Анти-с4.4а антитела и их применение

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам к С4.4а и их антигенсвязывающим фрагментам. Антитела специфически связываются с доменом S1 С4.4а, являются кросс-реактивными по отношению к С4.4а грызунов и интернализуются после связывания с клетками, экспрессирующими С4.4а. Изобретение обеспечивает способ получения указанных антител, а также конъюгат указанного антитела с лекарственным средством. Изобретение может применяться для лечения и диагностики нарушений и состояний, связанных со сверхэкспрессией С4.4а. 11 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 18 табл., 15 пр.

 

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантные антигенсвязывающие области и антитела, и функциональные фрагменты, содержащие такие антигенсвязывающие области, которые являются специфичными для заякоренного в мембране полипептида массой 29 кДа, называемого С4.4а, который сверхэкспрессируется в опухолях.

Кроме того, он имеет высокую распространённость в метастазах этих типов рака. Антитела, соответственно, могут применяться для лечения этих и других расстройств и состояний. Антитела в соответствии с настоящим изобретением также могут применяться в области диагностики, так же как и для дальнейшего исследования роли С4.4а в развитии нарушений, связанных с раком. Изобретение также обеспечивает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вышеупомянутые антитела, векторы, содержащие эти последовательности, фармацевтические композиции и наборы с инструкциями по применению.

Уровень техники

Терапия, основанная на антителах, оказывается очень эффективной при лечении различных раковых образований, включая солидные опухоли. Например, HERCEPTIN® успешно применяется для лечения рака молочной железы, и RITUXAN® эффективен при формах рака, связанных с В-клетками. Центральное место в развитии успешной терапии, основанной на антителах, является выделение антител против белков клеточной поверхности, про которые известно, что они предпочтительно экспрессируются на опухолевых клетках. Полипептид С4.4а (название гена: LYPD3) представляет собой заякоренный через гликофосфатидилинозитол (ГФИ) высокогликозилированный белок клеточной поверхности. Мышиный С4.4а был сначала описан как связанный с метастазами белок клеточной поверхности в раковых клетках крысы с метастазирующей опухолью поджелудочной железы (Wurfel, J. et. al. Gene 2001, 262:35-41). Человеческий С4.4а был клонирован из библиотеки плацентарной к-ДНК (Wurfel, J. et. al. Gene 2001, 262:35-41). С4.4а показывает структурную гомологию с uPAR-рецептором и содержит два домена LY6, показывающие типичные три складки белка цинкового пальца (Jacobsen В. & Ploug M., Current Medicinal Chemistry 2008, 15:2559-2573). Белок является высоко гликозилированным и содержит 6 предсказанных сайтов N-гликозилирования и несколько сайтов O-гликозилирования. Кроме того, С4.4а содержит в общей сложности 9 дисульфидных мостиков, локализованных в двух доменах Ly6 (Hansen L. et al., Biochem J. 2004, 380:845-857). С4.4а показывает сильную экспрессию в опухолевых клетках рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рак почек, рака головы и шеи и меланомы.

Нозерн-блоттинг продемонстрировал экспрессию С4.4а в ~50% первичных опухолей легкого и ~75% метастаз опухоли легкого, в то время как экспрессия в здоровой ткани легкого не была обнаружена (Wurfel J. et. al., Gene 2001, 262:35-41). Для немелкоклеточного рака легких С4.4а может использоваться в качестве прогностического маркера. В этом случае клинические данные ясно показывают, что высокая экспрессия С4.4а коррелирует с плохим прогнозом (Hansen L. et al., Lung Cancer 2007, 58:260-266). Детализированный анализ экспрессии в меланоме показал, что С4.4а не экспрессируется в меланоцитах и невусах, но экспрессируется в ~60% первичных злокачественных меланомах и в 100% метастаз в лимфатических узлах и коже (Seiter S. et al., J Invest Dermatol. 2001, 116(2):344-347). Кроме того, была обнаружена стимуляция экспрессии гена С4.4а в ткани рака молочной железы по сравнению с близлежащей нормальной тканью молочных желез (Fletcher G.C., Br. J. Cancer 2003, 88(4):579-585), в различных клеточных линиях рака молочной железы и при уротелиальном раке по сравнению с нормальным уротелием (Smith В. A. et al., Cancer Res 2001, 61(4):1678-1685). Экспрессия С4.4а была продемонстрирована с помощью FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) с поликлональным антителом в различных опухолевых клеточных линиях колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы и рака простаты. В IHC (иммуногистохимических) исследованиях образцов колоректального рака, рака поджелудочной железы и рака молочной железы вариабельное гликозилирование С4.4а на человеческих опухолевых клеточных линиях препятствует связыванию этих антител. Поэтому С4.4а должен быть по меньшей мере частично дегликозилированным, чтобы дать возможность для связывания этих поликлональных антител. У больных колоректальным раком экспрессия С4.4а широко распространена, и С4.4а покидает поверхность клеток, что делает его прогностическим сывороточным опухолевым маркером. Экспрессия С4.4а на инвазивном фронте является новым прогностическим маркером для рецидива колоректального рака (K. Konishi et al., Cancer Science 2010). Диагностические антитела против растворимого сывороточного С4.4а не были описаны (Paret С. et al., British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156). В нормальной ткани экспрессия С4.4а ограничена кератиноцитами кожи, эндотелиальными клетками пищевода и плацентарными клетками (Wurfel J. et. al., Gene 2001, 262:35-41), делая его идеальной мишенью для терапии опухоли. WO 01/23553 предлагает использование ингибитора С4.4а (например, анти-С4.4а антитело), который уменьшает или ингибирует экспрессию С4.4а или активность для лечения рака.

Точная функция С4.4а остается неизвестной; однако, он стимулируется в мигрирующих кератиноцитах при заживлении раны (Hansen L. et al., Biochem J. 2004, 380:845-857). В свете ассоциации с метастазами и структурной гомологии с uPAR предполагается, что эта молекула участвует в инвазии опухолевой клетки, вероятно, через взаимодействие с внеклеточным матриксом (Rosel М. et al., Oncogene 1998, 17(15):1989-2002; Paret С. et al, British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156). Потенциальными лигандами являются ламинин 1 и 5, галектин 3 (Paret С, Int. J. Cancer 2005, 115:724-733), а также agr2 (Anterior gradient homolog) и agr3 (Fletcher GC, Brit. J. Cancer 2003, 88:579-585).

Прогностическое значение ксенотрансплантатных мышиных моделей рака для клинического исхода болезни при терапии рака иммунотоксинами часто ограничивается отсутствием кросс-реактивности терапевтических антител с их мышиными ортологами, что приводит к уменьшенному неспецифическому связыванию с нормальной тканью. С другой стороны, нейтрализующие антимышиные Fv антитела, которые образуются у пациентов, которых лечат мышиными или химерными антителами, могут привести или к ограничивающей дозу токсичности, или к уменьшению терапевтической эффективности. Таким образом, чтобы полностью использовать потенциал специфической экспрессии С4.4а в терапии рака, требуются нацеливающие антитела, которые объединяют преимущества высокой аффинности связывания С4.4а с человеческими или гуманизированными антителами и с мышиной кросс-реактивностью.

Другим необходимым признаком новых антител является высокоаффинное связывание с различными линиями раковых клеток, экспрессирующими С4.4а на своей поверхности. С4.4а по-разному гликозилирован на опухолевых клетках (Paret С. et al., British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156). Таким образом, эффективные анти-С4.4а антитела должны связываться с эпитопом, презентирующимся опухолевыми клетками различных пациентов, независимо от индивидуальных различий, включая, но не ограничиваясь этим, различия в характере гликозилирования, которые приводит к экспрессии различных форм С4.4а.

Настоящее изобретение обеспечивает антитела, антигенсвязывающие фрагменты этих антител или их варианты, которые связываются с С4.4а с высокой аффинностью, эффективно интернализуются, и которые предпочтительно являются кросс-реактивными с С4.4а из других видов. Также предлагаются основанные на антителе способы лечения рака, в особенности для опухолей экспрессирующих С4.4а, таких как рак молочной железы, дыхательных путей, мозга, репродуктивных органов, пищеварительного тракта, мочевых путей, глаза, печени, кожи, головы и шеи, щитовидной железы, паращитовидной железы и их отдаленных метастазов, также включая лимфомы, саркомы и лейкемии. Эти способы лечения используют антитела, антигенсвязывающие фрагменты этих антител или их варианты, которые облегчают доставку терапевтически активных компонентов к раковым клеткам.

Краткое изложение сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является обеспечение антител или антигенсвязывающих фрагментов этих антител или их вариантов, которые являются высокоселективными для полипептида С4.4а, либо ГФИ-заякоренного на клеточной поверхности, либо растворимого благодаря удалению ГФИ-части, в сыворотке пациента и которые могут применяться в способах обнаружения экспрессии С4.4а, которая связана с заболеваниями, такими как рак легких, толстой кишки, молочной железы, шейки матки, поджелудочной железы, почки, головы и шеи или меланомы, и в лечении таких заболеваний. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение выделенных человеческих, гуманизированных или химерных антител или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, которые специфически связываются с эпитопом С4.4а, который присутствует в различных формах зрелого человеческого полипептида С4.4а из 278 аминокислот (SEQ ID 1), который представляется линиями раковых клеток, экспрессирующими С4.4а, и/или который связывается этими антителами с высокой аффинностью. Как применяется в описании настоящего изобретения, различные «формы» С4.4а включают, но не ограничиваются этим, различные гликоформы, различные изоформы или полипептиды С4.4а, которые подвергаются различным трансляционными и посттрансляционными модификациями. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, или их вариантов, которые безопасны для введения человеку.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антителами, или антигенсвязывающими фрагментами этих антител, или их вариантами, которые связываются с человеческим С4.4а и являются кросс-реактивными с С4.4а других видов. Предпочтительно указанными другими видами являются грызуны, такие как, например мыши или крысы. Наиболее предпочтительно, чтобы антитела, или антигенсвязывающие фрагменты этих антител или их варианты связывались с человеческим С4.4а и являлись кросс-реактивными к мышиному С4.4а.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, или их вариантов, которые связываются с широким набором различных клеток экспрессирующих С4.4а. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител или их вариантов, которые связываются с различными раковыми клетками или опухолевыми клетками, экспрессирующими С4.4а, и вызывают иммуноэффекторную активность (например, ADCC или CDC) против раковых клеток, экспрессирующих С4.4а, при помощи одного или более антител или их вариантов в соответствии с настоящим изобретением.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, или их вариантов, которые эффективно интернализуются после связывания с клеткой, экспрессирующей С4.4а. Антитело в соответствии с настоящим изобретением можно вводить одновременно с известными лекарственными средствами, и в некоторых случаях антитело может быть модифицировано само по себе. Например, антитело может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом, иммунотоксином, токсофором или радиоизотопом для возможного дополнительного увеличения эффективности.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, которые составляют инструмент для диагноза злокачественных или диспластических состояний, при которых экспрессия С4.4а повышается по сравнению с нормальной тканью или при которых С4.4а покидает поверхность клеток и становится детектируемым в сыворотке. Предлагаемые анти-С4.4а антитела являются конъюгированными с детектируемым маркером. Предпочтительными являются радиоактивно-меченные маркеры, ферментативно-меченные, меченные хромофором или люминофором.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты, к клеткам, экспрессирующим антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты, к способам получения антител в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающих фрагментов, к способам ингибирования роста диспластических клеток с применением антител в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающих фрагментов и к способам лечения и обнаружения рака, применяя антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты.

Изобретение обеспечивает антитела, которые отличаются от существующих антител С4.4а (Paret С. et al., British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156) в том, что они а) связываются с природным, экспрессирующимся на клеточной поверхности и полностью гликозилированным С4.4а, предпочтительно с доменом S1 природного экспрессирующегося на клеточной поверхности и полностью гликозилированного С4.4а, b) являются кросс-реактивными по отношению к мышиному С4.4а, и с) эффективно интернализируются в клетках, экспрессирующих С4.4а. Эти и другие цели настоящего изобретения более полно описаны в настоящем описании.

Одним объектом настоящего изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат антигенсвязывающую область, которая связывается специфически с природным экспрессирующимся на клеточной поверхности и полностью гликозилированным С4.4а, предпочтительно связывается специфически с доменом S1 (аминокислоты 1-85 из С4.4а; SEQ ID NO:1) природного экспрессирующегося на клеточной поверхности и полностью гликозилированного С4.4а полипептида. В другом варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты интернализуются в клетку, экспрессирующую С4.4а, после связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с вышеупомянутой клеткой. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с С4.4а с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с человеческим С4.4а с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с С4.4а человека и грызуна с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A, дополнительный предпочтительный вариант осуществления состоит в том, что С4.4а грызунов является мышиными С4.4а.

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:5 (H-CDR1), SEQ ID NO:9 (H-CDR2) и SEQ ID NO:13 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:17 (L-CDR1), SEQ ID NO:21 (L-CDR2) и SEQ ID NO:25 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:6 (H-CDR1), SEQ ID NO:10 (H-CDR2) и SEQ ID NO:14 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:18 (L-CDR1), SEQ ID NO:22 (L-CDR2) и SEQ ID NO:26 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:7 (H-CDR1). SEQ ID NO:11 (H-CDR2) и SEQ ID NO:15 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:19 (L-CDR1), SEQ ID NO:23 (L-CDR2) и SEQ ID NO:27 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:8 (H-CDR1), SEQ ID NO:12 (H-CDR2) и SEQ ID NO:16 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:20 (L-CDR1), SEQ ID NO:24 (L-CDR2) и SEQ ID NO:28 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:45 (H-CDR1), SEQ ID NO:46 (H-CDR2 и SEQ ID NO:47 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:48 (L-CDR1), SEQ ID NO:49 (L-CDR2) и SEQ ID NO:50 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:55 (H-CDR1), SEQ ID NO:56 (H-CDR2) и SEQ ID NO:57 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:58 (L-CDR1), SEQ ID NO:59 (L-CDR2) и SEQ ID NO:60 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:65 (H-CDR1), SEQ ID NO:66 (H-CDR2) и SEQ ID NO:67 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:68 (L-CDR1), SEQ ID NO:69 (L-CDR2) и SEQ ID NO:70 (L-CDR3).

В дополнительном более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:75 (H-CDR1), SEQ ID NO:76 (H-CDR2) и SEQ ID NO:77 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:78 (L-CDR1), SEQ ID NO:79 (L-CDR2) и SEQ ID NO:80 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:85 (H-CDR1), SEQ ID NO:86 (H-CDR2) и SEQ ID NO:87 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:88 (L-CDR1), SEQ ID NO:89 (L-CDR2) и SEQ ID NO:90 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:95 (H-CDR1), SEQ ID NO:96 (H-CDR2) и SEQ ID NO:97 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:98 (L-CDR1), SEQ ID NO:99 (L-CDR2) и SEQ ID NO:100 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:105 (H-CDR1), SEQ ID NO:106 (H-CDR2) и SEQ ID NO:107 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:108 (L-CDR1), SEQ ID NO:109 (L-CDR2) и SEQ ID NO:110 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:115 (H-CDR1), SEQ ID NO:116 (H-CDR2) и SEQ ID NO:117 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:118 (L-CDR1), SEQ ID NO:119 (L-CDR2) и SEQ ID NO:120 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:125 (H-CDR1), SEQ ID NO:126 (H-CDR2) и SEQ ID NO:127 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:128 (L-CDR1), SEQ ID NO:129 (L-CDR2) и SEQ ID NO:130 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:135 (H-CDR1), SEQ ID NO:136 (H-CDR2) и SEQ ID NO:137 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:138 (L-CDR1), SEQ ID NO:139 (L-CDR2) и SEQ ID NO:140 (L-CDR3).

Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть IgG (например, IgG1 IgG2, IgG3 IgG4), в то время как фрагмент антитела может быть Fab, Fab', F(ab')₂ или scFv, например. Фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, соответственно, может представлять собой или может содержать антигенсвязывающую область, которая ведет себя одним или более способами как описано в настоящем изобретении.

Изобретение также относится к выделенным последовательностям нуклеиновой кислоты, каждая из которых может кодировать вышеупомянутое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые является специфичными для эпитопа С4.4а. Нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением подходят для продуцирования антител или антигенсвязывающих фрагментов антител с помощью рекомбинантных технологий. Таким образом, настоящее изобретение также относится к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут применяться для терапевтических или профилактических применений. Изобретение поэтому включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения нарушения или состояния, связанных с нежелательным присутствием клеток, экспрессирующих С4.4а. В предпочтительном варианте осуществления вышеупомянутым нарушением является рак. Такой способ содержит стадии введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит антитело в соответствии с настоящим изобретением, как описано или рассмотрено в настоящем изобретении.

Изобретение также обеспечивает инструкции по применению библиотеки антител для выделения одного или более членов такой библиотеки, которые связываются специфически с С4.4а.

Описание чертежей

Фиг.1 показывает результат эксперимента по группированию эпитопов (Epitope grouping), выполненного с использованием сэндвич-анализа поверхностного плазменного резонанса. Y представляет собой единицы резонанса, Х - время в секундах. Одно из антител в соответствии с настоящим изобретением использовали для покрытия чипа. А указывает время добавления С4.4а. В указывает время добавления вторичного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Оба антитела неспособны одновременно связаться с С4.4а, что указывает по меньшей мере на перекрывающийся эпитоп.

Фиг.2 обеспечивает данные по связыванию анти-С4.4а антител в соответствии с настоящим изобретением с рекомбинантным человеческим (а) и мышиным (b) С4.4а на человеческом IgGI. Значения ЕС₅₀ определяли с помощью ELISA, как описано в Примере 4. М31-В01 (А) связывается с EC₅₀ 0,24 и 0,29 нМ с человеческим и мышиным С4.4а, соответственно. М20 В02 S-A (В) связывается с ЕС₅₀ 0,3 и 0,38 нМ с человеческим и мышиным С4.4а, соответственно. Х представлена как log нМ; Y представляет поглощение при 360 нм.

Фиг.3 обеспечивает данные по специфическому связыванию антител в соответствии с настоящим изобретением с различными опухолевыми клеточными линиями, либо трансфецированными hC4.4а, например A549:hC4.4a (а), либо с опухолевыми клеточными линиями с природной экспрессией С4.4а, например NCI H322 (b) NCI H292 (с), H1975/BCRP (d) или ВхРС3 (е). Значения ЕС₅₀ для связывающих М31-В01 (незакрашенные кружки) и M20-D02 S-A (закрашенные кружки) суммированы в (f). Контроль в виде изотипических IgGI (закрашенные треугольники) не показал связывания с клетками. Все данные были получены с помощью титрования FACS. Х представляет собой концентрацию (log нМ), и Y - среднее геометрическое значение флуоресценции (х10³).

Фиг.4(а) обеспечивает данные по специфической интернализации флуоресцентно-меченных анти-С4.4а антител в клетках А549:hC4.4а. Фиг.4(b) обеспечивает данные по нетрансфецированным клеткам А549 в качестве отрицательного контроля. А - М31-В01 (закрашенные квадраты); В - М20-D02 S-A (незакрашенные квадраты); С является контролем в виде изотипических hIgGI (звездочки); Х представляет время в минутах, и Y - количество гранул/клетка [* 10³]. Оба типа С4.4а антител интернализуются специфически, эффективно и быстро в опухолевых клетках, несущих С4.4а.

Фиг.4(с) и (d) представляет данные по интернализации М31-В01 в клетках А549:hC4.4а. Через 5 минут (с) можно наблюдать только слабое окрашивание клеточной поверхности. Через 90 минут (d) ясно видны интенсивно окрашенные эндосомы, содержащие интернализованное антитело М31-В01 , которое несет рН-зависимый флуоресцентный краситель, что указывает на эффективную интернализацию.

Фиг.5 представляет данные, что эпитоп М31-В01 и M20-D02 S-A связывается, как определено с помощью вестерн-блоттинга. А) показывает окрашенный Кумасси 250 SDS-PAGE различных видов С4.4а (линии 2+7 hC4.4а, линии 3+8 mC4.4a, линии 4+9 hC4.4a домен SI-Fc-his6, линии 5+10 hC4.4a домен S2-Fc-his6; линии 1, 6 и 11 содержат маркеры молекулярной массы; линии 2-5 содержат невосстановленные образцы; линии 6-10 содержат восстановленные образцы), В), и С) показывают соответствующие вестерн-блоты с одинаковой нагрузкой образца как в А). В) инкубировали с М31-В01, и С) инкубировали с M20-D02 S-A как идентифицирующее антитело. Оба антитела показывают окрашивание, специфическое, зависимое от восстановления, указывающее на конформационный эпитоп. Однако оба связываются с человеческим и мышиным полноразмерным С4.4а и с доменом S1 человеческого С4.4а, но не доменом S2 человеческого С4.4а.

Фиг.6 представляет данные по ингибированию пролиферации опухолевых клеток in vitro посредством антитела в соответствии с настоящим изобретением (В01-3), определенные с помощью измерений анализатором xCELLigence. Клетки A549:hC4.4a были либо совместно инкубированы с 100 нМ несвязывающих контрольных изотипических антител hIgGI (А), либо с 100 нМ В01-3 (В) в однолуночном планшете E-plate в течение времени, указанного в условиях, описанных в примере 15. Х - время в часах, Y -относительный уровень пролиферации клеток. Клетки A549:hC4.4a, инкубированные с В01-3, показывают уменьшенную пролиферацию клеток по сравнению с контрольными IgGI.

Фиг.7 показывает последовательности в соответствии с настоящим изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии новых антител, которые являются специфичными для С4.4а или имеют высокую аффинность к С4.4а и могут обеспечить терапевтическую полезность для субъекта. Антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые могут быть человеческим, гуманизированными или химерными, могут использоваться во многих контекстах, которые более полно описаны в настоящем изобретении.

Определения

"Человеческое" антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящим определено как такое, которое не является химерным (например, не "гуманизированным") и не из (ни полностью, ни частично) видов, отличных от человека. Человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть получены от человека или могут быть синтетическим человеческим антителом. "Синтетическое человеческое антитело" определяется в настоящем изобретении как антитело, получившее последовательность, полностью или частично, in silico из синтетических последовательностей, которые основаны на анализе известных человеческих последовательностей антител. Конструирование in silico последовательности человеческого антитела или его фрагмента может быть достигнуто, например, с помощью анализа базы данных человеческих антител или последовательностей фрагмента антител и созданием полипептидной последовательности, с использованием данных, полученных оттуда. Другим примером человеческого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является антитело, которое кодируется нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения (например, такой библиотеки, которая основана на антителах, взятых из человеческого природного источника). Примеры человеческих антител включают антитела, описанные в Soderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.

"Гуманизированное антитело" или его гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент определяются в настоящем изобретении как такие, которые (i) получаются из нечеловеческого источника (например, трансгенной мыши, которая несет гетерологичную иммунную систему), антитело которого происходит из последовательности человеческой зародышевой линии; (ii), где аминокислоты каркасной области нечеловеческого антитела частично заменены человеческими аминокислотными последовательностями с помощью генетической инженерией или (iii) привитые на гипервариабельном участке (CDR), где гипервариабельные участки CDR вариабельного домена имеют нечеловеческое происхождение, в то время как одна или более структур вариабельного домена имеют человеческое происхождение, а константный домен (если таковой имеется) имеет человеческое происхождение.

"Химерное антитело" или его антигенсвязывающий фрагмент определяется в настоящем изобретении как антитело, в котором вариабельные домены имеют нечеловеческое происхождение, а некоторые или все константные домены имеют человеческое происхождение.

Термин "моноклинальное антитело", как применяется в описании настоящего изобретения, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть, индивидуальные антитела, содержащиеся в популяции, являются идентичными антителами за исключением возможных мутаций, например, естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Таким образом, термин "моноклональный" указывает на характер антител, как не являющихся смесью отдельных антител. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против единственного эпитопа на антигене. В дополнение к их специфичности препараты моноклональных антител имеют преимущество в том, что они как правило, неконтаминированы другими иммуноглобулинами. Термин "моноклональный" не следует истолковывать, как требование продуцирования антитела каким-то особым методом. Термин моноклональное антитело специфически включает химерные, гуманизированные и человеческие антитела.

Как использующиеся в настоящем изобретении, антитело, которое "связывается специфически с" антигеном, "является специфическим к/для" антигену/антигена или "специфически узнает" антиген, представляющий интерес, например, опухоль-ассоциированную полипептидную антигенную мишень (в настоящем изобретении С4.4а), является антителом, которое связывает антиген с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело становится полезным как терапевтический агент в клетке-мишени или ткани-мишени, экспрессирующих антиген, и имеющее незначительную кросс-реактивность с другими белками или имеющее незначительную кросс-реактивность с такими белками как ортологи и варианты (например, мутантные формы, варианты сплайсинга или протеолитически усеченные формы) вышеупомянутой антигенной мишени. Выражение "специфически узнает" или "связывается специфически с" или является "специфическим к/для" по отношению к конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептидной цепи, как применяется в описании настоящего изобретения, может демонстрироваться, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, имеющим моновалентную Ко для антигена меньше, чем около 10^-4 М, альтернативно меньше, чем около 10^-5 М, альтернативно меньше, чем около 10^-6 М, альтернативно меньше, чем около 10^-7 М, альтернативно меньше, чем около 10^-8 М, альтернативно меньше, чем около 10^-9 М, альтернативно меньше, чем около 10^-10 М, альтернативно меньше, чем около 10^-11 М, альтернативно меньше, чем около 10^-12 М, или меньше. Антитело "связывается специфически с" антигеном, "специфическое к/для" антигену/антигена или "специфически узнает" антиген, если такое антитело в состоянии отличить такой антиген от одного или более ссылочного антигена(ов). В своей самой общей форме, "специфическое связывание", "связывается специфически с", является "специфическим к/для" или "специфически узнает" относится к способности антитела различать между антигеном, представляющим интерес, и неродственным антигеном, как определяется, например, в соответствии с одним из нижеследующих способов. Такие способы включают, но не ограничены этим: Вестерн-блоттинг, ELISA, РИА (радиоиммуноанализ), ECL (электрогенерированная хемилюминесценция), IRMA (иммунорадиометрический анализ) и пептидное сканирование. Например, может быть осуществлен стандартный анализ ELISA. Оценка может осуществляться посредством стандартного развития окрашивания (например, вторичное антитело с пероксидазой хрена и тетраметилбензидином с перекисью водорода). Реакция в определенных лунках оценивается по оптической плотности, например, при 450 нм. Типичная фоновая интенсивность (= негативной реакции) может быть 0,1 OD; типичная положительная реакция может давать 1 OD. Это означает, что отношение положительное/отрицательное может быть более чем 5-кратное, 10-кратное, 50-кратное и предпочтительно более чем 100-кратное. Как правило, определение специфичности связывания осуществляется при помощи не единственного референс-антигена, но набора от около трех до пяти неродственных антигенов, таких как молочный порошок, БСА, трансферрин и т.п.

"Связывающая способность" относится к силе сумме общих нековалентных взаимодействий между единственным связывающим участком молекулы и ее партнером по связыванию. Если не обозначено иначе, как использующаяся в настоящем изобретении, "связывающая способность" относится ко внутренней связывающей способности, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары по связыванию (например, антителом и антигеном). Константа диссоциации "K_D" обычно используется, чтобы описать сродство между молекулой (такой как антитело) и его партнером по связыванию (таким как антиген), то есть, как сильно лиганд связывается с конкретным белком. Аффинности лиганд-белок зависят от нековалентных межмолекулярных взаимодействий между этими двумя молекулами. Аффинность может быть измерена общепринятыми методиками, известными в данной области техники, включая описанные в настоящем изобретении. В одном варианте осуществления "K_D" или "значение K_D" в соответствии с настоящим изобретением измеряются при помощи анализа поверхностного плазменного резонанса с использованием прибора BiaCore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.) в соответствии с Примером 3. Вкратце, антитела иммобилизовывали на сенсорный чип СМ5 через непрямой реагент захвата, Fc античеловеческого IgG. Реактивы из "Human Antibody Capture Kit" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) использовались, как описано изготовителем.

Приблизительно 5000 резонансных единиц (RU) моноклональных мышиных античеловеческих антител IgG (Fc) были иммобилизованы на клетку. Анти-С4,4 антитела вводили для достижения уровня захвата приблизительно 200-600 RU. Различные концентрации человеческого или мышиного С4.4а вводили поверх иммобилизованных анти-С4.4а антител. Сенсограммы были генерированы после in-line коррекции сравнительной ячейки, с последующим вычитанием буфера образца. Константу равновесия диссоциации (K_D) вычисляли на основании отношения констант скоростей ассоциации (k_on) и диссоциации (k_off), полученных с помощью аппроксимации сенсограммы по первому порядку 1:1 модели связывания с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation Software. Другими подходящими устройствами являются BIACORE(R)-2000, BIACORE (R)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), или прибор ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Термин "антитело", как применяется в описании настоящего изобретения, описывает иммуноглобулиновые молекулы, предпочтительно состоящие из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, которые, как правило, связываются дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи (сокращаемые в настоящем изобретении как VH) и константный домен тяжелой цепи. Константный домен тяжелой цепи может содержать, например, три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи (сокращаемый в настоящем изобретении как VL) и константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи содержит один домен (CL). Домены VL и VH могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), вкрапленные в области, которые являются более консервативными, называемые каркасными участками (FR). Каждый VH и VL, как правило, состоит из трех CDR и до четырех FR. расположенных от N-конца к С-концу, например, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Как применяется в описании настоящего изобретения, термин «участки, определяющие комплементарность» (CDR; например, CDR1, CDR2 и CDR3), относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которого необходимо для связывания антигена. Каждый вариабельный домен, как правило, имеет три участка CDR, идентифицируемые как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждый участок, определяющий комплементарность, может содержать аминокислотные остатки из "участка, определяющего комплементарность", как определено Kabat (например, около остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или те остатки из "гипервариабельной петли" (например, около остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196:901-917 (1987)). В некоторых случаях участок, определяющий комплементарность, может включать аминокислоты как из участка CDR, определенного в соответствии с Kabat, так и из гипервариабельной петли.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей интактные антитела могут быть отнесены к различным "классам". Существует пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM - и некоторые из них могут дополнительно разделяться на "подклассы" (изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называют [альфа], [дельта], [эпсилон], [гамма] и [мю], соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов известны. Как применяется в описании настоящего изобретения, антитела являются общеизвестными антителами и их функциональными фрагментами.

"Функциональный фрагмент" или "антигенсвязывающий фрагмент антитела" антитела/иммуноглобулина настоящим определен как фрагмент антитела/иммуноглобулина (например, вариабельная область IgG), который сохраняет антигенсвязывающую область. "Антигенсвязывающая область" антитела, как правило, состоит из одной или более гипервариабельных областей антитела, например, CDR1, -2, и/или -3 области; однако вариабельные "каркасные" области могут также играть важную роль в связывании антигена, например, обеспечивая каркас для CDR. Предпочтительно, "антигенсвязывающая область" содержит аминокислотные остатки по меньшей мере от 4-ого до 103-его вариабельной области легкой цепи (VL) и от 5-ого до 109-ого вариабельной области тяжелой цепи (VH), более предпочтительно от 3 до 107 VL и от 4 до 111 VH, и особенно предпочтительным являются полные цепи VL и VH (положение аминокислот 1-109 VL и 1-113 VH; нумерация в соответствии с WO 97/08320). Предпочтительным классом иммуноглобулинов для использования в данном изобретении является IgG.

"Функциональные фрагменты" или "антигенсвязывающие фрагменты антитела" в соответствии с настоящим изобретением включают Fab, Fab', F(ab')₂ и фрагменты Fv; диатела; доменные антитела (DAbs), линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (scFv); и мультиспецифичные, такие как би- и триспецифические, антитела, образованные из фрагментов антител (С. А. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Подразумевается, что антитело, отличное от "мультиспецифического" или "мультифункционального" антитела, имеет идентичные сайты связывания. F(ab')₂ или Fab могут быть спроектированы, чтобы минимизировать или полностью удалить межмолекулярные дисульфидные взаимодействия, которые возникают между доменами C_H1 и C_L.

Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть получено из библиотеки рекомбинантных антител, которая основана на аминокислотных последовательностях, которые были выделены из антител большого количества здоровых добровольцев. Используя технологию n-CoDeR®, полностью человеческие гипервариабельные участки подверглись рекомбинации в новые молекулы антител. Уникальный процесс рекомбинации позволяет библиотеке содержать более широкое разнообразие антител, чем, возможно, было естественно создано иммунной системой человека.

Как применяется в описании настоящего изобретения, различные «формы» антигена, например, С4.4а настоящим определяются как различные молекулы белка, образующиеся из различных трансляционных и посттрансляционных модификаций, таких как, но не ограниченных этим, различия в сплайсинге первичного транскрипта С4.4а, различия в гликозилировании и различия в посттрансляционном протеолитическом расщеплении.

Как применяется в описании настоящего изобретения, термин 'эпитоп' включает любую детерминанту белка, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточными рецепторами. Эпитопные детерминанты обычно состоит из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислотные или углеводные боковые цепи или комбинации вышеперечисленного и обычно имеют специфические трехмерные структурные особенности, так же как специфические особенности распределения заряда. Про два антитела говорят, что они «связываются с одним и тем же эпитопом», если показано, что одно антитело конкурирует со вторым антителом в анализе конкурентного связывания каким-либо способом, известным специалистам в данной области техники.

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и выделено из компонента клетки, которая экспрессировала его. Контаминирующими компонентами клетки являются материалы, которые мешать в диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело очищалось (1) больше чем 95% по массе антитела как определяется, например, по методу Лоури, спектроскопией в УФ и видимой областях спектра или капиллярным SDS гель-электрофорезом (например, на Caliper LabChip GXII, GX 90 или Biorad Bioanalyzer device), и в дополнительно предпочтительных вариантах осуществления больше чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной, чтобы получить по меньшей мере 15 остатков N-концевых или внутренней аминокислотной последовательности, или (3) до гомогенности, определенной с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси-синего или, предпочтительно окрашиванием серебром. Выделенное встречающееся в природе антитело включает антитело в рекомбинантных клетках, так как по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Как правило, однако выделенное антитело будет получаться по меньшей мере одностадийной очисткой.

"Антителозависимая клеточная цитотоксичность" или "АЗКЦ" относится к форме цитотоксичности, в которой секретируемый Ig, связанный с рецептором гамма Fc (FcγRs), присутствующим на специфических цитотоксических клетках (например, NK-клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам связаться специфически с клеткой-мишенью, несущей антиген, и впоследствии убить клетку-мишень, например, цитотоксинами. Чтобы оценить АЗКЦ активность антитела, представляющего интерес, может быть осуществлен in vitro анализ АЗКЦ, такой как описанный в патенте США №5500362 или патенте США 5821337 или патенте США №6737056 (Presta). Полезные эффекторные клетки для такого исследования включают РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови, МКПК) и МК-клетки (естественные киллеры, ЕК).

"Комплементзависимая цитотоксичность" или "КЗЦТ" относятся к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы компонента (Clq) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с антигеном, им распознанным. Для оценки активации компонента используют анализ КЗЦТ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Полипептидные варианты с измененными аминокислотными последовательностями Fc-фрагмента (полипептиды с различными вариантами Fc-фрагмента) и увеличенное или уменьшенное связывание Clq описаны, например, в патенте США No. 6194551 и WO 1999/51642.

Термин иммуноконъюгат (взаимозаменяемо называемый "конъюгат антитело-лекарственное средство" или "ADC") относится к антителу, конъюгированному с одним или более цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, лекарственная субстанция, агент, ингибирующий рост, токсин (например, белковый токсин, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты), или радиоактивный изотоп (то есть, радиоконъюгат). Иммуноконъюгаты использовались для местной доставки цитотоксических веществ, таких как лекарственные средства, которые убивают или ингибируют рост или пролиферацию клеток при лечении рака (например, Liu et al, Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623)). Иммуноконъюгаты позволяют осуществлять направленную доставку лекарственных молекул в опухоль и внутриклеточное накопление там, где системное введение неконъюгированных лекарственных средств может привести к недопустимым уровням токсичности для нормальных клеток и/или тканей. Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин. Токсины могут проявить свои цитотоксические эффекты посредством механизмов, включающие связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.

«Процент (%) идентичности последовательности" относительно ссылочной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, соответственно, определяли как процент остатков нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков, соответственно, в последовательности-кандидате, которые идентичны по остаткам нуклеиновой кислоты или аминокислотным остаткам, соответственно в ссылочной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, соответственно, после выравнивания последовательностей и введение гэпов при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательности. Предпочтительным является выравнивание без гэпов. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые находятся в пределах компетентности специалистов в данной области техники, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такое как BLAST, BLAST 2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых полноразмерных последовательностей.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением

Настоящее изобретение касается способов ингибирования роста С4.4а-положительных раковых клеток и развития неопластического заболевания посредством обеспечения анти-С4.4а антител. Обеспечиваются антитела, антигенсвязывающие фрагменты этих антител и варианты антител и фрагментов, которые специфически связываются с человеческим полипептидом С4.4а (SEQ ID NO:1 или его фрагментом) массой 29 кДа. В предпочтительном варианте осуществления антитела, антигенсвязывающие фрагменты или их варианты связываются специфически с экстрацеллюлярным доменом S1 полипептида С4.4а. В настоящем изобретении полипептид С4.4а называют 'С4.4а'.

В другом варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты интернализуется в клетку, экспрессирующую С4.4а, после связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с вышеупомянутой клеткой. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с С4.4а с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с человеческим С4.4а с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с С4.4а человека и грызунов с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A, дополнительным предпочтительным вариантом осуществления является вариант, в котором С4.4а грызуна представляет собой мышиный С4.4а.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательности CDR тяжелой или легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95% идентичными по меньшей мере одной, предпочтительно соответствующей последовательность CDR, как изображено в таблице 7, или которые содержат вариабельные последовательности тяжелой или легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 60%;, 70%, 80%, 90%, 92% или 95% идентичными последовательностям VH или VL, изображенным в таблице 7, соответственно.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательности CDR тяжелой и/или легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95% идентичными по меньшей мере одной, предпочтительно соответствующей последовательности CDR антител М31-В01 или M20-D02 S-A, соответственно.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательности CDR тяжелой и/или легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95% идентичными, предпочтительно соответствующей последовательности CDR тяжелой и/или легкой цепи антител М31-В01 или M20-D02 S-A, соответственно.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательности CDR2 и -3 тяжелой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95% идентичными последовательностям CDR2 и -3 тяжелой цепи, и последовательности CDR1 и -3 легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60%; 70%, 80%, 90% или 95%, идентичными последовательностям CDR1 и -3 легкой цепи антител М31-В01. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательности CDR2 и -3 тяжелой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95% идентичными последовательностям CDR2 и -3 тяжелой цепи, и последовательности CDR1 и -3 легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95%, идентичными последовательностям CDR1 и -3 легкой цепи антител M20-D02 S-A.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% или 95% идентичной последовательности VH, раскрытой в таблице 7 или таблице 4, предпочтительно антител М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную последовательность легкой цепи, которая является по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% или 95% идентичной последовательности VL, раскрытой в таблице 7 или таблицах 3, предпочтительно антител М31-В01 или M20-D02 S-A.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепи, которые являются по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% или 95% идентичными последовательностям VH и VL антител М31-В01 или M20-D02 S-A, соответственно.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательности CDR тяжелой и легкой цепи, которые соответствуют производным М31-В01 или M20-D02 S-A, предпочтительно соответствующим консенсусным последовательностям CDR как изображено в таблице 15. Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления являются антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие последовательности CDR тяжелой цепи, совпадающие с соответствующими последовательностями CDR тяжелой цепи, как представлено консенсусными последовательностями SEQ ID NO:297 (CDR H1), SEQ ID NO:298 (CDR H2) и SEQ ID NO:299 (CDR Н3), и последовательности CDR легкой цепи, совпадающие с соответствующими последовательностям CDR легкой цепи, как представлено консенсусными последовательностями SEQ ID NO:300 (CDR L1), SEQ ID NO:22 (CDR L2) и SEQ ID NO:301 (CDR L3), или содержащие последовательности CDR тяжелой цепи, совпадающие с соответствующими последовательностями CDR тяжелой цепи, как представлено консенсусными последовательностями SEQ ID NO:302 (CDR H1), SEQ ID NO:303 (CDR H2) и SEQ ID NO:304 (CDR Н3), и последовательностям CDR легкой цепи, совпадающие с соответствующими последовательностям CDR легкой цепи, как представлено консенсусными последовательностями SEQ ID NO:305 (CDR L1), SEQ ID NO:306 (CDR L2) и SEQ ID NO:307 (CDR L3).

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат по меньшей мере одну, предпочтительно соответствующую последовательность CDR тяжелой и/или легкой цепи, как раскрыто в таблице 7 или таблицах 3 и 4, или предпочтительно антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть, предпочтительно соответствующих последовательностям CDR тяжелой и легкой цепи, как раскрыто в таблице 7 или таблицах 3 и 4, или предпочтительно антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат последовательности CDR1, CDR2 или CDR3 тяжелой или легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1 и CDR2 тяжелой или легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелой или легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелой или легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой или легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 и CDR2 и последовательности CDR легкой цепи CDR1, CDR2, CDR3 антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат последовательности CDR1, CDR2 или CDR3 тяжелой и легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1 и CDR2 тяжелой и легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелой и легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR2 и CDR3 тяжелой и легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4, последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат последовательности CDR тяжелой и легкой цепи антитела, как изображено в таблице 7 или таблицах 3 и 4.

В дополнительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат последовательности VH и/или VL, раскрытые в таблице 7 или таблицах 3 и 4. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат последовательности VH и VL антитела, изображенные в таблице 7 или таблицах 3 и 4.

В предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела изобретения являются моноклональными.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антитела изобретения являются человеческими, гуманизированными или химерными.

Варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов антитела, рассмотренных в изобретении, являются молекулами, в которых сохраняется антигенсвязывающая активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела для С4.4а. В предпочтительном варианте осуществления варианты конкурируют за связывание с С4.4а с антителом, изображенным в таблице 7, предпочтительно с антителом М31-В01 или M20-D02 S-A.

В этом документе делается ссылка на следующие предпочтительные антитела в соответствии с настоящим изобретением: "М31-В01", "M20-D02 S-А", "M60-G03" и "М36-Н02", "В01-3", "В01-5", "В01-7", "B01-10", "B01-12", "D02-4", "D02-6", "D02-7", "D02-II" и "D02-13".

М31-В01 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:41 (ДНК)/SEQ ID NO:33 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:37 (ДНК)/SEQ ID NO:29 (белок).

M20-D02 S-A представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:42 (ДНК)/SEQ ID NO:34 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:38 (ДНК)/SEQ ID NO:30 (белок).

M60-DG03 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:43 (ДНК)/SEQ ID NO:35 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:39 (ДНК)/SEQ ID NO:31 (белок).

М36-Н02 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:44 (ДНК)/SEQ ID NO:36 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:40 (ДНК)/SEQ ID NO:32 (белок).

В01-3 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:53 (ДНК)/SEQ ID NO:51 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:54 (ДНК)/SEQ ID NO:52 (белок).

B01-5 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:63 (ДНК)/SEQ ID NO:61 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:64 (ДНК)/SEQ ID NO:62 (белок).

B01-7 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:73 (ДНК)/SEQ ID NO:71 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:74 (ДНК)/SEQ ID NO:72 (белок).

B01-10 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:83 (ДНК)/SEQ ID NO:81 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:84 (ДНК)/SEQ ID NO:82 (белок).

B01-12 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:93 (ДНК)/SEQ ID NO:91 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:94 (ДНК)/SEQ ID NO:92 (белок).

D02-4 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:103 (ДНК)/SEQ ID NO:101 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:104 (ДНК)/SEQ ID NO:102 (белок).

D02-6 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:113 (ДНК)/SEQ ID NO:111 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:114 (ДНК)/SEQ ID NO:112 (белок).

D02-7 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:123 (ДНК)/SEQ ID NO:121 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:124 (ДНК)/SEQ ID NO:122 (белок).

D02-11 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:133 (ДНК)/SEQ ID NO:131 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:134 (ДНК)/SEQ ID NO:132 (белок).

D02-13 представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO:143 (ДНК)/SEQ ID NO:141 (белок), и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO:144 (ДНК)/SEQ ID NO:142 (белок).

В другом аспекте изобретение обеспечивает антитела или антигенсвязывающие фрагменты, имеющие антигенсвязывающую область, которая связывается специфически с, и/или имеют высокую аффинность к одной или более областям С4.4а, аминокислотная последовательность которой изображена посредством SEQ ID NO:1. Принято считать, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеют "высокую аффинность" к антигену, если измеренная аффинность составляет меньше чем 250 нМ (моновалентная аффинность антитела или антигенсвязывающего фрагмента). Антитело в соответствии с настоящим изобретением или антигенсвязывающая область предпочтительно могут связываться с человеческим С4.4а с аффинностью меньше чем 250 нМ, предпочтительно меньше чем 100 нМ, более предпочтительно меньше чем 25 нМ и еще более предпочтительно меньше чем с 11 нМ, определенными как моновалентная аффинность к человеческому С4.4а. Например, аффинность антитела в соответствии с настоящим изобретением против С4.4а может составить приблизительно 220,0 нМ или 1 нМ (моновалентная аффинность антитела или антигенсвязывающего фрагмента).

Таблица 1 обеспечивает перечень констант диссоциации типичных антител в соответствии с настоящим изобретением, как определено с помощью поверхностного плазменного резонанса (BiaCore) на иммобилизованном человеческом или мышином С4.4а.

Таблица 1
Моновалентные константы диссоциации, определенные для анти-С4.4а IgG1 с помощью поверхностного плазменного резонанса
	Человеческий С4.4а	Мышиный С4.4а
Антитело (IgG1)	KD [М]	KD [М]
М31-В01	7,0×10-8	1,3×10-7
M20-D02 S-A	2,2×10-7	1,8×10-7
В01-3	6,0×10-8	1,2×10-7
В01-5	4×10-9	1×10-8
В01-7	7×10-9	9×10-9
В01-10	4×10-9	1×10-9
В01-12	1×10-9	2×10-9
D02-4	2,9×10-8	5,6×10-8
D02-6	6×10-9	2,1×10-8
D02-7	9×10-9	2,2×10-8
D02-11	1×10-8	2,4×10-8
D02-13	2×10-9	4,2×10-8

Формат IgGI использовался для определения аффинности на основе клеток с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS), объединенного с анализом Скэтчарда. Фиг.3f) показывает прочность связывания типичных антител IgG с трансфецированными опухолевыми клетками А549, экспрессирующими С4.4а, и опухолевыми клетками, эндогенно экспрессирующими С4.4а. Таблица 8 обеспечивает перечень силы связывания (EC₅₀) типичных антител IgG с трансфецированными мышиными клетками CHO-S:mC4.4a и опухолевыми клетками NCI H292, эндогенно экспрессирующими С4.4а.

Таблица 8
Значения EC50, определенные для анти-С4.4а IgG1 с помощью FACS
	Мышиный С4.4а:СНО	NCI H292
Антитело (IgG1)	EC50 [М]	EC50 [M]
М31-В01	1,9×10-9	3×10-10
M20-D02 S-A	1,6×10-9	1,3×10-9
В01-3	3,6×10-10	6×10-11
В01-5	1,2×10-9	5×10-11
В01-7	5,7×10-10	6×10-11
В01-10	4,3×10-10	1×10-10
В01-12	1,4×10-9	Nd
D02-6	1×10-9	2×10-11
D02-7	7,8×10-10	3×10-11
D02-11	1,7×10-9	1×10-11
D02-13	2×10-9	1,2×10-10
nd = не определено

Принято считать, что IgGI имеет "высокую аффинность" к антигену, если значение аффинности, полученное с помощью FACS, составляет меньше чем 100 нМ (кажущаяся аффинность IgG). Бивалентное антитело в соответствии с настоящим изобретением или антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно могут связываться с человеческим С4.4а с аффинностью меньше чем 100 нМ, более предпочтительно меньше чем 50 нМ и еще более предпочтительно меньше чем 10 нМ. Дополнительно предпочтительными являются бивалентные антитела, которые связываются с С4.4а с аффинностью меньше чем 5 нМ, и более предпочтительно меньше чем 1 нМ, определенной как кажущаяся аффинность IgG к человеческому С4.4а. Например, кажущаяся аффинность антитела в соответствии с настоящим изобретением против С4.4а может составить около 4,3 нМ или 0,03 нМ на различных опухолевых клеточных линиях, как определено с помощью анализа FACS, как изображено в Фиг.3f.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением интернализируются "эффективно", если его времени полумаксимальной интернализации (t ½) в опухолевых клетках, экспрессирующих С4.4а, короче чем 180 минут или более предпочтительно короче чем 120 минут и еще более предпочтительно короче чем 90 минут. Дополнительно предпочтительными являются антитела или антигенсвязывающие фрагменты со временем полумаксимальной интернализации (t ½) 60 минут или меньше, как определено протоколом, описанным в примере 6, дополнительно предпочтительным является меньше чем 50 минут или меньше чем 35 минут. Таблица 9 обеспечивает перечень времен интернализации типичных антител в соответствии с настоящим изобретением, как определено протоколом, описанным в примере 6. Интернализуемые антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением удобны в качестве нацеливающего фрагмента конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Антитело или антигенсвязывающий фрагмент подходят в методах in vitro или in vivo для доставки соединений, предпочтительно цитотоксического агента в клетку, экспрессирующую С4.4а.

Таблица 9
	интернализация
Антитело (IgG1)	t ½ [мин]
М31-В01	49
M20-D02 S-A	60
В01-3	55
В01-7	33
В01-10	30
D02-6	39
D02-7	33
D02-11	22

В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или их производные или нуклеиновая кислота, кодирующая указанные белки, выделяют. Выделенный биологический компонент (такие как молекула нуклеиновой кислоты или белок, такое как антитело) является компонентом, который был по существу отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в котором компонент естественно существует, например, другая хромосомная и внехромосомная ДНК и РНК, белки и органеллы. Нуклеиновые кислоты и белки, которые были "выделены", включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных методов очистки Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) и Robert K. Scopes at al 1994 Protein Purification, - Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине так же как химически синтезируемые нуклеиновые кислоты.

Генерация антител

Библиотека фагового дисплея полностью человеческих антител n-CoDeR использовали для выделения высоко аффинных специфических к С4.4а человеческих моноклональных антител с помощью комбинации пэннинга с использованием целых клеток и белка и посредством разработки специфических инструментов. Эти инструменты и способы включают рекомбинантную клеточной линию, экспрессирующую человеческий С4.4а, клеточную линию, экспрессирующую мышиный С4.4а, рекомбинантный человеческий и мышиный С4.4а и развитие процедур пэннинга и скрининговых анализов, способных идентифицировать антитела, которые предпочтительно связываются с С4.4а, экспонируемым на клеточной поверхности, и которые являются кросс-реактивными к мышиному С4.4а.

Антитела к опухолевому маркеру С4.4а клеточной поверхности были разработаны с помощью комбинации трех нетрадиционных подходов в технологии фагового дисплея (PDT). Во-первых, рекомбинантные клеточные линии, экспрессирующие мембрано-связанную форму человеческого и мышиного С4.4а, были сконструированы с помощью стабильной трансфекции клеток СНО-S и опухолевых клеток А549 с плазмидой, кодирующей полноразмерную ГФИ-заякоренную форму человеческого или мышиного белка (SEQ ID NO:3) и (SEQ ID NO:4) соответственно, чтобы получить человеческие CHO-S:hC4.4a, мышиные CHO-S:mC4.4a и человеческие A549:hC4.4a клеточные линии соответственно. Во-вторых, селекции клеточной поверхности были выполнены с последними рекомбинантными клеточными линиями и клеточной линией рака молочной железы MCF-7. Предварительная адсорбция клеток CHO-S или нетрансфецированных клеток А549 была включена, чтобы избежать селекции Fab фрагментов, связывающихся с эпитопами родительских клеток. Дополнительные раунды селекции были осуществлены с рекомбинантным, растворимым, очищенным человеческим С4.4а, с рекомбинантным, растворимым, очищенным мышиным С4.4а. В-третьих, были разработаны скрининговые методы, которые предопределили успешный скрининг фаговой продукции, полученной при пэннинге на целых клетках A549:hC4.4a так же как на клетках CHO-S:hC4.4a. Комбинация этих специфических методов позволила выделить уникальные антитела "М31-В01", "M20-D02 S-A", "M60-G03", и, "М36-Н02".

Эти уникальные антитела дополнительно характеризовались посредством их связывающей аффинности в ELISA, с помощью BiaCore связывания с растворимым С4.4а, посредством их способности узнавать различные эпитопы на растворимом С4.4а и их способностью перекрестно реагировать с мышиным С4.4а, оцененными с помощью BiaCore и FACS, и их способностью интернализироваться в клетку в основанном на клетках анализе. Интернализацию оценивали количественно, измеряя интернализацию флуоресцентно меченных анти-С4.4а антител с разрешением во времени.

Варианты пептидов

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением не ограничены специфичными пептидными последовательностями, обеспечиваемыми в настоящем изобретении. Скорее, изобретение заключает в себе также варианты этих полипептидов. В отношении настоящего раскрытия и традиционно доступных технологий и ссылок, специалист в данной области техники будет в состоянии получить, проверить и использовать функциональные варианты антител, раскрытых в настоящем изобретении, одновременно принимая во внимание, что варианты, имеющие способность связываться с С4.4а, находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Вариант может включать, например, антитело, которое имеет по меньшей мере один измененный участок, определяющий комплементарность (CDR) (гипервариабельный) и/или каркасный (FR) (вариабельный) домен/положение по сравнению с пептидной последовательностью, раскрытой в настоящем изобретении. Чтобы лучше иллюстрировать эту концепцию, далее следует краткое описание структуры антитела.

Антитело составлено из двух пептидных цепей, каждая содержит один (легкая цепь) или три (тяжелая цепь) константных доменов и вариабельную область (VL, VH), последняя из которых состоит в каждом случае из четырех областей FR и трех находящихся между ними CDR. Антигенсвязывающий участок образуется одним или более CDR, к тому же FR участки служат структурной основой для CDR и, следовательно, играют важную роль в связывании антигена. Изменяя один или более аминокислотных остатков в участках CDR или FR, специалист в данной области техники обычно может генерировать мутантные или диверсифицированные последовательности антитела, которые могут быть скринированы против антигена, для поиска, например, новых или улучшенных свойств.

Таблицы 3 (VL) и 4 (VH) очерчивают участки CDR и FR для некоторых антител в соответствии с настоящим изобретением и сравнивают аминокислоты в данном положении друг к другу и с соответствующими консенсусными последовательностям.

Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в которых последовательности CDR выбираются, как показано в таблице 7.

Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления изобретения является антитело или антигенсвязывающий фрагмент, в которых последовательности VH и VL выбираются, как показано в таблице 7. Специалист в данной области техники может использовать данные в Таблицах 3, 4 и 7, чтобы конструировать варианты пептида, которые находятся в пределах объема настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы варианты конструировались посредством замены аминокислот в одном или более участках CDR; вариант мог бы также иметь один или более измененный структурный участок. Изменения также могут быть сделаны в структурных участках. Например, мог бы быть изменен участок FR пептида, в котором существует отклонение в остатке по сравнению с последовательностью зародышевой линии.

Что касается сравнения новых антител с соответствующими консенсусными последовательностями, которые перечислены в Таблицах 3 и 4, кандидатные остатки, которые могут быть изменены, включают, например, остаток 42 из вариабельной тяжелой цепи M20-D02 S-A по сравнению с VHIII Гена DP47. Альтернативно, специалист в данной области техники мог сделать такой же анализ, сравнивая аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем изобретении, с известными последовательностями того же класса таких антител с использованием, например, процедуры, описанной в Knappik A., et al, JMB 2000, 296:57-86.

Кроме того, варианты могут быть получены с использованием одного антитела в качестве отправной точки для оптимизации с помощью диверсификации одного или более аминокислотных остатков в антителе, предпочтительно аминокислотных остатков в одном или более CDR, и с помощью скрининга получающейся коллекции вариантов антител для вариантов с улучшенными свойствами. Особенно предпочтительным является диверсификация одного или более аминокислотных остатков в CDR3 VL и/или VH. Диверсификация может быть осуществлена с помощью синтеза коллекции молекул ДНК, с использованием технологии тринуклеотидного мутагенеза (TRIM) Virnekas В. et al., Nucl. Acids Res. 1994, 22:5600.). Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты включают молекулы с модификациями/вариациями, включая, но не ограничиваясь этим, например, модификации, приводящие к измененному периоду полураспада (например, модификацией Fc-участка или присоединением дополнительных молекул, таких как ПЭГ) или измененным активностям АЗКЦ или КЗЦТ.

Консервативные аминокислотные варианты

Полипептидные варианты могут быть сделаны так, чтобы сохранить общую молекулярную структуру пептидной последовательности антитела, описанной в настоящем изобретении. Учитывая свойства отдельных аминокислот, некоторые рациональные замены специалистом в данной области техники будут признаны полезными. Аминокислотные замены, а именно "консервативные замены", могут быть сделаны, например, на основе подобия полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе вовлекаемых остатков.

Например, (а) неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; (b) полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (с) положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и (d) отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Замены, как правило, могут делаться внутри групп (а) - (d). Кроме того, глицин и пролин могут быть заменять друг друга на основе их способности разрушить α-спирали. Похожим образом некоторые аминокислоты, такие как аланин, цистеин, лейцин, метионин, глутаминовая кислота, глутамин, гистидин и лизин более часто находятся в α-спирали, в то время как валин, изолейцин, фенилаланин, тирозин, триптофан и треонин чаще находятся в β-складчатых структурах. Глицин, серин, аспарагиновая кислота, аспарагин и пролин обычно находятся в петлях. Некоторые предпочтительные замены могут быть сделаны среди следующих групп: (i) S и Т; (ii) Р и G; и (iii) А, V, L и I. С учетом известного генетического кода и рекомбинантных и синтетических методик ДНК специалист в данной области техники с легкостью может сконструировать ДНК, кодирующую консервативные аминокислотные варианты. В одном частном примере, аминокислота в положении 3 в SEQ ID NO:33-36 может быть заменена с Q на Е.

Как применяется в описании настоящего изобретения "идентичность последовательности" между двумя полипептидными последовательностями, указывает на процент аминокислот, которые идентичны между последовательностями. "Гомология последовательности" указывает на процент аминокислот, которые либо идентичны, либо которые представляет консервативные аминокислотные замены.

Молекулы ДНК в соответствии с настоящим изобретением

Настоящее изобретение также относится к молекулам ДНК, которые кодируют антитело соответствии с настоящим изобретением или его антиген-связывающего фрагмента. Эти последовательности включают, но не ограничены этим, такие молекулы ДНК, предложенные в SEQ ID 37-44, 53, 54, 63, 64, 73, 74, 83, 84, 93, 94, 103, 104, 113, 114, 123, 124, 133, 134, 143, 144 и 308-345.

Молекулы ДНК в соответствии с настоящим изобретением не ограничены последовательностями, раскрытыми в настоящем изобретении, но также и включают их варианты. Варианты ДНК в пределах изобретения могут быть описаны в отношении их физических свойств при гибридизации. Специалист в данной области техники понимает, что ДНК может использоваться для идентификации ее комплементарной цепи и, так как ДНК является двухцепочечной, ее эквивалента или гомолога, используя методики гибридизации нуклеиновой кислоты. Также понятно, что гибридизация может произойти при меньше чем 100%-ая комплементарность. Однако, учитывая соответствующий выбор условий, могут использоваться методики гибридизации для дифференциации среди последовательностей ДНК на основе их структурным родством с конкретным зондом. Для руководства относительно таких условий см. Sambrook et al., 1989 выше и Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

Структурное сходство между двумя полинуклеотидными последовательностями может быть выражено как функция "жесткости" условий, при которых эти две последовательности гибридизуются друг с другом. Как применяется в описании настоящего изобретения, термин "жесткость" относится к степени, с которой условия ограничивают гибридизацию. Жесткие условия сильно ограничивают гибридизацию, и только наиболее структурно родственные молекулы гибридизуются друг с другом в таких условиях. С другой стороны нежесткие условия способствуют гибридизации молекул, демонстрирующих меньшую степень структурной родственности. Жесткость гибридизации, поэтому, прямо коррелирует со структурными взаимосвязями двух последовательностей нуклеиновой кислоты. Следующие отношения полезны в корреляции гибридизации и родственности (где T_m является температурой плавления дуплекса нуклеиновой кислоты):

a. T_m=69,3+0,41(G+C)%

b. T_m дуплекса ДНК уменьшается на 1°C с увеличением на каждый 1% числа оснований, спаренных вопреки принципу комплементарности.

с. (T_m)_µ2-(TM)_µ1= 18,5 log₁₀µ2/µ1,

где µ1 и µ2 - ионная сила двух растворов.

Жесткость гибридизации является функцией многих факторов, включая общую концентрацию ДНК, ионную силу, температуру, размер зонда и присутствие агентов, которые разрушают водородную связь. Факторы, стимулирующие гибридизацию, включают высокие концентрации ДНК, высокую ионную силу, низкие температуры, более длинные зонды и отсутствие агентов, которые разрушают водородные связи. Гибридизация, как правило, выполняется в две фазы: фаза "связывание" и фаза "отмывание".

Во-первых, в фазе связывания, зонд связывается с мишенью при условиях, способствующих гибридизации. Жесткость (строгость) обычно контролируется на этой стадии посредством изменения температуры. Для высокой жесткости температуру обычно держат между 65°С и 70°С, если не используют короткий (<20 нуклеотидов) олигонуклеотидный зонд. Типичный раствор для гибридизации содержит 6Х SSC, 0,5% SDS, 5X раствор Денхардта и 100 мкг неспецифичной ДНК-носитель. См. Ausubel et al, section 2.9, supplement 27 (1994). Безусловно, известны много отличающихся, и все же функционально эквивалентных буферных растворов. При более низкой степени сродства может быть выбрана более низкая температура. Температуры связывания низкой жесткости находятся между около 25°С и 40°С. Средняя жесткость находится между по меньшей мере около 40°С до меньше чем около 65°С. Высокая жесткость находится по меньшей мере около 65°С.

Во-вторых, избыток зонда удаляется отмыванием. Именно в этой фазе обычно применяются более жесткие условия. Следовательно, именно эта стадия "отмывания" является самой важной в определении родственности посредством гибридизации. Растворы для промывания, как правило, содержат более низкие концентрации солей. В качестве одного примера жесткой среды: раствор содержит 2Х SSC и 0,1% SDS. Раствор для отмывания высокой жесткости содержит эквивалент (в ионной силе) менее чем около 0,2Х SSC с предпочтительным жестким раствором, содержащим около 0,1Х SSC. Температуры, связанные с различными жесткостями, совпадают с обсужденными выше для "связывания". Раствор для промывания также, как правило, заменяется неоднократно во время промывания. Например, типичные условия промывания высокой жесткости включают промывание дважды в течение 30 минут при 55°С и три раза в течение 15 минут при 60°С.

Вариантом осуществления изобретения является выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует (i) антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, последовательности CDR, как это изображено в таблице 7, или (ii) вариабельные последовательности легких и тяжелых цепей, как изображено в таблице 7, или (iii), которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, последовательности CDR как изображено в таблице 7 или вариабельные последовательности легких и тяжелых цепей как изображено в таблице 7.

В одном частном примере варианта в соответствии с настоящим изобретением, положение 7 нуклеиновой кислоты в SEQ ID NO:37-40, или положение 16 в SEQ ID NO:41-44 может быть заменено с C на G, таким образом изменяя кодон с САС на GAG.

Функционально эквивалентные варианты

Еще один класс вариантов ДНК в объеме настоящего изобретения может быть описан в отношении продукта, который они кодируют. Эти функционально эквивалентные полинуклеотиды характеризуются тем фактом, что они кодируют те же самые последовательности пептида, найденные в SEQ ID NO:5-36, 45-50, 55-60, 65-70, 75-80, 85-90, 95-100, 105-110, 115-120, 125-130, 135-140, из-за вырожденности генетического кода.

Попятно, что варианты молекул ДНК, обеспеченные в настоящем изобретении, могут быть сконструированы несколькими различными способами. Например, они могут быть сконструированы как полностью синтетические ДНК. Методы эффективного синтеза олигонуклеотидов в диапазоне от 20 до около 150 нуклеотидов легко доступны. См. Ausubel et al, section 2.11, Supplement 21 (1993). Перекрывающиеся олигонуклеотиды могут быть синтезированы и собраны способом, о котором впервые сообщил Khorana et al, J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); см. также Ausubel et al., выше, Section 8.2. Синтетические ДНК предпочтительно конструируются с удобными сайтами рестрикции, спроектированными на 5' и 3' концах гена, для облегчения клонирования в соответствующий вектор.

Как было показано, метод генерирования вариантов должен начинаться с одной из ДНК, раскрытых в настоящем изобретении, и затем проводиться сайт-направленный мутагенез. См. Ausubel et al., выше, chapter 8, Supplement 37 (1997). В типичном методе целевая ДНК клонируется в одноцепочечную ДНК бактериофага в качестве носителя. Одноцепочечная ДНК изолируется и гибридизуется с олигонуклеотидом, содержащим желаемую нуклеотидную замену(ы). Комплементарная цепь синтезируется, и двухцепочечный фаг вводится в хозяина. Часть получающегося потомства будет содержать ожидаемый мутант, что может быть подтверждено с использованием секвенирования ДНК. Кроме того, доступны различные способы, которые увеличивают вероятность, что потомства фагов будет ожидаемый мутантом. Эти способы известны специалистам в данной области техники, и наборы коммерчески доступны для получения таких мутантов.

Рекомбинантные конструкции ДНК и экспрессия

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает рекомбинантные конструкции ДНК, содержащие одну или более нуклеотидных последовательностей в соответствии с настоящим изобретением. Рекомбинантные конструкции в соответствии с настоящим изобретением используются в соединении с вектором, таким как плазмида, фагмида, фаг или вирусный вектор, в который вставлена молекула ДНК, кодирующая антитело в соответствии с настоящим изобретением или антигенсвязывающий фрагмент.

Антитело, антигенсвязывающая часть или их производное, обеспеченные в настоящем изобретении, могут быть получены рекомбинантной экспрессией последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих легкие и тяжелые цепи или их части в клетке-хозяине. Для экспрессии антитела, антигенсвязывающей части или их производного рекомбинантно клетка-хозяин может быть трансфецирована одним или более рекомбинантными экспрессионным векторами, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи или их части таким образом, что легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК используются для приготовления и/или получения нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые и легкие цепи, для инкорпорации этих нуклеиновых кислот в рекомбинантные экспрессионные вектора и для введения векторов в клетки-хозяев так, как описано в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и в патенте США No. 4816397 by Boss et al.

Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные домены тяжелых и/или легких цепей, могут быть превращены, например, в полинуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные цепи антитела, Fab фрагменты или scFv. Фрагмент ДНК, кодирующий VL- или VH может быть функционально связан, (таким образом, что аминокислотные последовательности, закодированные двумя фрагментами ДНК, оказались в одной рамке считывания) к другому фрагменту ДНК, кодирующему, например, константный домен антитела или гибкий линкер. Последовательности человеческих константных доменов тяжелой цепи и легкой цепи известны специалистам в данной области техники (см., например, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены стандартной амплификацией с помощью ПЦР.

Чтобы создать полинуклеотидную последовательность, которая кодирует scFv, нуклеиновые кислоты, кодирующие VH и VL, могут быть функционально связаны с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, таким образом, чтобы последовательности VH и VL могли бы быть экспрессированы как белок с непрерывной единственной цепью с областями VL и VH, соединенными гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554).

Для экспрессии антител, антигенсвязывающих частей или их производных могут использоваться стандартные методы экспрессии рекомбинантных ДНК (см., например, Goeddel; Gene Экспрессия Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Например, ДНК, кодирующая требуемый полипептид, может быть вставлена в экспрессионный вектор, который затем трансфецируется в подходящую клетку-хозяина. Подходящими клетками-хозяевами являются прокариотические и эукариотические клетки. Примерами для прокариотических клеток-хозяев, являются, например, бактерии, примерами для эукариотических клеток-хозяев являются дрожжевые, клетки насекомых или млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления ДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи, вставляются в отдельные векторы. В других вариантах осуществления ДНК, кодирующие тяжелые и легкой цепи, вставляются в один и тот же вектор. Подразумевается, что конструкция экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей определяется такими факторами, как выбор клетки-хозяина, уровень экспрессии требуемого белка и будет ли экспрессия конститутивной или индуцибельной.

Бактериальная экспрессия

Полезные экспрессионные векторы для использования в бактериях конструируются путем инсерции структурной последовательности ДНК, кодирующей требуемый белок, вместе с подходящими сигналами инициирования трансляции и терминации в функционирующую рамку считывания с функциональным промотором. Вектор должен содержать один или более фенотипически селектируемые маркеры и сайт инициации репликации, чтобы гарантировать поддержания вектора и, если требуется, обеспечить амплификацию в клетке-хозяине. Подходящие прокариотические хозяева для трансформации включают Е.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды в родах Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus.

Бактериальные векторы могут базироваться, например, на бактериофагах плазмидах или фагмидах. Эти векторы могут содержать селектируемый маркер и бактериальный сайт инициации репликации, полученный из коммерчески доступных плазмид, как правило, содержащих элементы известного вектора для клонирования pBR322 (ATCC 37017). После трансформации подходящего штамма хозяина и роста штамма-хозяина до соответствующей плотности клеток селектируемый промотор дерепрессируется/индуцируется подходящим способом (например, изменением температуры или химической индукцией), и клетки культивируются в течение дополнительного периода. Клетки, как правило, отделяются центрифугированием, разрушаются физическими или химическими средствами и получающийся первичный экстракт сохраняется для дополнительной очистки.

В бактериальных системах целый ряд экспрессионных векторов могут быть преимущественно выбраны в зависимости от предполагаемого применения предназначенного для экспрессии белка. Например, если должно быть произведено большое количество такого белка для генерации антител или для скрининга библиотеки пептидов, например, могут быть желательными векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней продуктов в виде гибридных белков, которые являются легко очищаемыми. Антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающий фрагмент включают очищенные природные продукты, продукты химических синтетических процессов и продукты, полученные с помощью рекомбинантных методик из прокариотического хозяина, включая, например, Е.coli, Bacillusa subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды в пределах родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus, предпочтительно из клеток Е.coli.

Экспрессия в млекопитающих и очистка

Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые определяют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такого как CMV промотор/энхансер), обезьяньего вируса 40 (SV40) (такой как SV40 промотор/энхансер), аденовируса, (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и вируса полиомы. Для дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, U.S. 5168062 by Stinski, U.S. 4510245 by Bell et al. и U.S. 4968615 by Schaffner et al. Рекомбинантные экспрессионные векторы могут также включать сайт инициации репликации и селектируемые маркеры (см., например, U.S. 4399216, 4634665 и U.S. 5179017 by Axel et al.). Подходящие селектируемые маркеры включают гены, которые определяют устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат в клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Например, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), определяет устойчивость к метотрексату, и ген neo, определяет устойчивость к G418.

Трансфекция экспрессионного вектора в клетку-хозяина может быть выполнена с использованием стандартных методик, таких как электропорация, преципитация фосфатом кальция, и DEAE-декстраном, липофекция или трансфекция, опосредуемая поликатионами.

Подходящие клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии антител, антигенсвязывающей части или их производных, обеспечиваемые в настоящем изобретении, включают яичник китайского хомячка (клетки СНО) (включая dhfr-CHO клетки, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор разработан таким образом, что экспрессируемый белок секретируется в культурную среду, в которой выращивались клетки-хозяева. Транзиентная трансфекция/экспрессия антител может, например, быть достигнута в результате следования протоколам Durocher et al (2002) Nucl. Acids Res. Vol 30 e9. Стабильная трансфекция/экспрессия антител может, например, быть достигнута в результате следования протоколам системы UCOE (Т. Benton et al. (2002) Cytotechnology 38:43-46).

Антитела, антигенсвязывающие части или их производные могут быть выделены из культурной среды с использованием стандартных методов очистки белка.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающий фрагмент могут быть выделены и очищены из рекомбинантных клеточных культур известными методами включающими, но не ограниченные этим: осаждением сульфатом аммония или этанолом, экстракцией кислотой, хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием белка G, анионная или катионная ионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография, хроматография на гидроксиапатите и хроматография с использованием белка лектинов. Высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ") может также использоваться для очистки. См., например, Colligan, Current Protocols in Immunology или Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), например, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10, каждый из которых полностью включен в настоящее изобретение посредством ссылки.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающий фрагмент включают естественно очищенные продукты (очищенные природные продукты), продукты химических синтетических процессов и продукты, произведенные рекомбинантными методиками из эукариотического хозяина, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих, предпочтительно из клеток млекопитающих. В зависимости от хозяина, использованного в рекомбинантном технологическом процессе, антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент может быть гликозилированным или может быть негликозилированным, причем гликозилированный предпочтительный. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, выше, Sections 17.37-17,42; Ausubel, выше, Sections 10, 12, 13, 16, 18 и 20.

Терапевтические способы

Терапевтические способы включают в себя введение нуждающемуся в лечении субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, рассмотренных в настоящем изобретении. "Терапевтически эффективное" количество настоящим определяется как количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которое является достаточным количеством, чтобы исчерпать С4.4а-позитивные-клетки в обрабатываемой области субъекта - либо в виде единственной дозы, либо в соответствии с режимом многократной дозы, отдельно или в сочетании с другими агентами, которые приводят к облегчению неблагоприятного состояния, и таким количеством, которое еще токсикологически переносимо. Субъектом может быть человеком или другим животным (например, кроликом, крысой, мышью, собакой, обезьяной или другим более низкоуровневым приматом).

Антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент может быть введено совместно с известными медикаментами, и в некоторых случаях антитело могло быть само модифицировано. Например, антитело может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом или радиоизотопом для возможного дополнительного увеличения эффективности.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены как единственный фармацевтический агент или в сочетании с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, если комбинация не вызывает неприемлемых побочных эффектов. Эта комбинированная терапия включает введение единственной дозы лекарственной формы, которые содержит антитело в соответствии с настоящим изобретением и один или более дополнительные терапевтические агенты, так же как введение антитела в соответствии с настоящим изобретением и каждого дополнительного терапевтического агента в его собственной отдельной лекарственной форме. Например, антитело в соответствии с настоящим изобретением и терапевтический агент могут быть введены пациенту совместно в виде единственном пероральной лекарственной формы, такой как таблетка или капсула, или каждое вещество можно введено в отдельных лекарственных формах.

Если используются отдельные лекарственные формы, антитело в соответствии с настоящим изобретением и один или более дополнительных терапевтических агентов могут быть введены по существу в одно и то же время (например, одновременно) или ступенчато в отдельные моменты времени (например, последовательно).

В частности антитела настоящего изобретения могут использоваться в виде комбинированного препарата или по отдельности в комбинации с другими противоопухолевыми агентами, такими как алкилирующие агенты, антиметаболиты, выделенные из растений противоопухолевые агенты, агенты гормональной терапии, ингибиторы топоизомеразы, производные камптотецина, ингибиторы киназы, таргетные лекарства, антитела, интерфероны и/или модификаторы биологического ответа, анти-ангиогенные соединения и другие противоопухолевые лекарства. В этом отношении имеется следующий неограничивающий список примеров вторых агентов, которые могут использоваться в сочетании с антителами в соответствии с настоящим изобретением:

Алкилирующие агенты включают, но не ограничены этим: N-оксид азотистого иприта, циклофосфамид, ифосфамид, тиотепа, ранимустин, нимустин, темозоломид, алтретамин, апазиквон, бросталлицин, бендамустин, кармустин, эстрамустин, фотемустин, глуфосфамид, мафосфамид, бендамустин и митолактол; скоординированные платиной алкилирующие агенты включают, но не ограничены этим, цисплатин, карбоплатин, эптаплатин, лобаплатин, недаплатин, оксалиплатин и сатртаплатин;

Антиметаболиты включают, но не ограничены этим, метотрексат, 6-меркаптопурин рибозид, меркаптопурин, 5-фторурацил сам по себе или в комбинации с лейковорином, тегафур, доксифлуридин, кармофур, цитарабин, цитарабин окфосфат, еноцитабин, гемцитабин, флударабин, 5-азацитидин, капецитабин, кладрибин, клофарибин, децитабин, эфлорнитин, этинилцитидин, цитозин арабинозид, гидроксимочевина, мелфалан, неларабин, нолатрексед, окфосфит, преметрексед двунатриевый, пентостаин, пелитрексол, ралтитрексид, триапин, триметрексат, видарабин, винкристин и винорелбин;

Агенты гормональной терапии включают, но не ограничены этим: эксеместан, лупрон, анастрозол, доксеркальциферол, фадрозол, форместан, ингибиторы 11β-гидроксистероид-дегидрогеназы 1 типа, ингибиторы 17α-гидроксилазы/17,20-лиазы, такие как абиратерона ацетат, ингибиторы 5-α-редуктазы, такие как финастерид и эпристерид, антиэстрогены, такие как тамоксифена цитрат и фулвестрант, Трелстар, торемифен, ралоксифен, лазофоксифен, летрозол, антиандрогены, такие как бикалутамид, флутамид, мифепристон, нилутамид, касодекс и антипрогестероны, и комбинации вышеперечисленного;

Выделенные из растений противоопухолевые вещества включают, например, выбранные из ингибиторов митоза, например эпотилоны, такие как сагопилон, иксабепилон и эпотилон В, винбластин, винфлунин, доцетаксел и паклитаксел;

Цитотоксические агенты, ингибирующие топоизомеразу, включает, но не ограничены этим: акларубицин, доксорубицин, амонафид, белотекан, камптотецин, 10-гидроксикамптотецин, 9-аминокамптотецин, дифломотекан, иринотекан, топотекан, эдотекарин, эпимбицин, этопозид, эксатекан, гиматекан, луртотекан, митоксантрон, пирамбицин, пиксантрон, рубитекан, собузоксан, тафлупозид и комбинации вышеперечисленного;

Иммунологические препараты включают интерфероны, такие как интерферон альфа, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, интерферон бета, интерферон гамма-1а и интерферон гамма-n1 и другие иммуностимулирующие агенты, такие как L19-IL2 и другие производные IL2, филграстим, лентинан, сизофилан, ТераЦис, убенимекс, алдеслейкин, алемтузумаб, ВАМ-002, дакарбазин, даклизумаб, денилейкин, гемтузумаб, озогамицин, ибритумомаб, имиквмод, ленограстим, лентинан, вакцина против меланомы (Corixa), молграмостим, сарграмостим, тазонермин, теклейкин, тималазин, тозитумомаб, вимлизин, эпратузумаб, митумомаб, ореговомаб, пемтумомаб и провенге;

Модификаторы биологического ответа являются агентами, которые модифицируют защитные механизмы живых организмов или биологические ответы, такие как выживание, рост или дифференцировка клеток ткани, для придания им противоопухолевой активности; такие агенты включают, например, крестин, лентинан, сизофиран, пицибанил, промун и убенимекс;

Анти-ангиогенные соединения включают, но не ограничены этим, ацитретин, афлиберцепт, ангиостатин, аплидин, асентар, акситиниб, бевацизумаб, бриваниб аланинат, силенгтид, комбретастатин, эндостатин, фенретинид, галофугинон, пазопаниб, ранибизумаб, ребимастат, рецентин, регорафениб, ремоваб, ревлимид, сорафениб, скваламин, сунитиниб, телатиниб, талидомид, украин, ваталаниб и витаксин;

Антитела включают, но не ограничены этим: трастузумаб, цетуксимаб, бевацизумаб, ритуксимаб, тицилимумаб, ипилимумаб, люмиликсимаб, катумаксомаб, атацицепт, ореговомаб и алемтузумаб;

Ингибиторы VEGF такие как, например, сорафениб, регорафениб, бевацизумаб, сунитиниб, рецентин, акситиниб, афлиберцепт, телатиниб, бриваниб аланинат, ваталаниб, пазопаниб и ранибизумаб;

ингибиторы EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) (HER1) такие как, например, цетуксимаб, панитумумаб, вектибикс, гефитиниб, эрлотиниб и Зактима;

ингибиторы HER2 такие как, например, лапатиниб, тратузумаб и пертузумаб;

ингибиторы mTOR такие как, например, темсиролимус, сиролимус/рапамицин и эверолимус;

ингибиторы c-Met;

ингибиторы PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы) и AKT (протеинкиназ В);

ингибиторы CDK (циклин-зависимой киназы), такие как росковитин и флавопиридол;

Ингибиторы контрольной точки сборки митотического веретена и таргетированные антимитотические агенты, такие как ингибиторы PLK, ингибиторы Aurora (например, Гесперидин), ингибиторы контрольной точки киназы и ингибиторы KSP;

Ингибиторы HDAC такие как, например, панобиностат, вориностат, MS275, белиностат и LBH589;

ингибиторы HSP90 и HSP70;

Протеасомные ингибиторы, такие как бортезомиб и карфилзомиб;

Ингибиторы сериновой/треониновой киназы, включающие ингибиторы МЕК и ингибиторы Raf, такие как сорафениб;

Ингибиторы фарнезилтрансферазы такие как, например, типифарниб;

Ингибиторы тирозинкиназы включающие, например, дасатиниб, нилотибиб, регорафениб, бозутиниб, сорафениб, бевацизумаб, сунитиниб, цедираниб, акситиниб, афлиберцепт, телатиниб, иматиниба мезилат, бриванид аланинат, пазопаниб, ранибизумаб, ваталаниб, цетуксимаб, панитумумаб, вектибикс, гефитиниб, эрлотиниб, лапатиниб, тратузумаб, пертузумаб и ингибиторы c-Kit;

Агонисты рецептора витамина D;

Ингибиторы белка Bcl-2, такие как обатоклакс, натрий облимерсен и госсипол;

Антагонисты рецептора кластера дифференцировки 20, как например, ритуксимаб;

Ингибиторы рибонуклеотид редуктазы, как например, гемцитарабин;

Агонисты лиганда рецептора 1 некроза опухоли, вызывающие апоптоз, такой как, например, мапатумумаб;

Антагонисты рецептора 5-гидрокситриптамина такие как, например, rEV598, ксалипрод, палоносетрона гидрохлорид, гранисетрон, зиндол и АВ-1001;

Ингибиторы интегринов, включающие ингибиторы α-5-бета-1-интегрина такие как, например, Е7820, JSM 6425, волоциксимаб и эндостатин;

Антагонисты андрогенового рецептора включающие, например, нандролон деканоат, флюоксиместерон, Андроид, Prost-aid, андромустин, бикалутамид, флутамид, апоципротерон, апофлутамид, хлормадинона ацетат, андрокур, таби, ципротерона ацетат и нилутамид;

Ингибиторы ароматазы такие как, например, анастрозол, летрозол, тестолактон, эксеместан, аминоглютетимид и форместан;

Ингибиторы матриксной металлопротеиназы;

Другие противоопухолевые агенты включающие, например, алитретиноин, амплиген, атрасентан бексаротен, бортезомиб, бозентан, кальцитриол, эксизулинд, фотемустин, ибандроновая кислота, милтефозин, митоксантрон, L-аспарагиназа, прокарбазин, дакарбазин, гидроксикарбамид, пегаспаргаза, пентостатин, тазаротен, велкад, нитрат галлия, канфосфамид, даринапарзин и третиноин.

В предпочтительном варианте осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться в сочетании с химиотерапией (то есть цитотоксическими агентами), антигормонами и/или таргетными препаратами, такими как другие ингибиторы киназы (например, ингибиторы EGFR), ингибиторы mTOR и ингибиторы ангиогенеза.

Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут также использоваться в лечении рака в сочетании с радиационной терапией и/или хирургическим вмешательством.

Антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент может в некоторых случаях само быть модифицировано. Например, антитело может быть конъюгировано с любым из, но не ограничиваться упомянутыми выше соединениями или любым радиоизотопом для возможного дополнительного увеличения эффективности. Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы как таковые или в композициях в исследовании и диагностике, или как аналитические ссылочные стандарты, и т.п., которые известны специалистам в данной области техники.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться в качестве терапевтического или диагностического инструмента во множестве ситуаций, где С4.4а нежелательно экспрессируется или найден, например, при расстройствах клеточной пролиферации, таком как рак. Расстройства и состояния, особенно подходящие для лечения с антителом в соответствии с настоящим изобретением, являются солидными опухолями, такими как раковые опухоли молочной железы, дыхательных путей, мозга, репродуктивных органов, пищеварительного тракта, мочевых путей, глаза, печени, кожи, головы и шеи, щитовидной железы, паращитовидной железы и их отдаленных метастазов. Эти расстройства также включают лимфомы, саркомы и лейкемии.

Примеры рака молочной железы включают, но не ограничены этим: инвазивную протоковую карциному, инвазивную дольковую карциному, протоковую карциному in situ и дольковую карциному in situ.

Примеры раковых образований в дыхательных путях включают, но не ограничены этим: мелкоклеточную и немелкоклеточную карциному легких, также как аденому бронха и плевролегочную бластому.

Примеры мозговых раковых образований включают, но не ограничены этим: глиому ствола мозга и гипоталамуса, церебеллярную и церебральную астроцитому, глиобластому, медуллобластому, эпендимому, также как нейроэктодермальную и шишковидную опухоль.

Опухоли мужских репродуктивных органов включают, но не ограничены этим: рак простаты и тестикулярный рак. Опухоли женских репродуктивных органов включают, но не ограничены эти: эндометриальный, цервикальный, яичниковый, вагинальный и влагалищный рак, также как саркому матки.

Опухоли пищеварительного тракта включают, но не ограничены этим: анальный, рак толстой кишки, колоректальный, рак пищевода, желчного пузыря, ректальный, тонкого кишечника, поджелудочной железы, желудка и рак слюнной железы.

Опухоли мочевых путей включают, но не ограничены этим: рак мочевого пузыря, пениса, почек, почечной лоханки, мочеточника, уретральный и наследственные и спорадические папиллярные почечные раковые образования.

Раковые опухоли в глазе включают, но не ограничены этим, внутриглазную меланому и ретинобластому.

Примеры раковых опухолей печени включают, но не ограничены этим, гепатоцеллюлярную карциному (карциномы клеток печени с или без фиброламеллярным вариантом), холангиокарциному (карцинома внутрипеченочной жёлчной протоки), и смешанную гепатоцеллюлярную холангиокарциному.

Рак кожи включает, но не ограничен этим: плоскоклеточную карциному, саркому Капоши, злокачественную меланому, рак кожи клеток Меркеля и немеланомный рак кожи.

Раковые образования на голове и шее включают, но не ограничены этим: рак гортани, подглоточный рак, рак ротоглотки, рак губы и рак полости рта и плоскоклеточный рак.

Лимфомы включают, но не ограничены этим: СПИД-ассоциированную лимфому, неходжкинскую лимфому, Т-клеточную лимфому кожи, лимфому Беркита, болезнь Ходжкина и лимфому центральной нервной системы.

Саркомы включают, но не ограничены этим: саркому мягкой ткани, остеогенную саркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лимфосаркому и рабдомиосаркому.

Лейкемии включают, но не ограничены этим: острую миелоидную лейкемию, острой лимфобластную лейкемию, хронический лимфолейкоз, хроническую гранулоцитную лейкемию и лейкоз ворсистых клеток.

Упомянутые выше расстройства были хорошо характеризованы у людей, но также и существуют с подобной этиологией у других животных, включая млекопитающих, и могут подвергаться лечению путем введения фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением.

Для лечения любого из вышеупомянутых расстройств, могут быть составлены фармацевтические композиции для использования в соответствии с настоящим изобретением в обычной манере с использованием одного или более физиологически приемлемого носителя или вспомогательного вещества. Антитело в соответствии с настоящим изобретением или антигенсвязывающий фрагмент могут быть введены с помощью любых подходящих средств, которые могут варьироваться в зависимости от типа расстройства, которое подвергается лечению. Возможные способы введения лекарственного средства включают парентеральный (например, внутримышечный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный или подкожный), внутрилегочный и интраназальный, и, при необходимости, для местной иммуносупрессивной терапии внутриочаговое введение. Кроме того, антитело в соответствии с настоящим изобретением вводиться посредством импульсной инфузии, например, уменьшая дозы антитела. Предпочтительно, дозирование осуществляется в виде инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекции, что частично зависит от того, будет ли введение короткое или хроническое. Количество, которое будет введено, будет зависеть от множества факторов, таких как клинические симптомы, масса человека, вводятся ли другие лекарственные средства. Специалист в данной области техники понимает, что способ введения изменяется в зависимости от расстройства или патологического состояния, которое собираются лечить.

Определение терапевтически эффективного количества нового полипептида в соответствии с настоящим изобретением в основном будет зависеть от конкретных особенностей пациента, способа введения и природы расстройства, которое собираются лечить. Общее руководство может быть найдено, например, в публикациях Международной конференции по вопросам гармонизации (International Conference on Harmonization) и в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp.484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Более тщательное определение терапевтически эффективного количества будет зависеть от таких факторов как токсичность и эффективность лекарства. Токсичность может быть определена с использованием способов, известных специалистам в данной области техники и, которые можно найти в вышеупомянутых ссылках. Эффективность может быть определена с использованием тех же руководств в сочетании со способами, описанными ниже в Примерах.

Диагностические способы

Антитела С4.4а или их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться для того, чтобы обнаружить присутствие опухоли, которая экспрессирует С4.4а. Присутствие клеток, содержащих С4.4а, или нишу С4.4а внутри различных биологических образцов, включая сыворотку и образцы биопсии ткани, может быть обнаружено с помощью антител против С4.4а. Кроме того, антитела С4.4а могут использоваться в различных методологиях визуализации, таких как иммуносцинтиграфия с ⁹⁹Те (или с другим изотопом) конъюгированным антителом. Например, протокол визуализации, подобный тому, в котором недавно было описано использование антитела анти-PSMA (простатический специфический мембранный антиген), конъюгированного с ¹¹¹In, может использоваться для обнаружения карциномы поджелудочной железы или яичника (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21:759-766, 1997). Другим способом обнаружения, который может использоваться, является позитронно-эмиссионная томография посредством конъюгации антитела в соответствии с настоящим изобретением с подходящим изотопом (см. Herzog et al., J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993).

Фармацевтические композиции и введение

Вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтические композиции, которые содержат антитела С4.4а или их антигенсвязывающий фрагмент, одни или в сочетании по меньшей мере с одним дополнительным агентом, таким как стабилизирующие соединение, которые может вводиться в любом стерильном, биологически совместимом фармацевтическим носителе, включающим, но не ограничивающимся этим: физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, глюкоза и вода. Дополнительным вариантом осуществления являются фармацевтические композиции, содержащие С4.4а-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и дополнительное фармацевтически активное соединение, которое подходит для лечения заболеваний, связанных с С4.4а, таких как рак. Любая из этих молекул может быть введена отдельно пациенту или в сочетании с другими веществами, лекарствами или гормонами в фармацевтических композициях, где они смешаны с вспомогательным веществом(ами) или фармацевтически приемлемыми носителями. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически инертным.

Настоящее изобретение также касается введения фармацевтических композиций. Такое введение осуществляется перорально или парентерально. Способы парентеральной доставки включают: местное, внутриартериальное (непосредственно к опухоли), внутримышечное, подкожное, внутримедуллярное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение. В дополнение к активным ингредиентам эти фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие вспомогательные вещества и вспомогательные средства, которые облегчают процессинг активных соединений в препараты, которые могут использоваться фармацевтически. Более подробная информация о методиках для составления и введения может быть найдена в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть составлены с использованием фармацевтически приемлемых носителей, известных специалистам в данной области техники, в дозировках, подходящих для перорального введения. Такие носители позволяют фармацевтическим композициям быть сформулированными в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и т.п., для проглатывания пациентом.

Фармацевтические препараты для перорального использования могут быть получены путем комбинирования активных соединений с твердым вспомогательным веществом, при необходимости размалывая (гранулируя) получающуюся смесь, и перерабатывая смесь гранул после добавления подходящих вспомогательных средств при необходимости, чтобы получить таблетки или ядро драже. Подходящими вспомогательными веществами являются углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозы, такие как метил целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, или натрий карбоксиметилцеллюлоза; и камеди, включая гуммиарабик и трагакантовую камедь; и белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости могут быть добавлены вещества для улучшения распадаемости таблеток или солюбилизирующие агенты, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Ядра драже снабжаются подходящими покрытия, такими как концентрированные растворы сахаров, которые могут также содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, глазировочные растворы, и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены к таблеткам или покрытиям драже для идентификации продукта или характеризации количества активного соединения, то есть дозировку.

Фармацевтические препараты, которые могут использоваться перорально, включают твёрдые капсулы, приготовленные из желатина, так же как мягкие, герметические капсулы, приготовленные из желатина и покрытия такого как глицерин или сорбит. Твёрдые капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителем или связующими веществами, такими как лактоза или крахмалы, лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и при необходимости, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или диспергированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль с или без стабилизаторов.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений. Для инъекции фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнка, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензий, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Дополнительно, суспензии активных соединений могут быть получены в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды или липосомы. При необходимости, суспензии могут также содержать подходящие стабилизирующие агенты или агенты, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получить препарат высококонцентрированных растворов.

Для местного или назального введения используются в композиции пенетранты, соответствующие конкретному барьеру, через который должен быть пройден. Такие пенетранты известны специалистам в данной области техники.

Наборы

Изобретение дополнительно касается фармацевтических упаковок и наборов, содержащих один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами вышеупомянутых композиций в соответствии с настоящим изобретением. Ассоциированным с таким контейнером(ами) может быть уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, выражающее одобрение этого агентства изготовление, применение или продажу продукта для введения в человека.

В другом варианте осуществления наборы могут содержать последовательности ДНК, кодирующие антитела в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно последовательности ДНК, кодирующие эти антитела, обеспечиваются в плазмиде, подходящей для трансфекции в клетку-хозяина и экспрессии клеткой-хозяином. Плазмида может содержать промотор (часто индуцибельный промотор) для регуляции экспрессии ДНК в клетке-хозяине. Плазмида может также содержать соответствующие сайты рестрикции для облегчения вставки других последовательностей ДНК в плазмиду для продуцирования различных антител. Плазмиды могут также содержать многочисленные другие элементы, чтобы облегчить клонирование и экспрессию кодированных белков. Такие элементы известны специалистам в данной области техники и включают, например, селектируемые маркеры, кодоны инициирования, кодоны терминации, и т.п.

Получение и хранение

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут производиться способом, который известен специалистам в данной области техники, например, посредством обычного смешивания, растворения, гранулирования, создания драже, отмучивания, эмульгирования, заключения в капсулу, включения или процессов лиофилизации.

Фармацевтическая композиция может обеспечиваться в виде соли и может быть сформирована с кислотами, включая, но не ограничиваясь этим: хлористоводородную, серную, уксусную, молочную, винную, яблочную, янтарную и т.д. Соли имеют тенденцию быть более растворимыми в водных или других протонных растворителях, которые являются соответствующими формами свободного основания. В других случаях предпочтительными препаратами могут быть лиофилизованные порошки в 1 мМ - 50 мМ гистидине, 0,1%-2% сахарозы, 2%-7% маннита в интервале рН от 4,5 до 5,5, которые объединяются с буфером пред использованием.

После того, как фармацевтические композиции, содержащие соединение в соответствии с настоящим изобретением, введенные в приемлемой носитель, были приготовлены, они могут быть помещаться в соответствующий контейнер и маркироваться для лечения указанного состояния. Для введения антител против С4.4а или его антигенсвязывающего фрагмента, такая маркировка должна включать количество, частоту и способ введения.

Терапевтически эффективная доза

Фармацевтические композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в эффективном количестве, чтобы достигнуть намеченной цели, то есть лечения конкретного болезненного состояния, характеризуемого экспрессией С4.4а. Определение эффективной дозы находится в компетенции специалистов в данной области техники.

Для любого соединения терапевтически эффективная доза может быть оценена первоначально либо в тестах на клеточной культуре, например, неопластических клетках, либо в моделях на животных, обычно мышах, кроликах, собаках, свиньях или обезьянах. Животная модель также используется, чтобы оценить желательный диапазона концентрации и способ введения. Такая информация может затем использоваться для определения полезных доз способа введения для людей.

Терапевтически эффективная доза относится к тому количеству антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые облегчают симптомы или состояние. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, ED₅₀ (доза, терапевтически эффективная у 50% популяции) и LD₅₀ (доза, смертельная для 50% популяции). Отношение доз терапевтического и токсического эффектов представляет собой терапевтический индекс, и он может быть выражен как отношение ED₅₀/LD₅₀. Предпочтительными являются фармацевтические композиции, которые показывают большие терапевтические индексы. Данные, полученные из опытов на клеточной культуре и исследований на животных, используются для определения диапазона дозировок для использования у людей. Дозировка таких композиций находится предпочтительно в пределах диапазона концентраций в кровотоке, которые включает ED₅₀ с минимальной или отсутствующей токсичностью. Дозировка изменяется в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы, чувствительности пациента и способа введения.

Точная дозировка выбирается лечащим врачом в зависимости от пациента, которого собираются лечить. Дозировка и введение приспосабливаются, чтобы обеспечить достаточные уровни активного компонента или поддерживать желаемый эффект. Дополнительные факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают серьезность стадии заболевания, например, размер опухоли и местоположение; возраст, массу и пол пациента; диету, время и частоту введения, сочетание(я) лекарств, чувствительности реакции и переносимость/ответ на терапию. Долго действующие фармацевтические композиции могут вводиться каждые 3-4 дня, каждую неделю или один раз каждые две недели в зависимости от периода полураспада и уровня клиренса конкретной композиции.

Нормальное количество на дозу могут изменяться от 0,1 до 100000 микрограмм, до суммарной дозы около 1 г в зависимости от пути введения. Руководство относительно конкретных дозировок и способов доставки обеспечивается в литературе. См. патенты США No. 4657760; 5206344 или 5225212. Специалисты в данной области техники будут использовать различные композиции полинуклеотидов с большей вероятностью, чем композиции белков или их ингибиторов. Точно так же доставка полинуклеотидов или полипептидов будет специфической для конкретных клеток, состояний, местоположений и т.д. Предпочтительными специфическими активностями для радиоактивномеченных антител могут колебаться от 0,1 до 10 мКи/мг белка ((Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275-3280, 1999; Ulaner et al, 2008 Radiology 246(3):895-902).

Настоящее изобретение дополнительно описывается следующими примерами. Примеры приводятся исключительно, чтобы иллюстрировать изобретение в отношении специфических вариантов осуществления. Эти примеры, иллюстрируя определенные специфические аспекты изобретения, не представляют собой ограничения или ограничивают объем раскрываемого изобретения.

Все примеры были выполнены с использованием стандартных методик, которые являются известными и обычными для специалистов в данной области техники, за исключением случаев, описанных в деталях. Обычные методики молекулярной биологии следующих примеров могут быть выполнены как описано в стандартных лабораторных руководствах, таких как Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является:

А. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с С4.4а, предпочтительно с доменом S1 С4.4а.

В. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления А, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент проявляют кросс-реактивность к С4.4а грызуна, предпочтительно к мышиному С4.4а.

С. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно вариантам осуществления А или В, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент интернализуется после связывания с клетками, экспрессирующими С4.4а.

D. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления от А до С, в которых антитело или антигенсвязывающий фрагмент конкурируют за связывание с С4.4а с антителом М31-В01 или M20-D02 S-A.

Е. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления D, в котором аминокислотная последовательность антитела или антигенсвязывающего фрагмента является по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичной по меньшей мере одной последовательности CDR, изображенной в таблице 7, или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% или 95% идентичной по меньшей мере одной последовательности VH или VL, изображенной в таблице 7.

F. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления от D до Е, в которых аминокислотная последовательность антитела или антигенсвязывающего фрагмента является по меньшей мере на 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90% или 95% идентичной по меньшей мере одной последовательности CDR M31-B01 или M20-D02 S-A или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% или 95% идентичной последовательности VH или VL M31-B01 или M20-D02 S-A.

G. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления от D до F, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат по меньшей мере одну из последовательности CDR тяжелой цепи, которые соответствуют консенсусным последовательностям SEQ ID NO:297 или SEQ ID NO:302 (CDR H1), SEQ ID NO:298 или SEQ ID NO:303 (CDR H2), или SEQ ID NO:299 или SEQ ID NO:304 (CDR Н3), и/или по меньшей мере одну из последовательностей CDR легкой цепи, которые соответствуют консенсусным последовательностям SEQ ID NO:300 или SEQ ID NO:305 (CDR L1), SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:306 (CDR L2), или SEQ ID NO:301 или SEQ ID NO:307 (CDR L3).

H. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления от D до G,

a) в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности CDR тяжелой цепи, соответствующие SEQ ID NO:297 (CDR H1), SEQ ID NO:298 (CDR H2) и SEQ ID NO:299 (CDR Н3) и последовательности CDR легкой цепи, соответствующие SEQ ID NO:300 (CDR L1), SEQ ID NO:22 (CDR L2) и SEQ ID NO:301 (CDR L3), или

b) в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности CDR тяжелой цепи, соответствующие SEQ ID NO:302 (CDR H1), SEQ ID NO:303 (CDR H2) и SEQ ID NO:304 (CDR Н3), и последовательности CDR легкой цепи, соответствующие SEQ ID NO:305 (CDR L1), SEQ ID NO:306 (CDR L2) и SEQ ID NO:307 (CDR L3).

I. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления от D до Н, содержащие вариабельную тяжелую цепь и вариабельные последовательности CDR легкой цепи антитела М31-В01 или они же модифицированные, в которых

i. в модифицированной CDR-H1 аминокислота в положении 3 выбирается из группы, состоящей из N и S, и в положении 4 выбирается из группы, состоящей из А и Y;

ii. в модифицированной CDR-H2 аминокислота в положении 10 выбирается из группы, состоящей из Т и S, и в положении 11 выбирается из группы, состоящей из I и Т;

iii. в модифицированной CDR-H3 аминокислота в положении 10 выбирается из группы, состоящей из Y, K, G, W и N;

iv. в модифицированной CDR-L1 аминокислота в положении 1 выбирается из группы, состоящей из Т и S;

v. в модифицированной CDR-L2 аминокислота в положении 4 выбирается из группы, состоящей из Q и K;

vi. в модифицированной CDR-L3 аминокислота в положении 4 выбирается из группы, состоящей из W, Е, F и Y, в положении 7 выбирается из группы, состоящей из R, S и М, в положении 9 выбирается из группы, состоящей из N, K и S, в положении 10 выбирается из группы, состоящей из G и R, и в положении 11 выбирается из группы, состоящей из Р и А.

J. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от G до Н, содержащими структурную последовательность вариабельной тяжелой цепи и вариабельные последовательности CDR легкой цепи антитела М31-В01 или они же модифицированные, в которых в модифицированной вариабельной легкой цепи, аминокислота в положении 10 выбирается из группы, состоящей из А и V, и в положении 13 выбираются из группы, состоящей из А и Т.

K. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления D - Н, содержащими вариабельную тяжелую цепь и вариабельные последовательности CDR легкой цепи антитела M20-D02 S-A или они же модифицированные, в которых

i. в модифицированной CDR-H1 аминокислота в положении 3 выбирается из группы, состоящей из D и S;

ii. в модифицированной CDR-H2 аминокислота в положении 4 выбирается из группы, состоящей из V и I, в положении 9 выбирается из группы, состоящей из А и G, и в положении 10 выбирается из группы, состоящей из R и S;

iii. в измененном CDR-Н3 аминокислота в положении 9 выбирается из группы, состоящей из S, K и R, в положении 10 выбирается из группы, состоящей из А, S и R, в положении 14 выбирается из группы, состоящей из D, K, Е и R, и в положении 15 выбирается из группы, состоящей из S и Y;

iv. в измененном CDR-L1 аминокислота в положении 7 выбирается из группы, состоящей из V и I;

v. в измененном CDR-L3 аминокислота в положении 3 выбирается из группы, состоящей из A, Q и R, в положении 5 выбирается из группы, состоящей из D и G, в положении 7 выбирается из группы, состоящей из R и S, в положении 9 выбирается из группы, состоящей из N, W и S, и в положении 12 выбирается из группы, состоящей из V, А и G.

L. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от D до K, в которых антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат по меньшей мере одну последовательность CDR или по меньшей мере одну вариабельную последовательность тяжелой цепи или легкой цепи как изображено в таблице 7.

М. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, в которых антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности CDR тяжелой и легкой цепи или вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепи антитела таблицы 7.

N. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, содержащие вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:75-77, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:78-80, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:5, 9 и 13, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:17, 21 и 25, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:6, 10 и 14, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:18, 22 и 26, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:7, 11 и 15, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:19, 23 и 27, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:8, 12 и 16, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:20, 24 и 28, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:45-47, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:48-50, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:55-57, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:58-60, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:65-67, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:68-70, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:85-87, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:88-90, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:95-97, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:98-100, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:105-107, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:108-110, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:115-117, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:118-120, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:125-127, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:128-130, или

вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:135-137, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные в SEQ ID NO:138-140.

О. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, содержащие вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:81, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:82,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:33, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:29,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:34, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:30,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:35, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:31,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:36, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:32,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:51, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:52,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:61, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:62,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:71, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:72,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:91, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:92,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:101, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:102,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:111, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:112,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:121, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:122,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:131, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:132,

или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено в SEQ ID NO:141, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:142.

Р. Антитело в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, которое является антителом IgG.

Q. Антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, который является scFv, Fab, Fab' фрагментом или F(ab')₂ фрагментом.

R. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, которые являются моноклональным антителом или антигенсвязывающим фрагментом.

S. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, которое является человеческим, гуманизированным или химерным антителом или антигенсвязывающим фрагментом.

Т. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от А до S. В дополнительном варианте осуществления ADC содержит цитотоксический агент или радиоизотоп, в дополнительном предпочтительном варианте осуществления цитотоксический агент или радиоизотоп ковалентно связаны с антителом или антигенсвязывающим фрагментом.

U. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от А до S. Дополнительным вариантом осуществления является нуклеиновая кислота, как изображено в таблице 7.

V. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с вариантом осуществления U.

W. Клетка, экспрессирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления от А до S и/или содержащая нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантами осуществления U или вектор в соответствии с вариантами осуществления V.

X. Клетка в соответствии с вариантом осуществления W, в котором указанная клетка является прокариотической или эукариотической клеткой.

Y. Способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с любым из вариантов осуществления от А до S, содержащий культивирование клетки в соответствии с вариантом осуществления Х и очистку антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

Z. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от А до S или конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с вариантами осуществления Т в качестве медикамента.

АА. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от А до S в качестве диагностического агента.

ВВ. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от А до S или конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с вариантом осуществления Т в качестве медикамента для лечения рака.

СС. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантами осуществления от А до S или конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с вариантом осуществления Т.

DD. Комбинация антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с вариантами осуществления от А до S или фармацевтическая композиция в соответствии с вариантами осуществления СС и одно или более терапевтически активное соединение.

ЕЕ. Способ лечения расстройства или состояния, ассоциированных с нежелательным присутствием С4.4а, содержащий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции в соответствии с вариантом осуществления СС или комбинации в соответствии с вариантом осуществления DD. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления болезнью является рак.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Генерация антител из библиотек n-CoDeR

Изоляцию человеческих антител против С4.4а осуществляли с помощью технологии фагового дисплея, использующую библиотеку наивных антител n-CoDeR BioInvent International AB (Lund, Sweden; описанную в Soderling et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856) для селекции клеток. n-CoDeR является библиотекой Fab, в которой представлены все шесть CDR. Последовательности CDR первоначально получали от здоровых человеческих доноров.

Коротко, аликвоту библиотеки Fab фрагментов антител истощали от нежелательных поверхностных связующих предварительной инкубацией с 10⁷ родительских клеток CHO-S, не экспрессирующих С4.4а, в PBS/3% FcS/0,01% NaN₃ (буфер А) при 4°С вращением с донышка на крышку в течение 15 минут. Затем эти клетки отделяли центрифугированием, супернатант использовали для 2 дополнительных циклов предварительной инкубации на клетках CHO-S. Многостадийный (субсеквенциальный) пэннинг на целевых клетках (10⁷ клеток CHO-S:hC4.4a) осуществляли посредством инкубации с фаговым препаратом в течение 45 минут при 4°С в буфере А с последующей 10-кратной промывкой буфером А (4°С). Связанные фаги элюировали обрабатываемыми клетками в течении 5 мин вращением с донышка на крышку в 76 мМ лимонной кислоте (4°С). Препарат, содержащий элюированные фаги, нейтрализовали добавлением 1 М Tris/HCl, pH 7,5 и проводили 2 дополнительных цикла пэннинга. В каждом цикле элюированные фаги размножались, и титры фагов определяли, как ранее описано (Cicortas Gunnarsson et al., PEDS 2004, 17(3) 213-221). Коротко, аликвоты элюирующего раствора сохраняли для экспериментов титрования, в то время как остаток использовали для трансформации Е.coli HB10 в экспоненциальной фазе роста для приготовления новых сток-растворов фага. Для каждого селектирующего цикла, как входящие, так и выходящие фаги раститровывали на Е.coli HB10 в экспоненциальной фазе роста и клоны, отбирали с циклов 2 и 3 для анализа в ELISA фага.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA):

ELISA фага:

Отобранные фаги с различных циклов селекции анализировали на специфичность с использованием ELISA фага. Коротко, экспрессию фага осуществляли, добавляя 10 мкл ночной культуры (в LB-среде, дополненной 100 мкг/мл ампициллина и 15 мкг/мл тетрациклина) к 100 мкл свежей среды (LB-среда, дополненная 100 мкг/мл ампициллина, 15 мкг/мл тетрациклина и 0,1% глюкозы), и встряхивая при 250 об./мин и при 37°С в 96-луночном МТР (титрационный микропланшет) до тех пор, пока OD600 не достигло 0,5. Затем добавляли фаг-помощник M13K07 (Invitrogen) и образцы инкубировали в течение еще 15 мин при 37°С без встряхивания. После добавления ИПТГ (f.c. 0,25 мМ) клетки инкубировали в течение 16 ч при 30°С, при встряхивании при 200 об./мин.

96-Луночный МТР (Nunc-maxisorb) покрывали в течение 16 ч при 4°С 50 мкл рекомбинантного С4.4а (5 мкг/мл человеческого или мышиного белка). На следующий день планшеты промывали 3 раза PBS/0,05% Tween 20 (буфер В), обрабатывали блокирующим реагентом (3%-ое сухое молоко в буфере В) и промывали снова 3 раза буфером В. После этого аликвоты по 50 мкл от экспрессии фага переносили в лунку и инкубировали в течение 1 ч при 20°С. После 3-х кратной промывки буфером В добавляли антитела анти-М13, конъюгированные с HRP (пероксидаза хрена) (GE Healthcare, 27-9421-01; разбавленная 1:2500 в буфере В), и инкубировали в течение 1 ч при 20°С. Цветная реакция развивалась путем добавления 50 мкл ТМВ (Invitrogen) и остановилась через 5-15 минут при 20°С путем добавления 50 мкл останавливающего раствора (Invitrogen). Колориметрическую реакцию регистрировали при 450 нм с помощью ридера Tecan.

Скрининг sFab с помощью ELISA:

Для генерации растворимых Fab (sFab) ДНК фагмиды с циклов селекции 2 и 3 изолировали и расщепляли рестрикционными ферментами EagI и EcoRI в соответствии с инструкциями поставщиков, чтобы удалить продукт гена III. Получающийся фрагмент повторно лигировали, и конструкциями трансформировали в химически компетентные Е.coil TopIO, используя стандартные методы. В общей сложности отобрали ~1500 клонов, перенесли на 96-луночные планшеты, содержащие LB-среду (100 мкг/мл, 0,1% глюкоза) и встряхивали при 250 об./мин и 37°С до тех пор, пока OD600 не достигла 0,5. После этого индуцировали продуцирование sFab добавлением ИПТГ (конечная концентрация 0,5 мМ), и инкубацию продолжали в течение 16 ч при 30°С, при встряхивании при 200 об./мин. На следующее утро добавили BEL-буфер в каждую лунку (24,7 г/л борной кислоты; 18,7 г/л NaCl; 1,49 г/л EDTA pH 8,0; 2,5 мг/мл лизозима (Roche)), и 50 мкл обработанных культур анализировали на связывание sFab к мишени в ELISA, по существу, как описано для фагов, за исключением того, что обнаружение выполняли с анти-hIgG (Fab-специфичными), конъюгированными с HRP (Sigma; Product No. A 0293).

FACS:

Клеточное связывание sFab к клеткам-мишеням анализировали на биоанализаторе FACSarray от BD. Коротко, 50 мкл клеточной суспензии (2×10⁶ клеток/мл) перемешивали с 50 мкл супернатанта Е.coli в течение 1 ч при 4°С и 300 об./мин. Затем добавляли 100 мкл буфера А, клетки центрифугировали и дополнительно промывали 2 раза буфером А. Для обнаружения связанного конъюгата Fab и R-Phycoerythrin добавляли AffiniPure F(ab')₂-фрагмент козлиного анти-человеческого специфичного к F(ab')₂-фрагменту; Jackson Immuno Research; Product No. 109-116-097, разбавленного 1:100 в буфере А, и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После 3 промывок буфером А конечный осадок ресуспендировали в 150 мкл буфера А, и регистрировали 5000 событий FACS на образец. Анализ данных осуществляли, используя системное программное обеспечение BD FACSArray.

ПРИМЕР 2: Классификация эпитопов

Эксперименты классификации эпитопов осуществляли с использованием анализа поверхностного плазменного резонанса на Biacore T100 instrument (GE Healthcare Biacore, Inc.), с помощью мониторинга одновременного связывания пар анти-С4.4а антител к С4.4а. Все следующие стадии осуществляли при 20°С. Приблизительно 2000 RU (одна RU (резонансная единица) соответствует связыванию 1 пг белка на квадратный мм) первичного антитела ковалентно иммобилизовали на чип сенсора СМ5 через связывание с первичной аминогруппой. Чип активировали смесью 0,4 М N-этил-N-(3-диэтиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 0,1 М N-гидроксисукцинамида (NHC) в соотношении 1:1 при расходе 10 мкл/мин в течение 5-15 мин. Незанятые сайты связывания на поверхности затем блокировали избытком 1 М этаноламина рН 8,5. Растворимый С4.4а (концентрация 400 нМ в буфере HEPES-EP (GE Healthcare Biacore, Inc.) при расходе 10 мкл/мин в течение 3 минут), захватывался на поверхности через иммобилизованное антитело. Поэтому эпитоп антитела захвата блокировался на всех связанных молекулах С4.4а. Затем вторичное антитело немедленно пропускали по поверхности (при концентрации 200 нМ в буфере HEPES-EP при расходе 10 мкл/мин в течение 3 минут), чтобы связать с захваченным С4.4а. Два антитела, узнающие одни и те же или перекрывающиеся эпитопы, не могут связываться с С4.4а, в то время как антитела с отличными эпитопами в состоянии связаться. Поверхность антитела регенерировали 3М MgC1₂ (при расходе 10 мкл/мин в течение 30 секунд), для удаления всех связавшихся белков, и затем процесс повторяли с другими антителами.

Исследовали антитела М31-В01 и M20-D02 S-A в формате IgGI. Оба антитела оказались неспособными связаться одновременно с С4.4а и, поэтому конкурируют в связывании (см. Фиг.1).

ПРИМЕР 3: Перекрестная реактивность с мышиным С4.4а

В Таблице 1 представлены результаты BiaCore и исследований, показывающих кросс-реактивность и константы диссоциации (K_D) антител в соответствии с настоящим изобретением к мышиному С4.4а.

Связывающую способность антител анти-С4,4 определяли с помощью анализа поверхностного плазменного резонанса на приборе BiaCore T100 instrument (GE Healthcare Biacore, Inc.). Антитела иммобилизовали на чип сенсора СМ5 через непрямой реагент захвата, античеловеческие IgG Fc. Реагенты из "Human Antibody Capture Kit" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) использовали, как описано изготовителем. Приблизительно 5000 RU мышиных моноклональных античеловеческих антител IgG (Fc) иммобилизовали на клетку. Антитела анти-С4.4 инжектировали при концентрации 5 мкг/мл при 10 мкл/мин в течение 10с для достижения уровня захвата приблизительно 200-600 RU. Различные концентрации (400 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12.5 нМ, 6,25 нМ и 3,12 нМ) в буфере HEPES-EP (GE Healthcare Biacore, Inc.) человеческого или мышиного С4.4а вводили поверх иммобилизованных антитела анти-С4.4а при расходе 60 мкл/мин в течение 3 минут, и ждали диссоциации в течение 10 минут. Сенсограммы генерировали после коррекции с помощью подключенной ячейки сравнения с последующим вычитанием буфера образца. Равновесную константу диссоциации (K_D), вычисляли на основе отношения констант скоростей ассоциации (k_on) и диссоциации (k_Qff), полученных путем аппроксимации сенсограммы в соответствии с моделью связывания первого порядка 1:1, используя программное обеспечение Biavaluation (версия 4.0).

ПРИМЕР 4: Связывание с рекомбинантным человеческим и мышиным С4.4а

Фиг.2 изображает кривые связывания анти-С4.4 антитела М31-В01 и М20 D02 S-A на рекомбинантном человеческом С4.4а (А) и мышином С4.4а (В), соответственно. Коротко, 96-луночный МТР покрывали в течение 16 ч при 4°С рекомбинантным человеческим или мышиным С4.4а (плашки 100 нг/ячейку промывали 3 раза PBS/0,05% Tween 20 (= буфер В) обрабатывали блокирующим реагентом (PBS + 2% БСА), и промывали снова 3 раза буфером В. После этого антитела анти-С4.4а в соответствии с настоящим изобретением добавляли в концентрациях от 0,39 нг до 400 нг/на лунку и инкубировали в течение одного часа при 20°С. После трехкратной промывки буфером В, добавили в каждую лунку 20 нг Белка А в 100 мкл буфера В. Цветная реакция развивается при добавлении 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) (Sigma). Данные для определения ЕС₅₀ регистрировали через 18 минут, измеряя оптическую плотность при 360 нм с помощью инфинитного планшетного ридера Tecan. Значения EC₅₀ для М31-В01 составляли 0,24 и 0,29 нМ на человеческом и мышином С4.4а, соответственно. А для M20-D02 S-A ЕС₅₀ значения составляли 0,3 и 0,38 нМ на человеческом и мышином С4.4а, соответственно. Это указывает на высокий аффинитет связывание антитела анти-С4.4а в соответствии с настоящим изобретением как к человеческому, так и к мышиному растворимому рекомбинантному С4.4а.

ПРИМЕР 5: Связывание с различными опухолевыми клетками

Фиг.3 изображает кривые связывания и значения EC₅₀ для антител М31-В01 и M20-D02 S-A с различными опухолевыми клетками. Исследования проводили с помощью FACS с использованием трансфецированной клеточной линии A549:hC4.4a и исходно экспрессирующих С4.4а опухолевых клеточных линий NCI H292, NCI H332, H1975/BCRP и ВхРС3. Фиг.3f) показывает, что оба антитела в соответствии с настоящим изобретением, связываются специфически и с высокой аффинностью с этим широким диапазоном опухолевых клеток. Значения EC₅₀ дополнительных антител в соответствии с настоящим изобретением на клетках mC4.4а:СНО и клетках NCI H292 приведены в Таблице 8.

Титрование FACS осуществляли на 96-луночном титрационном микропланшете, в котором серийные разбавления первичного антитела в объеме 50 мкл буфера FACS (3% FCS в PBS) смешивали с 50 мкл суспензии клеток, состоящей из 2×10⁵ клеток/мл, которые снимали раствором (Ix) для диссоциации клеток без ферментов (Sigma), и ресуспендировали в буфере FACS. Инкубацию осуществляли при 4°С в течение 1 часа при перемешивании. Клетки осаждали, промывали буфером FACS и ресуспендировали в 100 мкл/лунка в растворе меченных фикоэритрином козьих античеловеческих IgG (Dianova) в буфере FACS. Инкубацию и промывание осуществляли, как описывали раньше. Анализ связанных клеткой антител осуществляли на соответствующей длине волны обнаружения, используя устройство FACS Array. Значения EC₅₀ определяли из средних значений двух измерений флуоресценции, используя программное обеспечение Swift 8.0.

ПРИМЕР 6: Интернализация

Относительная интернализация анти-С4.4а антител на трансфецированных С4.4а:А549 клетках показана на Фиг.4 и в Таблице 9. Исследование интернализации осуществляли с флуоресцентно меченными антителами С4.4а.

рН-Чувствительный флуоресцентный краситель CypHer 5E (GE Healthcare, РА15401) выбрали в качестве флуоресцентной метки, потому что только при кислом рН, существующем в эндосомах, сигнал флуоресценции может быть детектирован, в то время как при нейтральных или основных значениях рН никакой флуоресценции не обнаруживали. Для конъюгации антитела анти-С4.4а инкубировали в течение 1 ч при 20°C с двухмолярным избытком красителя в PBS/карбонат натрия при рН 8,3 (9:1). В среднем 1,6 остатков Lys модифицировались красителем. Эффекты модификации на аффинности исследовали при помощи FACS Assays, и изменения значений EC₅₀ можно считать незначительными. I×10⁴ клеток А549:hC4.4а использовали для исследования специфической интернализации С4.4а после связывания антитела. Клетки обрабатывали различными концентрациями (34 нМ - 6,6 нМ) меченных антител при 37°С/5% CO₂. Интернализацию измеряли кинетически в течение до 24 ч, используя анализатор клеток IN Cell Analyzer 1000. Анализ интернализации осуществляли с помощью микроскопа при 40 × увеличении путем определения гранулярности (количество гранул/клетка; возбуждение на 620 нм и эмиссия на 700 нм для CypHer5E). Ядра визуализировались окрашиванием ДНК, используя проникающий в клетку краситель Hoechst 33342 (0,5 мкг/мл, 30 мин инкубирования, эмиссия на 353-365 нм, детекция на 480 нм).

Соответствующие клетки с векторами, неэкспрессирующими С4.4а, использовали в качестве контроля так же как клетки дикого типа А549 (А549 wt). Человеческий IgGI выбирали в качестве изотипического контроля и метили параллельно. Проводили три независимых эксперимента; точки на графике представляют трехкратные определения. М31-В01 и M20-D02 S-A интернализовались эффективно. Время половиной от максимальной интернализации составляло 31 мин для М31-В01 и 49 мин для M20-D02 S-A, соответственно.

ПРИМЕР 7: Преобразование от Fab к формату IgG

Чтобы перенести области VH и VL от Fab к формату IgG и/или изменить систему экспрессии от Е.coli к клеточной системе млекопитающих, VH и VL амплифицировали, используя праймеры ПЦР. Фланкирующие сайты расщепления рестриктазами вводили как в 5', так и в 3' конец VH и VL, соответственно. Эти сайты рестрикции использовали для клонирования VH и VL в экспрессионный вектор, содержащий например каркас IgG.

Клетки Е.coli добавляли к 100 мкл воды в пробирку и инкубировали при 95°С в течение 10 минут и затем держали во льду в течение 5 мин. После перемешивания на вортексе, бактериальный дебрис осаждали центрифугированием. Супернатант использовали для амплификации ДНК. Реакции ПЦР подготавливали по отдельности для VH и VL с использованием специфических пар праймеров с сайтами рестрикции BamHI и HpaI для VL и BlpI и MfeI для VH, соответственно. Реакции ПЦР осуществляли с полимеразой AccuPrime Pfx (Invitrogen №12344-024) в соответствии с инструкциями изготовителей. Продукты ПЦР качественно оценивали на 1% агарозном геле. Экспрессионные векторы и продукты ПЦР расщепляли в течение 2 ч при 37°С соответствующими рестрикционными эндонуклеазами, чтобы создать совместимые (липкие) концы, в соответствии с инструкциями поставщиков. Реакцию гидролиза останавливали инкубацией при 70°С в течение 15 минут. Получающиеся фрагменты лигировали в экспрессионный вектор, и конструкциями трансформировали Е.coli или клетки млекопитающих с использованием стандартных способов.

ПРИМЕР 8: Модель рака подкожного ксенотрансплантата:

Противоопухолевые эффекты антител анти-С4.4а будут оцениваться с использованием моделей подкожного ксенотрансплантата у иммунодефицитных мышей. Клетки А431 поддерживаются как адгезионные культуры в DMEM, дополненным 10% FBS (эмбриональная бычья сыворотка). Мыши SCID возраста 6-7 недель будут прививаться подкожно на правой боковой поверхности 1×10е7 клеток в 0,1 мл среды. Моноклональные антитела будут вводить i.p. (интраперитонеально) 3 раза каждые 3 дня в дозе 5-60 мг/кг. Контрольных мышей будут обрабатывать PBS или не имеющими отношения к С4.4а моноклональным антителом. Размер опухоли будет измеряться каждые 2 дня штангенциркулем. Противоопухолевая эффективность будет оцениваться сравнением размера опухоли, обработанной анти-С4.4а антителами с контрольной обработкой.

ПРИМЕР 9: Модель рака подкожного ксенотрансплантата с конъюгатами антитело-лекарственное средство:

Анти-С4.4а антитела могут быть конъюгированы с цитостатическими низкомолекулярными веществами с использованием протоколов, которые известны специалистам в данной области техники (например, Liu et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1996). 93, 8618-8623). Клетки А431 поддерживаются как адгезионные культуры в DMEM, дополненным 10% FBS. Мыши SCID возраста 6-7 недель будут прививаться подкожно на правой боковой поверхности 1×10е7 клеток в 0,1 мл среды. Когда размеры опухоли достигнут 50 мм³, конъюгаты антитело-лекарственное средство будут вводить i.p. 3 раза каждые 3 дня в дозе 1-60 мг/кг. Контрольных мышей будут обрабатывать PBS или не имеющим отношения к С4.4а моноклональным антителом, или свободным неконъюгированным лекарством. Размер опухоли будет измеряться каждые 2 дня со штангенциркулем. Противоопухолевая эффективность будет оцениваться сравнением размера опухоли, обработанной анти-С4.4а антителами с контрольной обработкой.

ПРИМЕР 10: Клонирование, экспрессия и определение количества уровней экспрессии фрагмента Fab антитела для созревания аффинности.

Тяжелую и легкую цепь дикого типа Fab M31-B01 и M20-D02 S-A, несущие 3хНА-tag и гексагистидиновый тэг на C-конце тяжелой цепи, субклонировали в рЕТ28а бактериальный экспрессионный вектор (Novagen/Merck Chemicals Ltd., Nottingham, UK) и трансформировали в клетки Topi OF' (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany). Альтернативно, могут использоваться другие бактериальные экспрессионные векторы (например, векторная система pQE, Qiagen GmbH, Hilden, Germany) и штаммы (например, DH5, Invitrogen GmbH, Hilden, Germany). Варианты генерировали с помощью стандартного сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов и подтверждали с помощью секвенирования ДНК. В частности были модифицированы аминокислотные остатки внутри или в окружении определяющих комплементарность областей внутри тяжелой и/или легкой цепи.

Для экспрессии варианты трансформировали в штамм BL21starDE3 Escherichia coli (Invitrogen, C6010-03), инокулировали в ночную культуру в среде LB, содержащую канамицин (30 мкг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 18 часов. Экспрессионные культуры генерировали инокуляцией культуры 1:20 в свежую среду LB с канамицином (30 мкг/мл). Через 6 часов при 37°С добавляли 1 мМ ИПТГ, чтобы индуцировать экспрессию антитела, и культуры инкубировали в течение дополнительных 18 часов при 30°С.

Для количественного определения уровней экспрессии использовали метод ELISA. Коротко, планшеты МТР (Nunc maxisorp black, 460518) инкубировали с mAb, специфичным к НА epitope tag (Covance, MMS-101P), растворенными в буфере для иммобилизации (Candor Bioscience GmbH, 121125) при 4°С в течение 16 ч, промывали PBST (физиологический раствор, забуренный фосфатом, содержащий: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄, рН 7,4, 0,05% Tween 20), блокировали 100% Smart Block (Candor Bioscience GmbH, 113500) в течение 1 ч при 20°С и промывали снова. Культуры разбавляли в 10% Smart Block в PBST и связывали с планшетами МТР в течение 1 ч при 20°С. После промывки PBST захваченные антитела инкубировали с анти-лямбда антителом, конъюгированным с HRP (Sigma, A5175), и детектировали посредством инкубации планшета с 10 мкМ субстрата красный амплекс (Invitrogen, A12222) в течение 30 минут при 20°С в темноте с последующим измерением флуоресценции. Количественно определенные сигналы проверяли, чтобы они находились в динамическом диапазоне калибровочных серий, построенных с концентрированным культуральным супернатантом экспрессии исходных Fab (M31-B01 или М20 D02 S), что позволяло сделать относительную количественную оценку каждого индивидуального образца экспрессии Fab.

ПРИМЕР 11: Определение активности и межвидовой перекрестной реактивности генерированных вариантов Fab-фрагмента антитела

Чтобы определить активность мутантных вариантов Fab на рекомбинантном растворимом человечком или мышином С4.4а, использовали прямой формат ELISA анализа. Коротко, планшеты МТР (Nunc maxisorp black, 460518) покрывали 2 мкг/мл либо человеческим, либо мышиным С4.4а, растворенным в покрывающем буфере (Candor Bioscience GmbH, 121125), и инкубировали в течение 15 ч при 4°С. После трехкратной промывки PBST, планшеты блокировали 100% Smart Block (Candor Bioscience GmbH, 113500) в течение 1 ч при 20°С, и стадии промывки повторяли. Для связывания Fab фрагментов антитела 20 мкл культуральных супернатантов добавляли к планшетам в течение 1 ч при 20°C с последующей промывкой. В некоторых случаях эффективность промывки увеличивали дополнительной стадией инкубации с 10% Smart Block в PBST в течение 90 мин, с последующей трехкратной промывкой PBST

(«метод В» в Таблице 10b). Связанные исходные Fabs и варианты затем обнаруживали конъюгатом, специфичного к НА-эпитоп tag антитела и HRP (Bethyl, A190-108P). 10 мкМ субстрата амплекс красный (Invitrogen, 12222) добавляли к планшетам, и сигнал флуоресценции обнаруживали, используя обычный флуоресцентный ридер, например, Tecan Ultra. Значения нормированных сигналов аффинности вычисляли как отношения аффинности, скорректированной по фону, и оцифрованных сигналов в соответствующем ELISA: (Signalaffinity - Backgroundaffinity) / (Signalquantity - Backgroundquantity). Получающиеся значения положительно коррелируют, главным образом, с аффинностью, в то время как не нормированные значения коррелируют дополнительно с концентрацией связывания Fab в образце. Следовательно, значения нормированных сигналов аффинности служат очень хорошим руководством для определения вариантов улучшенной аффинности.

ПРИМЕР 12: Единичные и множественные аминокислотные замены

В таблицах 10а и 10b представлено несколько примеров одиночных аминокислотных замен, произведенных в тяжелых и легких цепях M20-D02 S-А. НС D101K, LC A90Q, LC V97A и LC V97G показали самое сильное улучшение относительно нормированных сигналов аффинности на человеческом С4.4а, с соответствующим сигналом на мышином С4.4а, по меньшей мере 1/8 по сравнению с сигналом на человеческом С4.4а (Таблица 10а). Помимо двух замен в CDR3s, НС D31S и НС V51I показали самое сильное улучшение относительно нормированных сигналов аффинности на человеческом С4.4а по сравнению с соответствующим сигналом на мышином С4.4а 30% в случае НС V51I (Таблица 10b).

Таблица 10а. Анализ одиночных аминокислотных замен в CDR3 тяжелых и легких цепей M20-D02 S-A. Приведены нормированные сигналы аффинности к человеческому и мышиному С4.4а: среднее значение и соответствующее стандартное отклонение двух измерений по меньшей мере из четырех.

Таблица 10а:
			человеческий	мышиный
положение	в SEQ ID NO:	положение	в SEQ ID NO:	Наименование	среднее	коэффициент Стьюдента	среднее	коэффициент Стьюдента
9	14	105	34	НС S100aR	0,43	0,13	0,02	0,01
9	14	105	34	НС S100aK	0,45	0,21	0,06	0,01
10	14	106	34	HC A100bR	0,87	0,21	0,01	0,01
10	14	106	34	HC A100bS	0,34	0,17	0,02	0,00
14	14	110	34	HC D101E	0,31	0,24	0,05	0,00
14	14	110	34	НС D101K	1,65	0,48	0,21	0,09

14	14	110	34	HCD101R	0,61	0,18	0,03	0,01
3	26	91	30	LC A90Q	1,41	0,67	0,29	0,15
3	26	91	30	LC A90R	0,94	0,47	0,17	0,04
5	26	93	30	LC D92G	0,64	0,25	0,10	0,04
9	26	97	30	LC N95aW	0,11	0,06	0,00	0,01
12	26	100	30	LC V97A	1,32	0,21	0,52	0,11
12	26	100	30	LC V97G	1,21	0,31	0,30	0,13
			34 - VH 30 - VL	M20-D02 S-A	0,04	0,03	0,01	0,01

Таблица 10b. Анализ одиночных аминокислотных замен в CDR3 тяжелых и легких цепей М20 D02-S-A. Приведены нормированные сигналы аффинности к человеческому и мышиному С4.4а, соответственно; данные числа являются средними значениями из четырех измерений. Различие между методами В и А состоит в дополнительной стадии инкубации в буфере в течение 90 мин в методе В.

Таблица 10b:
			метод А	метод В
положение	в SEQ ID NO:	положение	в SEQ ID NO:	наименование	человеческий	мышиный	человеческий	мышиный
3	6	31	34	HC D31S			0,84	0,04
4	10	51	34	HC V51I	0,52	0,16
9	10	56	34	НС A55G	0,15	0,04
10	10	57	34	НС R56S	0,21	0,06
			34 - VH 30 - VL	M20-D02 S-A	0,15	0,04	0,06	0,00

В таблицах 11а и 11b представлено несколько примеров одиночных аминокислотных замен, произведенных в тяжелых и легких цепях В01. LC W91E, LC W91F, LC W91Y и LC G95bR показали самое сильное улучшение относительно нормированных сигналов аффинности на человеческом С4.4а, с соответствующим сигналом на мышином С4.4а, по меньшей мере 1/8 по сравнению с сигналом на человеческом С4.4а, последние три на 40% и больше (Таблица 11а). Помимо замены в CDR3s НС A32Y показало самое сильное улучшение относительно нормированных сигналов аффинности на человеческом С4.4а (Таблица 11b).

Таблица 11а. Анализ одиночных аминокислотных замен в CDR3 тяжелых и легких цепей М31-В01. Приведены нормированные сигналы аффинности к человеческому и мышиному С4.4а; среднее значение и соответствующее среднеквадратичное отклонение двух измерений по меньшей мере из четырех.

Таблица 11а:
			человеческий	мышиный
положение	в SEQ ID NO:	положение	в SEQ ID NO:	наименование	среднее	коэффициент Стьюдента	среднее	коэффициент Стьюдента
10	13	106	33	НС Y102K	1,49	0,12	0,21	0,02
10	13	106	33	НС Y102W	1,65	0,15	0,13	0,03
4	25	93	29	LC W91E	3,17	0,44	0,40	0,02
4	25	93	29	LC W91F	4,30	0,78	2,53	0,39
4	25	93	29	LC W91Y	4,97	0,91	2,79	0,68
7	25	96	29	LC R94M	1,30	0,20	0,13	0,02
9	25	98	29	LC N95aK	1,11	0,01	0,12	0,04
10	25	99	29	LC G95bR	2,45	0,49	1,01	0,12
11	25	100	29	LC P96A	0,95	0,47	0,32	0,16
			33 - VH 29 - VL	М31-В01	1,11	0,34	0,13	0,07

Таблица 11b. Анализ одиночных аминокислотных замен в CDR3 тяжелых и легких цепей В01. Приведены нормированные сигналы аффинности к человеческому и мышиному С4.4а; данные числа являются средними значениями по меньшей мере из трех.

Таблица 11b:
положение	в SEQ ID NO:	положение	в SEQ ID NO:	наименование	человеческий	мышиный
3	5	31	33	HC N31S	1,53	0,32
4	5	32	33	НС A32Y	2,31	0,01
10	9	57	33	НС T56S	1,58	0,74
11	9	58	33	НС I57T	1,50	0,73
1	17	23	29	LC T24S	0,77	0,23
4	21	55	29	LC K53Q	1,12	0,35
			33 - VH 29 - VL	B01	1,23	0,16

В таблицах 12а и 12b представлено несколько примеров одиночных аминокислотных замен в анти-С4.4а антителах M20-D02 S-A. Некоторые замены проанализированы как одиночная аминокислотная замена (Таблицы 10а и 10b), дополнительно проанализированы только комбинированные замены как часть этого. В то время как не каждая комбинация приведена в Таблицах 12а и 12b, предполагается, что анти-С4.4а антитело может содержать любую комбинацию из модификаций, приведенных в таблицах 10а и 10b.

В таблицах 13а и 13b представлено несколько примеров одиночных аминокислотных замен в анти-С4.4а антителах М31-В01. Некоторые замены были проанализированы как одиночная аминокислотная замена (Таблицы 11а и 11b), дополнительно проанализированы только комбинированные замены как часть этого. В то время как не каждая комбинация приведена в Таблицах 13а и 13b, предполагается, что анти-С4.4а антитело может содержать любую комбинацию из модификаций, приведенных в таблицах 11а и 11b.

Представленные в таблицах 14а и 14b последовательности CDR растянуты к потенциальными сайтам дезамидирования, специфическим к Asn-Gly ("NG") и Asn-Ala ("NA") в M20-D02 S-A и М31-В01, так же как к соответствующим последовательностям некоторых соответствующих вариантов с множественными аминокислотными заменами.

В М20 D02-S-A существуют два потенциальных сайта дезамидирования в CDR, один в CDR-L3 и один в CDR H2. В D02-11, -10, -06, -07 и -13 сайт в CDR-L3 удален путем замены N>S.

В М31-В01 существуют два потенциальных сайта дезамидирования в CDR, один в CDR-L3 и один в CDR-HL. В В01-nn3, -05, -10, -nn4 и -12 сайт в CDR-L3 удален путем замены N>S, в В01-nnl удален путем замены N>K и в BO 1-06 удален путем замены G>R. В В01-02, -09, -10, -06, -nn4, -12, -nn5 и -11 сайт в CDR-H1 удален путем замены N>S. B01-10, -06, -nn4 и -12 не продемонстрировали ни одного из обоих потенциальных сайтов дезамидирования.

Способы, описанные в примерах 10-12, использовали, чтобы генерировать аффинные зрелые антитела посредством одиночных мутаций и комбинациями их одиночных мутаций. Эти способы хорошо подходят для генерации конкурентных антител, полученных из исходного антитела. Антитела вышеупомянутых примеров изображены в таблице 7. Эти примеры обеспечивают дополнительные С4.4а-связывающие антитела или фрагменты, связывающие фрагменты антигена, которые содержат последовательности CDR H1, которые являются по меньшей мере на 77% идентичными CDR Н1 антитела М31 В01, последовательности CDR H2, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными CDR H2 антитела М31 В01, последовательности CDR Н3, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными CDR Н3 антитела М31 В01, последовательности CDR L1, которые являются по меньшей мере на 92% идентичными CDR L1 антитела М31 В01, последовательности CDR L2, которые являются по меньшей мере на 85% идентичными CDR L2 антитела М31 В01, и последовательности CDR L3, которые являются по меньшей мере на 58% идентичными CDR L3 антитела М31 В01 (эти варианты антител конкурируют за связывание с М31 В01), и антитела или фрагменты, связывающие фрагменты антигена, которые содержат последовательности CDR H1, которые являются по меньшей мере на 88% идентичными CDR H1 антитела М20 D02 S-A, последовательности CDR H2, которые являются по меньшей мере на 85% идентичными CDR H2 антитела М20 D02 S-A, последовательности CDR Н3, которые являются по меньшей мере на 73% идентичными CDR Н3 антитела М20 D02 S-A, последовательности CDR L1, которые являются по меньшей мере на 92% идентичными CDR L1 антитела М20 D02 S-A, последовательности CDR L2, которые являются по меньшей мере на 100% идентичными CDR L2 антитела М20 D02 S-A, и последовательности CDR L3, которые являются по меньшей мере на 58% идентичными CDR L3 антитела М20 D02 S-A (эти варианты антител конкурируют за связывание с М20 D02 S-A).

Таблица 15а: Эта таблица суммирует вариации аминокислот CDR 1-3 тяжелых и легких цепей для М20 D02 S-A, как описано в примере 12.

Следующее представляет вышеупомянутые результаты в форме консенсусных последовательностей, соответствующих последовательностям CDR, полученным из М20 D02 S-A. Консенсус для CDR H1 изображен в Таблице 15а (i) (SEQ ID NO:297), для CDR H2 изображен в Таблице 15а (ii) (SEQ ID NO:298), для CDR Н3 изображен в Таблице 15а (iii) (SEQ ID NO:299), для CDR L1 изображен в Таблице 15а (iv) (SEQ ID NO:300), для CDR L2 является идентичным SEQ ID NO:22 (Таблица 15а (v)), для CDR L3 изображен в Таблице 15а (v) (SEQ ID NO:301), соответственно.

Таблица 15а: Эта таблица суммирует вариации аминокислот CDR 1-3 тяжелых и легких цепей для М20 D02 S-A, как описано в примере 12.

(i) CDR HI gVS20 D02 S-A (SEQ ID NO.6)

положение	1	2	3	4	5	%	7	8	9
аминокислота	F	S	D	Y	Q	M	Т	W
вариант			S
консенсус	F	S	D или S	Y	Q	M	T	W

(ii) CDR H2 М20 D02 S-A (SEQ ID NO:10)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

аминокислота

V

S

G

V

S

W

N

G

A

R

Т

Н

Y

A

D

S

V

k

G

R

вариант

I

G

S

консенсус

V

S

G

V или I

S

W

N

G

A или G

R или S

Т

Н

Y

A

D

S

V

k

G

R

(iii) CDR Н3 М20 D02 S-A (SEQ IP NO:14)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

аминокислота

А

K

G

D

Y

L

V

Y

S

A

Y

Y

F

D

S

вариант

K или R

S или R

K, Е или R

Y

консенсус

А

K

G

D

Y

L

V

Y

S, K или R

A, S или R

Y

Y

F

D, K, или R

SorY

(iv) CDR L1 М20 D02 S-A (SEQ ID NO:18)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

аминокислота

S

G

S

S

S

N

V

G

S

N

P

V

N

вариант

консенсус

S

G

S

S

S

N

V или I

G

S

N

P

V

N

(v) CDR L2 М20 D02 S-A (SEQ ID NO:22)

положение	1	2	3	4	5	6	7
аминокислота	R	N	N	Q	R	P	S
вариант
консенсус	R	N	N	Q	R	P	S

(vi) CDR L3 М20 D02 S-A (SEQ ID NO:26)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

аминокислота

C

A

A

W

D

D

R

L

N

G

W

V

вариант

Q или R

G

S

WorS

A или G

консенсус

C

A

A, Q или R

W

D или G

D

R или S

L

N, W или S

G

W

V, A или G

Следующее представляет вышеупомянутые результаты в форме консенсусных последовательностей, соответствующих последовательностям CDR, полученным из М31 В01. Консенсус для CDR H1 изображен в Таблице 15b (i) (SEQ ID NO:302), для CDR H2 изображен в Таблице 15b (ii) (SEQ ID NO:303), для CDR Н3 изображен в Таблице 15b (iii) (SEQ ID NO:304), для CDR L1 изображен в Таблице 15b (iv) (SEQ ID NO:305), для CDR L2 изображен в Таблице 15b (v) (SEQ ID NO:306), для CDR L3 изображен в Таблице 15b (v) (SEQ ID NO:307), соответственно.

Таблица 15b: Эта таблица суммирует вариации аминокислот CDR 1-3 тяжелых и легких цепей для М31 В01 как описано в примере 12.

(i) CDR H1 М31 В01 (SEQ ID NO:5)

положение	1	2	3	4	5	6	7	8	9
аминокислота	F	S	N	A	W	M	S	W	V
вариант			S	Y
консенсус	F	S	N или S	A или Y	W	M	S	W	V

(ii) CDR H2 М31 В01 (SEQ ID NO:9)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

аминокислота

V

S

Y

S

S

S

G

S

Т

1

Y

Y

A

D

S

V

K

G

R

вариант

S

Т

консенсус

V

S

Y

S

S

S

G

S

Т или S

I или Т

Y

Y

A

D

S

V

K

G

R

(iii) CDR Н3 М31 В01 (SEQ ID NO:13)

положение	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
аминокислота	А	R	E	G	L	W	A	F	D	Y
вариант										K, G, W или N

консенсус

A

R

Е

G

L

W

A

F

D

Y, K, G, W или N

(iv) CDR L1 М31 В01 (SEQ ID NO:17)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

аминокислота

Т

G

S

S

S

N

I

G

A

G

Y

V

V

H

вариант

S

консенсус

Т или S

G

S

S

S

N

I

G

A

G

Y

V

V

H

(v) CDR L2 М31 В01 (SEQ ID NO:21)

положение	1	2	3	4	5	6	7
аминокислота	D	N	N	K	R	P	S
вариант				Q
консенсус	D	N	N	K или Q	R	P	S

(vi) CDR L3 М31 В01 (SEQ ID NO:25)

положение

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

аминокислота

С

A

А

W

D

D

R

L

N

G

P

V

вариант

Е, F или Y

S или M

K или S

R

A

консенсус

С

А

A

W, E, F или Y

D

D

R, S или М

L

N, K или S

G или R

P или А

V

ПРИМЕР 13: Определение связывания антитела с однодоменными С4.4а с помощью вестерн-блоттинга

Для характеристики антитело-связывающего домена конструкций М31-В01 и M20-D02 S-A, состоящих из аминокислот 1-85 домена S1 С4.4а и 108-193 домена S2 С4.4 человеческого С4.4а SEQ ID NO:1 соответственно, генерировали как слитый ген C-концевого Fc IgGI человека и 6xHisTag, клонировали в экспрессионный вектор млекопитающих, содержащий промотор CMV5, и экспрессировали транзиентно в клетки НЕК293 6Е стандартными методами. Экспрессирующиеся белки S1 и S2 затем очищали от клеточных супернатантов металлохелатной хроматографией, используя NiNTA колонку Superflow (Qiagen) на 5 мл при 20°C. рН образцов доводили 1 М NaOH до рН 8,0, и затем наносили на колонку, ранее уравновешенную 50 мМ NaH₂PO₄ + 300 мМ NaCl рН 8,0 при 1 мл/мин. Колонку промывали с 15 CV (объемами колонки) равновесного буфера, и связанные белки с HisTag (гистидиновой меткой) элюировали 50 мМ NaH₂PO₄ + 300 мМ NaCl + 250 мМ имидалоза рН 8,0. Элюированные белки дополнительно очищали на Tricorn Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare) посредством эксклюзионной хроматографии.

Для дополнительного анализа полноразмерного (С4.4а SEQ ID NO:1), очищенные гибриды Sl-Fc-6xHisTag и Fc-6xHisTag S2 наносили на различные линии сборного NuPage Bis-Tris 4-12% градиентного геля (Invitrogen, № NP0322Box) и разделяли посредством электрофореза, используя NuPage MES SDS Running Puffer (Invitrogen NP0002) в соответствии с инструкциями производителя.

Гель SDS затем подвергали блоттингу для переноса с геля на мембрану (Invitrogen IB3010-02) с использованием устройства iBIot (Invitrogen). Мембрану блокировали в DPBS рН 7,4+4% сухое молоко + 0,1% Tween 20 в течение 16ч при 4°С, с последующими тремя стадиями промывки в течение 5 минут при 20°С в DPBS рН 7,4+0,1% Tween 20. М31-В01 (5,76 мг/мл) или M20-D02 S-A (3,49 мг/мл) применяли в разбавлениях 1/5000 и 1/2000 соответственно и инкубировали в течение 1,5 ч при 20°С, с последующими двумя стадиями промывки в течение 5 минут при 20°С в DPBS рН 7,4+0,1% Tween 20. Вторичное антитело (Щелочная фосфатаза. Конъюгат козлиных против человеческих IgG, специфичных к Fab; 109-055-097 Jackson ImmunoResearch), инкубировали при разбавлении 1/1000 в течение 1,5ч при 20°С. Последующие три стадии промывки в течение 5 минут при 20°С в DPBS рН 7,4+0,1% Tween 20. Окрашивание осуществляли Sigma Fast BCIP/NBT/1 таблетка в 10 мл воды при 20°С до тех пор, пока полосы не стали видимыми. Реакцию окрашивания останавливали, промывая водой.

Оба антитела М31-В01 и M20-D02 S-A связываются с полноразмерными человеческим и мышиным С4.4а. Кроме того, они связываются с доменом S1 С4.4а, но не с доменом S2 С4.4а, как изображено в Фиг. 6. Связывание может быть обнаружено исключительно в образцах, невосстановленных ДТТ, убедительно указывая на присутствие конформационно зависимого эпитопа, который стабилизируется одним или более дисульфидными мостиками.

ПРИМЕР 14: Исследования антителозависимой клеточной цитотоксичности (исследование АЗКЦ)

Противоопухолевая активность анти-С4.4а IgGs может быть опосредована АЗКЦ. С4.4а-экспрессирующие клетки А549:hC4.4а и исходные клетки, не экспрессирующие С4.4а, инкубировали с 250 нг/мл, с 1000 нг/мл или с 2000 нг/мл человеческого анти-С4.4а или контрольным антителом IgGI (например, антителом против дигоксина). Человеческие PBMCs добавляли к этим клеткам в соотношениях эффектор-мишень 50:1,25:1 и 5:1. Анализ по высвобождению хрома-51 осуществляли, для определения уровня лизиса мишени. Если уровень лизиса в присутствии анти-С4.4а антитела и PBMCs выше, чем уровень (спонтанного) лизиса в присутствии неподходящего антитела или в отсутствии антитела и PBMCs, это указывает, что имеет место АЗКЦ.

ПРИМЕР 15: Антитело-зависимое ингибирование пролиферации - клеточная пролиферация, измеренная посредством xCELLigence System

xCELLigence System (RTCA analyzer CatNo, 05228972001, Roche) отслеживает клеточные события в режиме реального времени без введения меток. Система измеряет электрический импеданс через микроэлектроды с встречно-гребенчатой структурой, собранных на дне E-Plates для тканевых культур. Измерение импеданса предоставляет количественную информацию о биологическом статусе клеток, включая число клеток, жизнеспособность и морфологию. Для определения темпа клеточной пролиферации клетки А549:hC4.4а инкубировали либо с несвязывающими контрольными изотипическими антителами hIgGI, либо с 100 нМ В01-3 (в качестве hIgGI). Сначала в каждую лунку планшета E-Plate 96 добавляли 50 мкл среды клеточной культуры (RPMI (Biochrom FG1640) + 10% FcS (Biochrom #80145) + 1 мкг/мл пуромицина (Sigma 8833)). E-Plate 96 инсталлировали в RTCA MP Station (CatNo. 05331625001, Roche), определяли фоновый импеданс для каждой лунки. Растворы удаляли снова из планшета E-Plate 96 и добавляли в лунки 50 мкл клеточной суспензии (5000 клеток/лунку А549:hC4.4а в среде клеточной культуры). Планшеты повторно инсталлировали и проводили измерения в течение 4 часов при 37°С + 5% CO₂. Планшет E-Plate 96 удаляли снова, и добавляли 100 мкл антител (100 нМ В01-3 или несвязывающие контрольные hIgGI) в среде клеточной культуры. Все образцы измеряли по три раза. После повторной инсталляции планшета E-Plate измерение проводили в течение 92 часов при 37°С + 5% CO₂. Результаты анализировали с помощью встроенного пакета программ. Результаты изображены на Фиг.6. Антитела ВО 1-3 отчетливо повышали пролиферацию клеток по сравнению с несвязывающим контрольным антителом. Это показывает, что антитела изобретения эффективно ингибируют клеточную пролиферацию клеток, экспрессирующих С4.4а.

Таблица 7:
Последовательности антител
Антитело	SEQ ID NO: HCDR1	SEQ ID NO: HCDR2	SEQ ID NO: HCDR3	SEQ ID NO: LCDR1	SEQ ID NO: LCDR2	SEQ ID NO: LCDR3	SEQ ID NO: VH Белок	SEQ ID NO: VL Белок	SEQ ID NO: VH Нуклеотид	SEQ ID NO: VL Нуклеотид
М31-В01	5	9	13	17	21	25	33	29	41	37
M20-D02 S-А	6	10	14	18	22	26	34	30	42	38
M60-G03	7	11	15	19	23	27	35	31	43	39
М36-Н02	8	12	16	20	24	28	36	32	44	40
В01-3	45	46	47	48	49	50	51	52	53	54
В01-5	55	56	57	58	59	60	61	62	63	64
В01-7	65	66	67	68	69	70	71	72	73	74
В01-10	75	76	77	78	79	80	81	82	83	84
В01-12	85	86	87	88	89	90	91	92	93	94
D02-4	95	96	97	98	99	100	101	102	103	104
D02-6	105	106	107	108	109	110	111	112	113	114
D02-7	115	116	117	118	119	120	121	122	123	124
D02-11	125	126	127	128	129	130	131	132	133	134
D02-13	135	136	137	138	139	140	141	142	143	144
B01-nn1	145	146	147	148	149	150	151	152	308	309
B01-nn2	153	154	155	156	157	158	159	160	310	311
B01-nn3	161	162	163	164	165	166	167	168	312	313
B01-nn4	169	170	171	172	173	174	175	176	314	315
B01-nn5	177	178	179	180	181	182	183	184	316	317
В01-2	185	186	187	188	189	190	191	192	318	319
В01-4	193	194	195	196	197	198	199	200	320	321
В01-6	201	202	203	204	205	206	207	208	322	323
В01-8	209	210	211	212	213	214	215	216	324	325
В01-9	217	218	219	220	221	222	223	224	326	327
В01-11	225	226	227	228	229	230	231	232	328	329
В01-12	233	234	235	236	237	238	239	240	330	331
D02-ogl	241	242	243	244	245	246	247	248	332	333
D02-5	249	250	251	252	253	254	255	256	334	335
D02-8	257	258	259	260	261	262	263	264	336	337
D02-9	265	266	267	268	269	270	271	272	338	339
D02-10	273	274	275	276	277	278	279	280	340	341
D02-11	281	282	283	284	285	286	287	288	342	343
D02-12	289	290	291	292	293	294	295	296	344	345

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с доменом S1 С4.4а, которые являются кросс-реактивными по отношению к С4.4а грызунов и интернализуются после связывания с клетками, экспрессирующими С4.4а, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности CDR тяжелой цепи, соответствующие SEQ ID NO: 302 (CDR Н1), SEQ ID NO: 303 (CDR H2) и SEQ ID NO: 304 (CDR Н3), и последовательности CDR легкой цепи, соответствующие SEQ ID NO: 305 (CDR L1), SEQ ID NO: 306 (CDR L2) и SEQ ID NO: 307 (CDR L3).

2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 75-77, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 78-80, или
вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 5, 9 и 13, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 17, 21 и 25, или
вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 45-47, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 48-50, или
вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 55-57, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 58-60, или
вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 65-67, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 68-70, или
вариабельные последовательности CDR тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 85-87, и вариабельные последовательности CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 88-90.

3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, содержащие вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 81, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено SEQ ID NO: 82,
или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 33, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено SEQ ID NO: 29,
или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 51, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено SEQ ID NO: 52,
или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 61, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено SEQ ID NO: 62,
или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 71, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено SEQ ID NO: 72,
или вариабельную последовательность тяжелой цепи, как представлено SEQ ID NO: 91, и вариабельную последовательность легкой цепи, как представлено SEQ ID NO: 92.

4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антитело является IgG антителом.

5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антигенсвязывающий фрагмент является фрагментом scFv, Fab, Fab′ или F(ab′)₂ фрагментом.

6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, которые являются моноклональным антителом или антигенсвязывающим фрагментом.

7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, которые являются человеческим, гуманизированным или химерным антителом или антигенсвязывающим фрагментом.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство для местной доставки цитотоксических веществ, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7.

9. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7.

10. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п. 9.

11. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 9 или экспрессионный вектор по п. 10, где клетка-хозяин экспрессирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7.

12. Клетка-хозяин по п. 11, где указанная клетка является прокариотической или эукариотической клеткой.

13. Способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-7, содержащий культивирование клетки по п. 12 и очищение антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7 в качестве медикамента.

15. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 8 в качестве медикамента.

16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7 в качестве диагностического агента.

17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7 в качестве медикамента для лечения рака.

18. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 8 в качестве медикамента для лечения рака.