Среда для криоконсервации семени быка и способ её приготовления



Среда для криоконсервации семени быка и способ её приготовления
Среда для криоконсервации семени быка и способ её приготовления

 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2577882:

Общество с ограниченной ответственностью "Криосреды" (ООО "Криосреды) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К.Эрнста (ВИЖ им. Л.К.Эрнста) (RU)
Открытое акционерное общество "Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных" (ОАО "ГЦВ") (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН) (RU)

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин 4,5-6,5, фосфолипиды сои 0,04-2,00, высокомолекулярное поверхностно-активное вещество 0,01-1, вода бидистиллированная остальное. Способ приготовления среды для криоконсервации семени быка включает приготовление безлипидной основы среды для криоконсервации семени быка путем разведения в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C трис-(гидроксиметил)-аминометана, лимонной кислоты, фруктозы, добавления глицерина и охлаждения до комнатной температуры, доведения pH раствора до 6,8. При этом отдельно готовят липосомальный концентрат посредством добавления в 10%-ный раствор сахарозы 0,2-20,0 мас.% фосфолипидов сои, вносят поверхностно-активное вещество, выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа, затем обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут и смешивают безлипидную основу среды для криоконсервации семени быка и липосомальный концентрат в соотношении 4:1, стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа или стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 мкм. Предлагаемая среда для криоконсервирования имеет повышенную биологическую безопасность, обладает оптической прозрачностью и имеет длительный срок использования. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота.

Известны среда для замораживания семени быка, включающая в себя лактозу, глицерин, пенициллин, стрептомицин, полимиксин, ЭДТА-кальций, ЭДТА-цинк, ЭДТА-меди, воду и желток куриных яиц (патент RU 2355358, A61D 19/02, опубл. 20.05.2009);

среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая фруктозу, цитрат натрия, TRIS, липопротеины низкой плотности из свежего желтка, глицерин, пенициллин и дистиллированную воду (патент CN 101220345, C12N 5/6, опубл. 16.07.2008);

среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая лактозу, глицерин, антиоксиданты - сорбит или тиосульфат натрия и желток (патент UA 10894, A61D 19/02, опубл. 29.12.1999);

среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая лактозу, желток куриных яиц, глицерин, цитрат натрия, дистиллированную воду и тканевый экстракт, полученный из половых органов коров (патент UA 31304, A61D 19/02, 10.04.2008).

Известен способ подготовки семени животных производителей к ее использованию, включающий смешивание лактозы, лимонной кислоты, трис-(оксиметил)-аминометана, глицерина, бромида-N, воды и желтка куриных яиц, смешивание со спермой и замораживание полученной смеси (патент RU №2393816, A61D 19/02, опубл. 10.07.2010).

Известен способ обработки семени быка, когда в лактозо-глицерино-желточную среду вводят сукцинат хитозана и полученной синтетической средой разбавляют цельную сперму быка (патент RU №2223718, A61D 19/02, опубл. 20.02.2004).

Однако все вышеописанные среды содержат вещество животного происхождения (желток куриного яйца), который при высокой криозащитной эффективности обладает рядом существенных недостатков: непостоянство состава, сложность стерилизации, быстрая потеря криозащитных свойств при хранении, способность вызывать иммунную сенсибилизацию при введении в половые пути самки, опасность патогенной передачи вирусов.

Известен способ криоконсервации животных клеток и тканей, включающий смешивание фруктозы, лимонной кислоты, трис-(гидроксиметил)-аминоэтана, глицерина, очищенной воды и фосфотидилхолина из фосфолипидов сои (патент WO 2003/022046 A1, A01N 1/02, опубл. 20.03.2003);

известен способ криоконсервации животных клеток и тканей, включающий смешивание клеток и тканей фруктозы, лимонной кислоты, трис-(гидроксиметил)-аминоэтана, глицерина, очищенной воды, гиалуроновой кислоты и фосфолипидов сои с животными клетками, в том числе семенем быка сои (патент US 2003/0077566 A1, A01N 1/02, опубл. 24.04.2003).

Однако все известные способы не обеспечивают длительного хранения среды для криоконсервации, т.к. разработанные способы не включают стерилизацию среды для криоконсервации, также среда для криоконсервации содержит лецитин в виде грубой суспензии, что делает среду для криоконсервации совершенно непрозрачной, что крайне затрудняет визуальный анализ качества замороженно-оттаяного семени.

Известны способы приготовления среды для разбавления семени производителей: способ, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде с последующей стерилизацией раствора разбавителя, при этом стерилизацию раствора разбавителя осуществляют в герметично закрытых емкостях электромагнитным полем определенной частоты, удельной энергоемкости при температуре нагрева 70-75°C (патент RU 1769422, 6 A61D 19/02, опубл. 27.06.1995);

способ, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде, при этом смесь компонентов герметизируют в емкостях, которые помещают в водную среду с температурой 18-20°C и воздействуют на смесь электромагнитным полем СВЧ-диапазона, затем данные емкости выдерживают в течение 16-20 часов, а потом осуществляют их нагрев до 58-60°C в течение 20-25 мин (патент RU 2073499, A61D 19/02, опубл. 20.02.1997).

Основными недостатками этих решений являются необходимость наличия сложной дорогостоящей техники, и, следовательно, высокая стоимость затрат на их выполнение, а также непостоянство состава среды и недостаточная для полного уничтожения патогенных микроорганизмов, вызывающих хламидийную и микоплазменную инфекции, степень стерилизации.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является синтетическая среда для замораживания семени быка, которая включает в себя трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,65-2,85%, фруктоза - 0,70-0,80%, лимонная кислота - 1,3-1,5%, глицерин - 5-7%, сухой соевый лецитин Центролекс Ф - 8-12%, вода дистиллированная - остальное (патент RU 2323701, A61D 19/02, опубл. 10.05.2008).

Данная среда, взятая в качестве прототипа, готовится следующим способом. В чистую химическую колбу вносят по рецепту трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту и заливают прокипяченной дистиллированной водой с температурой 80-90°C. Тщательно растворяют все компоненты. Затем раствор охлаждают до 40°C и вносят туда глицерин и сухой соевый лецитин. Соевый лецитин в предложенном варианте криозащитной среды гидратируется спонтанно и образует крупные липосомы со средним диаметром более 1000 нм.

Среда обладает высокой криозащитной эффективностью, не содержит компонентов животного происхождения, что обеспечивает ее санитарно-эпидемиологическую безопасность, но обладает двумя существенными недостатками. Данная среда не предназначена для длительного хранения и предполагает использование в течение 6 ч после приготовления; среда содержит лецитин в виде грубой суспензии, что делает среду совершенно непрозрачной. Это свойство среды затрудняет визуальный анализ качества замороженно-оттаяного семени и делает невозможным использование более прогрессивного инструментального анализа качества семени, требующего оптически прозрачной среды.

Целью изобретения является повышение биологической безопасности синтетической среды для криоконсервации семени быка и повышение ее технологических свойств (прозрачность, увеличение срока хранения).

Технический результат изобретения достигается тем, что предложена среда для криоконсервации семени быка, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, сахарозу, глицерин, сухой соевый лецитин (фосфолипиды сои), в качестве источника которого могут выступать коммерческий растительный лецитин разных марок (Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран и бидистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит высокомолекулярное нетоксическое поверхностно-активное вещество, в качестве которого используют метилцеллюлозу, или плуроник (F68, или F127, или F168), или каррагинан, или альгинат натрия, или гиалуроновую кислоту, или бычий сывороточный альбумин при следующих соотношениях компонентов, мас.%:

трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9
фруктоза 0,9
лимонная кислота 0,7
сахароза 2
глицерин 4,5-6,5
фосфолипиды сои 0,04-2,00
поверхностно-активное вещество 0,01-1
вода бидистиллированная остальное

Предложен способ приготовления среды для криоконсервации семени быка, включающий приготовление безлипидной основы среды для криоконсервации семени быка путем разведения в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C трис-(гидроксиметил)-аминометана, лимонной кислоты, фруктозы, добавления глицерина и охлаждения до комнатной температуры, доведения pH раствора до 6,8, отличающийся тем, что отдельно готовят липосомальный концентрат посредством добавления в 10%-ный раствор сахарозы 0,2-20,0 мас.% фосфолипидов сои, поверхностно-активное вещество, выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа, затем обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут и смешивают безлипидную основу среды для криоконсервации семени быка и липосомальный концентрат в соотношении 4:1, стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа или стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 мкм.

Общеизвестно, что для замораживания семени быка в основном используют среды, содержащие яичный желток. Яичный желток снижает чувствительность сперматозоидов к холодовому шоку и замораживаию. Носитель криозащитных свойств яичного желтка - легкая липопротеиновая фракция желтка. Основная часть легких липопротеинов ЯЖ организованна в небольшие конгломераты со средней молекулярной массой около 5×106 (Cook, Martin, 1969). Легкая липопротеиновая фракция желтка состоит из фосфолипидов (яичного лецитина) и белковой компоненты. Полагают, что криопротекторными свойствами обладает яичный лецитин. У очищенных белков легкой липопротеиновой фракции не обнаружено криопротекторных свойств. Тем не менее очищенные яичные фосфолипиды обладают более слабыми криозащитными свойствами по сравнению с полной фракцией легких липопротеинов. Яичный желток обладает высокой эффективностью в защите сперматозоидов от холодового шока как при охлаждении, так и при замораживании. Достаточно сказать, что удаление яичного желтка из стандартной среды для замораживания семени быка приводит к падению выживаемости сперматозоидов в цикле замораживания-оттаивания примерно в 6 раз, в то время как удаление из той же среды традиционного криопротектора - глицерина - только в 2 раза. Но, при высокой криозащитной эффективности желток обладает целым рядом нежелательных свойств: непостоянство состава, сложность стерилизации, быстрая потеря криозащитных свойств при хранении (несколько часов), способность вызывать иммунную сенсибилизацию при введении в половые пути самки. Кроме того, в последнее время в связи с массовым импортом племенных быков в Россию участились случаи абортов, вызванных хламидийной и микоплазменной инфекциями. В настоящее время нет четкой методики выявления возбудителей данных инфекций, а применяемая реакция цепной полимеризации не всегда дает возможности видового определения возбудителя. Таким образом, желток куриного яйца при наличии в нем антител к микоплазме часто является причиной выбраковки доброкачественной криоконсервированной семени быков-производителей.

Наиболее перспективным заменителем желтка является фосфолипиды растительного происхождения (соевый лецитин). Известно, что криозащитная эффективность фосфолипидов существенно зависит от формы организации фосфолипидных частиц в криопротектирующем растворе. Мы предлагаем вводить растительные фосфолипиды в виде липосом малого размера (30-350 нм). Лецитин в виде липосом малого размера образует более стабильную суспензию, не склонен к образованию осадка, легче взаимодействует с мембраной сперматозоида. Кроме того, фосфолипиды в виде липосом малого размера позволяет получить оптически прозрачную суспензию, что важно для визуальной и инструментальной оценки качества семени, разбавленного криосредой. Помимо фосфолипидов в среду вводится высокомолекулярное повехностно-активное веществово. Таким веществом может быть сухой очищенный альбумин либо высокомолекулярные поверхностно-активные вещества небелковой природы, а именно метилцеллюлоза, альгинат натрия, гиалуроновая кислота, каррагинан, плуроник и некоторые другие. Перечисленные вещества не только стабилизируют липосомы, но и меняют взаимодействие липосом с клеточной мембраной сперматозоида, повышая криозащитный эффект липосом.

Приготовление среды для криоконсервации семени быка заключалось в следующем.

Готовят безлипидную основу криозащитной среды для семени быка. Для этого в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C разводят трис-(гидроксиметил)-аминометан, лимонной кислоту, фруктозу, глицерина. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят pH раствора до 6,8.

Дополнительно готовят липосомальный концентрат следующего состава: сахароза 9-10 г, фосфолипиды сои (коммерческий соевый лецитин марок Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран) 0,2-10 г. Для получения суспензии фосфолипидов навеску сухого лецитина в растворе сахарозы и выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа. После гидратации лецитина в течение указанного времени получают первичную грубодисперсную суспензию фосфолипидов, содержащую мультиламмелярные липосомы со средним диаметром 1000-2000 нм (размер зависит от длительности гидратации, интенсивности помешивания и температуры раствора). Первичную грубодисперсную суспензию обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут. В результате обработки ультразвуком крупные липосомы в суспензии дробятся и переходят в форму преимущественно моноламмелярных липосом со средним диаметром 30-350 нм. Затем к суспензии липосом добавляют стабилизатор, в качестве которого может выступать: метилцеллюлоза в концентрации 0,05-0,25%, или плуроник (F68, или F127, или F168) в концентрации 0.05-0.25%, или каррагинан в концентрации 0,05-0,25%, или альгинат натрия в концентрации 0,05-0,5%), или гиалуроновая кислота в концентрации 0,1-0,5%), или бычий сывороточный альбумин в концентрации 1-5%).

Приготовленную безлипидную основу (первого либо второго вариантов) смешивают с липосомальным концентратом в соотношении 4:1.

Полученную криозащитную среду для семени быка можно использовать без дополнительной обработки либо подвергнуть стерилизации.

Метод стерилизации зависит от разновидности добавляемого стабилизатора и от среднего размера частиц, который находится в зависимости от конкретной марки коммерческих лецитинов и от режима ультразвуковой обработки.

Криозащитную среду стерилизуют фильтрацией или автоклавированием. Криозащитную среду стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 нм. Метод пригоден для суспензии липосом со средним размером частиц примерно до 150-170 нм. При более высоком среднем размере частиц в суспензии фильтры быстро забиваются и дальнейшая фильтрация становится невозможной.

Криозащитную среду стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа. Более высокотемпературное автоклавирование недопустимо, т.к. будет вызывать карамелизацию сахаров. Автоклавирование недопустимо, если в качестве стабилизатора липосом используют бычий сывороточный альбумин.

Готовую среду хранят при температуре +4°C в темном месте, т.к. свет и высокие температуры могут вызвать перекисное окисление в липосомах. Без стерилизации среда сохраняет стабильность и криозащитные свойства не менее 5 дней. Стерилизация может увеличивать срок хранения готовой криозащитной среды для семени быка до 2-3 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение размера частиц в суспензии соевых фосфолипидов марки Lecy-Pro-90 в растворе сахарозы.

В эксперименте использовали пищевой лецитин марки Lecy-Pro-90, приобретенные в компании «Протеин плюс». Первичную (грубодисперсную) суспензию «сухого лецитина» Lecy-Pro-90 получали спонтанной гидратацией сухого лецитина. Известно, что «сухие» соевые лецитины, которые содержат не менее 95% полярных липидов, способны при помещении в водную среду спонтанно образовывать суспензию, состоящую из мультиламеллярных липосом. Для получения суспензии навеску сухого лецитина Lecy-Pro-90 из расчета 6% помещали в раствор сахарозы и выдерживали при комнатной температуре, при постоянном помешивании 4 часа. Затем часть суспензии помещали в холодильник (+4°C) на 20-24 часа. В течение этого времени происходит практически полная гидратация лецитина и образуется суспензия, содержащая мультламеллярные липосомы. Данную суспензию далее называем суспензий, полученной спонтанной гидратацией. Вторую часть подвергали обработке ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т. Суспензию обрабатывали ультразвуком 22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут при помощи погружного зонда с диаметром торца 2 мм. Для предотвращения окисления лецитина во время ультразвуковой обработки суспензию охлаждали до +10°C на ледяной бане. Затем полученную суспензию хранили в холодильнике (+4°C) до измерений. Данный раствор далее назван суспензией, полученной ультразвуковым дроблением.

Измерение размеров частиц проводили через сутки после приготовления.

Размеры липосом или липидных мицелл в полученной суспензии определяли методом измерения динамического светорассеяния на анализаторе размеров субмикронных частиц «N5 Submicron Particle Size Analyser «BeckmanCoulter». Размеры липидных частиц в суспензии определяли через 1 сутки после приготовления. Также визуально оценивали внешний вид суспензии.

Результаты измерений представлены в таблице 1.

Таблица 1
Характеристика суспензий лецтина LeCy-Pro-90, полученных спонтанной гидратацией лецитина и ультразвуковым дроблением суспензионных частиц.
Способ приготовления суспензии Средний размер частиц, нм. Визуальная характеристика суспензии
Суспензия, полученная спонтанной гидратацией 1788,3±55,4 Непрозрачная смесь молочной консистенции, желтоватого цвета, слабый ореховый запах
Суспензия, полученная ультразвуковым дроблением 74,6±12,9 Полупрозрачная опалесцирующая жидкость, слабый ореховый запах. В тонком слое (около 0,5 см) на просвет можно различить напечатанный текст.

Помимо исследования характеристик суспензии были сделаны визуальные исследования сперматозоидов в 5% суспензии лецитина LeCy-Pro-90, полученной спонтанной гидратацией и в 1% суспензии лецитина LeCy-Pro-90, полученной ультразвуковым дроблением. Как видно на фиг.1, суспензия, обработанная ультразвуком, не препятствует визуальному исследованию сперматозоидов (фиг. 1б), в то время как в суспензии, полученной спонтанной гидратацией, сперматозоиды трудно различимы (фиг.1а).

Пример 2. Определение оптимальной концентрации лецитина LeCy-Pro-90 в суспензии, обработанной ультразвуком для обеспечения криозащитного воздействия на сперматозоиды быка при криоконсервации.

В эксперименте использовали пищевые лецитины марок LeCy-Pro-90, приобретенные в компании «Протеин плюс». Суспензии лецитина готовили на основе 10% раствора сахарозы. Первичную (грубодисперсную) суспензию «сухого лецитина» LeCy-Pro-90 получали спонтанной гидратацией сухого лецитина. Для получения суспензии навеску сухого лецитина в раствор сахарозы и выдерживали при комнатной температуре, периодически помешивая 4 часа. Затем обрабатывали суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут). Семя быков голштинской породы разбавляли 1/4 или более (в зависимости от концентрации спермиев в эякуляте) лактозо-глицериновой средой (10% лактозы, 0,2% HEPES, 5% глицерина с добавлением либо 20% яичного желтка (контроль), либо 20% липосомального концентрата с разной концентрацией липосом так, чтобы конечная концентрация липидов в среде составляла от 0,03 до 3%. Замораживание осуществляли в открытых гранулах на пластинах твердой двуокиси углерода (сухом льду) по стандартной методике (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008, 160 с.). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Hepes, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.

Криозащитную эффективность соевых фосфолипидов определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500.

Результаты исследований, представленые на фиг.2, свидетельствуют, что оптимальные концентрации соевого лецитина в виде суспензии липосом со средним диаметром 80-100 нм лежат в довольно широких пределах, от 0,1 до 1% лецитина в криозащитной среде. Подвижность сперматозоидов через 10 минут после оттаивания в экспериментальных группах с указанными концентрациями не имела достоверных отличий от контрольной группы с добавлением яичного желтка.

Пример 3. Сравнение криозащитной эффективности трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды с яичным желтком и трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды с добавлением растительных фосфолипидов в виде липосом малого размера.

В данном примере проводили сравнение криозащитного воздействия на спермин быка яичного желтка и липосомального концентрата, изготовленного из фосфолипидов сои на фоне трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды. В качестве контроля выступало семя быка, криоконсервированное в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде с добавлением 20% яичного желтка. В эксперименте к трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде вместо желтка добавляли 20% липосомального концентрата следующего состава: сахароза 10 г, фосфолипиды сои (азолектин) 1,8 г, альгинат натрия 0,5 г, бидистиллированной воды 88 мл. Липосомы дробили ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут).

Замораживание осуществляли в открытых гранулах на пластинах твердой двуокиси углерода (сухом льду) по стандартной методике (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008,160 с). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Hepes, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.

Криозащитную эффективность соевых фосфолипидов определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2.
Сравнение показателей замороженно-оттаянного семени быка, криоконсервированного в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде и в безжелточной трис-цитрат-глицериновой среде с фосфолипидами сои в форме липосом со средним диаметром 80-100 нм.
Криопротектирующая среда Подвижных спермиев сразу после оттаивания, %. Средняя скорость движения спермиев сразу после оттаивания Подвижных спермиев через 5 часов культивирования при 38°C, %.
Визуально Спермо-анализатор
Трис-цитрат-фруктозо-глицерожелточная среда 39,0±2,0 39,5±2,8 73,1±3,5 21,1±5,5
Трис-цитрат-фруктозо-глициновая среда с фосфолипидами сои 38,5±1,1 36,5±1,2 69,0±2,2 19,5±2,3

Как можно видеть из таблицы двигательные характеристики семени, криоконсервированного в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде с яичным желтком (контроль) и с липосомальным концентратом, содержащим сахарозу, растительные фосфолипиды в виде липосом со средним диаметром 80-100 нм и альгинат натрия, не имеют достоверных различий. Так подвижность после размораживания в контроле и экспериментальной группе составила соответственно 39,5±2,8% и 36,5±1,2% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после оттаивания 21,1±5,5% в контроле и 19,5±2,3 в экспериментальной группе. Данные свидетельствуют об эффективности предлагаемой криозащитной среды.

Пример 4. Исследование влияния хранения криозащитной среды перед использованием на ее криозащитную эффективность.

В эксперименте использовали семя быков Голштинской и черно-пестрой пород. Липосомальный концентрат готовили на основе 10% раствора сахарозы, в качестве источника растительных фосфолипидов использовали экстракт соевых бобов «Азолектин»(«Сигма»). Суспензию лецитина обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут). После озвучивания в липосомальный концентрат в качестве стабилизатора добавляли 0,1% плуроника Р68. Использовали безлипосомальную основу следующего состава (в весовых процентах): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,4; фруктоза - 0,9; лимонная кислота - 1,3; глицерин - 6, бидистиллированная вода. Безлипосомальную основу и липосомальный концентрат смешивали в соотношении 4:1. Среду стерилизовали автоклавированием при 115°C в течение 1 часа и запечатывали до использования. Среду хранили в холодильнике (+4°). Криоконсервацию семени быков проводили по стандартному методу замораживания в гранулах. Для замораживания использовали среду после 1 суток (контроль) и 10 суток хранения (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008, 160 с.). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Нереs, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.

Криозащитную эффективность среды определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500.

Таблица 3.
Влияние хранения среды перед использованием (хранение при +4°C) Показатели замороженно-оттаяной спермы в трис-цитрат-фруктозоглицериновой среде с липосомами, альгинатом и антиоксидантами.
Подвижность до замораживания, %. Показатели спермы после оттаивания
Подвижность после размораживания Подвижность после культивирования при 38°C, 5 часов, %.
Количество подвижных сперматозоидов, %. Средняя скорость
Криоконсервация семени в среде через 1 сутки после
приготовления*
80±1 39±5 62±7 15±5
Криоконсервация семени в среде через 10 суток после
приготовления*.
79±1 36±6 66±7 17±6

Результаты исследований, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что среда сохраняет криозащитную эффективность в течение 10 суток хранения. Так, двигательные характеристики семени составили: после криоконсервации в свежеприготовленной среде подвижность сразу после размораживания - 80±1% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после размораживания -15±5% подвижных сперматозоидов; после криоконсервации в среде, сохранявшейся при +4 в течение 10 суток подвижность сразу после размораживания - 79±1% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после размораживания - 17±6% подвижных сперматозоидов Таким образом, десятидневное хранение среды с соевым лецитинов в виде липосом малого размера не влияло на ее криозащитные характеристики.

Предлагаемая среда имеет повышенную биологическую безопасность, т.к. не содержит в своем составе яичного желтка или других сложных компонентов животного происхождения, которые могут быть носителями опасных патогенов.

В отличие от прототипа, среда с растительными лецитином в виде липосом, размером до 350 нм обладает оптической прозрачностью. Новая среда для криоконсервации семени быка не препятствует визуальному и инструментальному контролю качества семени.

За счет более эффективного взаимодействия липосом малого размера с клеточной мембраной сперматозоида оптимальные концентрации фосфолипида в криозащитной среде снижаются с 4-8% до 0,1-1%.

За счет высокой стабильности размеров липосом и стерилизации срок возможного использования готовой криосреды возрастает от 5 часов до 2-3-х месяцев, что позволяет оптимизировать затраты труда технологов на племпредприятиях.

Изобретение применимо в предприятиях, деятельность которых заключается в получении и криоконсервации семени быков-производителей.

1. Среда для криоконсервации семени быка, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, лимонную кислоту, сахарозу, фруктозу, глицерин, фосфолипиды сои, в качестве источника которых могут выступать коммерческий растительный лецитин разных марок, например Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран и бидистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит высокомолекулярное нетоксическое поверхностно-активное вещество, в качестве которого используют метилцеллюлозу, или плуроник (F68, или F127, или F168), или каррагинан, или альгинат натрия, или гиалуроновую кислоту, или бычий сывороточный альбумин при следующих соотношениях компонентов, мас.%:

Трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9
Фруктоза 0,9
Лимонная кислота 0,7
Сахароза 2
Глицерин 4,5-6,5
Фосфолипиды сои 0,04-2,00
Поверхностно-активное вещество 0,01-1
Вода бидистиллированная остальное

2. Способ приготовления среды для криоконсервации семени быка, включающий приготовление безлипидной основы среды для криоконсервации семени быка путем разведения в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C трис-(гидроксиметил)-аминометана, лимонной кислоты, фруктозы, добавления глицерина и охлаждения до комнатной температуры, pH раствора доводят до 6,8, отличающийся тем, что отдельно готовят липосомальный концентрат посредством добавления в 10%-ный раствор сахарозы 0,2-20,0 мас.% фосфолипидов сои, вносят поверхностно-активное вещество, выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая, 4-24 часа, затем обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут и смешивают безлипидную основу среды для криоконсервации семени быка и липосомальный концентрат в соотношении 4:1, стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа или стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 мкм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения функционального состояния яичников у самок сельскохозяйственных животных в условиях первой лактации.
Изобретение относится к птицеводству, в частности к среде для разбавления и длительного хранения спермы индюков. Среда характеризуется тем, что она содержит растворенные в дистиллированной воде глутамат натрия, глутаминовую кислоту, инозитол, калий фосфорнокислый двузамещенный, глюкозу и магния сульфат.

Изобретение относится к области искусственного осеменения животных и может применяться в сельскохозяйственном производстве. Способ забора криоконсервированного семени быков-производителей из сосуда Дьюара включает предварительное охлаждение корнцанга перед забором спермадоз в жидком азоте до температуры -196°C, при этом предварительному охлаждению подвергают только бранши корнцанга.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Предложенный станок для проведения искусственного осеменения телок и коров состоит из соединенных аркой боковых стоек с опорами, несущими перекрывающие створки.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу повышения воспроизводства косулей. Способ включает внутримышечное введение самкам стимулирующих овуляцию препаратов, при этом при воспроизводстве содержащихся в полувольных условиях косулей, отбирают самок с увеличенным числом приплода.
Изобретение относится к ветеринарии. Осуществляют одновременную ампутацию пениса и препуция.

Заявленное изобретение относится к ветеринарии, а именно к искусственному осеменению коров и телок. Вагиноскоп для искусственного осеменения коров и телок включает полипропиленовую трубку с защитным вкладышем, ручку, осветитель, в качестве которого используется фонарик с тремя светодиодами, и направляющую трубку из жести для фиксации осветителя и его прикрепления к стенке трубки вагиноскопа, при этом наружный конец полипропиленовой трубки имеет скос под углом 45-50 градусов и снабжен защитным вкладышем, прикрепленным к трубке.
Изобретение относится к области птицеводства, в частности к способам длительного хранения семени петухов в функциональном состоянии. Способ криоконсервации семени петухов характеризуется тем, что семя петухов разбавляют в 5 раз в среде, которая содержит 100 см3 дистиллированной воды, 6 г лактозы, 0,58 г лимонной кислоты, 1 г трис-оксиметил-аминометана, 10 см3 желтка куриного яйца, 5 см3 глицерина, при этом температура семени и среды 18-20º С.

Изобретение относится к устройству для введения и/или отбора жидкостей в яйцевод свиньи лапароскопическим путем и способу введения и/или отбора жидкостей с помощью указанного устройства.
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано в искусственном осеменении. Сперму от барана получают путем применения искусственной вагины, выполненной в виде единой цельнолитой двустенной резиновой трубки, имеющей эластичное овальное кольцо.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к посмертной патоморфологической диагностике бифуркационной недостаточности сосудов артериального круга большого мозга.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для борьбы с эктопаразитами и эндопаразитами у животных. Заявлена ветеринарная композиция для наружного применения для лечения или предотвращения паразитарных инфекций или инвазий у животного, содержащая: (a) комбинацию четырех активных агентов, содержащую фипронил, регулятор роста насекомых, празиквантел и авермектиновый или милбемициновый активный агент; и (b) фармацевтически приемлемый носитель; где указанная композиция является жидкой композицией для наружного нанесения.

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток крови проводят путем добавления ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовки полученной взвеси к замораживанию путем холодовой адаптации при +4,0°C в течение 10 минут.

Изобретение относится к медицине. Для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска.
Изобретение относится к медицине, в частности к области нормальной анатомии, и может быть использовано для обучения школьников, студентов, аспирантов и врачей. Осуществляют предварительное санирование анатомического объекта и его инъекционное инфильтрирование бальзамирующим раствором.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для хранения препаратов ДНК в жидком виде. Получают композицию, содержащую буферный раствор, включающий 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и воду - остальное.

Изобретение относится к медицине. Способ изготовления и хранения анатомических музейных влажных макропрепаратов включает промывание препарата водой с последующей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий, причем при приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор глиоксаля по объему, превышающему объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз, далее замену реагента производят трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором глиоксаля.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к способу получения 5-(1,5,3-дитиазепан-3-ил)-хинолина (1), заключающемуся во взаимодействии 5-аминохинолина и 1-окса-3,6-дитиациклогептана в среде этанол-хлороформ (1:1, объемные) в присутствии катализатора Sm(NO3)3·6Н2O при мольном соотношении 5-аминохинолин : 1-окса-3,6-дитиациклогептан : Sm(NO3)3·6H2O = 1:1:(0.03-0.07) при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 2.5-3.5 ч.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения композиций, содержащих стволовые плацентарные клетки. Способ включает: (a) получение адгезивных плацентарных клеток в растворе, включающем от 2% до 10% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, (b) фильтрацию полученного раствора через 70 мкм - 100 мкм фильтр; (c) разбавление указанных клеток до содержания не более 10±3·106 клеток на миллилитр раствором, включающим от 2% до 5% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, и (d) криоконсервацию раствора, содержащего клетки.

Изобретение относится к области криобиологии. Предложен способ консервации биоматериала. Способ включает размещение биоматериала в стерильной емкости, удаление воздуха из емкости и ее герметизацию, обработку биоматериала в закрытой среде в емкости со смотровым окном ксеноном и охлаждение биоматериала при постоянном визуальном мониторинге. Обработку биоматериала производят ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм., а последующее охлаждение биоматериала ведут до температуры не более +5°C, но не менее -10°C. Изобретение обеспечивает уменьшение вероятности разрушения биоматериала, в том числе в процессе хранения законсервированного биоматериала. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 2 пр.
Наверх