Способ культивирования лимона in vitro



Способ культивирования лимона in vitro
Способ культивирования лимона in vitro
Способ культивирования лимона in vitro
Способ культивирования лимона in vitro

 


Владельцы патента RU 2580033:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л. Изобретение позволяет сохранять в коллекции in vitro ценные генотипы цитрусовых культур с высокой степенью генетической стабильности и однородности растительного материала. 3 табл.

 

Способ относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к культуре тканей в условиях in vitro и может быть использован для микроразмножения и создания in vitro коллекций многолетних древесных культур.

Известно, что культивирование in vitro вегетативных органов древесных плодовых культур сопряжено с рядом трудностей, таких как сложность получения стерильной культуры, низкие коэффициенты размножения и укоренения, низкий уровень жизнеспособности микропобегов. Повышение эффективности размножения и надежности сохранения in vitro сортов коллекции цитрусовых возможно путем оптимизации состава питательных сред и использования техники микропрививки.

Аналогичные способы культивирования цитрусовых in vitro выполнены на сеянцах (Barlaas, Skene, 1982; Marin, Duran Villa, 1999; Chaturvedi et al., 2002; Avenido et al., 2004; Jajoo, 2009; Benabdesselam, 2011; Chen, 2012 и др.). Однако при культивировании сеянцев сортовые особенности утрачиваются и растения зацветают через 5-10 и более лет. Альтернативным путем надежного сохранения сортов цитрусовых in vitro является микропрививка, которая впервые была разработана L. Navarro для культивирования цитрусовых in vitro в 1980-х годах, затем эта техника модифицировалась другими авторами (Naz et al., 2007; Sharma et al., 2007; Hančević et al., 2009). Однако предлагаемая ими техника является трудоемкой и характеризуется высоким риском возникновения вторичной инфекции, так как для культивирования микропривитых растений используются жидкая питательная среда с перфорированными мостиками из фильтровальной бумаги.

Преимущество разработанного нами способа культивирования лимона in vitro состоит в том, что он позволяет сохранять и размножать генотипы с высокой степенью надежности и генетической стабильности за счет модификации техники микропрививки и состава питательной среды.

Научно-техническая задача, на решение которой направлено изобретение - оптимизировать протокол культивирования лимона in vitro для микроразмножения и сохранения ценных генотипов и создания депонированной коллекции цитрусовых культур. Технический результат заключается в увеличении коэффициента размножения и приживаемости микропрививки.

Поставленная задача достигается культивированием микропобегов в 3 этапа:

- культивирование стерильных пазушных почек от молодых побегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, при стандартных условиях - световом режиме 16/8, температуре +22±2°С;

- выращивание подвоев in vitro - стерильные семена помещают на среду WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%;

- прививка меристем с 2-3 примордиями от стерильных микропобегов на подвой - 3-4-х недельные сеянцы, выращенные in vitro с последующим культивированием на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Сущность заявленного изобретения иллюстрируется следующими материалами:

На фиг. 1 изображены введенные в культуру пазушные почки лимона через 8 дней (слева) и их пролиферация через 30 дней (справа).

На фиг. 2 изображены подвои - 5-недельные сеянцы для микропрививки. На фиг. 3 изображены микропривитые растения лимона Новоафонский на лимон Мейера через 20 (слева), через 40 (справа) дней после прививки.

На фиг. 3 изображены микропривитые растения лимона Новоафонский на лимон Мейера через 20 (слева), через 40 (справа) дней после прививки.

На первом этапе для введения в культуру пазушных почек молодые побеги обрабатывают 10% раствором Белизны 15 мин, затем 0,3% раствором Велтолен 25 мин и после трехкратной промывки стерильной дистиллированной водой помещают на среду почка с сегментом побега длиной 0,7-1,0 см.

Дальнейшее культивирование полученных из почек микропобегов цитрусовых осуществляется путем микропрививки. Подвой - сеянцы лимона Мейера (Citrus х meyeri Meyer) - получают следующим путем: стерильные семена очищают от семенных оболочек и помещают на среду WPM с добавлением БАП 1, ГК 2 мг/л, при стандартных световом и температурном режимах.

Прививку делают на подвой - 3-5-недельные сеянцы. В качестве привоя используют стерильные меристемы с 2-3 примордиями, размером 0,4-0,6 мм. Меристемы получают от деревьев открытого грунта (in vivo) и от введенных в стерильную культуру пазушных почек (in vitro). Прививку делают следующим способом: отрезают верхнюю часть сеянца, оставляя эпикотиль длиной 1,3-1,5 см. В месте среза делают L-образный надрез коры, под которую помещают меристему привоя. Корневую систему сеянца оставляют длиной 1-1,5 см. Далее микропривитые растения культивируют на свежей питательной среде.

Пример культивирования цитрусовых in vitro показан на 4 генотипах лимона. Первый этап - введение пазушных почек в стерильную культуру путем обработки побегов Белизной 10, 15% (10 мин) с последующей обработкой раствором Велтолен 0,2, 0,3, 0,4% (25 мин). Результат введения в стерильную культуру устанавливался по количеству стерильных жизнеспособных эксплантов (таблица 1).

Лучшим вариантом стерилизации оказался вариант III, где количество стерильных жизнеспособных почек составило 29,7%. В других вариантах этот показатель был ниже по причине контаминации либо некротических поражений тканей дезинфицирующими веществами.

Второй этап - выращивание подвоев in vitro. На этом этапе выявлена оптимальная комбинация регуляторов роста в среде WPM, позволяющая получать коэффициент размножения сеянцев до 4,2 (таблица 2, фиг. 2).

Третий этап - микропрививка сортов на сеянцы лимона Мейера (фиг. 3). Изучаемый показатель - процент приживаемости меристем в прививке - составил 65,8-81,6% при использовании in vitro культивируемых побегов в качестве источника меристем, в 2-3 превысив приживаемость in vivo меристем (таблица 3). Все различия достоверны (Fф≥F05) и существенны (HCP05=8,33). В аналогичных работах по процент успешных микропрививок колеблется от 30 до 75% (Naz et al., 2007; Sharma et al., 2007; Hančević et al., 2009). Микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Предложенный способ культивирования лимона in vitro позволяет обеспечить надежное сохранение генотипов и увеличить коэффициент размножения в 1,6 раза и приживаемость микропрививки на 6,6-35,1% по сравнению с аналогичными работами в этой области.

В целом заявленный способ дает возможность сохранять в коллекции in vitro ценные генотипы лимона с высокой степенью генетической стабильности и однородности растительного материала.

Способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов лапчатки белой (Potentilla alba L.) в условиях гидропоники, включающий использование черенков материнских растений, размножение и выращивание, где в качестве эксплантов используются черенки материнских растений, которые высаживают на питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП для введения в культуру ткани, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают для микроразмножения на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП+0,25 мкМ ИМК+0,05 мкМ ГК, укореняют побеги на агаризированной среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК, затем растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, закрепляют в кассетах и помещают в гидропонную установку на 90 суток для адаптации и выращивания растительного лекарственного сырья на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1/4 состава макросолей, 1/4 состава микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого, при температуре 24-26°C, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности картофелеводства. В способе выращивают мини-клубни оздоровленного картофеля в защищенном грунте, полученные от пробирочных растений.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйстве. Изобретение представляет собой способ подготовки микропобегов in vitro ясеня, осины, ивы для последующего укоренения в условиях ex vitro, включающий перенос растений после стадии мультипликации на питательную среду WPM для элонгации, с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л и никотиновой кислоты 0,5 мг/л, где в среду для элонгации добавляют глутамин в концентрации 0,5 или 1,0 ммоль/л, при этом культивирование растений осуществляется при повышенной освещенности - от 5 до 8 тыс.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйству. Изобретение представляет собой способ криоконсервации пазушных почек in vitro растений осины, заключающийся в изоляции пазушных почек, предварительном их обезвоживании в средах, содержащих осмолитики, переносе почек в криопробирки, криоконсервации криопробирок с почками в жидком азоте, оттаивании почек и посткриогенной регенерации из них растений, отличающийся тем, что на этапе обезвоживания перед быстрым замораживанием сначала почки помещают в раствор I, содержащий питательную среду и осмолитики (WPM с добавлением к сахарозе (0,2-0,5М) глицерола (1,7-2,5М)), затем почки переносят в раствор II, содержащий питательную среду и осмолитики (WPM, сахароза (0,2-0,5М), глицерол (2,5-3,5М), этиленгликоль (1-1,5М), диметилсульфоксид (1,5-2М)), с последующим переносом в жидкость для замораживания (WPM, содержащая сахарозу (0,2-0,5М), глицерол (3,5-4М), этиленгликоль (1,5-2,5М), диметилсульфоксид (1,5-2М)).

Изобретение относится к области биотехнологии и растениеводства. Изобретение представляет собой способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.), заключающийся в том, что растения помещают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, модифицированную 6% сахарозы, 10-12 г/л агар-агара, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-0,5 мг/л паклобутразола, 6 мМ глюконата кальция, а на ее поверхность выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра, закрывают пробирки и переносят их в условия при температуре от 1 до 10°С, 6-часовом световом дне и освещенности 0,5-0,8 клк.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения пеперомии in vitro, включающий отделение эксплантов, стерилизацию, посадку на питательную среду Мурасиге-Скуга, микроразмножение путем отделения побегов от эксплантов, их укоренение на питательной среде Мурасиге-Скуга и дальнейшее укоренение в грунте, где при микроразмножении экспланты высаживают на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга, дополненную 10 г/л глюкозы и 0,1 мг/л Рибав-Экстра и культивируют в течение 4 недель, затем сформировавшиеся растения-регенераты с корнями замачивают в растворе 3 мг/л индолилуксусной кислоты в течение 15 минут и укореняют в условиях ex vitro в грунте, состоящем из смеси торфа и песка 1:1.
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения хризантемы, включающий микрочеренкование растительных побегов, стерилизацию растительных эксплантов с последующей их высадкой на безгормональную питательную среду Мурасига и Скуга, размножение микроклонов, укоренение вновь образованных in vitro побегов и адаптацию растений-регенерантов к почвенным условиям, где на этапе стерилизации растительных эксплантов используют обработку микрочеренков водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного в концентрации 0,03% в течение 10 мин, без последующего промывания стерильной дистиллированной водой, на этапе микроразмножения проводят обработку микрочеренков раствором католита в течение 3 мин, на этапе адаптации почвенный субстрат обрабатывают водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного в концентрации 0,03%, а микрорастения обрабатывают раствором католита в течение 10 мин.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения дигаплоидных растений ячменя из культивируемых микроспор in vitro, включающий: - выращивание растений-доноров при пониженной температуре воздуха 15-20°C, световом режиме: 16 ч день/8 ч ночь, влажности воздуха 60-70%, интенсивности освещения 10000-15000 люкс, с проведением фитосанитарной обработки, при этом выращивание растений-доноров осуществляют до стадии от открытия влагалища флагового листа, когда соцветие находится внутри флагового листа, - стрессовую обработку колосьев при 4°C, в пробирках с бедной средой, содержащей KCl - 1,5 г/л, MgSO4×7H2O - 0,25 г/л, CaCl2×2Н2О - 0,1 г/л, маннитол - 60 г/л, калий-фосфатный буфер - 1 мл/л, pH 7,0, в течение 7 дней для переключения из гаметофитного пути развития микроспоры на спорофитный путь, - выделение микроспор из колосков в стерильных условиях, - культивирование выделенных микроспор на модифицированной среде для индукции эмбриогенеза, включающей 6% мальтозу, 10 завязей на 1,5 мл культуры и регуляторы роста растений в количестве 1 мг/л 2,4-Д, 0,2 мг/л зеатина, причем добавление вышеуказанных компонентов осуществляется перед добавлением микроспор, - регенерацию растений из эмбриоидов путем культивирования на твердой питательной среде Мурашига и Скуга без добавления регуляторов роста растений, - обработку гаплоидных растений ячменя антимитотическим препаратом N-диацетил-N-(β,γ-эпоксипропил) аминоколхицином для удвоения хромосом и получения дигаплоидых растений.
Изобретение относится к области декоративного садоводства. Изобретение представляет собой способ размножения растений фритиллярий методом in vitro, включающий стерилизацию эксплантов, разделение их на части, посадку на питательную среду Данстена и Шорта, отделение микролуковиц от эксплантов, их укоренение и адаптацию, отличающийся тем, что после разделения эксплантов их помещают на питательную среду Данстена и Шорта, содержащую 6 г/л агара с добавлением - 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ α-нафтилуксусной кислоты, после культивирования на данной среде микролуковицы размножают на безгормональной среде Данстена и Шорта в течение 4 недель при освещении 3 клк 16 ч свет/ 8 ч темнота при температуре 24°C, укореняют и адаптируют в контейнерах со сфагновым мхом, в темноте, при температуре 7°C, в течение 2 месяцев. Изобретение позволяет получить высокий выход посадочного материала представителей рода фритиллярия при минимальных затратах регуляторов роста. 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень). Изобретение позволяет повысить сохранность качественных характеристик культуры in vitro Лимонника китайского и Березы повислой. 3 табл.
Наверх