Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода serratia



Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода serratia
Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода serratia
Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода serratia
Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода serratia
Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода serratia

 


Владельцы патента RU 2580242:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение касается средства, обладающего противовирусной активностью относительно вирусов гриппа, осповакцины (ВОВ), вируса оспы мышей (ВОМ) и вируса герпеса 2-го типа (ВПГ-2) Представлено средство на основе нуклеазы бактерий рода Serratia. В качестве источника нуклеазы бактерий рода Serratia оно содержит очищенную культуральную жидкость штамма бактерий Serratia plymuthica, имеющую РНКазную активность от 109,0 до 926 ед/мл и содержание белка от 3,6 до 13,5 мг/мл. В качестве штамма бактерий Serratia plymuthica может быть использован штамм бактерий Serratia plymuthica Dg-91, или Dg-98, или Bp-868, или Az-372, депонированные в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационными номерами B-1288, или B-1297, или B-1296, или B-1285 соответственно. Изобретение может быть использовано в медицине, микробиологической промышленности. 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 22 пр.

 

Изобретение относится к новому средству, обладающему противовирусной активностью относительно вирусов гриппа, осповакцины (ВОВ), вируса оспы мышей (ВОМ) и вируса герпеса 2-го типа (ВПГ-2) и может быть использовано в медицине, микробиологической промышленности и биотехнологии. Указанное противовирусное средство представляет собой культуральную жидкость (КЖ) штаммов Serratia plymuthica Вр-868, или штамма Serratia plymuthica Dg-91, или штамма Serratia plymuthica Dg-98, или Serratia plymuthica Az-372.

В связи с широким распространением вирусных заболеваний, вызванных вирусами различной этиологии, в настоящее время особую актуальность имеет поиск средств противовирусной защиты с широким спектром действия против РНК- и ДНК-содержащих вирусов, углубленное изучение вирусных инфекций и создание препаратов, направленных на их подавление.

Известны данные об антивирусной активности панкреатической рибонуклеазы в отношении ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов, а также об их применении в клинике для лечения вирусных заболеваний. Рядом исследователей изучаются антивирусные свойства нуклеаз, выделенных из микроорганизмов, которые обладают более выраженными антивирусными свойствами, чем панкреатическая рибонуклеаза [Шапот В.С., Нуклеазы. М., 1968; Нуклеазы микроорганизмов, под ред. A.M. Безбородова. М., 1974 Nucleuses, ed. by S.M. Linn, R.J. Roberts, Cold Spring Harbour, 1982].

Известны сообщения об антивирусной, в частности антигриппозной, активности веществ, имеющих природное происхождение. Так, авторы И.Д. Макаренкова и др. (2010) сообщают о способности сульфатированного полисахарида - фукоидана из морской бурой водоросли Laminaria japonica подавлять продукцию высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1 в течение 24 ч инфекции при профилактической и лечебно-профилактической схемах применения. [Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой водоросли LAMINARIA JAPONICA в отношении инфекции культур клеток, вызванной вирусом гриппа A птиц (H5N1). Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г., Львов Д.К., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Вопросы вирусологии. 2010. Т. 55. №1. С. 41-45].

Показана противовирусная активность препаратов грибного происхождения [Разумов И.А., Косогова Т.А., Казачинская Е.В., Пучкова Л.И., Щербакова Н.С., Горбунова И.А., Михайловская И.Н., Локтев В.Б., Теплякова Т.В. Противовирусная активность водных экстрактов и полисахаридных фракций, полученных из мицелия и плодовых тел высших грибов. // Антибиотики и Химиотерапия, т. 55, №9-10, 2010].

Рибонуклеазы обладают выраженной противовирусной активностью в отношении таких РНК-содержащих вирусов, как вирусы гриппа, полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства [ГРИБЕНЧА С.В. Противовирусная активность РНКазы Bacillus intermedius у морских свинок и кроликов, зараженных вирусом бешенства // Вопросы вирусологии, 2006, №5, с. 41-43]. Дезоксирибонуклеазы тормозят синтез и размножение ДНК-содержащих вирусов, осповакцины, аденовируса, герпеса.

Одним из наиболее изученных энзимов этого класса является секретируемая эндонуклеаза Serratia marcescens. Грамотрицательные бактерии рода Serratia, в культуральной жидкости отдельных штаммов которых обнаружены высокие РНК-азная и ДНК-азная активности широко известны как продуценты различного рода препаратов [Габдуллина Г.К. Действие нуклеазы Serratia marcescens на клетки и рост асцитной опухоли Эрлиха: Автореф. дис… канд. биол. наук. - Казань, 1980. - 20 с.; Патент РФ №2148645, МПК C12N 9/20, опубл. 10.05.2000 г. «Штамм бактерий Serratia marcescens - продуцент липазы»]. Фермент тормозит размножение вирусов везикулярного стоматита и осповакцины в культуре клеток куриных фибробластов.

Известен штамм Serratia marcescens B-10 M-1 продуцент дезоксирибонуклеазы наиболее часто используемой в лабораторных условиях. [Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование. Рига, 1989, с. 3. 2. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М.: Наука, 1979, с. 7].

Первый созданный на основе эндонуклеазы Serratia marcescens противовирусный препарат получил название эндонуклеаза бактериальная. В настоящее время нуклеазы из бактерий Sarratia marcescens используют для лечения вирусных заболеваний пчел [Патент РФ №2038776, МПК A01K 51/00, опубл. 09.07.1995 г., «Средство "Эндоглюкин" для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей»]

Наиболее близким аналогом (прототипом) является средство на основе культуральной жидкости штамма бактерий Serratia marcescens [патент РФ №2420309, МПК A61K 39/00, опубл. 10.06.2011 г.].

Однако не известны опубликованные данные о том, что выше приведенные аналоги, в том числе и прототип, обладают ингибирующим действием против вирусов осповакцины (ВОВ), вируса оспы мышей (ВОМ) и вируса герпеса 2-го типа (ВПГ-2), а также высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 и человека A/H3N2.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание нового противовирусного средства на основе нуклеазы бактерий рода Serratia, обладающего ингибирующей активностью в отношении вирусов осповакцины (ВОВ), вируса оспы мышей (ВОМ) и вируса герпеса 2-го типа (ВПГ-2), а также высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 и человека A/H3N2.

Указанный технический результат достигается тем, что в противовирусном средстве на основе нуклеазы бактерий рода Serratia, согласно изобретению, в качестве источника нуклеазы бактерий рода Serratia оно содержит очищенную культуральную жидкость штамма бактерий Serratia plymuthica, имеющую РНКазную активность от 109,0 до 926 ед/мл и содержание белка от 3,6 до 13,5 мг/мл.

Очищенная культуральная жидкость штамма бактерий Serratia plymuthica получена центрифугированием при 10000-12000 об/мин и ультрафильтрацией через фильтр с размерами пор 0,1-0,3 мкм.

В качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Dg-91, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1288. Средство обладает ингибирующей активностью против вируса гриппа птиц типа А и вирусов ВОМ и ВПГ-2.

В качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Dg-98, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1297. Средство обладает ингибирующей активностью против вируса гриппа типа А и вирусов ВОВ и ВПГ-2. В качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Вр-868, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1296. Средство обладает ингибирующей активностью против вируса гриппа типа А и вируса ВПГ-2.

В качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Az-372, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1285. Средство обладает ингибирующей активностью против вируса гриппа типа А и вирусов ВОМ и ВПГ-2.

Штаммы, использованные для получения противовирусного средства, изолированы при высеве исследуемых образцов на среду РПА (pH 7,0-7,2, температура инкубирования 30-37°C). Характеристика заявляемых штаммов, связанная с источниками их выделения, представлена в таблице 1.

Штаммы являются факультативными анаэробами, хорошо растут при температуре 30-37°C. Согласно результатам определения нуклеотидной последовательности 16S рРНК бактерии данной группы отнесены к роду Serratia.

Совокупные данные по фенотипическим и геномным признакам позволяют идентифицировать штаммы Dg-91, Dg-98, Вр-868, Az-372, как принадлежащие к виду Serratia plymuthica.

Субкультуры штаммов хранят периодическими пересевами на среде LB ("Difco") с добавлением агара до 1,5%, pH 7,0-7,2) и в 15%-ном растворе глицерина в LB при низкотемпературном замораживании при минус 65°C. Справки о депонировании штаммов прилагаются.

Свойства средства на основе продуктов метаболизма штаммов Serratia plymuthica, обладающих активностью против вирусов гриппа, ВОВ, ВПГ-2, ВОМ обнаружены впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемых технических решений критериям изобретения «новизны» и «изобретательский уровень».

При культивировании применяли питательную среду "S" следующего состава в г/л: (Пептон Difco - 16,0; NaCI - 5,0; MgCl2 - 0,1-, Трис - 6,05; pH 8.0) или "Lb" (дрожжевой экстракт Difco - 10,0; пептон - 5,0; NaCI - 5,0; pH 7,2).

Для получения образцов культуральной жидкости (КЖ) штаммы культивировали в среде "S" или "LB" в течение 18 час при температуре 28-30°C с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 8000 об/мин на центрифуге JA-21. Полученные образцы КЖ и биомассы хранили до использования в замороженном состоянии при температуре минус 20°C.

Количественную оценку нуклеазной активности проводили по превращению субстратных нуклеиновых кислот (дрожжевой РНК или ДНК из молок лосося, «Медиген», Россия) во фрагменты, растворимые в 4%-ной HClO4, с появлением кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм. (Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Капранова М.Н., Голубенко И.А. Методы определения активности нуклеаз и родственных ферментов. В кн.: Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов. Казань: Изд-во КГУ - 1980. - С. 53-60).

Удельную активность измеряли в Е/мг белка. Концентрацию белка в образцах определяли по формуле: С мг/мл = (D228,5-D234,5) : 3 × n, где n - разведение образца []. (Ehresman Е., Imbault P. and Weil L.N.. // Anal. Biochem. 1973. V. 54. №2. P. 454-463).

Получение и анализ культуральной жидкости (КЖ) на содержание внеклеточных нуклеаз.

Клетки выращивали в колбах со средой LB или средой S на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования при температуре 30-37°C составляло 18-20 часов. КЖ собирали центрифугированием и замораживали до использования при температуре минус 20°C. Анализировали КЖ на наличие нуклеаз методом скрининга в агарозе с последующим определением ферментативной активности.

Анализ биомассы на содержание нуклеаз.

Для анализа использовали клеточные экстракты (КЭ). Для этого биомассу, полученную после центрифугирования и отбора КЖ в количестве 0,3-0,5 г, подвергали разрушению в 4-х мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе («MSE», Англия) при температуре 4-5°C. Контролируя на спектрофотометре падение величины D560 обработку суспензии ультразвуком проводили до уменьшения оптической плотности суспензии на 80-90% от исходной. Далее суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием при 8000 об/мин, в течение 20 мин, при температуре 4°C. Полученный экстракт клеток замораживали и хранили при температуре минус 20°C.

Результаты анализа субстанций культуральной жидкости (КЖ) и клеточного экстракта (КЭ) представлены в таблице 1.

В таблице 1 приведены средние данные по 2-м экспериментам. В качестве контроля использовали культуральную жидкость (кж) музейного штамма S.marcescens.

Изучение противовирусной активности образцов на основе бактериальных штаммов Serratia plymuthica

Подготовка вируса и культуры клеток к тестированию штамма.

Для тестирования токсичности и противовирусной эффективности бактериальных метаболитов относительно ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) использовали перевиваемую культуру клеток Vero, полученных из «Коллекции культур клеток» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Суспензию клеток с концентрацией 1×105 кл./мл питательной среды DMEM, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы фирмы «Gibco», вносили в объеме 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Планшеты с клетками помещали в термостат на 4 суток до образования монослоя при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности.

В качестве ДНК-содержащих вирусов в работе использовали ортопоксвирусы: вирус осповакцины (ВОВ, штамм Л-ИВП) и вирус оспы мышей (ВОМ, штамм К-1), а также вирус простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2, штамм MS), полученные из «Коллекции микроорганизмов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Концентрация вирусов на культуре клеток Vero по разным экспериментам составляла (4,4-5,5) lgТЦД50/мл (50% тканевых цитоплазматических доз в мл).

Определение токсических доз и противовирусного действия препаратов.

Для определения токсических доз препараты разводили в 2, 5, 10, 20, раз средой DMEM, вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками Vero и инкубировали в термостате при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 4 суток. Через 4 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток Vero, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК). Данные по токсичности образцов представлены в табл. 2

Исследование противовирусной активности образцов проводили по профилактической схеме: сначала на культуру клеток вносится образец и затем вирус. В монослой культуры клеток вносили по 50 мкл/лунку выбранного разведения образца, через 1 ч инкубации при температуре +37°C, 5% CO2 и 100% влажности вносили по 50 мкл/лунку разведенной ВСЖ. Клетки инкубировали 4 сут при температуре +37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 4 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток. Определяли инфекционность вирусов в клетках, то есть титры вирусов в lgТЦД50/мл в опыте и контроле (ИД50 in vitro с образцом и без него), а затем высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием образца: ИН = ИД50 контроль (lg) - ИД50 опыт (lg). Каждый вариант опыта выполняли в трех параллельных повторах, для анализа использовали средние величины полученных данных.

В качестве контроля использовали:

1. Контроль клеток, культивируемых в питательной среде DMEM.

2. Контроль репродукции ДНК-геномных вирусов в разведениях с 1 до 8 с десятикратным шагом без внесения препаратов, но с предварительным внесением питательной среды DMEM соответственно в объеме 50 мкл/лунку.

Ниже приведены примеры исследования противовирусной активности образцов препаратов на основе КЖ бактерий Serratia plymuthica Dg-91, Serratia plymuthica Az-372, Serratia plymuthica Bp-868, Serratia plymuthica Dg-98 относительно вирусов BOB, BOM, ВПГ-2.

Пример 1. Подготовка препарата (12-118) на основе водорастворимых метаболитов штамма Serratia plymuthica Dg-91 для испытания на противовирусную активность. Препарат получен на основе культуральной жидкости (КЖ). Суспензию клеток штамма Serratia plymuthica Dg-91, наработанных на агаризованной среде «LB» в течение 18 часов при температуре 28-30°C, вносили в количестве 2% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Полученную КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-91 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через миллипоровские фильтры Whatman с размерами пор 0,22 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата в профилактической схеме. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C.

Пример 2. Определение токсичности препарата №12-118.

Для определения токсических доз препарат №12-118 разводили в 5 и 10, раз средой DMEM, вносили по 50 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 4 суток. Через 4 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток DMEM, инкубированных с разными концентрациями препарата. Препарат был не токсичен на клеточной культуре MDCK при разведении в 5 и 10 раз (табл. 2).

Пример 3. Испытание противовирусного действия препарата 12-118.

Перед использованием препарат разводили на среде DMEM в 10 раз. Исследование противовирусной активности образцов проводили по профилактической схеме. В монослой культуры клеток вносили по 50 мкл/лунку выбранного разведения образца, через 1 ч инкубации при температуре +37°C, 5% СО2 и 100% влажности вносили по 50 мкл/лунку разведенной ВСЖ. Клетки инкубировали 4 сут при температуре +37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 4 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток. Индекс нейтрализации составил для вируса ВОМ - 2,03 lg, для вируса ВПГ-2 - 2,0 lg (табл. 3).

Пример 4. Испытание противовирусного действия препарата 12-116, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Serratia plymuthica Az-372. Клетки штамма выращивали в LB pH 7,2. Препарат готовили, как в примере 1. Перед использованием препарат разводили в 10 раз. При инфекционности вируса ВОМ (титр составил 4,6 lgТЦД50/мл) его нейтрализация на клетках Vero в профилактической схеме под влиянием препарата 12-116 составила 2,03 lg, а для вируса ВПГ-2 (титр 5,31)-индекс нейтрализации - 2,0 lg.

Пример 5. Получение препарата 11-47, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Serratia plymuthica Az-372. Клетки штамма выращивали в среде S при pH 7,8 в течение 18 ч. Далее образец получали как в примере 1.

Пример 6. Испытание противовирусного действия препарата 11-47, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Serratia plymuthica Az-372. Перед использованием препарат разводили в 10 раз. При инфекционности вируса ВОМ (титр 4,6 lgТЦД50/мл) его нейтрализация на клетках Vero в профилактической схеме под влиянием препарата 11-47 составила 3,0 lg, а для вируса ВПГ-2 (титр 5,31)-индекс нейтрализации - около 2,0 lg (табл. 3).

Пример 7. Получение препарата 12-05 и испытание его на противовирусную активность. Препарат получен на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plymuthica Dg-98. Суспензию клеток штамма, наработанных на агаризованной среде «S» в течение 20 часов при температуре 28-30°C, вносили в количестве 2% в колбы с 50 мл среды S и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Полученную КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-98 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через миллипоровские фильтры Whatman с размерами пор 0,22 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата в профилактической схеме. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C. Перед использованием препарат разводили в 10 раз. При инфекционности вируса ВОВ (титр 4,47±0,03 lgТЦД50/мл) и вируса ВПГ-2 (титр 5,31±0,19) нейтрализация на клетках Vero в профилактической схеме под влиянием препарата 12-05 составила 2,0 lg для обоих вирусов (табл. 3).

Пример 8. Получение препарата 14-08 и испытание его на противовирусную активность. Препарат получен на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plymuthica Dg-98. Суспензию клеток штамма, наработанных на агаризованной среде «LB» в течение 20 часов при температуре 28-30°C, вносили в количестве 2% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Полученную КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-98 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через миллипоровские фильтры Whatman с размерами пор 0,22 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата в профилактической схеме. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C. Перед использованием препарат разводили в 5 раз. При инфекционности вируса ВОВ (титр 4,47±0,03 lgТЦД50/мл) и вируса ВПГ-2 (титр 5,31±0,19) нейтрализация на клетках Vero в профилактической схеме под влиянием препарата 14-08 составила 2,0 lg для обоих вирусов (табл. 3).

Пример 9. Получение препарата 14-12 и испытание его на противовирусную активность. Препарат получен на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plymuthica Вр-868. Суспензию клеток штамма, наработанных на агаризованной среде «LB» в течение 20 часов при температуре 28-30°C, вносили в количестве 2% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Полученную КЖ штамма Serratia plymuthica Вр-868 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через миллипоровские фильтры Whatman с размерами пор 0,22 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата в профилактической схеме. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C. Перед использованием препарат разводили в 5 раз. Нейтрализация вирусов на клетках Vero под влиянием препарата 14-12 составила в профилактической схеме для ВОВ - 1,0 lg, а для вируса ВПГ-2 - 2,0 lg (табл. 3).

Пример 10. Получение препарата 12-120. В образец КЖ полученный как препарат 12-116 (пример 4) добавили сульфат аммония до 60% для осаждения белков. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C. Перед использованием его стерилизовали ультрафильтрацией и разводили в 5 раз стерильной средой DMEM. Противовирусную активность испытали на 3-х вирусах. Данные по активности представлены в табл. 3.

Подготовка к тестированию штаммов вируса гриппа и культуры клеток.

Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов использовали высокопатогенный вирус гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор, наработанный на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрация вируса составила: 103,5-6,5 lg ТЦД50/мл. Вирус гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2) (из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), титр 102,5-6,5 lg ТЦД50/мл вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ)). Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK.

Определение токсичности препаратов. Для определения токсических доз препараты разводили в 2, 5, 10, раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток.

Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов.

Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

Определение противовирусной активности препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха. Ниже приведены примеры конкретного применения заявляемых штаммов.

Пример 11. Получение препарата (образец 11-13), на основе экстракта клеток (КЭ) штамма Serratia plymuthica. Вр-868.

Биомассу клеток штамма (0,4 г), полученную после культивирования в «LB» и последующего центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 4 раза по 30″ с интервалом 30″, на ультразвуковом (УЗ)-дезинтеграторе. (с амплитудой 18), добиваясь максимально возможного разрушения клеток После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 12000 об/мин на микроцентрифуге "Eppendorf", КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman-фильтр с размерами пор 0,1 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C. Концентрация белка в образце составила 3,6 мг/мл, активность РНКазы 332,2 ед/мл или 3322 ед/г влажной биомассы.

Пример 12. Испытание противовирусного действия препарата №11-13, приготовленного на основе КЭ штамма Serratia plymuthica Вр-868 (в профилактической схеме) на вирусе гриппа человека (A/H3N2).

Для испытания препарат №11-13 развели в 5 раз и внесли на клетки MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета. Инкубация 2 часа. Удалили препарат, затем в лунки внесли среду RPMI-1640 без сыворотки и без трипсина. Добавили вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) с -1 по -7 по 50 мкл на лунку. Инкубация 2 сут. Учет с 1% эритроцитами петуха.

Планшеты с обработанными клетками и вирусом помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Индекс нейтрализации составил 2,5 lg при исходной концентрации вируса 102,5 lg ТЦД50/мл (табл. 4).

Пример 13. Получение препарата (образца) 12-16, на основе экстракта клеток (КЭ) штамма Serratia plymuthica Dg-91.

Биомассу клеток штамма Serratia plymuthica Dg-91. (0,4 г), полученную после культивирования в «LB» и последующего центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, ресуспендировали в 4 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали 4 раза по 30″ с интервалом 30″, на ультразвуковом (УЗ)-дезинтеграторе. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 12000 об/мин на микроцентрифуге "Eppendorf", КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman-фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C. Концентрация белка в образце составила 7,4 мг/мл, активность РНКазы 574,75 ед/мл, а ДНКазы - 463,1 ед/мл.

Пример 14. Испытание противовирусного действия КЭ штамма Serratia plymuthica Dg-91 на вирусе гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2). Анализ противовирусной активности штамма как в примере 12.

Клеточный экстракт (КЭ) штамма Serratia plymuthica Dg-91 (препарат №12-16) проверили в профилактической схеме на противовирусную активность. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg при исходной концентрации вируса 106,5 lg ТЦД50/мл (табл. 4).

Пример 15. Получение препарата (образца) 12-01 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plymuthica Dg-91.

Суспензию клеток готовили с использованием культуры штамма Serratia plymuthica Dg-91, наработанного на агаризованной среде «LB» в течение 18 часов при температуре 28-30°C. Суспензию вносили в количестве 2% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Для приготовления препарата на основе культуральной жидкости полученную КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-91 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman-фильтр с размерами пор 0,2 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата в профилактической схеме. РНКазная активность в КЖ составила 220,5 ед/мл. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C.

Пример 16. Испытание противовирусного действия КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-91 на вирусе гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2). Анализ противовирусной активности штамма как в примере 12.

Культуральную жидкость штамма Serratia plymuthica Dg-91 (препарат №12-01) проверили в профилактической схеме на противовирусную активность. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg при исходной концентрации вируса 106,5 lg ТЦД50/мл (табл. 4).

Пример 17. Испытание противовирусного действия КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-91 на вирусе гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1). Для испытания препарат №12-01 развели в 5 раз и внесли на клетки MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета. Инкубация 2 часа. Удалили препарат, затем в лунки внесли среду RPMI-1640 без сыворотки и без трипсина. Добавили вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) с -1 по -7 по 50 мкл на лунку. Инкубация 2 сут. Учет с 1% эритроцитами петуха.

Планшеты с обработанными клетками и вирусом помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg (табл. 4) при исходной концентрации вируса 106,5 lg ТЦД50/мл.

Пример 18. Получение препарата (образца) 12-25 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plymuthica. Az-372.

Образец 12-25 получен как в примере 15.

Испытание противовирусного действия препарата 12-25 на вирусе гриппа человека (A/H3N2) (профилактическая схема) как в примере 8. Индекс нейтрализации составил 3,0 lg при исходной концентрации вируса гриппа человека (A/H3N2) 106,5 lg ТЦД50/мл Концентрация белка составила 10,2 мг/мл, РНКазная активность - 108,9 ед/мл кж. (табл. 4).

Пример 19. Испытание КЖ Serratia plymuthica. Az-372. на вирусе гриппа птиц (A/H5N1). Препарат (образец) штамма под №11-41 получен как в примере 5 на среде «S». Концентрация белка составила 8,8 мг/мл, а РНКазная активность - 185,3 ед/мл. Индекс нейтрализации вируса гриппа (A/H5N1) составил 3,5 lg при исходной концентрации вируса 103,5 lg ТЦД50/мл (табл. 4)

Пример 20. Получение препарата (образца) 12-54 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plymuthica Dg-91.

Образец получали, как в примере 15, за исключением того, что клетки культивировали на среде «S».

Для приготовления препарата полученную КЖ штамма Serratia plymuthica Dg-91 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman-фильтр с размерами пор 0,2 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата.

Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C. РНКазная активность в КЖ составила 129,8 ед/мл.

Испытание противовирусного действия образца 12-54 проводили на вирусе гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1), как в примере 17. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg при исходной концентрации вируса 106,5 ТЦД50/мл (табл. 4).

Пример 21. Образец (12-20) получали как описано в примере 11. За исключением того, что использовали штамм Serratia plymuthica Dg-98. Осадок клеток штамма, полученный после центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, как в примере 11, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 4 раза по 30″ с интервалом 30″, на ультразвуковом (УЗ)-дезинтеграторе Процент разрушения 90%. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин на микроцентрифуге "Eppendorf", КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman-фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C.

Полученный КЭ после размораживания разводили в 2 раза дистиллированной водой и использовали для испытания на противовирусное действие на вирусе гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2): Индекс нейтрализации составил 3,5 lg при исходной концентрации вируса 103,5 lg ТЦД50/мл (табл. 4).

Пример 22. Для испытания использовали чистые стерильные среды «LB» и «S» в качестве противовирусного агента. Испытание проводили для исключения влияния компонентов среды на вирусы гриппа. Обработку клеток проводили как в примере 12. Данные среды не оказывали противовирусного эффекта и не влияли на культуру клеток MDCK. Титр вирусов не изменился по сравнению с контролем и составил: A/chikenKurgan/05/2005 (H5N1) 103,5-6,5 lg ТЦД50/мл, а вируса гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2): 102,5-6,5 lg ТЦД50/мл в зависимости от эксперимента.

Таким образом, из приведенных таблиц 3 и 4 видно, что заявляемое средство на основе нуклеазы бактерий штаммов бактерий Serratia plymuthica обеспечивает достижение технического результата, а именно обеспечивает ингибирующую активность в отношении вирусов осповакцины (ВОВ), вируса оспы мышей (ВОМ) и вируса герпеса 2-го типа (ВПГ-2), а также высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 и человека A/H3N2.

1. Противовирусное средство на основе нуклеазы бактерий рода Serratia, отличающееся тем, что в качестве источника нуклеазы бактерий рода Serratia оно содержит очищенную культуральную жидкость штамма бактерий Serratia plymuthica, имеющую РНКазную активность от 109,0 до 926 ед/мл и содержание белка от 3,6 до 13,5 мг/мл.

2. Противовирусное средство по п. 1, отличающееся тем, что очищенная культуральная жидкость штамма бактерий Serratia plymuthica получена центрифугированием при 10000-12000 об/мин и ультрафильтрацией через фильтр с размерами пор 0,1-0,3 мкм.

3. Противовирусное средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Dg-91, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1288.

4. Противовирусное средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Dg-98, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1297.

5. Противовирусное средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Вр-868, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1296.

6. Противовирусное средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве штамма бактерий Serratia plymuthica оно содержит штамм бактерий Serratia plymuthica Az-372, депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1285.



 

Похожие патенты:

Предложены комплекс для ферментативного гидролиза полисахаридных субстратов, способ его получения и его использование. Комплекс содержит основной каркас и ферментные компоненты.

Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к инженерной энзимологии, и может быть использовано для проведения биокаталитических превращений и получения химических соединений.

Настоящее изобретение относится к биохимии и раскрывает способ рафинирования масла. Для осуществления способа сначала смешивают водный раствор кислоты с маслом с получением смеси, имеющей рН 1-4, затем добавляют в указанную смесь основания с получением смеси, имеющей рН 6-8.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способ обработки лигноцеллюлозного материала, способ разжижения лигноцеллюлозного материала и система разжижения лигноцеллюлозного материала.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pET40CmAP/CGL, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/CGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (СmАР) и галактозоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus (CGL).
Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена клетка мицелиального гриба Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией, продуцирующая ксиланазу и лакказу.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот (AEH) из рекомбинантных бактерий Escherichia coli, несущих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Serratia species является продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chickenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2).
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Питательная среда для выделения Legionella pneumophila содержит автолизат селезенки КРС, агар микробиологический, уголь активированный, калия фосфат однозамещенный, калия фосфат двузамещенный, мезоинозит, L-цистеин, соль Мора, полимиксин, ванкомицин, амфотерицин и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus helveticus М-16, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11176 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ выращивания и разведения чайного гриба предусматривает культивирование чайного гриба в условиях аэрации при температуре 23-25°C в слабом растворе чая с растворенным в нем сахаром, выдержку в течение 5-6 дней, процеживание и слив готового напитка чайного гриба в банку-приемник в количестве 450-500 мл.

Группа изобретений относится к вариантам композиции, способной увеличивать образование масляной кислоты в толстом кишечнике. Предложена неферментированная композиция, включающая по меньшей мере один злак и по меньшей мере один изолированный пробиотический штамм Lactobacillus rhamnosus.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Питательная среда для культивирования бруцелл содержит ферментативный гидролизат желатина, ферментативный гидролизат рыбной муки, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, глюкозу, натрий сернистокислый пиро, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus fermentum В1-I, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-10888 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Штаммы spnk // 2580015
Изобретения относятся к области молекулярной генетики и касаются способов преобразования продуцирующего спиносад штамма Saccharopolyspora spinosa в штамм, продуцирующий предшественника спинеторама (варианты), и генетически модифицированной клетки-хозяина Saccharopolyspora spinosa.

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в молочной промышленности. Предлагается способ культивирования молочнокислых бактерий в молоке.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов - пробиотиков. Способ предусматривает выделение бифидобактерий и лактобактерий из фекалий хозяина.

Группа изобретений относится к вариантам штамма молочнокислых бактерий, устойчивых к низину, и их применению для получения ферментированных молочных продуктов с пониженным пост-окислением.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментному биокатализатору в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, образованные полигистидинсодержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полиглутаминовой кислотой.
Наверх