Способ диагностики клеточного иммунодефицита у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием


 


Владельцы патента RU 2577705:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии, экологии, токсикологии, и касается диагностики клеточного иммунодефицита у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием. Для этого создают экспериментальную модель стронциевого иммунодефицита путем внутрижелудочного введения в течение 45 суток экспериментальному животному водного раствора хлорида стронция преимущественно концентрацией 10 мг/л, из расчета 1 мг/кг веса животного. Затем производят забор у этого животного пробы крови и последующее извлечение селезенки, извлекают иммунокомпетентные клетки из крови и клетки-спленоциты из гомогенизированного материала селезенки и определяют на мембранах указанных клеток уровень экспрессии CD62L+. Рассчитывают критериальный коэффициент экспрессии, равный отношению CD62L+ кровь/CD62L+ селезенка, и при его значении, равном 8 и менее, диагностируют клеточный иммунодефицит у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием. Способ обеспечивает возможность изучения патогенетических механизмов токсического действия стронция на иммунную систему. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано для изучения патогенетических механизмов токсического действия тяжелых металлов, в частности стронция, на иммунитет, в том числе в условиях проведения клинических испытаний препаратов, содержащих металлы.

В последнее десятилетие возникла проблема воздействия стабильного стронция на здоровье в связи с вовлечением в питьевое водоснабжение больших объемов артезианской воды водоносных горизонтов, где содержание стабильного стронция в 5-20 раз превышает предельно допустимое - 7 мг/л. Стронций, будучи изоформен кальцию и обладая высокой подвижностью, способен блокировать ионные каналы для последнего, воздействовать на кальцийзависимые рецепторы и конкурировать за активные участки белков, не выполняя физиологической функции, что может определить ингибирующее влияние стронция на иммунную реакцию.

На сегодняшний день недостаточно изучено иммунотоксическое действие стронция на медиаторы, клетки и органы иммунной системы. Согласно литературным данным [Synhaeve N.. Inuence of a chronic 90Sr contamination by ingestion on the hematopoietic, immune and bone systems. Agricultural sciences. Universite Paris Sud - Paris XI, 2011] длительное поступление с питьевой водой малых доз стронция изменяет способность иммунной системы экспериментальных животных - мышей, отвечать на антигенную стимуляцию. Поступление в эксперименте в организм животных малых доз Sr2+ вызывает изменения в ранней клеточной дифференцировке Т-лимфоцитов, в частности значительное увеличение количества клеток, оказывающих супрессорный эффект. В связи с этим возникла необходимость глубоко изучить и расширить представления о патогенетических механизмах развития клеточного иммунодефицита на примерах экспериментальных животных, определить параметры их чувствительности при внутрижелудочном поступлении стронция на основе моделирования стронциевого иммунодефицита.

Из уровня техники известны подобные, проводимые с научной точки зрения на экспериментальных животных, технические решения, касающиеся диагностики различных заболеваний при хроническом отравлении тяжелыми металлами.

Так, из заявки РФ №2003118544 известен способ определения параметров чувствительности экспериментальных животных к токсическому действию водорастворимых ксенобиотиков, согласно которому проводят регистрацию гибели животных под действием ксенобиотика, причем регистрируют изменение среднего времени гибели (TL) гидробионтов в зависимости от концентрации токсиканта (С) с последующим графическим определением константы летальности (KL), минимального времени наступления гибели (TL(min)) и расчетом показателя чувствительности биообъекта к токсическому действию ксенобиотика (tgα) по формуле tgα=KL·TL(min).

Его недостатком является то, что в качестве экспериментальных животных используют гидробионты - дафнии, у которых невозможно установить наличие клеточного иммунодефицита из-за отсутствия лимфоидных органов, обеспечивающих воспроизводство главных иммунокомпетентных клеток иммунной системы - Т-лимфоцитов - клеточных популяций, отвечающих за адаптивный иммунитет.

Также из патента РФ №2404431 известен способ диагностики никелевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, при котором у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na+, К+-АТФ-азы почечной ткани. При значениях МДА 4,88±0,03 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани соответственно 2,18±0,03 и 3,57±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na+, К+-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани 2,21±0,08 и 5,39±0,13 мкмоль Рн/мг белка/час и менее соответственно диагностируют нефропатию. При диагностике никелевой нефропатии данным способом учитывают нарушения водо- и электролитовыделительной функции почек, а также патогенетические механизмы этих нарушений.

Еще из патента РФ №2449280 известен способ диагностики кадмиевой ангиопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении. Известный способ заключается в том, что у животных в эритроцитах определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА), активность каталазы в сыворотке крови и супероксиддисмутазы (СОД) и одновременно определяют показатели гемодинамики: брюшную аорту (БА), нижнюю полую вену (НПВ) и почечную артерию (ПА левую, ПА правую), среднюю скорость кровотока - М; упругоэластические свойства сосудов - PI; общее периферическое сосудистое сопротивление - RI. При значениях МДА 5,15±0,157 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, значениях СОД - 1,73±0,07 ед/мг белка и менее, каталазы - 308,04±17,83 мкат/л и более, а также данных гемодинамики в макрососудах: БА (М - 14,83±1,12 см/с и более, PI - 2,01±0,24 см/с и менее, RI - 0,89±0,02 у.ед. и менее), НПВ (М - 7,82±0,27 см/с и менее, PI - 2,49±0,23 см/с и более, RI - 1,157±0,038 у.ед. и более), ПА лев (М - 6,19±0,62 см/с и более, PI - 3,83±0,37 см/с и менее, RI - 1,12±0,034 у.ед. и менее), ПА пр (М - 5,77±0,43 см/с и более, PI - 3,61±0,48 см/с и менее, RI - 1,09±0,031 у.ед. и менее) и в микрососудах: М - 1,068±0,103 см/с и менее, PI - 17,42±1,28 см/с и более, RI - 1,78±0,07 у.ед. и более соответственно диагностируют кадмиевую ангиопатию. Способ позволяет оценить патогенетические механизмы токсического действия кадмия на формирование функциональных и патоморфологических изменений сосудистой стенки.

Однако подходы, указанные в этих известных способах, не могут быть использованы при диагностике иммунодефицита у лабораторных животных, т.к. подобранные для оценки патогенетических механизмов токсического действия металлов тесты отражают исключительно состояние эндотелия сосудов и выделительную функцию почек и не относятся к показателям иммунной системы.

Недостатком описываемого известного способа является и то, что металл вводится парентерально (подкожно), что, во-первых, не является естественным способом попадания элемента в организм и искажает результаты моделирования формирования патологического процесса, во-вторых иммунная система в отличие от почечной (мочевыделительной) системы, является более чувствительной к интоксикации и отражает более ранние нарушения в состоянии организма подопытных животных и человека.

Кроме того, эти известные способы не позволяют судить о патогенетических механизмах развития именно клеточного иммунодефицита.

Из уровня техники известно еще одно решение, описанное в авторском свидетельстве СССР №1698681 «Способ определения клеточной пролиферативной активности животных после введения канцерогенных веществ». При реализации этого способа извлекают у лабораторных животных надпочечники и измеряют их массу. И по величине соответствующего соотношения массы левого к массе правого надпочечника менее 1,0 определяют наличие клеточной пролиферативной активности.

Это решение, скорее, направлено на изучение канцерогенного эффекта, чем иммунотоксического и представляет интерес исключительно в области экспериментальной онкологии.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики у экспериментальных животных клеточного иммунодефицита, ассоциированного с воздействием стронция, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении возможности диагностики клеточного иммунодефицита у экспериментальных животных, ассоциированного с воздействием стронция.

Это позволяет расширить представление о патогенетической роли L-селектина, в частности CD62L+-рецептора, в формировании иммунодефицитных состояний в условиях экспозиции действующими дозами тяжелых металлов (стронция), сопровождающихся нарушениями активационных процессов в норме, происходящих в селезенке.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики клеточного иммунодефицита у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием, согласно которому создают экспериментальную модель стронциевого иммунодефицита путем внутрижелудочного введения в течение 45 суток экспериментальному животному водного раствора хлорида стронция из расчета 1 мг/кг веса животного, далее производят забор у этого животного пробы крови и последующее извлечение селезенки, затем извлекают иммунокомпетентные клетки из крови и клетки-спленоциты из гомогенизированного материала селезенки, определяют на мембранах указанных клеток уровень экспрессии CD62L+, рассчитывают критериальный коэффициент экспрессии, равный отношению CD62L+кровь/CD62L+селезенка, и при его значении равном 8 и менее диагностируют клеточный иммунодефицит у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием.

При создании экспериментальной модели стронциевого иммунодефицита используется водный раствор хлорида стронция с концентрацией 10 мг/л.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в определении параметров чувствительности лабораторных животных к интоксикации стронцием, на основе создания экспериментальной модели стронциевого иммунодефицита.

Решение этой задачи позволяет более глубоко изучить и расширить представления о патогенетических механизмах развития клеточного иммунодефицита, определить параметры чувствительности экспериментальных животных при внутрижелудочном поступлении стронция (что является естественным способом попадания элемента в организм) и созданной при этом экспериментальной модели стронциевого иммунодефицита, благодаря чему повышается воспроизводимость и точность, удобство для тиражированного проведения экспериментов на животных при оценке иммунотропных эффектов других токсикантов или лекарственных препаратов, касающихся клеточного иммунодефицита, при их клинических испытаниях.

Для понимания существа патогенетических механизмов развития клеточного иммунодефицита следует пояснить следующее.

Рядом авторов установлено, что под влиянием стронция происходят изменение клеточного состава иммунокомпетентных клеток и нарушение их функциональной активности в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах и периферической крови опытных животных [Synhaeve N.. Inuence of a chronic 90Sr contamination by ingestion on the hematopoietic, immune and bone systems. Agricultural sciences. Universite Paris Sud-Paris XI, 2011]. Селезенка является местом антигензависимой дифференцировки, активации Т-лимфоцитов и запускает реакции на антигены, попадающие в кровь. Важная функция в регуляции кинетики пула иммунокомпетентных клеток принадлежит L-селектину: CD62L, Ly-22, LAM-1, LECAM, MEL-14, [Trinité В. Chan C.N., Lee C.S., Mahajan S., Luo Y., Muesing M.A., Folkvord J.M., Pham M., Levy D.N. // PLOS ONE 2014; 9(10): doi: 10.1371/journal.pone.0l10719]. Также CD62L может функционировать как рецептор сигнализации, изменяя транслокацию ряда генов. Снижение экспрессии L-селектина и, как следствие, повышение уровня растворимых форм молекул клеточной адгезии описано в патогенезе многих заболеваний и является маркером клеточной активации.

Пул периферических Т-лимфоцитов включает в себя две большие группы Т-клеток, идентифицируемых по наличию на их поверхности активационного поверхностного маркера CD62L - это наивные Т-клетки и Т-клетки памяти. CD62L является конституциональной молекулой, экспрессируется на 50%-78% неактивированных циркулирующих лимфоцитах, обеспечивает селективную адгезию клеток к стенке сосуда, необходимую для их экстравазации и дальнейшего проникновения в очаг поражения. Известно, что при оптимальной антигенной стимуляции не более 10% Т-клеток дифференцируются в центральные клетки памяти, имеющие высокую экспрессию CD62L и обеспечивающие проявление феномена иммунологической памяти на системном уровне, пул которых во взрослом организме не изменяется даже после многократных симуляций антигеном.

Шеддинг (слущивание, потеря рецептора мембраной) чаще всего является следствием активационных процессов, затрагивающих различные популяции клеток. Шеддинг CD62L возможен в результате внеклеточного накопленного Аденозинтрифосфàта (АТФ) и повышения ядерной транслокации NF-kB (ядерный фактор «каппа-би»). АТФ, стимулируя пуринергические рецепторы P2Y, модулирует активность фосфолипазы С и повышает активность NF-kB. Изменение экспрессии CD62L также может осуществляться при активации РI3K/Akt-зависимого сигнального пути. Стронций способен трансформировать компоненты клеточных сигнальных путей и модифицировать активность фактора транскрипции NF-kB, и тем самым изменять экспрессию поверхностных антигенов клетки. Механизм действия стронция в значительной степени связан с изменением концентрации АТФ во внеклеточной среде. Кальций и стронций могут воздействовать на один кальцийчувствительный рецептор, но при этом вызывать активацию различных сигнальных путей. Так, в системе in vivo стронций вызывает транслокацию NF-kB из цитоплазмы в ядро через активацию DAG-PKCβII сигнального пути, а кальций - через PI3-зависимый путь. Эта разница в соответствующих сигнальных каскадах позволяет Sr2+ усиливать Са2+ индуцированный ответ клетки, и наоборот. На клеточной линии RAW 264.7 установлено, что с увеличением дозы Sr2+ происходит снижение RANKL-индуцированной ядерной транслокации NF-kB и АР-1, а эффект, оказываемый стронцием на активационные процессы клетки, является зависимым от типа клетки и дозы стронция [Caudrillier A., Hurtel-Lemaire A.-S., Wattel A., Cournarie F., Godin С, Petit L., Petit J.-P., Terwilliger E., Kamel S., Brown E. M., Mentaverri R., Brazier M. // Mol Pharmacol. 2010. V. 78, №4, 569-576].

Один из возможных молекулярных механизмов снижения активации лимфоцитов под влиянием стронция может быть, по видимому, объяснен изменением активности транскрипционного фактора NF-kB. Сложность устройства и особенности ядерной транслокации NF-kB позволяют клетке различным образом реагировать на всевозможные стимулы, что ведет к неодинаковым последствиям. Молекулярный механизм торможения шеддинга CD62L в присутствии действующей дозы стронция (т.е. для экспериментальной модели стронциевого иммунодефицита) не исключает действие Sr2+ на уровне плазматической мембраны, вызывая конформационные изменения рецептора, что требует дальнейшего изучения.

В ходе настоящего исследования по предлагаемому способу установлено модифицирующее влияние Sr2+ на активационные процессы в клетке.

Очевидно, что стронций при концентрации 10 мг/л ингибирует шеддинг CD62L на спленоцитах (на клетках селезенки), не изменяя экспрессию L-селектина на периферических лимфоцитах (на клетках крови). Стабильный стронций оказывает воздействие на активационную способность клеток, что обусловлено способностью металла модифицировать экспрессию L-селектина, тем самым трансформировать следующим за этим каскад молекулярных событий, характерных для иммуносупрессии. Отражением этих событий и служит установленный в ходе эксперимента критериальный коэффициент селектиновой экспрессии: CD62L+кровь/CD62L+селезенка, снижение которого до 8 и менее единиц может являеться ранним критерием иммунотоксического эффекта стронция.

Таким образом, все отличительные признаки предлагаемого решения направлены не только на доказательства патогенетических механизмов клеточного иммунодефицита, но и позволяют их конкретизировать как проявление именно стронциевого иммунодефицита. На эту цель работает и создание на лабораторном животном экспериментальной модели иммунодефицита в условиях внутрижелудочного поступления стронция с питьевой водой, и выбор в качестве чувствительного индуктора процесса иммунодефицита CD62L+ - периферийной крови и материала селезенки, и предложенное в качестве критериального коэффициента отношение CD62L+кровь/CD62L+селезенка, а также числовое значение этого коэффициента.

Индуцированное воздействие на иммунную систему лабораторных животных осуществлялось минимально действующей концентрацией стронция (10 мг/л), умеренно превышающей принятую предельно допустимую концентрацию (ПДК) стронция в воде (7 мг/л).

Выбор в качестве рабочей концентрации стронция 10 мг/л для индукции иммунотропных изменений основывался на следующих рассуждениях. По данным научной литературы в концентрациях 10 и более мг/л хлорид стронция, вводимый самкам крыс с питьевой водой во время беременности, оказывал эмбриотоксическое действие (Сергеев Е.П., Кучма Н.Ю. // Гигиена и санитария. 1979. №6. С. 11-13). Поэтому использование в качестве действующей концентрации стронция выше 10 мг/л может привести к возникновению более грубых, чем иммунотоксические, функциональных и морфологических изменений в тканях. Тогда как применение концентрации ниже чем 10 мг/л может не сопровождаться инициацией возникновением иммунотропных эффектов, так как она будет сопоставима с недействующей концентрацией.

Перечень операций предлагаемого способа будет проиллюстрирован примером конкретного осуществления.

1. Эксперименты выполнены на 24 здоровых 8-10-недельных (масса 18-24 г) мышах линий Balb/c, разделенных на две группы: 1 - контрольная (количеством n=8) (без введения стронция), 2 - опытная группа (количеством n=16), т.е. животные с моделированной интоксикацией хлоридом стронция;

2. Для эксперимента был приготовлен водный раствор хлорида стронция в концентрации 10 мг/л.

3. С использованием мышей опытной группы создавали экспериментальную модель стронциевого иммунодефицита путем однократного внутрижелудочного введения каждые сутки в течение 45 суток экспериментальному животному указанного раствора хлорида стронция из расчета 1 мг/кг веса животного. Средний объем вводимой жидкости - 2 мл. При внутрижелудочном введении использовали специальный зонд, позволяющий осуществить доставку указанного раствора в желудок через пищевод. Контрольной группе животных вводился аналогичный объем дистиллированной воды также в течение 45 суток.

4. Далее у подготовленных мышей опытной и контрольной групп производили забор пробы крови в количестве 1 мл путем надреза подъязычной вены.

5. Затем опытную и контрольную мышь забивали путем декапитации, производили вскрытие брюшной полости и извлекали селезенку, которая для последующих опытов помещалась в ступки со льдом. Затем проводили щадящую гомогенизацию лимфоидного органа - селезенки (с помощью гомогенизатора «Miltenyi Biotec», Германия).

6. Из клеток селезенки производили выделение суспензии клеток селезенки (спленоцитов) стандартными методами (http://www.miltenybiotec/com/en/products-and-services/macs-sample-preparation/sample-dissociation/tissue-dissociation-kits/spleen-dissociation-kit-mouse.aspx) - ссылка на инструкцию производителя набора Spleen Dissociation Kit, mouse (кат. №130-095-926, Miltenyi Biotec, Германия) или Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029, doi: 10.3791/1029 (2008).

7. Для получения иммунокомпетентных клеток из крови использовали метод позитивной иммуноселекции с помощью магнитных частиц («Miltenyi Biotec», Германия), покрытых антителами крысы к CD62L мыши («Becton Dickinson», США). Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также международными правилами «Guide for the Careand Use of Laboratory Animals».

8. Затем на поверхности указанных выделенных клеток определяют уровень экспрессии CD62L+.

9. На основе полученных результатов рассчитывают критериальный коэффициент, равный отношению CD62L+кровь/CD62L+селезенка.

10. И при его значении, равном 8 и менее, диагностируют клеточный иммунодефицит у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием.

Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что большинство клеток периферической крови демонстрируют более высокую по сравнению с клетками селезенки экспрессию CD62L+. Исследование экспрессии CD62L на лимфоцитах периферической крови у мышей опытной группы не выявило статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой. Цитофлуориметрический анализ экспрессии CD62L-маркера на спленоцитах показал, что у мышей опытной группы статистически значимо (p<0,05) повышается количество CD62L+ по сравнению с результатами, идентифицированными у интактных животных.

Установлено, что при поступлении в организм животных стронция статистически значимо (p<0,05) снижается критериальный коэффициент CD62L+кровь/CD62L+селезенка, что является отражением иммунодефицитного состояния у животных. Процентное содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих поверхностный фенотип CD62L+, зависит от активационных процессов в периферических лимфоидных органах (селезенка). Таким образом, проведенные исследования показали, что действующая концентрация раствора хлорида стронция 10 мг/л вызывает снижение процессов активации иммунокомпетентных клеток на уровне вторичных лимфоидных органов.

Для обоснования пороговости критериального коэффициента экспрессии, который бы характеризовал иммунные нарушения у экспериментального животного, исходили из следующего принципа. У всех животных, получавших действующую концентрацию стронция, величина критериального коэффициента не превышала 8, в то же время все интактные по отношению к поступлению стронция животные характеризовались уровнем критериального коэффициента более 8 (9 и выше) (см. таблицу).

Приведенные данные показывают, что идентифицикация снижения коэффициента селектиновой экспрессии (CD62L+кровь/CD62L+селезенка) менее чем в 8 раз позволяет диагносцировать иммунотоксический эффект стронция, заключающийся в торможении (угнетении) процесса формирования клеточной иммунной защиты.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным лабораторным животным, выступающим в качестве экспериментальной модели стронциевого клеточного иммунодефицита, созданной путем внутрижелудочного введения в течение 45 суток раствора хлорида стронция из расчета 1 мг/кг веса животного.

Пример 1. Мышь №1. Не получала стронций с питьевой водой. Значение клеточного фенотипа CD62L+ в крови 21%, в селезенке - 2%. Критериальный индекс=10,5 (т.е. выше 8). Таким образом, анализ клеточных фенотипов, отвечающих за активационные механизмы и их физиологический уровень, указывает на нормальное функционирование лимфоидных клеток в системе кровь-селезенка.

Пример 2. Мышь №7. Получала стронций в питьевой воде в дозе 1 мг/кг в течение 45 суток. Значение клеточного фенотипа CD62L+ в крови 26%, в селезенке - 5%. Критериальный индекс=5,2 (т.е. меньше 8). Таким образом, анализ клеточных фенотипов, отвечающих за активационные механизмы и их пониженный уровень, указывает на наличие дефицитного состояния в иммунной системе, обусловленного действием стронция.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет более глубоко изучить и расширить представления о патогенетических механизмах развития клеточного иммунодефицита, определить параметры чувствительности экспериментальных животных при внутрижелудочном поступлении стронция и созданной при этом экспериментальной модели стронциевого иммунодефицита, благодаря чему повышается воспроизводимость и точность, удобство для тиражированного проведения экспериментов на животных при оценке иммунотропных эффектов других токсикантов или лекарственных препаратов, касающихся клеточного иммунодефицита, при их клинических испытаниях.

Преимущества заявляемого способа состоят в том, что эксперимент производят in vivo, т.е. на организме лабораторного животного, в условиях неинвазивного внутрижелудочного поступления токсиканта (стронция), что, во-первых, повышает возможности его воспроизводимости, а также позволяет моделировать естественные условия его иммутоксического действия, изучить механизмы взаимосвязи различных компартментов иммунной системы, таких как иммунные клетки периферической крови и клетки лимфоидных органов, что в дальнейшем позволяет провести корректный качественный и количественный анализ их взаимодействия или кооперации (кровь-селезенка).

Преимуществом заявляемого способа является и то, что лежащий в его основе диагностический алгоритм позволяет идентифицировать состояние клеточного иммунодефицита по изменению показателей клеток селезенки (спленоцитов), в то время как аналогичный показатель, указывающий на иммунодефицит клеток периферической крови (лимфоцитов), остается неизмененным. Таким образом, диагностика с использованием только клеток крови не может обеспечить достоверную идентификацию клеточного иммунодефицита, тогда как заявляемым способом на клетках селезенки диагностируются более ранние его проявления.

Заявляемый способ повышает точность изучения параметров иммунодефицита, так как на этапе оценки результатов эксперимента, производимого in vitro, используется высокотехнологическое тестирование, заключающееся в выборе чувствительного маркера - CD62L+, изменение содержания которого является ранним признаком иммунодефицита, а также в использовании высокочувствительного метода его идентификации - проточной цитометрии на полуавтоматическом лазерном цитометре с современным программным обеспечением. Тем не менее, использование современных подходов к идентификации стронциевого иммунодефицита и параметров чувствительности к стронциевой интоксикации не приводит к его усложнению. Он прост в исполнении, что позволяет его тиражировать, например, при оценке иммунотропных эффектов других токсикантов или лекарственных препаратов при их клинических испытаниях.

1. Способ диагностики клеточного иммунодефицита у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием, характеризующийся тем, что создают экспериментальную модель стронциевого иммунодефицита путем внутрижелудочного введения в течение 45 суток экспериментальному животному водного раствора хлорида стронция из расчета 1 мг/кг веса животного, далее производят забор у этого животного пробы крови и последующее извлечение селезенки, затем извлекают иммунокомпетентные клетки из крови и клетки-спленоциты из гомогенизированного материала селезенки, определяют на мембранах указанных клеток уровень экспрессии CD62L+, рассчитывают критериальный коэффициент экспрессии, равный отношению CD62L+ кровь/CD62L+ селезенка, и при его значении, равном 8 и менее, диагностируют клеточный иммунодефицит у экспериментальных животных в условиях экспозиции стронцием.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при создании экспериментальной модели стронциевого иммунодефицита используется водный раствор хлорида стронция с концентрацией 10 мг/л.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использована для выявления in vitro антитела, обладающего эффекторной функцией. Для этого смешивают естественные клетки-киллеры и опухолевые клетки, добавляют примерно по 104 клеток на 200 мкл в лунки многолуночного планшета.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования раннего токсикоза тяжелой степени, включающий определение в крови беременных женщин концентрации лептина и фактора роста плаценты (ФРП), отличающийся тем, что дополнительно производят определение значения максимальной амплитуды агрегации тромбоцитов (МААТ), содержания лимфоцитов CD95+ (Л CD95+), уровня общего IgE и концентрации C-реактивного белка (СРБ), и при значении этих показателей в сроки 6-8 недель и 9-12 недель беременности соответственно: концентрации лептина (нг/мл) - 18,9±2,8 и 23,4±3,2; концентрации ФРП (пг/мл) - 55±4,1 и 91±6,2; значении МААТ (%) - 42,6±1,4 и 45,1±1,5; содержании Л CD95+ (%) - 44,2±3,5 и 49,7±3,8; уровня общего IgE (пг/мл) - 295±19 и 322±16; концентрации СРБ (мкг/мл) - 96±4,2 и 108±5,3 прогнозируют ранний токсикоз тяжелой степени.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу проведения иммунохроматографического анализа. Способ включает регистрацию окрашенных коллоидным маркером специфических комплексов антиген-антитело на поверхности рабочей мембраны.

Изобретение относится к медицине, а именно офтальмологии, и может быть использовано для диагностики стационарной миопии высокой степени. Для этого при хирургии выделяют фрагмент теноновой капсулы, который измельчают и замораживают в парах жидкого азота до -180°С.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбору противоаллергических препаратов. Для этого формируют образцы, содержащие 0,95-1,05×106 лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови.
Изобретение касается способа выявления пациента с риском развития расстройства щитовидной железы в результате лечения в режиме, который истощает лимфоциты. Способ включает определение до лечения наличия антител, направленных против пероксидазы щитовидной железы или микросом щитовидной железы, у пациента.

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Представленный штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейства Asfarviridae, род Asfivirus, адаптирован к перевиваемой культуре клеток COS-1 и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики острого лимфобластного лейкоза у пациента, включающий выявление признаков лейкоза, тестирование клеток крови на лейкоз, инкубирование клеток крови фактором, идуцирующим лейкоз, с тем, чтобы индуцировать экспрессию клеточных поверхностных маркеров, которые являются признаком лейкоза, где фактор, индуцирующий лейкоз - это супернатант Aspergillus flavus, EBV-инфицированный CCL87 супернатант, очищенная EBV культура или их комбинации.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления нарушения энергетического обмена в синцитиотрофобласте плаценты беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки эффективности терапии генитального туберкулеза, включающий контрольные иммунологические обследования, отличающийся тем, что по окончании интенсивной фазы терапии проводят 1-й контроль, который включает определение индекса стимуляции интерферона-гамма (ИФН-γ) с туберкулином очищенным (ППД-Л), определение уровней специфических иммуноглобулинов (IgA, IgM) к микобактерии туберкулеза (МБТ) методом иммуноферментного анализа (ИФА), а 2-й контроль проводят через 6-11 месяцев после окончания основного курса терапии, при этом в случае если индекс стимуляции ИФН-γ с ППД-Л по окончании интенсивной фазы противотуберкулезной терапии был выше 7, 8 - только по ИФН-γ с ППД-Л, в случае если оптическая плотность IgM к МБТ была более 0,600 - только по IgM к МБТ, в случае если оптическая плотность при IgA к МБТ была более 0,450 - контроль проводят только по IgA к МБТ; при этом по результатам контрольных исследований рекомендуют продление, или коррекцию, или окончание терапии. Осуществление изобретения обеспечивает повышение точности оценки противотуберкулезной терапии. 2 пр., 1 табл.

Изобретение относится к области методов молекулярно-генетической диагностики в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и касается прогнозирования качества получаемых эмбрионов. Сущность способа: пациентку генотипируют по полиморфным локусам, по результатам генотипирования определяют вероятность получения эмбрионов низкого качества по формуле р=1/(1+е-z), где Z=-2236-0,79*AMHT/G - 20,621*AMHG/G +0,993*FSHRA/G+ 0,364*FSHRG/G - 1,206*LHCGR(935 A>G)A/G + 1,164*LHCGR(935 A>G)A/A + 22,888*LHCGR(872 A>G)A/G + 21,6*LHCGR(872 A>G)A/A. При значениях p больше 0,5 прогнозируют получение эмбрионов низкого качества, а при значениях р меньше 0,5 не прогнозируют получение эмбрионов низкого качества. Изобретение может быть полезным в выборе персонализированной схемы стимуляции суперовуляции, разработке индивидуальной тактики эмбриологического этапа в ходе лечения пациентки методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Генотипирование может служить малоинвазивным, доступным, недорогим тестом, применяемым однократно перед началом проведения программы ВРТ. 1 пр., 1 табл., 1 ил.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ идентификации антитела, которое специфически связывается с интересующим антигеном на клеточной поверхности, предусматривающий иммунизацию животного вектором экспрессии, кодирующим антиген клеточной поверхности; приведение в контакт клеток, содержащих на своей поверхности антитела и выделенных из животного, подвергнутого иммунизации, причем антитела связаны с первой сортируемой меткой, с клетками, экспрессирующими антиген, связанный со второй сортируемой меткой; определение специфического связывания с использованием клеточного сортера по наличию первой и второй сортируемой метки в клеточном комплексе; а также идентификацию участков, определяющих комплементарность с антигеном (CDR), у идентифицированного антитела и прививку CDR на каркасную область акцепторного антитела. Данное изобретение предполагает скрининг антител, специфичных в отношении мембраносвязанных антигенов, что может найти дальнейшее применение в разработке терапевтических и диагностических средств. 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Штамм выделен от убитого кабана в охотхозяйстве «Озерное» Медынского района Калужской области в 2014 г., паспортизирован с названием «Калуга-2014» и депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3115. Штамм обладает высокой инфекционной активностью, накапливается в культурах клеток костного мозга свиней и лейкоцитах свиней в титре 6,0-7,0 lgГАЕ50/см3. Гибель зараженных свиней наступает с признаками острой формы АЧС через 6-8 суток после проявления клинических признаков болезни. Изобретение может быть использовано в качестве референс-штамма при проведении мониторинговых исследований в РФ с новыми изолятами вируса, циркулирующими в популяции кабанов, а также выделенными от домашних свиней. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа количественного определения N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина) в крови. Сущность способа заключается в том, что производят отбор пробы крови, подготовку ее к анализу и количественное определение нитрозоамина в пробе методом газохроматографического анализа. При этом подготовку пробы производят путем добавления к ней гидроксида калия при соотношении 1 объемная часть пробы к 1,6 массовой части гидроксида калия, с последующей отгонкой дистиллята с помощью водяного пара и введением в дистиллят гидроксида калия при соотношении 1 объемная часть дистиллята к 1,6 массовой части гидроксида калия. Далее смесь дистиллята и гидроксида калия помещают в замкнутую систему дозатора равновесного пара, где в изотермических условиях осуществляют термостатирование, преимущественно в течение 20 мин, для установления фазового равновесия. Производят отбор газовой фазы над дистиллятом и вводят ее в капиллярную колонку газохроматографа, далее осуществляют газохроматографическое разделение N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина. Количество каждого указанного вещества устанавливают по градуировочному графику. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики нагноившейся постнекротической псевдокисты поджелудочной железы. Для этого в крови больного определяют активность фагоцитов по уровню экспрессии CD 14+/HLA-DR+ методом проточной цитометрии и статистического ROC-анализа. При содержании CD14+/HLA-DR+ ниже 85% диагностируют нагноившуюся постнекротическую псевдокисту поджелудочной железы. Использование данного способа позволяет диагностировать нагноившуюся постнекротическую псевдокисту поджелудочной железы, что позволяет определять тактику ведения таких больных и осуществлять выбор оперативного вмешательства. 2 пр., 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и может быть использовано в качестве способа прогнозирования риска прогрессирования стенокардии напряжения, развития гипертрофии левого желудочка и ожирения у больных ишемической болезнью сердца, сочетанной с сахарным диабетом 2-го типа. Сущность способа: выявляют генетический полиморфизм Т1565С гена ITGB3 у пациентов с ИБС, протекающей на фоне сахарного диабета 2-го типа. При обнаружении у больных аллеля С гена ITGB3 прогнозируют повышенный риск прогрессирования стенокардии напряжения, развития гипертрофии левого желудочка и ожирения. Использование изобретения в медицине позволяет прогнозировать с высокой вероятностью развитие осложнений при ишемической болезни сердца, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа. 1 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для определения общего периостина. Антитело против периостина содержит последовательности гипервариабельного участка ("HVR") SEQ ID NO: 1 и последовательности HVR SEQ ID NO: 2 или последовательности HVR SEQ ID NO: 3 и последовательности HVR SEQ ID NO: 4. Группа изобретений относится также к способу определения общего периостина и к композиции для его определения. Использование данной группы изобретений позволяет распознавать изоформы периостина с высокой чувствительностью для диагностики астмы у пациента. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 23 ил., 8 табл., 8 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии и представляет собой способ оценки тяжести течения ретинобластомы у детей. Согласно изобретению в сыворотке крови определяют антитела к раннему антигену вируса Эпштейна-Барр и при их наличии оценивают течение как тяжелое. Осуществление изобретения обеспечивает повышение эффективности терапии за счет раннего определения тяжести течения ретинобластомы у детей. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использовано для прогноза формирования затяжного течения соматоформных расстройств. Для этого проводится иммунологическое обследование и при одновременном содержании в крови Т-лимфоцитов (CD3+) 59% и менее, цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) 19% и менее, лимфоцитов с маркерами поздней активации (HLADR+) 20% и более прогнозируют затяжное течение соматоформных расстройств. Использование данного изобретения позволяет прогнозировать течение соматоформных расстройств на более ранних этапах заболевания и целенаправленно проводить психофармакологические мероприятия с включением методов иммунокоррекции. 1 табл., 2 пр.
Наверх