Способ консервации биоматериала



Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала
Способ консервации биоматериала

 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2577996:

Общество с ограниченной ответственностью "ИнПрес" (RU)

Изобретение относится к области криобиологии. Предложен способ консервации биоматериала. Способ включает размещение биоматериала в стерильной емкости, удаление воздуха из емкости и ее герметизацию, обработку биоматериала в закрытой среде в емкости со смотровым окном ксеноном и охлаждение биоматериала при постоянном визуальном мониторинге. Обработку биоматериала производят ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм., а последующее охлаждение биоматериала ведут до температуры не более +5°C, но не менее -10°C. Изобретение обеспечивает уменьшение вероятности разрушения биоматериала, в том числе в процессе хранения законсервированного биоматериала. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, точнее к криобиологии, в частности к способам, препаратам и устройствам для криоконсервации и транспортировки биологической ткани.

Из уровня техники известен способ криоконсервации яичниковой ткани, включающий замораживание образца в атмосфере ксенона, причем в носитель с замораживаемым лоскутом яичниковой ткани подается ксенон 95-99,99% степени чистоты под давлением не менее 1,5 атм., носитель герметично укупоривают, не сбрасывая давления ксенона, выдерживают при отрицательной до -20°C температуре и погружают в жидкий азот; при отогревании объекта носитель извлекают из жидкого азота и выдерживают при комнатной температуре 5-15 мин, после чего носитель вскрывают, сбрасывая давление ксенона, закачанного при замораживании, и извлекают препарат [RU 2012103061, МПК C12N5/07, 31.01.2012].

Известен способ криоконсервации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), включающий подготовку смеси культуры в культуральной среде, смешивание культуры клеток в культуральной среде с криопротектором, ступенчатое контролируемое охлаждение и замораживание смеси культуральной среды с криопротектором до температуры хранения и последующее хранение замороженной смеси при низких температурах, при этом в качестве криопротектора для насыщения смеси используют газ ксенон, вводимый до насыщения в подготовленную смесь клеточной культуры ММСК в среде DMEM, находящуюся в открытых криопробирках путем продувания культуральной среды ксеноном при 0°C с дальнейшим охлаждением и образованием первичного монолита культуральной среды с криопротектором, направляемым затем на замораживание до температуры хранения [RU 2433173, МПК C12N 5/00, 01.06.2010].

В качестве прототипа был выбран способ гипотермического сохранения биологической ткани для последующего восстановления в жизнеспособном состоянии, включающий следующие стадии: обработка биологической ткани в закрытой среде клатратобразующей газовой смесью, состоящей из клатратобразующего газа и кислорода, при этом клатратобразующий газ выбирают из группы, включающей гексафторид серы и ксенон, концентрация клатратобразующего газа в клатратобразующей газовой смеси находится в диапазоне от 75 до 95 мольных (массовых) процентов, и при указанной обработке клатратобразующая газовая смесь вытесняет газы, окружающие биологическую ткань, далее при температуре от 1 до 5°C создание давления на биологическую ткань и окружающую ее клатратобразующую газовую смесь величиной до 6,9 атм. для образования клатратов внутри биологической ткани при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна, последующее охлаждение биологической ткани и окружающей ее клатратобразующей газовой смеси до температуры от -20°C [US 8124329, МПК A01N 1/00, 07.05.2009].

Общим недостатком известных способов, за исключением прототипа, является отсутствие операции визуального мониторинга состояния биоматериала в период его пребывания в атмосфере ксенона. К примеру, на этапе клатратообразования требуется знать время, необходимое для насыщения биоматериала. Оно зависит от множества факторов: величина, плотность, структура биоматериала и другие. Однако без возможности визуального мониторинга процесса консервации невозможным является определение наличия клатратов в биоматериале.

В качестве дополнительного недостатка прототипа можно выделить следующее: применение низкой температуры хранения -20°C биоматериала, что повышает вероятность льдообразования в консервируемом объекте, что разрушает биоматериал и определяет невозможность использования способа, описанного в прототипе, с некоторыми из видов биоматериалов, например, в качестве способа консервации крови и кожи человека. Кроме того, недостатком прототипа является обработка биоматериала смесью, содержащей кислород, при этом кислород остается в емкости и способствует разрушению биоматериала как дополнительный окислительный фактор.

Техническая задача заявляемого способа - создание универсального способа консервации биоматериала, уменьшение вероятности разрушения биоматериала, в том числе в процессе хранения законсервированного биоматериала.

Технический результат - возможность применения заявляемого способа, если в качестве объекта консервации использованы ткани человека, уменьшение вероятности разрушения биоматериала, в том числе в процессе хранения законсервированного биоматериала.

Сущность заявляемого способа заключается в следующем. Способ консервации биоматериала включает размещение биоматериала в стерильной емкости, удаление воздуха из емкости и ее последующую герметизацию, обработку биоматериала в закрытой среде в емкости со смотровым окном ксеноном и последующее охлаждение биоматериала при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна. Причем, в отличие от прототипа, обработку биоматериала производят ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм., а последующее охлаждение биоматериала ведут до температуры не более +5°C, но не менее -10°C.

Предпочтительно обработку биоматериала производят в закрытой среде ксеноном 99,999% степенью чистоты.

Удаление воздуха из емкости может быть осуществлено путем продувки емкости ксеноном 90-99,999% степенью чистоты, вакуумированием или аналогичным способом. Продувку емкости ксеноном 90-99,999% степенью чистоты производят путем закачки ксенона 90-99,999% степенью чистоты, создавая давление в емкости, равное 1-2 атм. и последующим выпуском газов из емкости до давления в 0 атм.

Использование ксенона наибольшей степенью чистоты уменьшает вероятность разрушения биоматериала за счет уменьшения вероятности перекисного окисления липидов мембран, что также определяет возможность применения заявляемого способа, если в качестве объекта консервации использованы ткани человека, поскольку выбранный диапазон значений степени чистоты ксенона является оптимальным для них.

Продувка емкости только ксеноном за счет его тяжести позволяет удалить из емкости другие газы, в том числе кислород, которые оказывают окисляющие воздействия на консервируемый биоматериал в процессе в течение долгого времени хранения, повышая вероятность разрушения биоматериала.

Визуальный мониторинг позволяет в процессе консервации отслеживать состояние биоматериала, производить контроль его состояния, отслеживать необходимость произведения корректировок давления и температуры, в пределах заявляемых диапазонов и определить момент окончания консервации, таким образом, в случае необходимости принять меры по сохранению биоматериала.

Таким образом, визуальный мониторинг позволяет отслеживать состояние биоматериала, что снижает вероятность разрушения биоматериала. Возможность определения момента окончания консервации (момента образования клатратов ксенона) не требует применения низких температур при консервации, которые являются гарантией образования клатратов ксенона (а не обычного льда) Отслеживание процесса образования клатратов позволяет управлять процессом биоконсервации, например, путем повышения давления или регулирования температуры охлаждения биоматериала для достижения более быстрого результата биоконсервации в клатратах. Более быстрое отслеживание момента образования клатратов и более быстрая биоконсервация, в том числе за счет повышенного давления, позволяет отследить момент по прекращению подачи ксенона, которые с любой степенью чистоты содержит примеси, ухудшающие качество консервации биоматериала.Охлаждение биоматериала до температуры от -10°C до +5°C уменьшает вероятность разрушения биоматериала, поскольку исключается вероятность образования льда в консервируемом объекте, что определяет возможность применения заявляемого способа, если в качестве объекта консервации использованы ткани человека.

Наличие отличительных существенных признаков позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критерию патентоспособности «новизна».

Осуществление обработки биоматериалом ксеноном при давлении от 7 до 9 атм. и последующее охлаждение до температуры от -10°C до +5°C при постоянном визуальном мониторинге через смотровое окно позволяет достичь синергетического эффекта по уменьшению вероятности разрушения биоматериала, что подтверждается результатами опытов.

Осуществление обработки биоматериалом ксеноном при давлении 7-9 атм. и последующее охлаждение до температуры от -10°C до +5°C позволяет достичь образования клатратов при высоком качестве законсервированного биоматериала.

Однако, осуществление обработки биоматериалом ксеноном при давлении 7-9 атм. и последующее охлаждение до температуры от -10°C до +5°C при постоянном визуальном мониторинге через смотровое окно позволяет достичь образования клатратов с повышением последующего срока хранения законсервированного биоматериала порядка 10 раз (результаты опытов), при этом сохраняется высокое качество законсервированного биоматериала.

Простота заявленного изобретения, решающего давно существующую проблему, свидетельствует о его оригинальности, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критерию «изобретательский уровень».

Заявляемое изобретение может быть выполнено из известных материалов с помощью известных средств, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критерию патентоспособности «промышленная применимость».

Заявляемый способ может быть реализован с помощью контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала.

Фиг. 1 - контейнер для консервации, хранения и транспортировки биоматериала (вид сбоку).

Фиг. 2 - контейнер для консервации, хранения и транспортировки биоматериала (вид сверху).

Контейнер для консервации, хранения и транспортировки биоматериала содержит теплоизолированный корпус 1, например, цилиндрической формы, с патрубком 2, полым основанием 3 и крышкой 4, выполненной с возможностью закрывания с образованием герметичной камеры, аккумулятор 5, микроконтроллер 6, выполненный с возможностью взаимодействия с внешней ЭВМ (не показан на чертежах), и подключенные к микроконтроллеру 6 датчик температуры 7, датчик давления 8 и элемент Пельтье 9.

Элемент Пельтье 9 выполнен с возможностью подключения к внешнему источнику питания через разъем (не показан на чертежах).

Аккумулятор 5, микроконтроллер 6, элемент Пельтье 9 размещены внутри основания 3.

С целью обеспечения герметичности крышка 4 содержит уплотнительное устройство 11 манжетного типа и закрывается с помощью фиксатора 12.

На корпусе 1 с внутренней стороны размещены датчик температуры 7 и датчик давления 8, подключенные к микроконтроллеру 6 через герметичный разъем (не показан на чертежах) в основании 3 корпуса 1. Датчик давления 8 и датчик температуры 7 подключены к аккумулятору 5 и прикреплены к корпусу 1 с помощью двухстороннего скотча типа 3М.

Крышка 4 содержит смотровое окно 10 с металлической оправой 13. Смотровое окно 10 выполнено из органического стекла и предназначено для визуального мониторинга процесса биоконсервации.

Корпус 1 выполнен из стали и с внутренней стороны содержит теплоизолирующий материал 14, в качестве которого использован полиуретан, что обеспечивает теплоизоляцию корпуса 1.

В основание 3 вмонтированы элемент Пельтье 9, датчик давления 8, датчик температуры 7, микроконтроллер 6 и аккумулятор 5.

Микроконтроллер 6 выполнен с возможностью подключения к внешнему источнику питания и ПЭВМ (не показаны на чертежах) с помощью разъема 15, выполненного в виде разъема USB. Аккумулятор 5 выполнен с разъемом 16 для его зарядки. Разъем 15 и разъем 16 расположены с внешней стороны основания 3.

Контейнер имеет патрубок 2 с целью герметичного соединения с трубопроводом для подачи и отвода газов (не обозначен на чертежах). Трубопровод для подачи и отвода газов выполнен с возможностью регулирования количества газа и направления его движения. Трубопроводом для подачи и отвода газов представляет собой фитинг 17 с обратным клапаном 18 и регулятором потока газа 19.

Контейнер размещен на опоре 20.

Принцип работы контейнера заключается в следующем.

В заявляемом контейнере размещают биоматериал, закрывают крышку 4 с образованием герметичной камеры, подключают элемент Пельтье 9 и микроконтроллер 6 к внешнему источнику питания, с помощью трубопровода для подачи и отвода газов контейнера производят подачу ксенона и его откачку, тем самым повышая и понижая давление в контейнере. С помощью разъема 15 микроконтроллер 6 подключают к ПЭВМ. Оператор с помощью ПЭВМ подает сигнал на микроконтроллер 6, который управляя работой элемента Пельтье 9, устанавливает и поддерживает необходимую температуру в герметичной камере.

Аккумулятор 5 питает датчик температуры 7 и датчик давления 8, которые в свою очередь считывают показания температуры и давления и передают их в микроконтроллер 6. ПЭВМ считывает информацию с микроконтроллера 6 и отображает ее для пользователя. С помощью разъема 16 аккумулятор 5 подключают к внешнему источнику питания для подзарядки.

Через смотровое окно 10 осуществляют осмотр биоматериала, размещенного в контейнере, в том числе в процессе консервации, хранения и транспортировки биоматериала.

Ниже описаны примеры осуществления заявляемого способа с различными видами биоматериалов (тканями человека):

Пример 1.

В качестве объекта исследования были выбраны клетки (эритроциты человека). Кровь была взята у здоровых доноров и заготавливалась во флаконы «S-Monovette» объемом 8 мл. с этилендиаминтетрауксусной кислотой. Далее производят отделение от крови эритроцитов с помощью фиколла и стандартного протокола методом афереза. С целью изготовления аликвот исследуемых образцов было взято 250·10-3 мл эритроцитов 2 групп по 10 образцов. В качестве контрольной группы были использованы эритроциты, которые в течение не более 5 суток хранили при температуре +4°C, не используя криопротекторов и консервирующих растворов.

Далее аликвоты помещают в стерильной емкости (контейнер для консервации, хранения и транспортировки) со смотровым окном, производят удаление воздуха из емкости и ее последующую герметизацию. Удаление воздуха из емкости осуществляют путем продувки емкости ксеноном 99,999% степенью чистоты так, что производят закачку ксенона 99,999% степенью чистоты, создавая давление в емкости, равное 1-2 атм. и последующим выпуском газов из емкости до давления в 0 атм.

После удаления газов осуществляют обработку биоматериала в закрытой среде ксеноном различной степенью чистоты до различной величины давления и последующее охлаждение биоматериала до различного значения температур.

1. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 75% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

2. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 90% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

3. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 95% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

4. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 99,999% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

Визуальный мониторинг с помощью смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала позволяет в процессе консервации отслеживать состояние биоматериала, отслеживать необходимостьпроизведения корректировок давления и температуры, с помощью ПЭВМ через микроконтроллер 6 управляя работой датчика температуры 7 и датчика давления 8, в пределах заявляемых диапазонов, а также определить момент клатрирования образца, который сигнализирует о начале консервации и перехода в режим хранения.

Далее оценивают степень разрушенных в ходе консервации эритроцитов после определенного срока хранения, устанавливая данную величину в процентном отношении относительно показателей контрольной группы. Результаты представлены в таблицах 1-4 соответственно.

Количество разрушенных клеток измеряют спектрометрически на спектрометре «Ultrospec 1100» при длине волны 450 нм. Для этого в качестве исходной (нулевой) пробы берут 10*10-3 мл супернатанта с контрольной группы, который разводят в 1 мл натрий-фосфатного буфера, затем измеряют степень поглощения пропущенного света исследуемым раствором и полученную величину устанавливают за ноль. В качестве второй крайней точки измеряют величину поглощения пропущенного света раствором со 100% разрушенными клетками эритроцитов. Для этого берут 250*10-3 мл. отделенных на фиколле эритроцитов и смешивают с 250·10-3 мл дистиллированной воды, далее полученный раствор интенсивно пипетируют и однократно замораживают-размораживают, после чего берут 10·10-3 мл супернатанта и разводят в 1 мл натрий-фосфатного буфера и измеряют степень поглощения пропущенного света исследуемым раствором, устанавливая полученную величину за 100%.

Температура более +5°C при давлении 7-9 атм. является температурой разложения клатратов, что определяет невозможность ее использования с целью консервации биоматериала. Однако консервация биоматериала возможна при температуре +5°C и высоком значении давления (намного выше чем 9 атм.), причем высокое значение давления повышает вероятность разрушения образца.

В случае, когда биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 4-9 атм. и охлаждают биоматериал до температуры от -10°C до +5°C при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна наблюдается наименьшее количество разрушенных эритроцитов. Полученные результаты дополнительно показывают стабильность сохранения эритроцитов при данных температурах с течением времени.

Пример 2.

В качестве объекта исследования были выбраны кожные лоскуты, взятые у здоровых добровольцев с передней брюшной стенки в проекции белой линии живота над уровнем пупка. Эксплантированные кожные лоскуты сразу после изъятия помещают в раствор«DMEM» производства компании Sigma-Aldrich и таким образом хранят до момента совершения манипуляций. Далее производят подготовку кожных лоскутов, таким образом, чтобы каждый исследуемый образец представлял собой лоскут размером 3 мм (ширина) и 3 мм (длина), и помещают полученные образцы в пробирки «Greiner Nalgene Cryo» и заливают их раствором «DMEM» в количестве 0,5 мл, в концентрации 1 к 1 (ткань/раствор).

Пробирки помещают в стерильную емкость (контейнер для консервации, хранения и транспортировки) со смотровым окном 10, далее производят удаление воздуха из емкости и ее последующую герметизацию. Удаление воздуха из емкости осуществляют путем продувки емкости ксеноном 99,999% степенью чистоты так, что производят закачку ксенона 99,999% степенью чистоты, создавая давление в емкости, равное 1-2 атм. и последующим выпуском газов из емкости до давления в 0 атм.

После удаления газов осуществляют обработку биоматериала в закрытой среде ксеноном различной степенью чистоты до различной величины давления и последующее охлаждение биоматериала до различного значения температур.

1. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 75% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

2. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 90% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

3. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 95% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотровогоокна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

4. Биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 99,999% степенью чистоты до величины давления в 2 атм. и охлаждают биоматериал до температуры -30°C (в первом случае); -10°C (во втором случае); -5°C (в третьем случае); +5°C (в четвертом случае) при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала и хранят полученный консервируемый биоматериал, не изменяя температуры -30°C; -10°C; -5°C; +5°C (соответственно). Далее проводят подобную совокупность действий, изменяя значение давления 4 атм.; 6 атм.; 9 атм.; 10 атм.

Визуальный мониторинг с помощью смотрового окна 10 контейнера для консервации, хранения и транспортировки биоматериала позволяет в процессе консервации отслеживать состояние биоматериала, отслеживать необходимость произведения корректировок давления и температуры, с помощью ПЭВМ через микроконтроллер 6 управляя работой датчика температуры 7 и датчика давления 8, в пределах заявляемых диапазонов, а также определить момент клатрирования образца, который сигнализирует о начале консервации и перехода в режим хранения.

После размораживания оценивают жизнеспособность консервированных в клатратах кожных лоскутов по количеству вышедших (экспансированных) прогениторных клеток -фибробластов на 1 мм среза кожного лоскута. Для этого расконсервируемые кожные лоскуты помещают в ростовую среду на основе «DMEM» и 10% фетальной бычьей сыворотки и далее культивируют в СО2 - инкубаторе при температуре 37 С и периодической замене среды для культивирования. Затем определяют количество клеток-фибробластов, которые выходят (экспансируют) из разных участков культивируемого кожного лоскута через равные временные промежутки на 6, 9, 12 и 15 сутки после размораживания. Результаты выражают в количестве клеток и сравнивают с неконсервированным кожным лоскутом (контрольный образец). Результаты представлены в таблицах 5-8 соответственно.

Из полученных результатов видно, что в случае, когда биоматериал обрабатывают в закрытой среде ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 4-9 атм. и охлаждают биоматериал до температуры от -10°C до +5°C при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна, активность экспансии фибробластов во внешнюю среду (после консервации в клатратах) пристандартных методах культивирования консервированных кожных лоскутов в отношении контрольных образцов одинаково активна и отстает лишь на 3 дня по отношению к интактной коже (контрольный образец). Таким образом, консервированные в клатратах кожные лоскуты демонстрируют стабильный клеточный рост и тенденцию к формированию монослоя на 20 сутки культивирования (Рис. 1 - образование монослоя прогениторными клетками кожных лоскутов после консервации в клатратах на 20 сутки культивирования (увеличение 400)).

Также для оценки морфофункционального состояния консервированных и неконсервированных лоскутов была проведена гистология образцов с использованием стандартных методов окраски и были описаны изменения кожных лоскутов, которые возникли в процессе консервации в отличие от контрольного образца:

Рис. 2 - консервированный заявляемым способом кожный лоскут. Окраска гематоксилин - эозин (увеличение 20);

Рис. 3 - контрольный образец. Окраска гематоксилин - эозин (увеличение 10).

При охлаждении биоматериала при давлении менее 4 атм., как показывают результаты опытов (Таблица 1-8) консервированный биоматериал будет иметь плохое качество, в том числе и при хранении, клатраты образуются в меньшем количестве и по всей внутренней и внешней поверхности биоматериала.

При охлаждении биоматериала при давлении более 9 атм., значительно повышается вероятность повреждения биоматериала из-за достаточно высокого давления.

При температуре выше +5°C значительно повышается вероятность разложения клатратов. При температуре ниже -10°C повышается вероятность разрушения биоматериала (из-за образования льда), в том числе в процессе хранения законсервированного биоматериала и в процессе образования клатратов.

Получение клатратов при температуре от -10°C до +5°C и давлении от 4 до менее 7 атм. обусловлено необходимостью соблюдения ряда условий, в том числе небольшой размер биоматериала и его низкая стартовая температура. Таким образом, с целью достижения поставленного технического результата обрабатывают биоматериал в закрытой среде ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм. и охлаждают биоматериал до температуры от -10°C до +5°C при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна.

Таким образом, заявляемое изобретение может быть применено, если в качестве объекта консервации использованы ткани человека, что доказано на клетках крови и кожи человека. Заявляемый способ позволяет достичь уменьшения вероятности разрушения биоматериала в процессе консервации.

1. Способ консервации биоматериала, включающий размещение биоматериала в стерильной емкости, удаление воздуха из емкости и ее последующую герметизацию, обработку биоматериала в закрытой среде в емкости со смотровым окном ксеноном и последующее охлаждение биоматериала при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала посредством смотрового окна, отличающийся тем, что обработку биоматериала производят ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм., а последующее охлаждение биоматериала ведут до температуры не более +5°C, но не менее -10°C.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку биоматериала производят в закрытой среде ксеноном 99,999% степенью чистоты.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что удаление воздуха из емкости осуществляют путем продувки емкости ксеноном 90-99,999% степенью чистоты, а именно производят закачку ксенона 90-99,999% степенью чистоты, создавая давление в емкости, равное 1-2 атм. и последующий выпуск газов из емкости до давления в 0 атм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для генерации цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Описана мышь, имеющая неполный N-концевой домен в гене IL-33.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ имплантации биологического материала в организм с использованием композиции, содержащей коллаген.

Предложен способ получения рекомбинантного полипептида. Способ включает культивирование клеток CHO в среде с общим содержанием аминокислот от около 40 до примерно 100 мМ при условиях, включающих в себя, по крайней мере, один температурный сдвиг и, по крайней мере, один сдвиг pH, и экспрессирование рекомбинантного полипептида.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ идентификации антитела, которое специфически связывается с интересующим антигеном на клеточной поверхности, предусматривающий иммунизацию животного вектором экспрессии, кодирующим антиген клеточной поверхности; приведение в контакт клеток, содержащих на своей поверхности антитела и выделенных из животного, подвергнутого иммунизации, причем антитела связаны с первой сортируемой меткой, с клетками, экспрессирующими антиген, связанный со второй сортируемой меткой; определение специфического связывания с использованием клеточного сортера по наличию первой и второй сортируемой метки в клеточном комплексе; а также идентификацию участков, определяющих комплементарность с антигеном (CDR), у идентифицированного антитела и прививку CDR на каркасную область акцепторного антитела.

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения миобластов из слизистой оболочки полости рта человека. Для этого проводят биопсию слизистой оболочки полости рта человека и обработку биоптата, предусматривающую отмывку, измельчение, ферментативное расщепление ткани десны протеолитическими ферментами.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использована для повышения реперфузии у пациента, имеющего заболевание периферических сосудов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения клеток дефинитивной эндодермы, включающий культивирование стволовых клеток, полученных из партеногенетических клеток в присутствии трихостатина A в условиях отсутствия активина А, где TSA изменяет эпигенетический статус клетки, последующее культивирование стволовых клеток в отсутствие TSA, с получением таким образом клеток дефинитивной эндодермы, где TSA присутствует в концентрации 100 нМ-100 мкМ и где культивирование в присутствии TSA проводят в течение 24-72 часов и культивирование в отсутствие TSA проводят в течение 6-72 часов.

Настоящее изобретение относится к способу получения панкреатических гормонпродуцирующих клеток (варианты). Представленный способ включает культивирование человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток в среде, содержащей (+)-(R)-транс-4-(1-аминоэтил)-N-(4-пиридил)циклогексанкарбоксамид дигидрохлорид; далее культивирование полученных клеток в среде, содержащей (i) 6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1Н-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]никотинонитрил и/или (ii) (2′Z,3′Е)-6-броминдирубин-3′-оксим; далее культивирование полученных клеток в среде, содержащей (i) 6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1Н-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]никотинонитрил и/или (ii) (2′Z,3′E)-6-броминдирубин-3′-оксим и активин; далее образование клеточной массы из полученных клеток и культивирование клеточной массы в суспензионном состоянии в среде; далее культивирование полученных клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, дорсоморфин, 4-[4-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-5-(2-придинил)-1Н-имидазол-2-ил]-бензамид и основной фактор роста фибробластов; далее культивирование полученных клеток.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин 4,5-6,5, фосфолипиды сои 0,04-2,00, высокомолекулярное поверхностно-активное вещество 0,01-1, вода бидистиллированная остальное.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к посмертной патоморфологической диагностике бифуркационной недостаточности сосудов артериального круга большого мозга.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для борьбы с эктопаразитами и эндопаразитами у животных. Заявлена ветеринарная композиция для наружного применения для лечения или предотвращения паразитарных инфекций или инвазий у животного, содержащая: (a) комбинацию четырех активных агентов, содержащую фипронил, регулятор роста насекомых, празиквантел и авермектиновый или милбемициновый активный агент; и (b) фармацевтически приемлемый носитель; где указанная композиция является жидкой композицией для наружного нанесения.

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток крови проводят путем добавления ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовки полученной взвеси к замораживанию путем холодовой адаптации при +4,0°C в течение 10 минут.

Изобретение относится к медицине. Для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска.
Изобретение относится к медицине, в частности к области нормальной анатомии, и может быть использовано для обучения школьников, студентов, аспирантов и врачей. Осуществляют предварительное санирование анатомического объекта и его инъекционное инфильтрирование бальзамирующим раствором.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для хранения препаратов ДНК в жидком виде. Получают композицию, содержащую буферный раствор, включающий 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и воду - остальное.

Изобретение относится к медицине. Способ изготовления и хранения анатомических музейных влажных макропрепаратов включает промывание препарата водой с последующей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий, причем при приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор глиоксаля по объему, превышающему объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз, далее замену реагента производят трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором глиоксаля.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к способу получения 5-(1,5,3-дитиазепан-3-ил)-хинолина (1), заключающемуся во взаимодействии 5-аминохинолина и 1-окса-3,6-дитиациклогептана в среде этанол-хлороформ (1:1, объемные) в присутствии катализатора Sm(NO3)3·6Н2O при мольном соотношении 5-аминохинолин : 1-окса-3,6-дитиациклогептан : Sm(NO3)3·6H2O = 1:1:(0.03-0.07) при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 2.5-3.5 ч.

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН 7,4. Производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка». Со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва. Производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Первый круговой разрез производят на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх. Добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 (DMEM/F12) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%. При этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО2, питательную среду заменяют 2 раза в день. Изобретение позволяет снизить степень загрязнения продукта. 2 ил., 1 пр.
Наверх