимости от того, какое значение pH требуется.

Отделение осадка комплекса силиконового пеногасителя с солью фосфорной кислоты осуществляют любым подходящим методом, например фильтрованием или центрифугированием.

Способ получения целевого вещества обычно включает стадии выращивания микроорганизма - продуцента полезного вещества в питательной среде, подходящей для выращивания указанных микроорганизмов, и выделения целевого продукта полезного вещества из культуральной жидкости.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, различные органические кислоты, а также другие сырьевые материалы, такие как свекловичный жом, отруби и другие подобные материалы. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п. В качестве источника ростовых факторов и аминокислот при культивировании грибных продуцентов также может использоваться кукурузный экстракт и т.п.

Очистка целевого продукта может осуществляться любым способом, известным специалисту в данной области техники, таким как, например, фильтрация, мембранная очистка, диализ, осаждение, хроматография с последующим концентрированием и сушкой, например, лиофильной сушкой.

Использование указанного выше способа согласно настоящему изобретению позволяет успешно проводить стадию ультрафильтрацию супернатанта, содержащего полезное вещество, и получать целевой продукт с высоким выходом и с высокой степенью очистки.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

Пример 1.

В качестве иллюстративного примера полезного вещества белковой природы использовали Fab-фрагменты антитела против вируса бешенства, полученные в ходе культивирования высокоэффективного штамма дрожжей Pichia pastoris, - продуцента терапевтических моноклональных антител против вируса бешенства.

Для отработки методики хроматографического фракционирования брали две емкости объемом 0,5 л, добавляли в каждую из них K2HPO4 в количестве, необходимом для получения концентрации фосфата в культуральной жидкости 100 мМ в одной емкости и 200 мМ в другой емкости, и в каждую емкость при постоянном перемешивании при помощи магнитной мешалки добавляли около 300 мл размороженной после хранения при -70°C культуральной жидкости, содержащей Fab-фрагменты против вируса бешенства и силиконовый пеногаситель «Софэксил» (полидиметилсилоксан) и имеющей желто-бурый цвет. Измеряли pH, который находился в пределах от 7,3 до 7,6. Указанный интервал значений pH был сочтен подходящим для целевого продукта и дополнительное доведение pH не требовалось. Оптимальное значение pH для Fab-фрагментов находится в районе 8,0. Смесь выдерживали при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 15 мин, затем центрифугировали в стаканах объемом 0,5 л фирмы Beckman в угловом роторе Beckman JA-10 на центрифуге Beckman JA-21 при 5000 об/мин при температуре +4°C в течение 10 мин. Осадок комплекса силиконового пеногасителя с фосфатами отделяли центрифугированием, а супернатант, содержащий целевой продукт, помещали в емкость объемом 1 л и затем подвергали тангенциальной ультрафильтрации.

В емкость на 1 л с полученным супернатантом помещали входную магистральную трубку, подсоединенную к входу насоса фирмы Cole Parmer (США), выходную магистраль насоса подводили к мембранному модулю, из которого выводили магистраль в ту же емкость. Магистраль модуля для пермеата отводили в сливной бак для последующего удаления. На выходе насоса по пути магистрали в модуль устанавливали манометр. На выходе модуля по пути магистрали в емкость устанавливали зажим для регулирования разницы давления на мембрану, таким образом контролируя процесс образования объема пермеата в единицу времени. Рециркуляция культуральной жидкости в модуле проводилась при помощи насоса около 35-40 мин при давлении 0.5-1 psi и 50-60% от максимальной скорости насоса при комнатной температуре, при периодическом добавлении стартового буфера для хроматографии 100 мМ K2HPO4 (pH 8,0) без натрия хлорида в количестве 150-200 мл против 2 л этого буфера в два этапа: 1) концентрирование культуральной жидкости от объема 1 л до 50-100 мл, 2) а затем - дробное добавление стартового буфера для хроматографии. После завершения процесса, сконцентрированное и отдиализованное таким образом сырье концентрировали до 50-70 мл (фактор концентрирования 20 раз) и вытесняли из системы подачей в модуль около 200 мл стартового буфера без натрия хлорида в ту же рабочую емкость. Обработанная жидкость (около 250 мл) характеризовалась pH 8,0, желтоватым оттенком (ОД650 0,3-0,7 ОЕ), отсутствием запаха и прозрачностью. Общий объем фасовали по 50 мл для последующих экспериментов по хроматографии и хранили на -70°C. После добавления хлорида натрия до 1 М, и повторного контроля pH с доведением pH до 8.0 при необходимости, полученный раствор был готов к этапу подбора условий при использовании металлхелатной хроматографии (IMAC).

Результаты непрямого ИФА показали, что активность Fab фрагмента в процессе переработки культуральной жидкости до проведения хроматографии падает незначительно.

Таким образом, было показано, что использование способа удаления силиконового пеногасителя «Софэксил» согласно настоящему изобретению позволяет успешно проводить стадию ультрафильтрации супернатанта, содержащего полезное вещество, и получать целевой продукт с высоким выходом и с высокой степенью очистки.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы являются частью настоящей заявки, включенные путем ссылки.

1. Способ удаления силиконового пеногасителя из культуральной жидкости, образовавшейся после ферментации микроорганизмов - продуцентов полезных веществ, включающий следующие стадии:
- введение солей фосфорной кислоты со щелочными металлами в указанную культуральную жидкость после удаления из нее биомассы микроорганизма-продуцента; и
- отделение осадка комплекса силиконового пеногасителя с солью фосфорной кислоты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным силиконовым пеногасителем является полимер силоксана, выбранный из группы, включающей полиметилсилоксан, полидиметилсилоксан и их смесь.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным полезным веществом является белок.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанным белком является антитело или его фрагмент.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанной солью фосфорной кислоты является гидрофосфат.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную соль фосфорной кислоты вводят до достижения ее концентрации в диапазоне от 100 мМ до 200 мМ в культуральной жидкости.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после внесения в культуральную жидкость солей фосфорной кислоты устанавливают рН раствора, оптимальный для целевого продукта.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отделение осадка комплекса силиконового пеногасителя с солью фосфорной кислоты осуществляют центрифугированием.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в гидролизно-спиртовой, пищевой и других отраслях промышленности, где проходят процессы пенообразования.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к полимерной композиции пеногасителя. Описана композиция пеногасителя, содержащая 15-35% масс.

Изобретение относится к композициям для контроля пенообразования для систем жидких детергентов. Предложена композиция для контроля пенообразования, содержащая: (А) кремнийорганический антивспенивающий агент, содержащий (i) органополисилоксан, имеющий по меньшей мере один связанный с кремнием заместитель формулы Х-Ar, где Х представляет собой двухвалентную алифатическую группу, связанную с атомом кремния через атом углерода, а Ar представляет собой ароматическую группу, (ii) кремнийорганический полимер формулы R1 aSiO(4-a)/2, где R1 представляет собой углеводородную группу, углеводородокси или гидроксил, и а имеет среднее значение от 0,5 до 2,4, и (iii) гидрофобный наполнитель, и (В) органополисилоксановую смолу, содержащую по меньшей мере одну полиоксиалкиленовую группу, а также тетрафункциональные силоксановые звенья формулы SiO4/2 и монофункциональные силоксановые звенья формулы R2 3SiO1/2, причем общее число тетрафункциональных силоксановых звеньев в смоле составляет не менее 50% от общего числа силоксановых звеньев, а R2 представляет собой углеводородную группу.

Изобретение относится к технологии получения термосвариваемых пластиковых пленочных и листовых структур и может быть использовано для упаковки чувствительных к кислороду продуктов.
Изобретение относится к получению и использованию композиций, контролирующих пенообразование, особенно в водных средах. .

Изобретение относится к способам очистки аминового раствора, применяемого для выделения из природного газа сероводорода и углекислого газа, и может быть использовано в нефтегазоперерабатывающей промышленности.
Изобретение относится к способу подавления вспенивания водной системы. .
Изобретение относится к составам для снижения пенообразования в частности при водной дегазации растворов синтетических каучуков, и может быть использовано в производстве синтетических латексов и каучуков.
Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к сахарной. .
Наверх