Противовирусное средство на основе сухого экстракта лишайника cetraria islandica
Владельцы патента RU 2580305:
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противовирусному средству на основе экстракта лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. (Цетрарии исландской). Противовирусное средство на основе экстракта лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. (Цетрарии исландской), которое содержит сухой экстракт указанного лишайника, приготовленный методом высушивания водного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья или приготовленный методом высушивания этанольного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья, водные растворы которого в концентрации не менее 0,1 мг/мл при водном извлечении и в концентрации не менее 0,01 мг/мл при этанольном извлечении обладают противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1. Вышеописанное средство обладает эффективной противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1. 2 з.п. ф-лы, 9 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области фармацевтики, химической технологии, вирусологии, медицины и ветеринарии. Изобретение касается средства, полученного на основе сухого экстракта лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. (Цетрарии исландской), с противовирусной активностью в отношении вируса гриппа.
Грипп - острое инфекционное заболевание дыхательных путей, вызываемое вирусом гриппа. Входит в группу острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Периодически распространяется в виде эпидемий и пандемий. В настоящее время выявлено более 2000 вариантов вируса гриппа, различающихся между собой антигенным спектром [http://www.nih.gov/researchmatters/october2009/10052009india.htm]. По оценкам ВОЗ от всех вариантов вируса во время сезонных эпидемий в мире ежегодно умирают от 250 до 500 тыс. человек (большинство из них старше 65 лет), в некоторые годы число смертей может достигать миллиона [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/].
В настоящее время не существует достаточно эффективных средств предотвращения эпидемий и пандемий гриппа. Борьба с гриппозной инфекцией основывается на вакцинопрофилактике и на лечении с комплексным применением этиотропных, патогенетических и симптоматических средств [Ершов Ф.И., Романцев М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях. - М., 2007, 368]. Среди препаратов этиотропного действия известны два класса: ингибиторы М2-каналов (производные адамантана) и ингибиторы нейраминидазы (озельтамивир и занамивир). Препараты этиотропного действия первого класса (амантадин и ремантадин) блокируют протонные насосы и предотвращают проникновение вируса в клетки [Stephenson, I; Nicholson K (1999). «Chemotherapeutic control of infiuenza». J Antimicrob Chemother 44 (1): 6-10. PMID 10459804], однако они часто являются малоэффективными в отношении штаммов вируса гриппа птиц и совсем не эффективными в отношении вируса гриппа В, что связано с возникновением мутаций в гене М2 белка, приводящих к появлению резистентности вируса гриппа к ремантадину [Watts J. Asian nations step up action to curb spread of avian influenza. Lancet. 2004, 363, 9406: 373, 430, 6996: 209-213]. Препараты второго класса (озельтамивир и занамивир) эффективны в отношении вирусов гриппа А и В, они подавляют распространение вируса в организме, снижают тяжесть симптомов, сокращают продолжительность заболевания и уменьшают частоту вторичных осложнений, однако имеются данные о том, что названные лекарственные средства вызывают ряд побочных действий, таких как тошнота, рвота, диарея, а также психические расстройства: нарушение сознания, галлюцинации, психозы [http://www.medicalnewstoday.com/articles/89734.php]. Кроме того, имеются данные о появлении устойчивости многих штаммов вируса гриппа к озельтамивиру [WHO Rapid Advice Guidelines on pharmacological management of humans infected with avian influenza A (H5N1) virus, WHO., 2006].
Отдельную группу для профилактики и лечения гриппа представляют препараты интерферона, обладающего противовирусным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием.
Еще одним препаратом, используемым иногда при терапии гриппа, является рибавирин. Последний в комбинации с интерфероном применяется при лечении гриппа на ранних стадиях инфекции. Являясь аналогом нуклеозидов, рибавирин эффективен в субтоксических концентрациях, и системное его применение вызывает побочные реакции, в частности анемию и тератогенный эффект при употреблении во время беременности. Тем не менее рибавирин использовался внутривенно при терапии тяжелых случаев заболевания человека гриппом птиц субтипа H5N1. После применения рибавирина были отмечены случаи полного выздоровления пациентов. Рибавирин является препаратом комплексного механизма действия. Он влияет на репликацию вируса гриппа двумя путями - прямо, вмешиваясь в полимеразные процессы при репликации и транскрипции вирусного генома, и опосредованно - угнетая фермент клетки инозинмонофосфатдегидрогеназу и истощая тем самым клеточный пул гуанозинтрифосфата (ГТФ), являющегося субстратом, необходимым для построения вирусных РНК. Поскольку основная мишень препарата не вирусный, а клеточный фермент, то устойчивые к рибавирину штаммы вируса гриппа отмечаются крайне редко или не обнаруживаются вообще. В то же время невысокая активность и существенные побочные эффекты позволяют рекомендовать его только при тяжелых состояниях больных гриппом (De Clercq Е. // Nat Rev Dmg Discov. 2006; 5:1015-25; Beigel J, Bray M. // Antiviral Research 2008; 78:91-102).
В связи с вышеизложенным поиск новых эффективных в отношении гриппозной инфекции лекарственных веществ является одной из приоритетных задач здравоохранения.
Предшествующий уровень техники
Известно отечественное противовирусное средство гипорамин (Hiporhaminum), получаемое из листьев облепихи крушиновидной - Hippophae rhamnoides L. семейства Лоховые - Elaeagnaceae, представляющее собой сухой очищенный стандартизованный экстракт на основе полифенольного комплекса галлоэллаготаннинов (Вичканова С.А. Изучение листьев облепихи и создание на их основе отечественного противовирусного средства «Гипорамин» // В книге: «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». V Междунар. съезд. Матер. съезда. - С. - П. - 2001. - С. 198-204). Гипорамин обладает выраженной противовирусной активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа человека. В основе механизма действия гипорамина лежит ингибирующий эффект на вирусную нейраминидазу. Однако для гипарамина в литературе не описана противовирусная активность в отношении пандемических штаммов вируса гриппа человека субтипа H1N1, а также в отношении высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц субтипа H5N1 с пандемическим потенциалом, способных инфицировать людей и вызывать тяжелые заболевания с летальным исходом.
Известен ингибитор репродукции пандемического вируса гриппа человека (штамм A/California/07/09 (H1N1)v), представляющий собой (R)-усниновую кислоту и окисленное производное (S)-усниновой кислоты (Соколов Д.Н., Лузина О.А., Половинка М.П., Салахутдинов Н.Ф., Киселев О.И., Зарубаев В.В., Штро А.А. Усниновая кислота и ее окисленное производное в качестве ингибиторов репродукции вируса гриппа // Патент РФ №2464033. Бюл. №29 от 20.10.2012). (R)-Усниновую кислоту выделяли из лишайника Cladonia stellaris, а окисленное производное (S)-усниновую кислоту из смеси лишайников рода Usnea. Исследования биологической активности этих соединений, проведенные в отношении пандемического вируса гриппа человека (штамм A/California/07/09 (H1N1)v), показали их высокую эффективность как ингибиторов репродукции этого вируса. Полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую степень подавления репликации вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)v в культуре клеток MDCK данными соединениями, превышающую, например, тот же показатель у эталона сравнения - рибавирина в 2-3 раза.
Однако для (R)-Усниновой кислоты из лишайника Cladonia stellaris, а также для окисленного производного (S)-усниновой кислоты не показана противовирусная активность в отношении штаммов вируса гриппа других подтипов, включая высокопатогенные штаммы вируса гриппа птиц субтипа H5N1 с пандемическим потенциалом, способные инфицировать людей и вызывать у них тяжелые заболевания с летальным исходом.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является средство для лечения и профилактики острых респираторных вирусных и бактериальных заболеваний, (патент РФ №2412718, МПК A61K 39/09, опубл. 27.02.2011 г.), характеризующееся тем, что оно содержит 10-70% сахарный сироп слоевища лишайника цетрарии исландской (Cetraria islandica (L.) Ach.) или смесь слоевища лишайника цетрарии исландской (Cetraria islandica (L.) Ach.) с лекарственным растением, обладающим отхаркивающим, противовоспалительным, бактерицидным, противовирусным и общеукрепляющим действием при массовом соотношении слоевища лишайника цетрарии исландской и лекарственного растения 1:10 и консервант в количестве 0,2 мас.%, при этом плотность сиропа составляет 1,22-1,30 г/см3 и массовая доля полисахаридов не менее 0,8%. Противовирусную активность в опытах in vitro оценивали в отношении следующих вирусов: грипп A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), грипп А/Чита/3/03 (H3N2), грипп A/Duck/Singapore/R/F 119-3/97 (H5N2), грипп B/Victoria/35/72, аденовирус человека 5 типа (Ad5), вирус парагриппа человека 3 типа (ПГ3). В качестве препаратов сравнения использовали Ремантадин для вируса гриппа и Виразол для аденовируса и вируса парагриппа. Однако в прототипе отсутствуют данные об активности средства на основе лишайника Цетрарии исландской (Cetraria islandica (L.) Ach.) против вируса гриппа A/H5N1.
Техническим результатом изобретения является расширение спектра противовирусной активности средства на основе сухого экстракта лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. (Цетрарии исландской) в отношении вируса гриппа субтипов AH3N2 и A/H5N1. Технический результат достигается тем, что средство на основе экстракта лишайника Cetraria islandica, согласно изобретению содержит сухой экстракт указанного лишайника, приготовленный методом высушивания водного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья, при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 35,7-43,7 мг/г |
| суммарные белки | 3,7-4,5 мг/г |
| катехины | 1,0-1,2 мг/г |
| флавонолы | 32,0-39,0 мг/г |
| танины | 63,0-77,0 мг/г |
| сапонины | 62,0-76,0 мг/г |
или приготовленный методом высушивания этанольного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья, при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 118,0-144,2 мг/г |
| суммарные белки | 10,3-12,5 мг/г |
| катехины | 0,6-0,8 мг/г |
| флавонолы | 5,9-7,3 мг/г |
| танины | 25,0-28,0 мг/г |
| сапонины | 507,0-620,0 мг/г |
водные растворы которого в концентрации не менее 0,1 мг/мл при водном извлечении и в концентрации не менее 0,01 мг/мл при этанольном извлечении обладают противовирусной активностью в отношении вируса гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1. Средство может быть приготовлено методом высушивания водного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 39,7 мг/г |
| суммарные белки | 4,1 мг/г |
| катехины | 1,1 мг/г |
| флавонолы | 35,7 мг/г |
| танины | 70,0 мг/г |
| сапонины | 69,3 мг/г |
водный раствор которого в концентрации не менее 0,1 мг/мл обладает активностью против вируса гриппа.
Средство может быть приготовлено методом высушивания этанольного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 131,1 мг/г |
| суммарные белки | 11,4 мг/г |
| катехины | 0,7 мг/г |
| флавонолы | 6,6 мг/г |
| танины | 25,0 мг/г |
| сапонины | 563,3 мг/г |
водный раствор которого в концентрации не менее 0,01 мг/мл обладает активностью против вируса гриппа.
Таким образом, по сравнению с прототипом разработано новое противовирусное средство для ингибирования репродукции вируса гриппа субтипов H3N2 и H5N1 в зависимости от способа извлечения экстрактивных веществ из сухого вещества лишайника Cetraria islandica (L.) Ach., а также от содержания экстрактивных веществ в сухих экстрактах и от их суммарной концентрации в водных растворах экстрактов.
Ниже приведены примеры 1-2 получения экстрактивных веществ из лишайника Cetraria islandica (L.) Ach.
Пример 1. Получение сухого экстракта из лишайника методом высушивания водного извлечения из измельченного и гомогенизированного сырья
10 г измельченного и гомогенизированного сухого сырья лишайника суспендировали в 600 мл стерильной дистиллированной воды в течение 1 часа при периодическом помешивании при температуре (95-100°С). При этих условиях оптимальной продолжительностью процесса максимального извлечения таких классов БАВ, как полисахариды и белки, был период 1 ч, так как увеличение продолжительности процесса свыше 1 ч не приводило к статистически достоверному увеличению содержания данных БАВ в водных извлечениях экстрактивных веществ по сравнению с таковым при проведении процесса извлечения в течение 1 ч, а только удлиняло технологический процесс (табл. 1).
Затем надосадочную жидкость отделяли фильтрованием, а осадок повторно обрабатывали 400 мл воды в течение 1 часа при температуре 95-100°С, далее экстракты объединяли, выпаривали на ротационном испарителе и высушивали при температуре 60°С в сушильном шкафу.
Пример 2. Получение сухого экстракта из лишайника методом высушивания этанольного извлечения из измельченного и гомогенизированного сырья
10 г измельченного и гомогенизированного сухого сырья лишайника суспендировали в 200 мл 70%-ного водного раствора этанола трехкратно в течение 8 часов общего времени экстрагирования при температуре 60°С. При этих условиях оптимальной продолжительностью общего процесса максимального извлечения полисахаридов и белков был период 8 ч, так как увеличение продолжительности процесса до 96 ч не приводило к статистически достоверному увеличению содержания данных классов БАВ в этанольных извлечениях экстрактивных веществ по сравнению с таковым при проведении общего процесса извлечения в течение 8 ч, а только удлиняло технологический процесс (табл. 2).
Затем объединенные охлажденные экстракты фильтровали через стеклянные фильтры, выпаривали на ротационном испарителе и высушивали при температуре 60°С в сушильном шкафу.
Пример 3. Определение характеристик водного и этанольного извлечений
Для качественного обнаружения флавоноидных соединений в экстрактах лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. применяли качественные реакции с раствором натрия гидроксида, алюминия хлорида, железа хлорида, а также метод тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Обнаружение содержания катехинов в экстрактах проводили спектрофотометрическим методом, основанном на способности давать малиновое окрашивание с 1%-ным раствором ванилина в концентрированной соляной кислоте. Плотность раствора замеряли при 504 нм. Пересчетный коэффициент рассчитан по d-катехину.
Флавонолы определяли спектрофотометрическим методом по Беликову. Количество их рассчитывали по графику, построенному по рутину.
Содержание танинов определяли титрометрически по Левенталю.
Сапонины осаждали из упаренного спиртового экстракта семикратным объемом ацетона.
Количественное содержание белка в образцах определяли по Бредфорду по фармакопейной методике.
Суммарное содержание полисахаридов определяли спектрофотометрически модифицированным антроновым методом Дрейвуда, включающим кислотный гидролиз полисахаридов серной кислотой с получением моносахаридов, образующих с антроном окрашенные комплексы сине-зеленого цвета с максимумом спектра поглощения при 520-625 нм. При разбавлении реакционной смеси этиловым спиртом максимум спектра поглощения смещается до 430 нм. Определение содержания полисахаридов проводили в пересчете на глюкозу, используя предварительно построенный калибровочный график зависимости величины оптической плотности глюкозы (λ=430 нм) от концентрации.
Результаты определения химических характеристик водного и этанольного извлечений из лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. приведены в таблице 3.
Как видно из таблицы 3, сухой экстракт лишайника, приготовленный методом высушивания этанольного извлечения из измельченного и гомогенизированного сырья, по сравнению с сухим экстрактом, полученным методом высушивания водного извлечения из измельченного и гомогенизированного сырья, содержит сахаров больше в 33 раза, белков больше в 2,8 раза, сапонинов больше в 8,2 раза, в то время как катехинов меньше в 1,6 раза, флавонолов меньше в 5,4 раза и танинов меньше в 2,6 раза.
Пример 4. Определение вирулицидной активности экстрактов лишайника Cetraria islandica
Вирулицидную активность экстрактов лишайника исследовали после экспозиции их с вируссодержащим материалом при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем титровали инфекционную активность вируса гриппа в каждом варианте опыта в культуре клеток MDCK. Экстракт характеризовался вирулицидной активностью в случае снижения инфекционного титра вируса гриппа для клеток MDCK после экспозиции в 100 раз и более.
Как видно из таблицы 4, водный и этанольный экстракты Cetraria islandica обладают выраженными вирулицидными свойствами в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (снижение инфекционной активности под действием экстрактов происходит на 7,0 lg и более).
При этом наибольшей способностью инактивировать инфекционные свойства вируса гриппа субтипа H5N1 обладает этанольный экстракт, который снижает инфекционную активность данного вируса на 9,5 lg.
В отношении вируса гриппа человека субтипа H3N2 ни один из исследованных экстрактов вирулицидными свойствами не обладает (табл. 4).
Пример 5. Определение противовирусной активности экстрактов лишайника Cetraria islandica в культуре клеток MDCK
Культура клеток. Для тестирования противовирусной активности экстрактов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». По 100 мкл суспензии клеток MDCK в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы, вносили в 96-луночные планшеты. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°С, 5% CO2 и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.
Определение токсичности экстрактов. Для определения токсических концентраций образцы экстрактов разводили в несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослое культуры клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа. Для этого образцы экстрактов растворяли в среде RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, делали разведения образцов в 5 раз, в 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой, вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре +37°С, 5% CO2 и 100% влажности на 2 сут. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослое клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями экстрактов лишайника. В опытах по определению противовирусной активности экстрактов на культуре клеток MDCK использовали предварительно определенные их максимально переносимые концентрации (МПК) для этой клеточной культуры.
Определение противовирусной активности экстрактов в отношении вируса гриппа. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и штамм вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п.Кольцове, Новосибирская обл.).
Наработку вируса гриппа производили на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ), титрование вируса гриппа проводили на культуре клеток MDCK. Концентрация разных субтипов вируса гриппа в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляла от 5,5 до 9,5 lg ТЦД50/мл (десятичных логарифмов 50% тканевых цитопатических доз в мл). В опытах по определению противовирусной активности экстрактов лишайника в отношении вируса гриппа готовили разведения ВАЖ каждого вируса от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием поддерживающей среды RPMI-1640 (ООО «Биолот», Россия), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США).
Для определения противовирусной активности образцов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения экстракта на поддерживающей среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Затем в лунки с препаратом добавляли по 50 мкл разведенной поддерживающей средой от 10-1 до 10-8 вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ). Клетки инкубировали 2 сут при температуре 37°С в атмосфере 5% CO2. Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие (ЦПД) в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1%-ной суспензией эритроцитов кур. За титр вируса в контроле и опыте принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации в лунке, и выражали в количестве 50% инфекционных доз (ИД50). Титры вируса определяли в lg ТЦД50/мл в контроле (50%-ная инфицирующая доза - ИД50 in vitro без препарата) и в опыте (ИД50 in vitro с препаратом). Вирусингибирующее действие исследуемых экстрактов оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем, для этого высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием экстракта: ИН=ИД50контроль-ИД50 опыт (lg).
На основании полученных данных рассчитывали 50% ингибирующую дозу IC50, т.е. концентрацию экстракта, снижающую уровень вирусной репликации вдвое (на 0,3 lg ИД50), и индекс селективности или химиотерапевтический индекс (SI), представляющий собой отношение ТС50 к IC50.
В качестве контроля использовали:
1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде RPMI-1640 (ООО «Биолот», С-Петербург), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США).
2. Контроль репродукции штаммов вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) с 1 до 8 разведения с десятикратным шагом без внесения экстрактов.
В процессе исследования ингибирования репродукции вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) экстрактами лишайника и эталонами сравнения (римантадином, тамифлю и рибавирином) по профилактической схеме в монослое клеток MDCK были получены результаты, представленные в таблицах 5 и 6.
Как видно из таблицы 5, экстракт, полученный из водного извлечения лишайника, проявил незначительный противовирусный эффект в отношении используемых в эксперименте штаммов вируса гриппа субтипов H3N2 и H5N1.
Индексы нейтрализации для штаммов вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) под действием экстракта, полученного из водного извлечения Цетрарии исландской, в концентрации 1,0 мг/мл составили 1,0 и 1,5 lg соответственно. Экстракт, полученный из этанольного извлечения лишайника Cetraria islandica, проявивший по сравнению с экстрактом из водного извлечения лишайника более выраженный противогриппозный эффект (ИН в отношении субтипов H3N2 и H5N1 вируса гриппа составили 2,0 и 2,5 соответственно), содержал 11,4 мг/г суммарных белков и 131,1 мг/г суммарных сахаров (табл. 3). Более значительная противовирусная активность экстракта из этанольного извлечения лишайника по сравнению с таковым из водного извлечения может быть связана с большим содержанием суммарных белков (в 2,8 раза), сахаров (в 33 раза) и сапонинов (в 8,2 раза).
Интересно было сравнить в экспериментах in vitro противовирусную активность экстрактов и коммерческих противогриппозных препаратов: тамифлю, римантадина и рибавирина, в отношении этих штаммов вируса гриппа. Как видно из табл. 5, рибавирин и этанольный экстракт лишайника проявили сравнимую противовирусную активность в отношении обоих штаммов вируса гриппа, римантадин обнаружил противовирусную активность, сравнимую с этанольным экстрактом лишайника, только в отношении вируса гриппа человека, и, наконец, тамифлю оказывал незначительное противовирусное действие на данные вирусы. Полученные результаты объясняются механизмами действия коммерческих препаратов против гриппа и согласуются с литературными данными [Stephenson, I; Nicholson K (1999). «Chemotherapeutic control of influenza». J Antimicrob Chemother 44 (1): 6-10. PMID 10459804; Watts J. Asian nations step up action to curb spread of avian influenza. Lancet. 2004, 363, 9406: 373]., 430, 6996: 209-213; WHO Rapid Advice Guidelines on pharmacological management of humans infected with avian influenza A (H5N1) virus, WHO., 2006; De Clercq E. // Nat Rev Dmg Discov. 2006; 5:1015-25; Beigel J, Bray M. // Antiviral Research 2008; 78:91-102].
На основании полученных данных были рассчитаны среднетоксические (ТС50) и среднеэффективные вирусингибирующие (1С50) концентрации экстрактов лишайника Cetraria islandica и коммерческих противогриппозных препаратов в отношении используемых штаммов вируса гриппа, снижающие уровень вирусной репликации вдвое (на 0,3 lg ИД50), и индексы селективности или химиотерапевтические индексы (SI), представляющие собой отношение ТС50 к IC50 (табл. 6).
Представленные в таблице 6 результаты показывают, что водный и этанольный экстракты подавляют размножение вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в культуре клеток MDCK, при этом среднеэффективные ингибирующие концентрации составляют 15,0 и 3,5 мкг/мл, а индексы селективности 50 и 128,5 соответственно, что говорит о низкой токсичности этих экстрактов для эукариотических клеток.
Оценка противовирусной активности экстрактов, представленных в таблице 6, по отношению к вирусу гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) показала, что значения IC50 для водного и этанольного экстрактов были выше по сравнению со значениями данного показателя для препаратов в отношении вируса гриппа птиц H5N1 и составляли 130,0 и 13,0 мкг/мл соответственно, при этом индексы селективности составляли 5,8 и 34,6 соответственно.
Таким образом, получены водные и этанольные экстракты лишайника, обладающие низкой токсичностью и выраженной противовирусной активностью в культуре клеток MDCK. Данные растительные экстракты способны ингибировать репликацию вирусов гриппа A/H3N2 и A/H5N1 в концентрациях от нескольких микрограмм до нескольких десятков микрограмм в миллилитре.
Экстракты, внесенные за 24 ч до инфицирования клеток MDCK вирусом гриппа, защищали клетки от патогенного действия вируса (табл. 7). Наибольшим противовирусным эффектом в этих условиях обладал этанольный экстракт, который защищал 41,2 и 55,6% клеток от патогенного воздействия вируса гриппа субтипов H5N1 и H3N2 соответственно при 100% гибели клеток в контроле (без внесения экстрактов). Меньшей противовирусной активностью характеризовался водный экстракт (табл. 7).
При внесении экстрактов лишайника в момент инфицирования клеток вирусом гриппа также наблюдали их противовирусную активность. В этом случае также больший противовирусный эффект отмечен для этанольного экстракта: этот экстракт защищал 44,5 и 75,8% клеток MDCK от вирусиндуцированной гибели, обусловленной вирусами гриппа A/Aichi/2/68 и A/chicken/Kurgan/05/2005 соответственно при 100% гибели клеток в контроле (без внесения экстрактов) (табл. 7).
В дальнейшем представлялось интересным выяснить, в какой мере сохраняется способность у инфицированных и обработанных экстрактами Cetraria islandica клеток MDCK продуцировать инфекционный вирус. Полученные данные свидетельствуют о том, что в пробах культуральной среды, отобранных через 48 ч после инфицирования культур клеток, обработанных экстрактами лишайника, наблюдали существенное снижение инфекционного вируса по сравнению с концентрацией вируса в пробах из необработанных клеточных культур (табл. 8 и 9).
При этом наиболее выраженными противовирусными свойствами в отношении вируса гриппа A/Aichi/2/68 обладал этанольный экстракт, который в концентрации 50 мкг/мл подавлял на 3,5 lg способность клеток продуцировать инфекционный вирус в течение 48 ч после заражения, в то время как в отношении вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 большую противовирусную активность обнаружил водный экстракт, который в концентрации 500 мкг/мл подавлял на 6,0 lg способность клеток продуцировать инфекционный вирус (табл. 8 и 9).
Для изучения механизма действия экстрактов Cetraria islandica на гриппозную инфекцию были проведены опыты по исследованию зависимости противовирусного эффекта экстрактов от времени их введения: за 24 и 1 ч до и через 1, 3, 6 и 24 ч после заражения клеток MDCK вирусом. Этанольный экстракт ингибировал инфекцию, вызванную вирусом гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), на стадии адсорбции вируса и в период от 0 до 6 ч после инфекции, в то время как водный экстракт ингибирующее действие оказывал также на стадии адсорбции вируса и в течение только раннего периода его репликации (от 0 до 1 ч после инфекции). В отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) оба экстракта ингибировали инфекцию на стадии адсорбции вируса и в период от 5 до 6 ч после инфекции. Таким образом, водный и этанольный экстракты лишайника Cetraria islandica имеют высокую биологическую активность, которая проявляется в том, что они эффективно ингибируют репликацию вируса гриппа в культуре клеток MDCK, и могут использоваться в качестве основы для новых высокоэффективных противовирусных препаратов для профилактики и лечения гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1.
1. Противовирусное средство на основе экстракта лишайника Cetraria islandica (L.) Ach. (Цетрарии исландской), характеризующееся тем, что оно содержит сухой экстракт указанного лишайника, приготовленный методом высушивания водного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья, при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 35,7-43,7 мг/г |
| суммарные белки | 3,7-4,5 мг/г |
| катехины | 1,0-1,2 мг/г |
| флавонолы | 32,0-39,0 мг/г |
| танины | 63,0-77,0 мг/г |
| сапонины | 62,0-76,0 мг/г |
или приготовленный методом высушивания этанольного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья, при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 118,0-144,2 мг/г |
| суммарные белки | 10,3-12,5 мг/г |
| катехины | 0,6-0,8 мг/г |
| флавонолы | 5,9-7,3 мг/г |
| танины | 25,0-28,0 мг/г |
| сапонины | 507,0-620,0 мг/г |
водные растворы которого в концентрации не менее 0,1 мг/мл при водном извлечении и в концентрации не менее 0,01 мг/мл при этанольном извлечении обладают противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1.
2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно приготовлено методом высушивания водного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 39,7 мг/г |
| суммарные белки | 4,1 мг/г |
| катехины | 1,1 мг/г |
| флавонолы | 35,7 мг/г |
| танины | 70,0 мг/г |
| сапонины | 69,3 мг/г |
водный раствор которого в концентрации не менее 0,1 мг/мл обладает активностью против вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1.
3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно приготовлено методом высушивания этанольного извлечения биологически активных веществ из измельченного и гомогенизированного сырья при следующем содержании компонентов в сухом экстракте:
| полисахариды | 131,1 мг/г |
| суммарные белки | 11,4 мг/г |
| катехины | 0,7 мг/г |
| флавонолы | 6,6 мг/г |
| танины | 25,0 мг/г |
| сапонины | 563,3 мг/г |
водный раствор которого в концентрации не менее 0,01 мг/мл обладает активностью против вируса гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1.
