Способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови человека

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека. Осуществление изобретения позволяет расширить арсенал указанных способов, а также снизить трудоемкость анализа. 4 пр., 4 табл.

 

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности (ЛНП) сыворотки крови человека, и предназначен для оценки предрасположенности ЛНП подвергаться окислительной модификации, то есть приобретать потенциально атерогенные свойства.

Атеросклероз представляет комплексный процесс, инициированный повреждением артериальной стенки модифицированными окислением ЛНП (Libby P., Aikawa М., Schonbeck U. Cholesterol and atherosclerosis // Biochim Biophys Acta. - 2000. - V. 1529. - P. 299-3094; Deveraj S., Jialal I. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis // Int J Clin Lab Res. - 1996. - V. 26. - P. 178-184; Riccioni G., De Santis A., Cerasa V., et al. Atherosclerotic plaque formation and risk factors // Int J Immunopathol Pharmacol. - 2003. - V. 16. - P. 25-31.), которые затем стимулируют выкрутку моноцитов и их дифференциацию в макрофаги и формированию «пенистых» клеток и утолщению артериальной стенки (Lusis A.J. Atherosclerosis // Nature 2000. - V. 407. - P. 233-241; Holvoet P., Mertens A., Verhamme P., et al. Circulating oxidized LDL is a useful marker for typing patients with coronary artery disease // Arterioscl Thromb Vase Biol. - 2001. - V. 21. - P. 844-848). Следствием этого атеросклеротического процесса является ишемическая болезнь сердца и цереброваскулярные заболевания. В частности, увеличение толщины интима-медиального комплекса каротидных артерий представляет раннюю фазу атеросклеротического процесса (Zureik М., Ducimetiere P., Touboul P.J., et al. Magne С. Common carotid intima-media thickness predicts occurrence of carotid atherosclerotic plaques: longitudinal results from the Aging Vascular Study (EVA) study // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2000. - V. 20. - P. 1622-1629; Heiss G., Sharrett A.R., Barnes R., et al. Carotid atherosclerosis measured by B-mode ultrasound in populations: associations with cardiovascular risk factors in the ARIC Study // Am J Epidemiol. - 1991. - V. 134. - P. 250-256; Salonen R., Salonen J.T. Determinants of carotid intima-media thickness: a population-based ultrasonography study in eastern Finnish men // J Intern Med. - 1991. - V. 229. - P. 225-231) и является общепризнанным маркером атеросклероза, который связан с диагностированным заболеванием коронарных артерий (Davis Р.Н., Dawson J.D., Riley W.A., Lauer R.M. Carotid intimal-medial thickness is related to cardiovascular risk factors measured from childhood through middle age: the Muscatine study // Circulation. - 2001. - V. 104. - P. 2815-2819; Salonen J.T., Salonen R. Ultrasonographically assessed carotid morphology and the risk of coronary heart disease // Arterioscler Thromb. - 1991. - 11. - P. 1245-1249).

Предполагают, что антиоксиданты ингибируют липидную пероксидацию и поэтому могут играть протективную роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний (Diaz M.N., Frei В., Vita J.A., Keaney F.R. Jr. Antioxidants and atherosclerotic heart disease // N Eng J Med. - 1997. - V. 337. - P. 408-416; Riccioni G., Bucciarelli Т., Mancini В., et al. The role of the antioxidant vitamin supplementation in the prevention of cardiovascular diseases // Expert Opin Investig Drugs. - 2007. - V. 16. - P. 25-32) за счет предотвращения формирования раннего атеросклеротического повреждения (Steinberg D., Parthasarathy S., Carew Т.Е., et al. Beyond cholesterol: modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity // N Engl J Med. - 1989. - V. 320. - P. 915-924.). Данные некоторых популяционных исследований показали, что концентрации в пище (Klipsetein-Grobusch К., Launer L.J., Geleijnse J.M., et al. Serum carotenoids and atherosclerosis. The Rotterdam Study // Atherosclerosis. - 2000. - V. 148. - P. 49-56; Klipstein-Grobusch K., den Breeijen J.H., Grobbee D.E., et al. Dietary antioxidants and peripheral artery disease: the Rotterdam study // Am J Epidemiol. - 2001. - V. 154. - P. 145-149) и сыворотке крови антиоксидантов, таких как витамин Е (Gey K.F., Puska P. Plasma vitamin E and A inversely correlated to mortality from ischemic heart disease in cross-cultural epidemiology // Ann N Y Acad Sci. - 1989. - V. 570. - P. 268-282), витамин С (Ramirez J., Flowers N.C. Leukocyte ascorbic acid and its relationship to coronary heart disease in man // Am J Clin Nutr. - 1980. - V. 33. - P. 2079-2087; Nyyssonen K., Parviainen M.T., Salonen R., et al. Vitamin С deficiency and risk of myocardial infarction: prospective study of men in eastern Finland // BMJ. - 1997. - V. 314. - P. 634-638) и каротиноиды (Iribarren С, Folsom A.R., Jacobs D.R. Jr, et al. Association of serum vitamin levels, LDL susceptibility to oxidation, and autoantibodies against MDA-LDL with carotids atherosclerosis. The ARIC Study Investigators Atherosclerosis Risk in Communities // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 1997. - V. 17. - P. 1171-1177; De Wart F.G., Schouten E.G., Stalenhoef A.F., Kok F.J. Serum carotenoids, alpha tocopherols and mortality risk in a prospective study among Dutch elderly // Int J Epidemiol. - 2000. - V. 30. - P. 136-143; Dwyer J.H., Navab M., Dwyer K.M., et al. The oxygenated carotenoid lutein and progression of early atherosclerosis. The Los Angeles Atherosclerosis Study // Circulation. - 2001. - V. 103. - P. 2922-2927), находятся в обратной зависимости с кардиоваскулярной смертностью. Однако другие эпидемиологические исследования не выявили связи между кардиоваскуляными заболеваниями и концентрациями антиоксидантов в сыворотке крови (De Wart F.G., Smilde T.G., Wollerrsheim H. et al. Smoking characteristics, antioxidant vitamins, and carotid artery wall thickness among lifelong smokers // J Clin Epidemiol. - 2000. - V. 53. - P. 707-714; Evans R.V., Shaten B.J., Day B.W., Kuller L.H. Prospective association between lipid soluble antioxidants and coronary heart disease in men. The Multiple Risk Factor Intervention Trial // Am J Epidemiol. - 1998. - V. 147. - P. 180-186); в частности, получены отрицательные результаты клинических испытаний с применением β-каротина (Omenn G.S., Goodman G.E., Thornquist M.D. et al. Effects of a combination of beta carotene and vitamin A on lung cancer and cardiovascular disease // N Engl J Med. - 1996. - V. 334. - P. 1150-1155; Greenberg E.R., Baron J.A., Karagas M.R. et al. Mortality associated with low plasma concentration of beta carotene and the effect of oral supplementation // JAMA. - 1996 - V. 275. - P. 699-703) и витамина E (Heart Protection Study Collaborative Group. MRC/BHF Heart Protection Study of antioxidant vitamin supplementation in 20 536 high-risk individuals: a randomised placebo-controlled trial // Lancet. - 2002. - V. 360. - P. 23-33; Hense H.W., Stender M., Bors W., Keil U. Lack of association between vitamin E and myocardial infarction in a population with high vitamin E levels // Atherosclerosis. - 1993. - V. 103. - P. 21-28) для предотвращения кардиоваскулярных заболеваний.

Возможно, противоречивые результаты о роли антиоксидантов в развитии атеросклеротического процесса связаны с отсутствием информативных, физиологических тест-систем определения, с одной стороны, окисляемости ЛНП in vitro и, с другой стороны, уровней содержания окисленных ЛНП в сыворотке или плазме крови человека in vivo.

В настоящее время окисляемость ЛНП устанавливают измерением трех показателей (конъюгированные диены, липидные пероксиды и тиобарбатуровая кислота-активные субстраты (ТБК-АС) после инициации окисления добавлением ионов меди или инкубацией образцов с перитонеальными макрофагами мыши. Стандартно приготовленные ультрацентрифугированием ЛНП (50 мг/мл по белку) инкубируют с сульфатом меди (2 мкМоль/л) в кюветах при 37°С в термостатируемых спектрофотометрах. Абсорбцию при 234 нм автоматически измеряют с 10-минутными интервалами. «Лаг-время», время до инициации окисления, определяют по методу, описанному Esterbauer и соав. (Esterbauer Н., Striegl Н., Puhl Н., Rotheneder М. Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein // Free Radic. Res. Commun. - 1989. - V. 6. - P. 67-75). После инкубации от 90 до 180 мин с 2 мкМоль/л CuSO₄ реакцию окисления останавливают добавлением этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и содержание липидных пероксидов в ЛНП измеряют колориметрически с использованием специальных коммерческих китов (Determiner lipid peroxides, Kyowa Medics Co, Tokyo) (Ishikawa Т., Suzukawa M., Ito Т., et al. Effect of tea flavonoid supplementation on the susceptibility of low-density lipoprotein to oxidative modification // Am J Clin Nutr. - 1997. - V. 66. - P. 261-266.). Содержание ТБК-АС измеряют с помощью метода Buege и Aust (Buege J.A., Aust S.D. Microsomal lipid peroxidation // Methods Enzymol. - 1978. - V. 52. - P. 302-310.). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) подсчитывают, используя коэффициент экстинкции (1,56×10⁵ моль/см). Для тестирования чувствительности ЛНП к макрофаг-опосредованному окислению, ЛНП (100 мг/л по белку) инкубируют с мышиными перитонеальными макрофагами в среде HamF10. После этого реакцию окисления останавливают добавлением ЭДТА и среда отделяется от макрофагов центрифугированием. Липидные пероксиды и ТБК-АС в среде определяют, как описано выше.

Основными недостатками существующих методов определения окисляемости ЛНП является искусственное окисление с использованием сульфата меди (по данным разных авторов - разные концентрации), что, по мнению авторов заявки, является не физиологичным и «жестким» окислением, требует стадий выделения ЛНП длительным ультрацентрифугированием при низкой температуре, суточного диализа для отделения солей, используемых для создания градиента плотности, для регистрации окисления требуется специальный автоматизированный спектрофотометр для регистрации в ультрафиолетовой области (234 нм) с термостатируемой приставкой для кювет и регистрация в течение минимум 90-180 мин. При определении ТБК-АС требуется стадия кипячение проб в присутствии фосфорной кислоты для образования комплекса, а для экстракции и измерения этих комплексов используется органический растворитель. Использование данных методов возможно в научных исследованиях в условиях специализированных лабораторий.

Поэтому проблема определения окисляемости ЛНП в условиях рутинных исследований для назначения антиоксидантной терапии при атеросклерозе, контроля эффективности терапии, а в фармакологии - поиски эффективных антиоксидантов, остается весьма актуальной.

Ранее была разработана тест-система определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности (ММ-ЛНП) для ранней диагностики субклинического атеросклероза (Шойбонов Б.Б. Способ определения минимально модифицированных ЛПНП в сыворотке или плазме крови человека // Патент РФ №2501013 от 10.12.2013 г. ). Суть метода заключается в том, что ММ-ЛНП агрегируют из сыворотки или плазмы крови путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон с мол. массой 12600 (ПВП-12600), при конечной концентрации ПВП от 11,3% до 14,2% в пробе. После инкубации в течение 10 мин измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность и при величине разности более 10 БД констатируют атерогенность крови у обследуемого человека за счет повышенного уровня ММ-ЛПНП. Метод был апробирован при ранней диагностике субклинического атеросклероза. Проведенные исследования уровня содержания ММ-ЛНП в сыворотке крови у 800 относительно здоровых лиц, проходящих плановый медицинский осмотр, выявили у 38% (304 человек) повышенный уровень данного атерогенного ЛНП. Для инструментального подтверждения наличия атеросклероза были проведены исследования импульсно-волновым доплеровским сканированием сонных артерий у относительно здоровых людей с повышенным уровнем ММ-ЛПНП. В результате ультразвукового исследования у 57% было выявлено утолщение интимо-медиального слоя сонных артерий и подтвержден инструментально диагноз субклинический атеросклероз брахиоцефальных артерий. У остальных (43%) данные параметры оставались в пределах нормальных величин и свидетельствовали о том, что повышение уровня ММ-ЛПНП предшествует морфологическим изменениям (утолщению) интима-медиального слоя в обследованных артериях.

Дальнейшие исследования ММ-ЛНП у больных с клиническим атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами, обнаружили следующий факт. Исследования динамики агрегации ММ-ЛНП во времени показали интересные результаты, которые свидетельствовали о том, что после 10-минутной инкубации в некоторых пробах крови больных еще продолжалась реакция агрегации, то есть повышалась оптическая плотность пробы еще в течение 10 мин на уровне 10-30% от данных, полученных после первой 10 мин инкубации. Дальнейшая инкубация вплоть до 120 мин во всех пробах выявила слабое повышение оптической плотности за счет незначительной агрегации нативных ЛНП. Данный факт нами был интерпретирован как разная степень окисляемости ЛНП и стал основой для разработки принципиально нового способа оценки резистентности к окислению ЛНП.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов экспресс-определения резистентности к окислению ЛНП сыворотки крови человека для рутинных исследований.

Поставленная задача решается путем добавления к сыворотке крови человека буферного раствора, содержащего поливинилпирролидон с молекулярной массой 12600 (ПВП-12600), определения степени помутнения турбидиметрическим методом и расчета резистентности к окислению ЛНП по приведенной ниже формуле.

Техническим результатом, получаемым при реализации изобретения, является расширение арсенала методов для экспресс-определения резистентности к окислению ЛНП сыворотки крови человека с целью индивидуальной коррекции антиоксидантного статуса, а также контроля эффективности терапии атеросклероза.

Этот результат достигается тем, что экспресс-определение резистентности к окислению ЛПНП сыворотки крови человека проводят путем обработки сыворотки крови человека 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-НС1-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка: ПВП (1:6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы, констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.

Способ осуществляют следующим образом.

Буфер-1 для агрегации мЛНП готовят растворением 15 г ПВП-12600 в 100 мл 0,01М Трис-HCl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Буфер-К, в отличие от Буфера-1, не содержит ПВП. К Буферу-1 добавляют сыворотку крови, тщательно перемешивают, инкубируют, измеряют степень помутнения через 10 мин и 20 мин фотометрически и рассчитывают содержание агрегированных ЛНП по формуле:

где:

[ЛНП_АГР] - содержания агрегированных ЛНП в опытной пробе в единицах (ЕД);

Е_О - оптическая плотность опытной пробы, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-1, при длине волны 450 нм, ед. опт. пл.;

Е_К - оптическая плотность контрольной пробы при длине волны 450 нм, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К, ед. опт. пл.;

100 - коэффициент перерасчета в единицы ЕД.

Пример 1. Динамика изменения уровня агрегированных ЛНП во времени в среде 12,8% ПВП-12600 и 14,3% сыворотки больных с атеросклерозом каротидных артерий. К 12,5 мкл сыворотки крови больных атеросклерозом каротидных артерий добавляют 75 мкл Буфера-1, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 120 мин в 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшетах. Агрегация ммЛНП измеряют спектрофотометрически при длине волны 450 нм с интервалами 10, 20, 60 и 120 мин и по формуле 1 рассчитывают содержание агрегированных ЛНП. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, при добавлении к сыворотке 15% ПВП-12600 во всех пробах резко наблюдается агрегация минимально модифицированных ЛНП и к 10 минуте стабилизируется оптическая плотность, измеряемая при длине волны 450 нм. До 20 минуты инкубации наблюдается две тенденции:

1) в сыворотке №1 практически оптическая плотность не меняется после 10 мин до 20 минуты, а с 20 минуты до 120 минуты во всех пробах наблюдается незначительное плавное линейное повышение оптической плотности за счет дальнейшей агрегации ЛНП;

2) сыворотки №3, 6, 8 с 10 минуты инкубации до 20 минуты продолжается повышение мутности на уровне 10-30% от уровня 10 минутной величины оптической плотности.

После 20 минут инкубации наблюдается незначительный прирост уровня агрегированных ЛНП за 1 мин. Тенденция к стабильному незначительному (менее 20 раз) росту уровня содержания агрегированных ЛНП в интервале от 20 до 120 мин по сравнению с динамикой изменений уровней агрегированных ЛНП в интервале от 10 мин до 20 мин позволяет нам рассматривать как неспецифическую фазу активного окисления нативных ЛНП.

Таким образом, наиболее информативной стадией исследования окисления «предрасположенных», «предмодифицированных» ЛНП является интервал времени от 10 мин до 20 мин. Именно в этом интервале времени наблюдается «Лаг»-фаза окисления, которая описана при окислении ЛНП ионами меди.

Для исследования механизма агрегации ЛНП, который наблюдается в интервале от 10 до 20 мин инкубации сыворотки крови больных атеросклерозом каротидных артерий в среде ПВП-12600, были проведены следующие эксперименты.

Пример 2. Подбор оптимальной концентрации 15% ПВП-12600 для агрегации нативных ЛНП. Ранее при разработке метода определения минимально модифицированных липопротеинов было показано, что добавление к пулированной сыворотке крови здоровых доноров возрастающих концентрации буфера, содержащего 15% ПВП 12600±2700, приводит к агрегации нативных липопротеинов низкой плотности при конечной концентрации ПВП в системе менее 12,0%. При дальнейшем увеличении концентрации ПВП до 12,9% в системе наблюдается диссоциация образовавшихся агрегатов нативных липопротеинов низкой плотности и характеризуется снижением мутности раствора сыворотки крови здоровых людей. При концентрации ПВП от 12,9% и до 14,2% в системе оптическая плотность раствора сыворотки практически не меняется. Полученные данные свидетельствуют о том, что при концентрации ПВП 12600±2700 выше 12,9% в системе (от 12,9% до 14%) в пулированной сыворотке крови больных с субклиническим атеросклерозом каротидных артерий наблюдается агрегация минимально модифицированных ЛНП.

Для экспериментального обоснования физиологичности способа определения резистентности к окислению ЛНП нами использованы данные об агрегации нативных ЛНП в среде, содержащей ПВП-12600 менее 12% у относительно здоровых людей. Для этого проведены исследования влияния концентрации ПВП (менее 12%) на агрегацию нативных ЛНП в пулированной сыворотке крови 10 относительно здоровых людей. Полученные данные представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, с увеличением концентрации ПВП-12600 в среде наблюдается агрегация нативных ЛНП, причем максимальная агрегация наблюдается при концентрации 6,8% ПВП-12600. Дальнейшее увеличение приводит к снижению агрегации нативных ЛНП. Данный факт нами объясняется тем, что при концентрации ПВП-12600, равной 6,8%, окисляются предрасположенные (предмодифицированные) ЛНП. При дальнейшем увеличении концентрации ПВП-12600 в среде наблюдается их растворение. Для подтверждения данного предположения нами проведены следующие эксперименты.

Пример 3. Влияние природного антиоксиданта, глутатиона, на агрегацию нативных ЛНП в условиях 6,8% ПВП-12600. Д ля исследования молекулярных механизмов агрегации ЛНП в условиях 6,8% ПВП-12600, нами использован естественный физиологический антиоксидант, глутатион, с исходной концентрацией 0,1 Моль/л. Для определения дозо-зависимого эффекта ингибирования агрегации ЛНП использовали прогрессивное разведение от 45 до 0,69 мМоль/л в 9-ти луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 (Labsystem, Финляндия). Ставили 2 контроля: 1 - контроль системы на агрегацию ЛНП (150 мкл 15% ПВП-12600 + 150 мкл 0,15М NaCl + 35 мкл пулированной сыворотки от 10 здоровых доноров); 2 - контроль на бланк пулированной сыворотки (300 мкл NaCl + 35 мкл пулированной сыворотки). Пробы тщательно перемешивали и сразу измеряли экстинкцию при длине волны 450 нм в течение 20 мин. Рассчитывали процент агрегации ЛНП относительно контроля системы. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, глутатион начинает ингибировать агрегацию ЛНП, начиная с концентрации 2,75 мМоль/л и при физиологических концентрациях дозо-зависимо от 5,5 до 11 мМоль/л полностью подавляет агрегацию ЛНП.

Таким образом, исследования влияния глутатиона на агрегацию ЛНП в условиях 6,8% ПВП-12600, свидетельствуют о том, что агрегация обусловлена окислением нативных ЛНП. В условиях 6,8% ПВП не наблюдается спонтанная агрегация минимально модифицированных ЛНП, которую мы наблюдаем при концентрации ПВП-12600 более 12% сразу после добавления сыворотки крови.

Для подтверждения информативности и физиологичности тест-системы исследования агрегации ЛНП вследствие окисления под действием ПВП-12600 при концентрации 6,8% в среде, проведены исследования влияния тиосульфата натрия на окисление ЛНП. Препарат тиосульфата натрия ранее был использован как эффективный анти-атеросклеротический препарат при экспериментальном атеросклерозе на животных (Окуневич И.В., Хныченко Л.К., Сапронов Н.С. Средство, обладающее гиполипидемической и антиатеросклеротической активностью // Патент РФ №2372923 от 20.11.2009 г.).

Пример 4. Влияние тиосульфата натрия на агрегацию нативных ЛНП в условиях 6,8% ПВП-12600

Для экспериментов использовали аптечный препарат тиосульфата натрия (TC-Na) с концентрацией 300 мг/мл. Предварительно разводили до концентрации 0,1 моль/л. В лунки 9-канальной кюветы вносили от 10 до 150 мкл 0,1 М TC-Na, объем доводили до 150 мкл раствором 0,15 М NaCl. Затем вносили по 30 мкл пулированной сыворотки от 10 здоровых доноров и 150 мкл 15% ПВП-12600. Тщательно перемешивали и инкубировали в течение 20 мин и 18 часов при комнатной температуре. Контроли ставили, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, при концентрации TC-Na от 3,0 до 9,1 мМоль/л и инкубации в течение 20 мин наблюдается ингибирование на уровне 10%, увеличение концентрации TC-Na от 15,2 до 45,5 мМоль/л вызывает дозо-зависимый эффект ингибирования агрегации ЛНП. Продолжение инкубации в течение 18 часов при комнатной температуре выявило двойственный эффект влияния TC-Na на агрегацию ЛНП. При концентрации TC-Na от 3,0 до 9,1 мМоль/л наблюдается эффект усиления агрегации до 147%, дальнейшее увеличение концентрации до 15,2 мМоль/л приводит к снижению агрегации ЛНП. Начиная с концентрации 22,7 до 45,5 мМоль/л TC-Na, сохраняется ингибирующий эффект, подобно 20-минутной инкубации.

Таким образом, исследование влияния TC-Na показали двойственный эффект влияния на агрегацию ЛНП в среде 6,8% ПВП-12600 в зависимости от времени инкубации. С одной стороны, ингибирование агрегации ЛНП препаратом TC-Na может иметь положительный эффект при терапии атеросклероза. С другой стороны, усиление агрегации при низких концентрациях TC-Na может вызывать противоположный, проатерогенный эффект. Полученный данные согласуются с противоречивыми результатами, полученными при терапии атеросклероза антиоксидантами и требуют индивидуального подбора терапевтической дозы антиоксиданта с учетом резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности.

Таким образом, заявляемый способ является информативным и диагностически значимым, так как позволяет оценить предрасположенность ЛНП подвергаться окислительной модификации, то есть приобретать потенциально атерогенные свойства, поскольку известно, что окислительная модификация ЛНП играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что перед исследованием резистентности к окислению ЛНП не требуется стадия выделения ЛНП с использованием ультрацентрифугирования, является, быстрым, физиологичным, позволяет на индивидуальных сыворотках проводить предварительную оценку эффективности конкретных антиоксидантов, не требует дополнительных затрат при внедрении, для измерения агрегированных ЛНП адаптирован фотометр для иммуноферментного анализа, имеющийся во всех в клинико-диагностических лабораториях.

Способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы, констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.