Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов



Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов

 


Владельцы патента RU 2580317:

ИНДИАНА ЮНИВЕРСИТИ РИСЕРЧ ЭНД ТЕКНОЛОДЖИ КОРПОРЕЙШН (US)

Изобретение относится к пролекарственным препаратам, состоящим из пептидов, принадлежащих к суперсемейству глюкагонов, где указанный пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, был модифицирован путем присоединения дипептида к пептиду, принадлежащему к суперсемейству глюкагонов, посредством амидной связи. Описанные здесь пролекарства имеют длительное время полужизни и могут превращаться в активную форму в физиологических условиях посредством неферментативной реакции, инициированной химической нестабильностью. 15 з.п. ф-лы, 18 ил., 19 табл., 19 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США No. 61/358188, поданной 24 июня, 2010, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Введение материала в электронной форме посредством ссылки

Электронная версия списка нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, прилагаемая к описанию настоящей заявки вместе с распечатанным списком этих последовательностей, была создана 21 июня 2010 в виде одного файла размером 957 кb ACII (текст) под именем «Sequence_Listing_213134» и во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Пептидные лекарственные средства представляют собой высокоэффективные препараты, которые обладают относительно кратковременным действием и имеют вариабельный терапевтический индекс. Настоящее изобретение относится к пептидным пролекарствам, где производное пролекарства было получено в целях замедления начала его действия и увеличения времени полужизни лекарственного средства. Замедленное начало действия лекарственного средства является преимущественным свойством, так как оно позволяет обеспечивать системное распределение пролекарства перед его активацией. В соответствии с этим, введение пролекарств позволяет избежать осложнений, вызываемых в период максимальной активности лекарственного средства после его введения, и повысить терапевтический индекс родительского лекарственного средства.

Распознавание рецептора и последующий процессинг пептидных и белковых агонистов являются главным путем разложения многих пептидных и белковых лекарственных средств. Таким образом, связывание пептидного лекарственного средства с его рецептором будет приводить к биологической стимуляции, а также к инициации последующей дезактивации пептида/белка, фармакологически индуцируемой посредством ферментативного разложения пептида или белка. В соответствии с настоящим изобретением, пролекарства с пролонгированным временем биологической полужизни пептида или белка могут быть получены с применением стратегии, направленной на ингибирование распознавания пролекарства соответствующим рецептором.

Описанные здесь пролекарства, в конечном счете, подвергаются химическому превращению в структуры, которые могут распознаваться рецептором, где скорость такого химического превращения определяет время начала и продолжительности биологического действия in vivo. Молекулярное конструирование, описанное в настоящей заявке, основано на внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от вспомогательных химических добавок или ферментов.

Пре-проглюкагон представляет собой полипептид-предшественник, состоящий из 158 аминокислот, который процессируется в различных тканях с образованием ряда различных пептидов, происходящих от проглюкагона, включая глюкагон (SEQ ID NO: 701), глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1; аминокислоты 7-36, представленные здесь последовательностями SEQ ID NO: 703 и SEQ ID NO: 704), глюкагон-подобный пептид-2 (GLP-2; SEQ ID NO: 708) и оксинтомодулин (OXM; SEQ ID NO: 706), которые обладают физиологическими функциями широкого ряда, включая гомеостаз глюкозы, секрецию инсулина, опорожнение желудка и увеличение объема тонкого кишечника, а также регуляцию потребление пищи.

Глюкагон представляет собой пептид, состоящий из 29 аминокислот, которые соответствуют аминокислотам 33-61 в последовательности пре-проглюкагона, а GLP-1 продуцируется как пептид, состоящий из 37 аминокислот, соответствующих аминокислотам 72-108 пре-проглюкагона. GLP-1 (7-36) в виде амида (SEQ ID NO: 704; C-конец представляет собой амид аргинина) или GLP-1 (7-37) в виде кислоты (SEQ ID NO: 703; C-конец представляет собой глицин) являются биологически активными формами GLP-1, которые обладают, по существу, эквивалентной активностью по отношению к рецептору GLP-1.

Глюкагон представляет собой жизненно необходимое лекарственное средство, которое используется в экстренной терапии для лечения гипогликемии в тяжелой форме. Сообщалось, что оксинтомодулин обладает фармакологической активностью, направленной на подавление аппетита и снижение массы тела. Клинические исследования агонистов рецептора GLP-1 или стабилизированных аналогов GLP-1 подтвердили, что такое семейство пептидов может оказаться эффективным для лечения диабета типа II. Кроме того, такое лечение, из-за его глюкозозависимого действия, является более безопасным, чем инсулиновая терапия, а поэтому устраняет какой-либо риск развития гипогликемии. Исследование взаимосвязи «структура - активность» показало, что N-концевой гистидин для каждого из этих пептидов (глюкагона, GLP-1 и оксинтомодулина) играет особенно важную роль во всех их функциях, и что N-концевые удлиненные формы значительно снижают биологическую активность.

Известно, что существуют другие пептиды, которые по своей структуре и активности напоминают глюкагон и GLP-1. Так, например, экзендин-4 представляет собой пептид, который присутствует в слюне ядозуба и, по своей структуре, напоминает GLP-1, и так же, как глюкагон и GLP-1, повышает уровень высвобождения инсулина.

Кроме того, полипептид, угнетающий секрецию желудочного сока, (GIP) также известен как глюкозозависимый инсулинотропный пептид и является членом семейства гормонов секретинов. GIP происходит от пробелка, состоящего из 153 аминокислот, кодируемых геном GIP и циркулирует в кровотоке как биологически активный пептид, состоящий из 42 аминокислот (SEQ ID NO: 707). Ген GIP экспрессируется в тонком кишечнике, а также в слюнных железах и является слабым ингибитором секреции желудочного сока. GIP, помимо его ингибирующего действия в желудке в присутствии глюкозы, повышает уровень высвобождения инсулина β-клетками панкреатических островков при введении в физиологических дозах. Очевидно, что GIP функционирует как кишечный фактор, который стимулирует высвобождение инсулина поджелудочной железы и может играть физиологически важную роль в поддержании гомеостаза глюкозы.

Остеокальцин (SEQ ID NO: 709) представляет собой неколлагеновый белок, обнаруживаемый в костях и в дентине. Этот белок секретируется остеобластами и, очевидно, играет определенную роль в минерализации и в гомеостазе ионов кальция. Сообщалось, что остеокальцин функционирует как гормон в организме, стимулирует высвобождение большего количества инсулина бета-клетками поджелудочной железы, и в то же самое время регулирует высвобождение гормона адипонектина жировыми клетками, что приводит к повышению чувствительности к инсулину.

Одним из недостатков терапевтического применения биологически активных пептидов, таких как остеокальцин, GIP, глюкагон, GLP-1 и оксинтомодулин является их очень короткое время полужизни (приблизительно две минуты для глюкагона и GLP-1) в плазме. В соответствии с этим, для осуществления соответствующей регуляции уровня глюкозы, нативные родственные глюкагону пептиды должны вводиться непрерывно в течение длительного периода времени. Короткое время полужизни родственных глюкагону пептидов и GLP-1 обусловлено их быстрым разложением дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV), которая расщепляет эти пептиды между второй и третьей аминокислотами. Такое расщепление приводит не только к инактивации нативных пептидов, но, в случае глюкагона и GLP-1, их укороченные формы могут служить функциональными антагонистами их соответствующих рецепторов. В соответствии с этим, для реализации всего терапевтического потенциала механизмов действия этих лекарственных средств необходимо получить варианты GIP, глюкагона, GLP-1 и оксинтомодулина, а также родственных пептидов, которые обладали бы более продолжительным временем действия.

Описание сущности изобретения

В соответствии с некоторыми своими вариантами, настоящее изобретение относится к пролекарственному производному биологически активного полипептида, выбранного из группы, состоящей из глюкагона, экзендина-4, GLP-1, GLP-2, GIP, вазоактивного кишечного пептида (VIP), полипептида 27, активирующего аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27), пептида, состоящего из гистидина-метионина (PHM), оксинтомодулина, секретина, остеокальцина, рилизинг-фактора гормона роста, а также аналогов, производных и конъюгатов вышеуказанных соединений. Производное пролекарства включает дипептидный элемент пролекарства, ковалентно связанный с активным центром биологически активного полипептида посредством амидной связи. В некоторых вариантах изобретения, дипептид ковалентно связан с биологически активным полипептидом в положении, которое нарушает способность биологически активного полипептида взаимодействовать с его соответствующим рецептором или кофактором. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с амино-концом биологически активного пептида. Последующее удаление пептида в физиологических условиях и в отсутствии ферментативной активности будет приводить к полному восстановлению активности полипептида.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему общую структуру A-B-Q. В этом варианте, Q представляет собой биологически активный пептид, выбранный из группы пептидов, принадлежащих к суперсемейству глюкагонов, включая родственные глюкагону пептиды, остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, а A-B представляет собой дипептидное пролекарство, связанное с биологически активным пептидом посредством амидной связи. Более конкретно, в некоторых вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту или оксикислоту, а B представляет собой N-алкилированную аминокислоту, связанную с Q посредством амидной связи, образующейся между карбоксилом B (в A-B) и амином Q. Кроме того, в некоторых вариантах изобретения, A, B или аминокислота Q, к которой присоединена A-B, представляют собой некодируемую аминокислоту, а химическое отщепление A-B от Q, по меньшей мере примерно на 90%, происходит приблизительно за 1-720 часов в PBS в физиологических условиях. В другом варианте изобретения, химическое отщепление A-B от Q происходит по меньшей мере примерно на 50% приблизительно за 1 час или приблизительно за 1 неделю в PBS в физиологических условиях.

В некоторых вариантах изобретения, A и B выбирают так, чтобы они ингибировали ферментативное отщепление дипептида A-B от Q под действием ферментов, присутствующих в сыворотке млекопитающих. В некоторых вариантах изобретения, A и/или B выбирают так, чтобы полупериод отщепления A-B от Q в PBS в физиологических условиях не превышал более, чем в два раза полупериод отщепления и A-B от Q в растворе, содержащем протеазу DPP-IV (то есть, так, чтобы отщепление A-B от Q в присутствии протеазы DPP-IV и в физиологических условиях не происходило более, чем в 2 раза быстрее, чем в идентичных условиях в отсутствии фермента). В некоторых вариантах изобретения, A и/или B представляют собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D, а В представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера L. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера L, а В представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D и В представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства (A-B) включает соединение, имеющее общую структуру формулы I:

где R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С118алкила, С218алкенила, (С118алкил)OH, (С118алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил) и C1-C12алкил(W1)C1-C12алкила, где W1 представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил; или R4 и R8, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С118алкила, (С118алкил)OH, (С118алкил)NH2, (С118алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил), или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, C1-C8алкил, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH.

Очевидно, что если W1 представляет собой N, то в физиологических условиях, атом азота связан с H.

В другом варианте изобретения, дипептидный элемент пролекарства (A-B) включает соединение, имеющее общую структуру формулы I:

где R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С118алкила, С218алкенила, (С118алкил)OH, (С118алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил) и C1-C12алкил(W1)C1-C12алкил, где W1 представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил; или R4 и R8, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С118алкила, (С118алкил)OH, (С118алкил)NH2, (С118алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил), или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, C1-C8алкил, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Как описано выше, в некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему общую структуру A-B-Q, где Q представляет собой пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов (например, родственный глюкагону пептид, рилизинг-фактор гормона роста (GHRH; SEQ ID NO: 719), вазоактивный кишечный пептид (VIP; SEQ ID NO: 720), полипептид 27, активирующий аденилат-циклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO: 721), пептид, состоящий из гистидина-метионина (PHM; SEQ ID NO: 722), или секретин (SEQ ID NO: 723), и/или их аналоги, производные и конъюгаты). Пептиды, принадлежащие к суперсемейству глюкагонов, могут иметь общие структурные свойства, включая, но не ограничиваясь ими, гомологию в N-концевых аминокислотах и/или альфа-спиральную структуру в С-концевой части. Очевидно, что С-конец обычно связывается с рецептором, а N-конец обычно участвует в передаче сигнала рецептору. Несколько аминокислот в N-концевой части и в С-концевой части являются в высокой степени консервативными среди членов суперсемейства глюкагонов, например, His1, Gly4, Phe6, Phe22, Val23, Trp25 и Leu26, причем, аминокислоты в этих положениях являются идентичными по консервативным заменам или имеют сходные аминокислотные боковые цепи. В некоторых вариантах изобретения, Q представляет собой родственный глюкагону пептид, например, глюкагон (SEQ ID NO: 701), оксинтомодулин (SEQ ID NO: 706), экзендин-4 (SEQ ID NO: 718), глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) (аминокислоты 7-37, представленные в SEQ ID №№: 703 и 707), глюкагон-подобный пептид-2 (GLP-2) (SEQ ID NO: 708), GIP (SEQ ID NO: 707) или их аналоги, производные и конъюгаты. В некоторых вариантах изобретения, Q представляет собой родственный глюкагону пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична соответствующей последовательности нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного экзендина-4, нативного (7-37)GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP по всей длине нативного пептида (или во всех положениях, соответствующих глюкагону, см., например, фиг. 10). В других вариантах изобретения, пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов (Q), содержит аминокислотную последовательность нативного глюкагона, нативного экзендина-4, нативного (7-37)GLP-1, нативного GLP-2, нативного GHRH, нативного VIP, нативного PACAP-27, нативного PHM, нативного оксинтомодулина, нативного секретина или нативного GIP, имеющую до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций. В других вариантах изобретения, Q содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой химеру из двух или более нативных последовательностей пептида, родственного глюкагону. В некоторых вариантах изобретения, Q содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 50% идентична последовательности нативного глюкагона (SEQ ID NO: 701), и которая сохраняет альфа-спиральную конформацию аминокислот, соответствующих аминокислотам 12-29 SEQ ID NO:701.

Q может быть любым известным пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, включая, например, любые родственные глюкагону пептиды, известные специалистам, некоторые из которых описаны в настоящей заявке как неограничивающие примеры. Различные аналоги GLP-1 известны специалистам и представляют собой родственный глюкагону пептид согласно изобретению, см., например, заявки WO 2008023050, WO 2007030519, WO 2005058954, WO 2003011892, WO 2007046834, WO 2006134340, WO 2006124529, WO 2004022004, WO 2003018516, WO 2007124461, каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки, и в которых представлены последовательности или формулы аналогов или производных GLP-1. В некоторых вариантах изобретения, Q представляет собой родственный глюкагону пептид, принадлежащий к классу 1, 2, 3, 4 или 5, как подробно описано в настоящей заявке. В любом из описанных здесь вариантов, Q представляет собой любую из последовательностей SEQ ID NN: 1-684, 701-742, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1908.

Хотя дипептидное пролекарство, например, A-B, может быть связано с Q в любом положении, которое блокирует активность Q, однако, в описанных здесь вариантах представлены примеры положений, которые являются подходящими для связывания A-B. Если представленные здесь положения пронумерованы со ссылкой на положения в нативной последовательности глюкагона (SEQ ID NO: 701), то соответствующее положение в аналогах глюкагона или в других пептидах, принадлежащих к суперсемейству глюкагона, может быть определено путем выравнивания. См., например, фиг. 10, где проиллюстрировано выравнивание некоторых пептидов, принадлежащих к суперсемейству глюкагонов. Так, например, положение 24 в нативном глюкагоне соответствует положению 24 (7-37) GLP-1.

В некоторых вариантах изобретения, пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, может содержать С-конец или C-концевую аминокислотную последовательность, включая, но не ограничиваясь ими, COOH, CONH2, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 710), GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO: 711), карбокси-концевое удлинение оксинтомодулина, KRNRNNIA (SEQ ID NO: 714) или KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO: 713). Кроме того, C-концевые аминокислотные последовательности для пептидов, принадлежащих к семейству глюкагонов, более подробно описаны ниже.

В других аспектах изобретения, Q содержит остеокальцин (SEQ ID NO: 709) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности нативного остеокальцина по всей длине нативного пептида. Q может содержать аналог остеокальцина, в котором, по сравнению с нативным остеокальцином, имеются до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций. В других аспектах изобретения, Q содержит рилизинг-фактор гормона роста (GHRH) (SEQ ID NO: 719) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична нативному GHRH по всей длине нативного пептида. Q может содержать аналог GHRH, в котором, по сравнению с нативным GHRH, имеется до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций. В некоторых вариантах изобретения, Q может представлять собой любой аналог остеокальцина или GHRH, известный специалистам.

В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему общую структуру A-B-Q, где Q представляет собой пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, остеокальцин или их аналоги, производные или конъюгаты, а A-B имеет общую структуру:

,

где R1 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H и С18алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, СН2(C5-C9гетероарил), или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С18алкила, (С14алкил)OH, (С14алкил)NH2, (С14алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH.

Если R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, то R1 и R2 не являются H.

В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему общую структуру A-B-Q, где Q представляет собой пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, остеокальцин или их аналоги, производные или конъюгаты, а A-B имеет общую структуру:

где R1 и R8 независимо представляют собой H или С18алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и СН2(C5-C9гетероарил), или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С18алкила, (С14алкил)OH, (С14алкил)NH2, (С14алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, С18алкил, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH, галогена, при условии, что если R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, то R1 и R2 не являются H.

В других вариантах изобретения, Q представляет собой пептид, выбранный из группы, состоящей из рилизинг-фактора гормона роста (GHRH; SEQ ID NO: 719), вазоактивного кишечного пептида (VIP; SEQ ID NO: 720), полипептида 27, активирующего аденилат-циклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO: 721), пептида, состоящего из гистидина-метионина (PHM; SEQ ID NO: 722), или секретина (SEQ ID NO: 723), глюкагона (SEQ ID NO: 701), экзендина-4 (SEQ ID NO: 718), глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1) (аминокислоты 7-37, представленные в SEQ ID №№: 703 и 704), глюкагон-подобного пептида-2 (GLP-2) (SEQ ID NO: 708), GIP (SEQ ID NO: 707) или их аналогов, производных и конъюгатов. В некоторых вариантах изобретения, Q представляет собой пептид, родственный глюкагону.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к аналогу пролекарства, а именно, пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов или остеокальцина или их аналога, производного или конъюгата, где молекула пролекарства (A-B) ковалентно связана с Q в одном или нескольких внутренних аминокислотных остатках в последовательности Q, например, в положении Q, соответствующем положениям 12, 16, 17, 18, 20, 28, или 29 нативного глюкагона (SEQ ID NO: 701). Так, например, в некоторых вариантах изобретения, молекула пролекарства (A-B) связана прямо или посредством линкера, с замещенным Lys в положении 20 в Q. В таких вариантах изобретения, Q может содержать в положении 20 (по сравнению с нативной последовательностью глюкагона) замену, имеющую структуру:

В других вариантах изобретения, молекула пролекарства (A-B) связана прямо или посредством линкера с замененным амино-Phe в положении 22. В таких вариантах изобретения, Q может содержать в положении 22 (по сравнению с нативной последовательностью глюкагона) замену, имеющую структуру:

Альтернативно или дополнительно, молекула пролекарства (A-B) связана прямо или посредством линкера с амино-концом Q, где A-B имеет структуру:

,

где R1 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H и С18алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, СН2(C5-C9гетероарил), или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С18алкила, (С14алкил)OH, (С14алкил)NH2, (С14алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH, при условии, что если каждый из R1 и R2 не является Н, то R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо.

В других вариантах изобретения, молекула пролекарства (A-B) связана прямо или посредством линкера с амино-концом Q, где A-B имеет структуру:

,

где R1 и R8 независимо представляют собой H или С18алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, 14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и СН2(C3-C9гетероарил) или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С18алкила, (С14алкил)OH, (С14алкил)NH2, (С14алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, С18алкил, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH, галогена, при условии, что если оба R1 и R2 не являются Н, то R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах изобретения, лишь одна молекула пролекарства связана с Q. Так, например, в таких вариантах изобретения, если молекула пролекарства (A-B) связана с Q у N-конца, то молекулы пролекарства (A-B) не связаны с внутренним аминокислотным остатком в последовательности Q, и наоборот. В некоторых вариантах изобретения, две или три молекулы пролекарства связаны с Q, например, у N-конца и в одном или нескольких внутренних сайтах.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1 представлен график изменения массы тела у мышей с ожирением, вызванным кормлением (DIO), которым раз в неделю внутрибрюшинно инъецировали дозу 15 или 70 нмоль/кг аналога глюкагона. Мышей ежедневно взвешивали (N=8) после первой инъекции: только носителя ▼, пептида А, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов («Пептида A») в дозе 15 нмоль/кг (▷) или 70 нмоль/кг (►), или производного пролекарства Пептида A, где дипептид связан с N-концом Пептида А посредством амидной связи, и где указанный дипептид представляет собой Aib-1 Pro0 (вводимый в дозе 15 нмоль/кг (O) или 70 нмоль/кг (●)),Aib-1 Pro0 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (◇)), Lys-1 Sar0 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (♦)), dAla-1 Pro0 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (◄)) или Ac-Aib-1 Pro-1 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (■)).

На фиг.2 представлен график изменения массы тела у мышей с ожирением, вызванным кормлением (DIO), которым раз в неделю внутрибрюшинно инъецировали дозы 0,5, 3, 15 или 70 нмоль/кг только носителя (♦), Пептида А (в дозе 0,5 ▲, 3 ►, 15 ▼ или 70 ◄ нмоль/кг/день) или Lys-1 Sar0 - Пептида А (в дозе 0,5 Δ, 3 ▷, 15 ▽ или 70 ◁ нмоль/кг/день).

На фиг. 3 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у DIO-мышей (N=8), которым сначала инъецировали пептид, родственный глюкагону, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно инъецировали во время -60 минут либо только носитель (▲), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих пептидов:

(A) Пептида А (в дозе 15 < или 70 ◄ нмоль/кг/день),

(B) Lys-1 Sar0 Пептида А (в дозе 15 ▷ или 70 ► нмоль/кг/ день), или

(C) dLys-1 Sar0 Пептида А (в дозе 15 □, или 70 ■ нмоль/кг/ день).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во время 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во время -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

На фиг. 4 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у DIO-мышей (N=8), которым сначала инъецировали пептид, родственный глюкагону, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно инъецировали во время -15 минут либо только носитель (▼), либо дозу 2 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys-1 Sar0-Пептида А (■),

(B) Lys-1 (X), Sar0-Пептида А (▲), (X представляет собой 1K ПЭГ-цепь, связанную с боковой цепью Lys)

(C) Lys-1 (Y), Sar0 Пептида А, (♦), (Y представляет собой трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys)

(D) dLys-1 Sar0-Пептида А (►).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во время 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во время -15, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

На фиг. 5 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у DIO-мышей (N=8), которым сначала инъецировали пептид, родственный глюкагону, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно инъецировали во время -15 минут либо только носитель (▼), либо дозу 20 нмоль/кг dLys-1 Sar0-Пептида А, (►), либо дозу 0,67 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys-1 Sar0-Пептида А (■),

(B) Lys-1 (X), Sar0-Пептида А (▲), (X представляет собой 1K ПЭГ-цепь, связанную с боковой цепью Lys)

(C) Lys-1 (Y), Sar0-Пептида А (♦), (Y представляет собой трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во время 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во время -15, 0, 15, 30, 60, и 120 минут.

На фиг. 6 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у DIO-мышей (N=8), которым сначала инъецировали пептид, родственный глюкагону, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно инъецировали во время -60 минут либо только носитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Пептида А (в дозе 15 Δ или 70 ▲ нмоль/кг/день),

(B) dLys-1 Sar0-Пептида А (в дозе 15 □, или 70 ■ нмоль/кг/день), или

(C) Lys-1 Sar0-Пептида А (в дозе 15 ▷ или 70 ► нмоль/кг/день).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во время 0 минут и через 24 часа (см. фиг.7). Указанные уровни глюкозы в крови были измерены во время -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут до или после первого введения раствора глюкозы (то есть, начало отсчета 0 минут).

На фиг. 7 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у DIO-мышей (N=8), которым внутрибрюшинно, во время -60 минут, инъецировали либо только носитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Пептида А (в дозе 15 Δ или 70 ▲ нмоль/кг/день),

(B) dLys-1 Sar0 Пептида А (в дозе 15 ◇ или 70 ▽ нмоль/кг/день), или

(C) Lys-1 Sar0 Пептида А (в дозе 15 ♦ или 70 ■ нмоль/кг/день).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во время 0 минут и через 24 часа. Указанные уровни глюкозы в крови были измерены через 0, 15, 30, 60 и 120 минут после второй инъекции раствора глюкозы, которую осуществляли через 24 часа.

На фиг. 8 представлены данные, указывающие на потерю массы у DIO-мышей (N=8), которым внутрибрюшинно инъецировали указанные соединения в дозе 15 или 70 нмоль/кг. Указанные массы тела измеряли через 7 дней после введения соединений.

На фиг. 9A-B представлены графики уровней глюкозы в крови (BG) (мг/дл) у DIO-мышей (n=8). Мышам внутрибрюшинно инъецировали только носитель или пептид-пролекарство за 24, 8, 4 или 1 час до введения провокационной дозы (указанной на фигуре) путем инъекции 25% глюкозы в физиологическом растворе в дозе 1,5 г/кг массы тела. Указанные уровни глюкозы в крови измеряли через 0, 15, 30, 60 и 120 минут после введения провокационной дозы раствора глюкозы. На фиг. 9A указаны уровни глюкозы в крови после введения Lys-1 Sar0-Пептида А (то есть, содержащего элемент пролекарство Lys-1 Sar0). На фиг. 9B указаны уровни глюкозы в крови после введения dLys-1 Sar0 Пептида А (то есть, содержащего элемент пролекарство D-Lys-1 Sar0).

На фиг. 10 проиллюстрировано выравнивание аминокислотных последовательностей различных пептидов, принадлежащих к суперсемейству глюкагонов, или их релевантных фрагментов. Представленными аминокислотными последовательностями являются последовательности GHRH (SEQ ID NO: 719), PHI (SEQ ID NO: 722), VIP (SEQ ID NO: 720), PACAP-27 (SEQ ID NO: 721), экзендина-4 (SEQ ID NO: 718), GLP-1 (SEQ ID NO: 703), глюкагона (SEQ ID NO: 701), оксинтомодулина (SEQ ID NO: 706), GIP (SEQ ID NO: 707), GLP-2 (SEQ ID NO: 708) и секретина (SEQ ID NO: 724).

На фиг. 11 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у DIO-мышей (девять групп, по восемь мышей в каждой), которым подкожно вводили одну дозу только носителя или 10 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Пептида С, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов («Пептида C»),

(B) dK-Sar-Пептида C,

(C) Пептида В, принадлежащего к суперсемейству dK-Gly(N-гексил)глюкагонов («Пептида B»), или

(D) dK-F(N-Me)-Пептида C.

Мышам, возраст которых составлял 5,5 месяцев, приблизительно в течение 2 месяцев давали корм с высоким содержанием жира. Уровни глюкозы в крови измеряли через 0, 2, 4, 24 и 72 часа после инъекции.

На фиг. 12 представлен график изменения массы тела у DIO-мышей (девять групп, по восемь мышей в каждой), которым подкожно вводили одну дозу только носителя или 10 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Пептида С,

(B) dK-Sar-Пептида C,

(C) dK-Gly(N-гексил)-Пептида B, или

(D) dK-F(N-Me)-Пептида C.

Мышам, возраст которых составлял 5,5 месяцев, приблизительно в течение 2 месяцев давали корм с высоким содержанием жира. В течение 1-недельного исследования проводили мониторинг потребления пищи и жировой массы.

На фиг. 13A и 13B представлены графики рецептор-связывающей активности dK-Gly(N-гексил)-пептида B (Фиг. 13A) и dK-Sar-пептида C (Фиг. 13B) в 20% человеческой плазме, где указанную активность определяли с помощью люциферазного анализа на активность GLP-рецептора.

На фиг. 14 представлен график изменения массы тела у DIO-мышей (n=8), которым подкожно вводили одну дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг только носителя или одного из следующих соединений:

(A) Пептида C,

(B) dLys-1 Sar0-Пептида C, или

(C) dLys-1-Gly(N-гексил)-Пептида B.

Массу тела определяли на дни 1, 3, 5 и 7 данного исследования. Мышам в возрасте 5 месяцев и с исходной средней массой тела 31,2 г, приблизительно в течение 5 месяцев давали стандартный корм для мышей.

На фиг. 15A-C представлены графики уровней глюкозы в крови (BG) (мг/дл) у DIO-мышей (n=8), которым подкожно вводили одну дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг только носителя или одного из следующих соединений:

(A) Пептида C,

(B) dLys-1Sar0-Пептида C, или

(C) dLys-1-Gly(N-гексил)0-Пептида B.

Указанные уровни глюкозы в крови измеряли путем внутрибрюшинной инъекции на дни 1 (фиг. 15A), 3 (фиг. 15B) и 5 (фиг. 15C). Мышам в возрасте 5 месяцев приблизительно в течение 5 месяцев давали стандартный корм для мышей.

На фиг. 16A-C представлены графики рецептор-связывающей активности dK-Gly(N-гексил)-Пептида С (фиг. 16A), dLys-Sar-Пептида C (фиг. 16B) и dLys-Phe(N-метил)-Пептида C (фиг. 16C) в 20% человеческой плазме, где указанную активность определяли с помощью люциферазного анализа на активность GLP-рецептора.

На фиг. 17A-D представлены графики рецептор-связывающей активности Aib-Sar-Пептида D (фиг. 17A), dLys-Sar-Пептида D (фиг. 17B), dK-Gly(N-гексил)-Пептида D (фиг. 17C) и dLys-Phe(N-метил)-Пептида D (фиг. 17D) в 20% человеческой плазме, где указанную активность определяли с помощью люциферазного анализа на активность GLP-рецептора.

На фиг. 18 представлен график влияния одной подкожной дозы Пептида D и Aib-Sar-Пептида D в указанных концентрациях на уровне глюкозы в крови у мышей в течение 72 часов.

Подробное описание изобретения

Определения

В описании и в формуле изобретения используется терминология в соответствии с определениями, приведенными ниже.

Используемый здесь термин «пролекарство» определен как любое соединение, которое, до реализации его фармакологического действия, подвергается химической модификации.

Используемый здесь термин «аминокислота» охватывает любую молекулу, содержащую функциональные амино- и карбокси-группы, где аминогруппа и карбоксилатная группа связаны с одним и тем же атомом углерода (альфа-углерода). Альфа-углерод может иметь, но необязательно, один или два дополнительных органических заместителя. Аминокислота может быть обозначена трехбуквенным кодом, однобуквенным кодом или, в некоторых случаях, обозначена по названию ее боковой цепи. Так, например, неприродная аминокислота, содержащая циклогексановую группу, связанную с альфа-углеродом, называется «циклогексаном» или «циклогексилом». В целях настоящего изобретения, при обозначении аминокислоты без конкретного указания ее стереохимической структуры подразумевается, что такая аминокислота включает L- или D-форму или их рацемическую смесь. Однако, если аминокислота обозначается трехбуквенным кодом и имеет верхний индекс (то есть, Lys-1), то при таком обозначении подразумевается, что данная аминокислота имеет нативную L-форму, а D-форма обозначается строчной буквой «d», стоящей перед трехбуквенным кодом, имеющим надстрочный индекс (то есть, dLys-1).

Используемый здесь термин «оксикислота» означает аминокислоту, которая была модифицирована путем замены аминогруппы у альфа-углерода гидроксильной группой.

Используемый здесь термин «некодируемая аминокислота» включает любую из нижеследующих 20 аминокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, которая не имеет L-изомера.

«Дипептид» образуется в результате связывания α-аминокислоты или α-гидроксикислоты с другой аминокислотой посредством пептидной связи.

Используемый здесь термин «химическое расщепление», если отсутствует какое-либо дополнительное пояснение, охватывает неферментативную реакцию, приводящую к разрушению ковалентной химической связи.

Термин «биологически активный полипептид» означает полипептиды, обладающие биологическим действием in vitro и/или in vivo.

Используемый здесь термин «ацилированная» аминокислота означает аминокислоту, содержащую ацильную группу, которая не является нативной для данной природной аминокислоты, независимо от способа ее продуцирования. Репрезентативные способы продуцирования ацилированных аминокислот и ацилированных пептидов известны специалистам и включают ацилирование аминокислоты перед ее включением в пептид или пептидный синтез с последующим химическим ацилированием пептида. В некоторых вариантах изобретения, введение ацильной группы приводит к образованию пептида, обладающего одним или несколькими свойствами, такими как (i) увеличенное время полужизни в кровотоке, (ii) замедленное начало действия, (iii) продолжительное действие, (iv) повышенная резистентность к протеазам, таким как DPP-IV, и (v) повышенная активность по отношению к рецептору пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и/или пептида остеокальцина.

Используемый здесь термин «алкилированная» аминокислота означает аминокислоту, содержащую алкильную группу, которая не является нативной для данной природной аминокислоты, независимо от способа ее продуцирования. Репрезентативные методы продуцирования алкилированных аминокислот и алкилированных пептидов известны специалистам, и включают алкилирование аминокислоты перед ее включением в пептид или пептидный синтез с последующим химическим алкилированием пептида. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что алкилирование пептидов, очевидно, дает аналогичные, если не те же самые, эффекты, как и ацилирование пептидов, такие как, например, увеличенное время полужизни в кровотоке, замедленное начало действия, продолжительное действие, повышенная резистентность к протеазам, таким как DPP-IV, и повышенная активность по отношению к рецептору пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и/или к рецепторам пептида остеокальцина.

Используемый здесь термин «пептид» является общим термином и охватывает пептиды, которые имеют модифицированные амино- и карбокси-концы. Так, например, при обозначении аминокислотной последовательности стандартных аминокислот подразумеваются стандартные аминокислоты у N- и C-концов, а также соответствующая оксикислота у N-конца и/или соответствующая C-концевая аминокислота, модифицированная так, что она содержит амидную группу вместо концевой карбоксильной группы.

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой стандартный фармацевтический носитель, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия типа «масло в воде» или «вода в масле» и смачивающие агенты различных типов. Этот термин также охватывает любые агенты, разрешенные к применению Регуляторными органами Федерального правительства США или перечисленные в фармакопее США как агенты, которые могут быть использованы для их введения животным, включая человека.

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» означает соли соединений, которые сохраняют биологическую активность родительского соединения, и которые не оказывают каких-либо нежелательных биологических или других эффектов. Многие описанные здесь соединения способны образовывать соли кислот и/или оснований благодаря присутствию на них аминогрупп и/или карбоксильных групп или подобных групп.

Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических оснований. Солями неорганических оснований являются, например, только соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. Солями органических оснований являются, но не ограничиваются ими, соли первичных, вторичных и третичных аминов.

Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических кислот. Солями неорганических кислот являются соли хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и т.п. Солями органических кислот являются соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты и т.п.

Используемый здесь термин «лечение» включает профилактику конкретного расстройства или состояния, или ослабление симптомов, ассоциированных с конкретным расстройством или состоянием, и/или предупреждение или устранение указанных симптомов. Так, например, используемый здесь термин «лечение диабета» в общих чертах означает поддержание близких к норме уровней глюкозы в крови, и может включать увеличение или снижение уровней глюкозы в крови в зависимости от конкретной ситуации.

Используемый здесь термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» пролекарства означает нетоксическое, но достаточное количество пролекарства, необходимое для достижения желательного эффекта. Так, например, таким желательным эффектом может быть предупреждение или лечение гипергликемии. «Эффективное количество» варьируется для каждого конкретного индивидуума, в зависимости от возраста и общего состояния индивидуума, способа введения и т.п. Так, например, «эффективное количество» не всегда может быть точно определено. Однако, соответствующее «эффективное количество» для каждого конкретного индивидуума может быть определено средним специалистом в данной области путем рутинного экспериментирования.

Термин «парентеральный» относится к введению не через пищеварительный тракт, а некоторыми другими способами, такими как подкожное, внутримышечное, интраспинальное или внутривенное введение.

Используемый здесь термин «идентичность» означает сходство двух или более последовательностей. Идентичность измеряют путем деления числа идентичных остатков на общее число остатков и умножения полученного результата на 100 с получением процента. Таким образом, две копии абсолютно одинаковых последовательностей имеют 100% идентичность, а две последовательности, которые имеют аминокислотные делеции, добавления или замены по отношению друг к другу, имеют меньшую степень идентичности. Для специалиста в данной области очевидно, что для определения идентичности последовательностей могут быть использованы некоторые компьютерные программы, такие как программы, в которых применяются алгоритмы, такие как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410).

Термин «пептид, родственный глюкагону» означает пептиды, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) по отношению к одному или нескольким рецепторам глюкагона, GLP-1, GLP-2 и GIP и имеют аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% (например, на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) идентична последовательности по меньшей мере одного из таких соединений, как нативный глюкагон, нативный оксинтомодулин, нативный экзендин-4, нативный GLP-1, нативный GLP-2 или нативный GIP. Если это не оговорено особо, то любое указание на положение аминокислоты в пептиде, родственном глюкагону (например, положение связывания с молекулой пролекарства, молекулой конъюгата или с гидрофильным полимером, положение ацилирования или алкилирования) означает положение по отношению к нативной аминокислотной последовательности глюкагона (SEQ ID NO: 701).

Термин «пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов» означает группу пептидов, родственных по структуре своих N-концевых и C-концевых областей (см., например, Sherwood et al., Endocrine Reviews 21:619-670 (2000)). Членами этой группы являются все родственные глюкагону пептиды, а также рилизинг-фактор гормона роста (GHRH; SEQ ID NO: 719), вазоактивный кишечный пептид (VIP; SEQ ID NO: 720), полипептид 27, активирующий аденилат-циклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO: 721), пептид, состоящий из гистидина-изолейцина (PHI), пептид, состоящий из гистидина-метионина (PHM; SEQ ID NO: 722) или секретин (SEQ ID NO: 723), и их аналоги, производные или конъюгаты, в которых имеются до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций по сравнению с нативным пептидом. Такие пептиды, предпочтительно, сохраняют способность взаимодействовать (являются агонистами или антагонистами) с рецепторами, принадлежащими к суперсемейству рецепторов глюкагона. Если это не оговорено особо, то любое указание на положение аминокислоты в пептиде, принадлежащем к суперсемейству глюкагонов (например, положение связывания с молекулой пролекарства, молекулой конъюгата или с гидрофильным полимером, положение ацилирования или алкилирования) означает положение по отношению к нативной аминокислотной последовательности глюкагона (SEQ ID NO: 701), см. фиг. 10, где проиллюстрировано выравнивание последовательностей соответствующих пептидов, принадлежащих к суперсемейству глюкагонов.

Термин «агонист GLP-1» означает соединение, которое стимулирует активность рецептора GLP-1, измеряемую по продуцированию cAMP с использованием анализа на экспериментальной in vitro модели, описанной в примере 13 Международной заявки No. WO 2007/056362, опубликованной 18 мая 2007, описание которой во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки.

Используемый здесь термин «нативный GLP-1» является общим термином, который означает GLP-1(7-36) в форме амида (состоящего из последовательности SEQ ID NO: 704), GLP-1(7-37) в форме кислоты (состоящей из последовательности SEQ ID NO: 703) или смесь этих двух соединений. Используемый здесь общий термин «GLP-1», при отсутствии каких-либо дополнительный пояснений, означает нативный GLP-1.

Используемый здесь термин «пептид глюкагона» является общим термином, который означает природный пептид глюкагона SEQ ID NO: 701, а также его модифицированные производные, имеющие одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с нативной последовательностью глюкагона, необязательно включая, но не ограничиваясь ими, замены в положениях аминокислот 1, 2, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 24, 28 и 29. Вообще говоря, при всех указаниях конкретного положения аминокислоты (например, положения 28) подразумевается положение данной аминокислоты в нативном глюкагоне (SEQ ID NO: 701) или соответствующее положение данной аминокислоты в любых его аналогах. Так, например, «положение 28» должно означать соответствующее положение 27 в аналоге глюкагона, в котором первая аминокислота SEQ ID NO: 701 была делетирована. Аналогичным образом, «положение 28» должно означать соответствующее положение 29 в аналоге глюкагона, в котором одна аминокислота была присоединена перед N-концом SEQ ID NO: 701.

Используемый здесь термин «пептид GLP-1» является общим термином, который означает нативный GLP-1, а также его модифицированные производные, имеющие одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с нативной последовательностью GLP-1.

Используемый здесь термин аминокислотная «модификация» означает замену, добавление или делецию аминокислоты и включает замену или добавление любой из 20 аминокислот, обычно встречающихся в человеческих белках, а также редких или неприродных аминокислот. Редкие аминокислоты поставляются коммерческими фирмами, включая Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL), и Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Редкие аминокислоты могут быть закуплены у коммерческих поставщиков, синтезированы de novo или химически модифицированы или дериватизированы из природных аминокислот. Аминокислотными модификациями являются: связывание аминокислоты с частью конъюгата, такой как гидрофильный полимер; ацилирование; алкилирование; и/или другая химическая дериватизация аминокислоты.

Используемый здесь термин «аминокислотная замена» означает замену одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком.

Используемый здесь термин «консервативная аминокислотная замена» определен здесь как замена аминокислоты другой аминокислотой, принадлежащей к одной из нижеследующих пяти групп:

I. Небольшие алифатические остатки, неполярные остатки или остатки со слабой полярностью:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды:

Asp, Asn, Glu, Gln;

III. Полярные, положительно заряженные остатки:

His, Arg, Lys; орнитин (Orn)

IV. Крупные, алифатические, неполярные остатки:

Met, Leu, Ile, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин

V. Крупные, ароматические остатки:

Phe, Tyr, Trp, ацетилфенилаланин.

Используемый здесь термин «химера 2» означает пептид глюкагона, где нативная аминокислотная последовательность глюкагона (SEQ ID NO: 701) имеет следующие модификации: Gln в положении 17, Ala в положении 18, Lys в положении 20, Glu в положении 21, Ile в положении 23, Ala в положении 24 и С-концевой амид.

Используемый здесь общий термин «полиэтиленгликолевая цепь» или «ПЭГ-цепь» означает смеси конденсационных полимеров этиленоксида и воды в виде разветвленной или прямой цепи, представленной общей формулой H(OCH2CH2)kOH, где k равно по меньшей мере 9. Этот термин, при отсутствии каких-либо дополнительных пояснений, включает полимеры этиленгликоля со средней общей молекулярной массой, выбранной из масс в интервале 500-80000 дальтон. Термин «полиэтиленгликолевая цепь» или «ПЭГ-цепь», если он используется вместе с численным показателем, указывает на приблизительную среднюю молекулярную массу этой цепи. Так, например, ПЭГ-5000 (5k ПЭГ) означает полиэтиленгликолевую цепь, имеющую общую молекулярную массу, которая в среднем составляет примерно 5000 дальтон.

Используемый здесь термин «ПЭГилированный» и аналогичные термины относятся к соединению, природная структура которого была модифицирована путем присоединения к этому соединению полиэтиленгликолевой цепи. «ПЭГилированный полипептид» представляет собой полипептид, который имеет ПЭГ-цепь, ковалентно связанную с полипептидом.

Используемый здесь термин «линкер» означает связь, молекулу или группу молекул, которые связывают две отдельные молекулы друг с другом. Линкеры могут служить для обеспечения оптимального пространства для двух молекул, либо они могут также обеспечивать лабильную связь, которая позволяет отделять эти две молекулы друг от друга. Лабильными связями являются фоторасщепляемые группы; группы, которые отщепляются под действием кислоты; группы, которые отщепляются под действием основания, и группы, отщепляемые под действием ферментов.

Используемый здесь термин «димер» означает комплекс, содержащий две субъединицы, ковалентно связанные друг с другом посредством линкера. Термин «димер», употребляемый без какой-либо его качественной характеристики, охватывает гомодимеры и гетеродимеры. Гомодимер содержит две идентичных субъединицы, а гетеродимер содержит две субъединицы, которые отличаются друг от друга, хотя эти две субъединицы, в основном, аналогичны друг другу.

Используемый здесь термин «C1-Cnалкил», где n может быть равно 1-6, означает разветвленную или прямую алкильную группу, имеющую от 1 до указанного числа атомов углерода. Обычно, C1-C6алкильными группами являются, но не ограничиваются ими, метил, этил, н-пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил и т.п.

Используемый здесь термины «C2-Cnалкенил», где n может быть равно 2-6, означает олефиновую ненасыщенную разветвленную или прямую группу, имеющую от 2 до указанного числа атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Примерами таких групп являются, но не ограничиваются ими: 1-пропенил, 2-пропенил(-CH2-CH=CH2), 1,3-бутадиенил(-CH=CHCH=CH2), 1-бутенил(-CH=CHCH2CH3), гексенил, пентенил и т.п.

Термин «C2-Cnалкинил», где n может быть равно 2-6, означает ненасыщенную разветвленную или прямую группу, имеющую от 2 до n атомов углерода и по меньшей мере одну тройную связь. Примерами таких групп являются, но не ограничиваются ими: 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил и т.п.

Используемый здесь термин «арил» означает моно- или бициклическую карбоциклическую систему, имеющую один или два ароматических кольца, включая, но не ограничиваясь ими, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, инденил и т.п. Размер арильного кольца и присутствие заместителей или линкерных групп определяется по числу присутствующих атомов углерода. Так, например, термин «(C1-C3алкил)(C6-C10арил)» означает 6-10-членный арил, связанный с родительской молекулой посредством 1-3-членной алкильной цепи.

Используемый здесь термин «гетероарил» означает моно- или бициклическую систему, содержащую одно или два ароматических кольца и по меньшей мере один атом азота, кислорода или серы в ароматическом кольце. Размер гетероарильного кольца и присутствие заместителей или линкерных групп определяется по числу присутствующих атомов углерода. Так, например, термин «(C1-Cnалкил)(C5-C6гетероарил)» означает 5- или 6-членный гетероарил, связанный с родительской молекулой посредством 1 «n»-членной алкильной цепи.

Используемый здесь термин «гетероалкил» означает прямой или разветвленный углеводород, содержащий указанное число атомов углерода и по меньшей мере один гетероатом в остове данной структуры. Гетероатомами, подходящими для целей настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, N, S и O.

Используемый здесь термин «галоген» означает один или несколько членов группы, состоящей из фтора, хлора, брома и иода.

Используемый здесь термин «заряженная аминокислота» означает аминокислоту, содержащую боковую цепь, которая является отрицательно заряженной (то есть, депротонированной) или положительно заряженной (то есть, протонированной) в водном растворе при физиологическом рН. Так, например, отрицательно заряженными аминокислотами являются аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, цистеиновая кислота, гомоцистеиновая кислота и гомоглутаминовая кислота, а положительно заряженными аминокислотами являются аргинин, лизин и гистидин. Заряженными аминокислотами являются заряженные аминокислоты из числа 20 аминокислот, обычно встречающихся в человеческих белках, а также нетипичные или неприродные аминокислоты.

Используемый здесь термин «кислотная аминокислота» означает аминокислоту, которая содержит вторую кислотную молекулу (то есть, не являющуюся α-карбоксильной группой, которая присутствует во всех аминокислотах), включая, например, группу карбоновой кислоты или сульфоновой кислоты.

Используемый здесь термин «пациент», если отсутствуют какие-либо дополнительные пояснения, включает любое теплокровное позвоночное одомашненное животное (включая, например, но не ограничиваясь ими, крупный рогатый скот, лошадей, кошек, собак и других животных-компаньонов), млекопитающее и человек.

Варианты осуществления изобретения

В настоящей заявке описано приготовление пролекарств-производных биологически активных полипептидов, которые могут быть использованы для лечения заболевания, например, диабета и ожирения. Более конкретно, описанные здесь пролекарства приготавливают в целях увеличения времени полужизни родительского биологически активного пептида или белка, что способствует последующей активации пролекарства по механизму неферментативного расщепления. Идеальное пролекарство должно быть растворимым в воде в физиологических условиях (например, при рН 7,2 и при 37°C) и стабильным в форме порошка при длительном хранении. Оно должно быть иммунологически инертным и обладать низкой активностью по сравнению с родительскими лекарственным средством. В некоторых вариантах изобретения, пролекарство обладает активностью, которая составляет не более чем 10% от активности родительского лекарственного средства. В некоторых вариантах изобретения, пролекарство обладает активностью, которая составляет примерно менее чем 10%, примерно менее чем 5%, примерно 1%, или примерно менее чем 1% от активности родительского лекарственного средства. Кроме того, пролекарство, при его введении в организм, должно превращаться в активное лекарственное средство с количественным выходом в течение определенного периода времени. Как описано в настоящей заявке, авторами был разработан общий метод получения пролекарств известного биологически активного полипептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов, принадлежащих к суперсемейству глюкагонов, включая пептиды, родственные глюкагону, а также остеокальцин и аналоги, производные и конъюгаты каждого из этих полипептидов, которые удовлетворяют всем этим требованиям.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к химически обратимому пролекарству, содержащему последовательность пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, включая, например, пептид, родственный глюкагону, или остеокальцин или его аналоги, производные или конъюгаты, модифицированные так, чтобы они содержали дипептидный элемент пролекарства, ковалентно связанный с пептидом посредством амидной связи. Ковалентное связывание дипептидного элемента пролекарства с активным центром пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, приводит к ингибированию активности полипептида вплоть до расщепления дипептидного элемента пролекарства. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему «полупериод неферментативной активации» (t½), составляющий примерно от 1 до 720 часов в физиологических условиях. Описанные здесь физиологические условия включают температуру примерно 35-40°C и pH примерно 7,0-7,4, а обычно рН 7,2-7,4, и температуру 36-38°C.

В основном, скорость расщепления, а поэтому и активация пролекарства зависит от структуры и стереохимии дипептидного элемента пролекарства. Описанные здесь пролекарства, в конечном счете, подвергаются химическому превращению в структуры, которые распознаются нативным рецептором лекарственного средства, где скорость такого химического превращения определяет время начала биологического действия in vivo и продолжительность такого действия. Конструирование молекул, описанное в настоящей заявке, основано на внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов. Скорость превращения регулируется химической природой дипептидного заместителя и его расщепления в физиологических условиях. Поскольку физиологический рН и температура строго регулируется в точно определенном интервале, то скорость превращения пролекарства в лекарственное средство будет в высокой степени воспроизводимой у одного пациента и у различных пациентов.

Настоящее изобретение относится к описанным здесь пролекарствам, которые, благодаря их форме, имеют продолжительное время полужизни, составляющее по меньшей мере примерно 1 час, а в некоторых вариантах изобретения, оно составляет примерно более, чем 20 часов. В некоторых вариантах изобретения, время полужизни пролекарств составляет примерно 1, 6, 8, 12, 20, 24, 48 или 72 часа. В некоторых вариантах изобретения, время полужизни пролекарств составляет примерно 100 часов или более, включая время полужизни, составляющее примерно до 168, 336, 504, 672 или 720 часов, и эти пролекарства превращаются в активную форму в физиологических условиях посредством неферментативной реакции, индуцируемой природной химической нестабильностью. В некоторых вариантах изобретения, время t½ неферментативной активации пролекарства составляет 1-100 часов, а обычно 12-72 часа, например, 12-48 часов и 48-72 часа, а в некоторых вариантах изобретения, t½ составляет 24-48 часов как было измерено путем инкубирования пролекарства в забуференном фосфатом растворе (например, PBS) при 37°C и pH 7,2. В другом варианте изобретения, время t½ неферментативной активации пролекарства составляет примерно 1-6 часов, например, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов или примерно 6 часов. В другом варианте изобретения, время t½ неферментативной активации пролекарства составляет 6-24 часа. Время полужизни различных пролекарств вычисляют по формуле t½=0,693/k, где «k» означает константу скорости первого порядка для разложения пролекарства. В некоторых вариантах изобретения, активация пролекарства происходит после расщепления дипептида, связанного амидной связью, с образованием дикетопиперазина или дикетоморфолина и высвобождением активного полипептидного лекарственного средства. Были идентифицированы конкретные дипептиды, состоящие из природных, некодируемых и/или синтетических аминокислот, которые облегчают внутримолекулярное разложение в физиологических условиях и высвобождение активных полипептидов.

В соответствии с некоторыми своими вариантами, настоящее изобретение относится к пролекарству, состоящему из пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, или остеокальцина или их аналогов, производных или конъюгатов, имеющих структуру A-B-Q. В этом варианте изобретения, Q представляет собой пептид, A представляет собой аминокислоту или гидроксикислоту, а В представляет собой N-алкилированную аминокислоту. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону. А и B, взятые вместе, представляют собой дипептидный элемент пролекарства, который связан с Q посредством образования амидной связи между A-B и амином Q. В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере одной из A, B, или аминокислотой Q, с которой связан A-B, является некодируемая аминокислота. Кроме того, в некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства выбирают так, чтобы химическое отщепление A-B от Q по меньшей мере примерно на 90% происходило приблизительно за 1-720 часов в PBS в физиологических условиях. В другом варианте изобретения, аминокислоты дипептида выбирают так, чтобы полупериод отщепления A-B от Q в PBS в физиологических условиях не более чем в 2-5 раз превышал полупериод отщепления A-B от Q в растворе, содержащем протеазу DPP-IV (включая, например, человеческую сыворотку).

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, алифатическую аминогруппу Q (например, первичный амин), включая, например, N-концевой амин или аминогруппу аминокислотной боковой цепи, модифицируют путем ковалентного связывания с дипептидным элементом пролекарства посредством амидной связи. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства присоединяют к аминогруппе боковой цепи аминокислоты, присутствующей в Q, либо непосредственно, либо посредством линкерной молекулы. В некоторых вариантах изобретения, линкерная молекула содержит ацильную группу или алкильную группу, несущую амин. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пептиду, принадлежащему к суперсемейству глюкагонов, например, к пептиду, родственному глюкагону, где указанные пептиды содержат ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 или 20 пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и где указанная ацильная группа или алкильная группа также содержит дипептидный элемент пролекарства, связанный с ацильной группой или алкильной группой посредством амидной связи. Так, например, в одном из вариантов изобретения рассматривается пролекарство, которое связано с аминогруппой Q либо непосредственно, либо посредством линкерной группы, где ацильная группа или алкильная группа связаны с пролекарством либо непосредственно, либо посредством линкерной группы.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства непосредственно связан с аминокислотной боковой цепью, где указанная аминокислота имеет общую структуру:

где n равно целому числу 1-4.

Альтернативно, дипептидный элемент пролекарства может быть связан с амино-заместителем, присутствующим на арильном кольце ароматической аминокислоты, включая, например, ароматическую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из амино-Phe, амино-нафтилаланина, амино-триптофана, амино-фенилглицина амино-гомо-Phe и амино-тирозина. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с ароматической аминогруппой аминокислоты, имеющей общую структуру:

где m равно целому числу от 0 до 3. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с 4-аминогруппой аминокислоты, имеющей общую структуру:

где m равно целому числу от 0 до 3. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с аминогруппой боковой цепи лизина или ароматической аминогруппой 4-аминофенилаланина (вместо нативного фенилаланина или тирозинового остатка биологически активного пептида). В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с первичным амином, присутствующим на внутренней аминокислоте пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, включая родственный глюкагону пептид, остеокальцин или их аналоги, производные или конъюгаты.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства имеет общую структуру A-B, где A представляет собой аминокислоту или гидроксикислоту, а B представляет собой N- алкилированную аминокислоту, связанную посредством амидной связи с первичной аминогруппой такого пептида, в результате чего образуется соответствующее пролекарство, состоящее из пептида. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону. В некоторых вариантах изобретения, A и B выбирают так, чтобы при связывании дипептида A-B с первичным амином такого пептида посредством амидной связи, химическое отщепление A-B от Q по меньшей мере примерно на 90% происходило приблизительно за 1-720 часов в PBS в физиологических условиях. В некоторых вариантах изобретения, A и/или B представляют собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D, а В представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера L. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера L, а В представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, A представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D, и В представляет собой аминокислоту в конфигурации стереоизомера D.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, дипептидный элемент пролекарства может быть дополнительно модифицирован так, чтобы он содержал гидрофильную группу. В некоторых вариантах изобретения, гидрофильной группой является полиэтиленгликолевая цепь. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, полиэтиленгликолевая цепь размером в 40k или выше ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты A или B дипептидного элемента пролекарства. В другом варианте изобретения, указанный дипептидный элемент пролекарства дополнительно или альтернативно, может быть ацилирован или алкилирован жирной кислотой или желчной кислотой или их солью, например, жирной C4-C30-кислотой, жирной C8-C24-кислотой, холевой кислотой, C4-C30-алкилом, C8-C24-алкилом, или алкилом, содержащим стероидную молекулу желчной кислоты. Аминокислотой «A» дипептидного элемента пролекарства может быть, например, d-лизин, ковалентно связанный с ацильной или алкильной группой посредством аминогруппы его боковой цепи, или d-цистеин, ковалентно связанный с молекулой ПЭГ посредством сульфгидрильной группы его боковой цепи. Дипептидный элемент пролекарства может быть непосредственно связан с гидрофильной группой, ацильной группой или алкильной группой, либо он может быть связан с гидрофильной группой, ацильной группой или алкильной группой посредством спейсера, как описано в настоящей заявке. Альтернативно, дипептидный элемент пролекарства может быть связан с депо-белком, таким как декстран или крупная молекула ПЭГ (размером превышающим или равным 80000 дальтон), которая служит для секвестрации пролекарства на участке инъекции до тех пор, пока расщепление дипептида не будет приводить к высвобождению биологически активного пептида. Другие модификации дипептидных пролекарств описаны ниже в разделе, относящемся к пептидам, родственным глюкагону.

Дипептидный элемент пролекарства был сконструирован так, чтобы он расщеплялся после внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от других химических добавок или ферментов. Более конкретно, в некоторых вариантах изобретения, дипептидную структуру выбирают так, чтобы она была устойчивой к расщеплению пептидазами, присутствующими в сыворотке млекопитающих, включая, например, дипептидил-пептидазу IV (DPP-IV). В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, скорость отщепления дипептидного элемента пролекарства от биологически активного пептида, в основном, не увеличивается (например, более чем в 2 раза) в том случае, когда реакцию проводят в физиологических условиях в присутствии сывороточных протеаз, по сравнению с реакцией, проводимой в отсутствии таких протеаз. Таким образом, полупериод отщепления A-B от биологически активного пептида в PBS в физиологических условиях не более чем в два, три, четыре или пять раз превышает полупериод отщепления A-B от биологически активного белка в растворе, содержащем протеазу DPP-IV. В некоторых вариантах изобретения, раствор, содержащий протеазу DPP-IV, представляет собой сыворотку, а более конкретно, сыворотку млекопитающего, включая человеческую сыворотку.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, A или B дипептидного элемента пролекарства, или аминокислота пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, с которым связаны A-B, представляют собой некодируемую аминокислоту. В некоторых вариантах изобретения, аминокислота «B» представляет собой N-алкилированную аминокислоту, но не пролин. В некоторых вариантах изобретения, N-алкилированная группа аминокислоты B представляет собой C1-C18алкил, а в некоторых вариантах изобретения, она представляет собой C1-C6алкил.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, производное пролекарства, состоящее из пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и включающее описанный здесь дипептидный элемент пролекарства, может быть введено вместе с ингибитором протеазы, включая специфический ингибитор DPP-IV (например, Januvia®, Merck & Co, Inc), который служит в качестве средства, замедляющего активацию пролекарства. В этом варианте изобретения, аминокислоты элемента пролекарства выбирают так, чтобы дипептид представлял собой приемлемый субстрат для расщепления протеазой DPP-IV. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону. Ингибитор протеазы может быть введен в составе отдельно взятых композиций, либо пролекарство и ингибитор протеазы могут быть приготовлены в виде одной композиции. При введении в виде отдельных композиций, ингибитор протеазы обычно вводят через 1-5 часов, 1-2 часа, 30 минут или 10 минут после введения пролекарства. В некоторых вариантах изобретения, две отдельные композиции вводят непосредственно одну за другой.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства имеет общую структуру формулы I:

где R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С118алкила, С218алкенила, (С118алкил)OH, (С118алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил) и C1-C12алкил(А)(W1)C1-C12алкил, где W1 представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил; или R4 и R8, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С118алкила, (С118алкил)OH, (С118алкил)NH2, (С118алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил), или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, C1-C8алкил, или R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH.

Очевидно, что если W1 представляет собой N, то в физиологических условиях, атом азота связан с H.

В других вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства имеет общую структуру формулы I:

,

где R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С118алкила, С218алкенила, (С118алкил)OH, (С118алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил) и C1-C12алкил(W1)C1-C12алкила, где W1 представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил; или R4 и R8, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С118алкила, (С118алкил)OH, (С118алкил)NH2, (С118алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарил), или R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, C1-C8алкил, или R6 и R1, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

В некоторых вариантах изобретения, R8 представляет собой H, а R5 представляет собой NHR6.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства имеет структуру формулы I, где

R1 и R8 независимо представляют собой H или С18алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, СН2(C3-C9гетероарил) или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил;

R5 представляет собой NHR6; и

R6 представляет собой H или С18алкил.

В других вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства имеет структуру формулы I, где:

R1 и R8 независимо представляют собой H или С18алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероциклил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и СН2(C3-C9гетероарил), или R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил;

R3 представляет собой С118алкил;

R5 представляет собой NHR6; и

R6 представляет собой H или С18алкил; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Время полужизни пролекарства, полученного в соответствии с настоящим изобретением, определяют по заместителям дипептидного элемента пролекарства, его расположению и аминокислоте, с которой он связан. Так, например, пролекарство может содержать пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, где дипептидный элемент пролекарства связан посредством альфа-аминогруппы N-концевой аминокислоты белка, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов. В этом варианте изобретения, пролекарства, имеющее t½, например, приблизительно 1 час, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо представляют собой С118алкил или арил; или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляют собой водород, и

R5 представляет собой амин.

В других вариантах изобретения, пролекарства, имеющие t½ например, приблизительно 1 час, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо представляют собой С118алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, либо R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород,

R5 представляет собой NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Кроме того, пролекарства, имеющие дипептидный элемент пролекарства связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и имеющие t½, например, приблизительно от 6 до 24 часов, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и арила; или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила и арила; а R5 представляет собой амин;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, а один из R4 и R8 представляет собой водород.

В некоторых вариантах изобретения, пролекарства, имеющие дипептидный элемент пролекарства, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и имеющие t½, например, приблизительно от 12 до 72 часов, или в некоторых вариантах изобретения, от 12 до 48 часов, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила, (С118алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2 и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 представляет собой NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из Н, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена,

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, а по меньшей мере один из R4 и R8 представляет собой водород.

В некоторых вариантах изобретения, пролекарства, имеющие дипептидный элемент пролекарства связанный с N-концевой аминокислотой пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и имеющего t½, например, приблизительно от 12 до 72 часов, а в некоторых вариантах изобретения, от 12 до 48 часов, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

где:

R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила и (C1-C4алкил)NH2, или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С18алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 выбран из группы, состоящей из водорода и С18алкила; и

R5 представляет собой NH2,

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом.

В других вариантах изобретения, пролекарства, имеющие дипептидный элемент пролекарства, связанный с N-концевой аминокислотой пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и имеющие t½, например, приблизительно от 12 до 72 часов, или в некоторых вариантах изобретения, от 12 до 48 часов, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила и (C1-C4алкил)NH2;

R3 представляет собой С18алкил;

R4 представляет собой водород; и

R5 представляет собой NH2,

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом.

В некоторых вариантах изобретения, пролекарства, имеющие дипептидный элемент пролекарства связанный с N-концевой аминокислотой пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и имеющие t½, например, приблизительно от 12 до 72 часов, или в некоторых вариантах изобретения, от 12 до 48 часов, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила и (C1-C4алкил)NH2, или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С18алкил;

R4 представляет собой (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 представляет собой NH2,

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С18алкила и (C0-C4алкил)OH,

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом.

В некоторых вариантах изобретения, пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, представляет собой пептид, родственный глюкагону. В любом из этих вариантов, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1908.

Кроме того, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему дипептидный элемент пролекарства, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, и имеющему t½, например, приблизительно от 72 до 168 часов, где указанный дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где R1 выбран из группы, состоящей из водорода, С18алкила и арила;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород; и

R5 представляет собой амин или N-замещенный амин или гидроксил;

при условии, что если R1 представляет собой алкил или арил, то R1 и R5, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где R1 выбран из группы, состоящей из водорода, С18алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой Н, С18алкил, либо R6 и R1, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена;

при условии, что если R1 представляет собой алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, то R1 и R5, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с аминовой боковой цепью внутренней аминокислоты пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов. В этом варианте изобретения, пролекарства, имеющие t½, например, приблизительно 1 час, имеют структуру:

,

где R1 и R2 независимо представляют собой С18алкил или арил; или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород, а R5 представляет собой амин.

В некоторых вариантах изобретения, пролекарства, имеющие t½, например, приблизительно 1 час, имеют структуру:

,

где R1 и R2 независимо представляют собой С18алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7; или R1 и R2 связаны посредством -(CH2)p-, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород;

R5 представляет собой NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Кроме того, пролекарства, имеют t½, например, приблизительно от 6 до 24 часов и содержат дипептидный элемент пролекарства, связанный с внутренней аминокислотной боковой цепью, где указанный дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила или арила; или R1 и R2 связаны посредством -(CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил, либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо представляет собой С118алкил или арил; и

R5 представляет собой амин или N-замещенный амин;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, а один из R4 и R8 представляет собой водород.

В некоторых вариантах изобретения, пролекарства, имеющие t½, например, приблизительно от 12 до 72 часов, а в некоторых вариантах изобретения, от 12 до 48 часов, и включающие дипептидный элемент пролекарства, связанный с внутренней аминокислотной боковой цепью, содержат дипептидный элемент пролекарства, имеющий структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо представляют собой водород, С18алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 представляет собой NHR6;

R6 представляет собой Н или С18алкил, либо R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, а по меньшей мере один из R4 и R8 представляет собой водород. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону.

Кроме того, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему t½, например, приблизительно от 72 до 168 часов и содержащему дипептидный элемент пролекарства, связанный с внутренней аминокислотной боковой цепью пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, где указанный дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и арила;

R3 представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород; и

R5 представляет собой амин или N-замещенный амин или гидроксил;

при условии, что если R1 и R2 независимо представляют собой алкил или арил, то R1 или R2 связаны с R5 посредством (CH2)p, где p равно 2-9.

В некоторых своих вариантах изобретения, настоящее изобретение относится к пролекарству, имеющему t½, например, приблизительно от 72 до 168 часов и содержащему дипептидный элемент пролекарства, связанный с внутренней аминокислотной боковой цепью пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, где указанный дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где R1 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3представляет собой С118алкил;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой Н или С18алкил, либо R6 и R1, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена;

при условии, что если R1 и R2 независимо представляют собой алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, то R1 и R2 связаны с R5 посредством (CH2)p, где p равно 2-9. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону. В любом из этих вариантов, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, имеющий любую из последовательностей SEQ ID №№: 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1908.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с боковой цепью амина внутренней аминокислоты пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, где указанная внутренняя аминокислота имеет структуру формулы II:

,

где n равно целому числу, выбранному из 1-4. В некоторых вариантах изобретения, n равно 3 или 4, а в некоторых вариантах изобретения, внутренней аминокислотой является лизин. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с первичным амином на боковой цепи аминокислоты, находящейся в положениях 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов. В некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положениях 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 имеет структуру формулы II:

где n равно целому числу, выбранному из 1-4, а дипептидный элемент пролекарства связан с аминокислотной боковой цепью посредством амидной связи. В некоторых вариантах изобретения, n равно 4, а аминокислота находится в положении 20. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону.

В другом варианте изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, посредством амина, присутствующего на арильной группе ароматической аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, ароматической аминокислотой является внутренняя аминокислота пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, однако, указанной ароматической аминокислотой может быть также N-концевая аминокислота. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону. В некоторых вариантах изобретения, ароматическая аминокислота выбрана из группы, состоящей из амино-Phe, амино-нафтилаланина, амино-триптофана, амино-фенилглицина, амино-гомо-Phe и амино-тирозина. В некоторых вариантах изобретения, первичный амин, который образует амидную связь с дипептидным элементом пролекарства, находится на арильной группе в пара-положении. В некоторых вариантах изобретения, ароматический амин имеет структуру формулы III:

,

где m равно целому числу от 1 до 3.

В тех вариантах изобретения, в которых дипептидный элемент пролекарства связан с пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, посредством амина, присутствующего на арильной группе ароматической аминокислоты, пролекарства, у которых t½, например, составляет приблизительно 1 час, имеют дипептидную структуру:

,

где

R1 и R2 независимо представляют собой С118алкил или арил;

R3 представляет собой С118алкил, либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и арила, а R5 представляет собой амин или гидроксил.

В некоторых вариантах изобретения, в которых дипептидный элемент пролекарства связан с пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, посредством амина, присутствующего на арильной группе ароматической аминокислоты, пролекарства, у которых t½, например, составляет приблизительно 1 час, имеют дипептидную структуру:

,

где

R1 и R2 независимо представляют собой С118алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7,

R5 представляет собой NH2 или ОН; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, родственный глюкагону. Кроме того, настоящее изобретение относится к пролекарствам, содержащим дипептидный элемент пролекарства, связанный с ароматической аминокислотой, и имеющим t½, например, приблизительно от 6 до 24 часов, где указанный дипептид имеет структуру:

,

где

R1 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила и арила, или R1 и R2 связаны посредством (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и арила, а R5 представляет собой амин или N-замещенный амин.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарствам, имеющим дипептидный элемент пролекарства, связанный с ароматической аминокислотой, и имеющим t½, например, приблизительно от 6 до 24 часов, где указанный дипептид имеет структуру:

,

где

R1 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, (С118алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2 и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С118алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7,

R5 представляет собой NHR6;

R6 представляет собой Н, С18алкил, или R6 и R1, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Кроме того, настоящее изобретение относится к пролекарствам, имеющим дипептидный элемент пролекарства, связанный посредством ароматической аминокислоты, и t½, составляющее, например, приблизительно от 72 до 168 часов, где указанный дипептид имеет структуру:

,

где

R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила и арила;

R3 представляет собой С118алкил; или R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

каждый из R4 и R8 представляет собой водород; и

R5 выбран из группы, состоящей из амина, N-замещенного амина и гидроксила.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарствам, имеющим дипептидный элемент пролекарства, связанный посредством ароматической аминокислоты, и t½, составляющее, например, приблизительно от 72 до 168 часов, где указанный дипептид имеет структуру:

,

где

R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С18алкила, (C0-C4алкил)COOH и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, или R1 и R5, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо;

R3 представляет собой С118алкил; либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 представляет собой водород, либо он образует 4-6-членное гетероциклическое кольцо с R3;

R8 представляет собой водород;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой Н или С18алкил, либо R6 и R1, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, С118алкила, С218алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с ароматической аминокислотой посредством первичного амина, присутствующего в качестве арильного заместителя ароматической аминокислоты, где ароматическая аминокислота присутствует в положениях 10, 13, 22 или 25 пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов (в соответствии с нумерацией последовательности глюкагона, см., например, фиг. 10). В некоторых вариантах изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с ароматической аминокислотой, локализованной в положении 22 пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с N-концевым амином пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, включая, например, пептид, родственный глюкагону, или остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, где указанный дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где

R1 выбран из группы, состоящей из H и С118алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, CH2(C5-C9гетероарил), либо R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С18алкила, (C3-C6)циклоалкила, либо R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, либо R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из Н и ОН. В некоторых вариантах изобретения R1 представляет собой Н или С18алкил; R2 выбран из группы, состоящей из Н, С16алкила, CH2OH, (C1-C4алкил)NH2, (C3-C6циклоалкил) и CH2(C6арил)R7, либо R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо; R3 представляет собой С16алкил, а R4 выбран из группы, состоящей из Н, С14алкила, (C3-C6)циклоалкила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, и (C0-C4алкил)(C6-арил)R7, либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо. В другом варианте изобретения R3 представляет собой CH3, R5 представляет собой NHR6, а в другом альтернативном варианте R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, а R5 представляет собой NHR6.

В соответствии с другим вариантом изобретения, дипептидный элемент пролекарства связан с N-концевым амином пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, включая, например, пептид, родственный глюкагону, или остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, где указанный дипептидный элемент пролекарства имеет структуру:

,

где

R1 выбран из группы, состоящей из H и С118алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, С18алкила, С28алкенила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкил), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, CH2(C5-C9гетероарил), либо R1 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из С18алкила, (C3-C6)циклоалкила, либо R4 и R3, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 представляет собой NHR6 или ОН;

R6 представляет собой H, либо R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)СООН, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)ОН и галогена. В некоторых вариантах изобретения R1 представляет собой Н или С18алкил; R2 выбран из группы, состоящей из Н, С16алкила, CH2OH, (C1-C4алкил)NH2, (C3-C6циклоалкил) и CH2(C6арил)R7, либо R6 и R2, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо; R3 представляет собой С16алкил, а R4 выбран из группы, состоящей из Н, С14алкила, (C3-C6)циклоалкила, (С14алкил)OH, (С14алкил)SH и (C0-C4алкил)(C6-арил)R7, либо R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо. В другом варианте изобретения R3 представляет собой CH3, R5 представляет собой NHR6, а в другом альтернативном варианте R3 и R4, взятые вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, а R5 представляет собой NHR6.

В некоторых вариантах изобретения, Q представляет собой любую из SEQ ID NO: 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1908.

Пептиды, родственные глюкагону

В некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к пептидам, родственным глюкагону (как части группы, обозначенной «Q»). Термин «пептид, родственный глюкагону» означает пептиды, обладающие биологической активностью (как агонисты или антагонисты) по отношению к любым одному или нескольким рецепторам глюкагона, GLP-1, GLP-2 и GIP, и содержащие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% (например, на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) идентична последовательности по меньшей мере одного из соединений, таких как нативный глюкагон, нативный оксинтомодулин, нативный экзендин-4, нативный GLP-1, нативный GLP-2 или нативный GIP. Следует отметить, что в настоящей заявке рассматриваются все возможные активные подгруппы пептида, родственного глюкагону, например, пептиды, обладающие биологической активностью (как агонисты или антагонисты) по отношению к любым одному или нескольким рецепторам глюкагонам, или GLP-1, или рецепторам GIP, вместе со всеми возможными подгруппами последовательностей, идентичных каждому из перечисленных здесь нативных пептидов, например, пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности нативного глюкагона по всей его длине. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, родственным глюкагону, являются пептид, обладающий агонистической активностью по отношению к рецептору глюкагона, агонистической активностью по отношению к рецептору GIP, агонистической активностью по отношению к рецептору глюкагона/рецептору GLP-1, антагонистической активностью по отношению к рецептору глюкагона или антагонистической активностью по отношению к рецептору глюкагона и агонистической активностью по отношению к рецептору GLP-1. В некоторых вариантах изобретения, пептид сохраняет альфа-спиральную конформацию у С-концевой половины молекулы. В некоторых вариантах изобретения, пептид сохраняет положения, участвующие во взаимодействии с рецептором или в передаче сигнала рецептору, например, положение 3 глюкагона или положения 7, 10, 12, 13, 15 или 17 (1-37)GLP-1. В соответствии с этим, пептидом, родственным глюкагону, может быть пептид класса 1, класса 2, класса 3, класса 4 и/или класса 5, каждый из которых подробно описан в настоящей заявке.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, дипептидный элемент пролекарства может быть присоединен посредством амидной связи к любому из биологически активных соединений, ранее описанных в Международных заявках №№ PCT/US2008/08608 (поданной 3 января, 2008), PCT/US2008/053857 (поданной 13 февраля, 2008), PCT/US2009/47437 (поданной 16 июня, 2009), PCT/US2009/47438 (поданной 16 июня, 2009), PCT/US2009/47447 (поданной 16 июня, 2009), PCT/US2008/080973 (поданной 23 октября, 2008), и PCT/US2008/081333 (поданной 27 октября, 2008), описание которых точно вводится в настоящую заявку посредством ссылки. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, описанный здесь дипептидный элемент пролекарства может быть связан с биологически активными пептидами, описанными в PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437, PCT/US2009/47438, PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 и PCT/US2008/081333, либо посредством N-концевого амина или с аминогруппой боковой цепи лизина в положении 20, либо посредством ароматической аминогруппы 4-амино-фенилаланина вместо аминокислоты в положении 22 любого из описанных биологически активных пептидов. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, описанный здесь дипептидный элемент пролекарства связан посредством амидной связи с N-концевым амином биологически активного пептида, описанного в PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437, PCT/US2009/47438, PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 и PCT/US2008/081333. В некоторых вариантах изобретения, пептидом, принадлежащим к суперсемейству глюкагонов, является пептид, имеющий любую из SEQ ID NN: 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1908.

Модификации

Родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность нативного глюкагона (SEQ ID NO: 701) с модификациями. В репрезентативных вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид может иметь всего 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций по сравнению с нативной последовательностью глюкагона, например, консервативных или неконсервативных замен. В некоторых аспектах изобретения, описанные здесь модификации и замены были внесены в конкретные положения родственного глюкагону пептида, где нумерация этих положений соответствует нумерации положений в последовательности глюкагона (SEQ ID NO: 701). В некоторых вариантах изобретения, 1, 2, 3, 4 или 5 неконсервативных замен были внесены в любое из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, а также в любое из этих положений были внесены до 5 дополнительных консервативных замен. В некоторых вариантах изобретения, 1, 2 или 3 аминокислотных модификации вводят в положения аминокислот 1-16, и 1, 2 или 3 аминокислотных модификации вводят в положения аминокислот 17-26. В некоторых вариантах изобретения, такие родственные глюкагону пептиды сохраняют по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 природных аминокислот в соответствующих положениях нативного глюкагона (например, они имеют 1-7, 1-5 или 1-3 модификаций по сравнению с природным глюкагоном).

Резистентность к DPP-IV

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид содержит модификацию в положении 1 или 2, введенную для снижения чувствительности к расщеплению дипептидил-пептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положении 1 родственного глюкагону пептида (например, выбранного из пептидов, представленных на фиг. 10), заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положении 2 родственного глюкагону пептида заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положении 2 родственного глюкагону пептида не является D-серин.

Гидрофильные группы

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 4, или родственный глюкагону пептид класса 5) присоединен к гидрофильной группе (ковалентно связан с этой группой). Гидрофильные группы могут быть присоединены к родственному глюкагону пептиду в любых условиях, подходящих для реакции взаимодействия белка с активированной полимерной молекулой. При этом могут быть применены любые методы, известные специалистам, включая ацилирование, восстановительное алкилирование, реакцию присоединения Михаэля, алкилирование посредством тиола или другие методы хемоселективного конъюгирования/лигирования, где указанные методы осуществляют посредством взаимодействия реакционноспособной группы на молекуле ПЭГ (например, альдегидной группы, аминогруппы, сложноэфирной группы, тиоловой группы, α-галогенацетильной группы, малеимидогруппы или гидразиногруппой) с реакционноспособной группой на соединении-мишени (например, с альдегидной группой, аминогруппой, сложноэфирной группой, тиоловой группой, α-галогенацетильной группой, малеимидогруппой или гидразиногруппой). Активирующими группами, которые могут быть использованы для связывания водорастворимых полимеров с одним или несколькими белками, являются, но не ограничиваются ими, сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, трезилат, азиридин, оксиран и 5-пиридил. В случае присоединения к пептиду посредством восстановительного алкилирования, выбранный полимер должен содержать один реакционноспособный альдегид, который может регулировать степень полимеризации. См., например, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); и Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).

Что касается родственных глюкагону пептидов классов 1-3, то дополнительными активирующими группами, которые могут быть использованы для связывания водорастворимых полимеров с одним или несколькими белками, являются альфа-галогенированная ацильная группа (например, альфа-иодуксусная кислота, альфа-бромуксусная кислота, альфа-хлоруксусная кислота). В некоторых вариантах изобретения, в которых пептидом, родственным глюкагону, является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, тиол-содержащую аминокислоту модифицируют малеимид-активированным ПЭГ путем проведения реакции присоединения Михаэля, в результате чего получают ПЭГилированный пептид, содержащий тиоэфирную связь, представленную ниже:

В других вариантах изобретения, тиол аминокислоты родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют галогенацетил-активированным ПЭГ посредством реакции нуклеофильного замещения с получением ПЭГилированного пептида, содержащего тиоэфирную связь, представленную ниже:

Подходящими гидрофильными группами являются полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиэтилированные полиолы (например, ПОП), полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза, полиоксиэтилированный глицерин (ПОГ), полиоксиалкилены, пропиональдегид полиэтиленгликоля, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометокси-полиэтиленгликоль, моно-(C1-C10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, полиацетали, поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/ангидрида малеиновой кислоты, поли(бета-аминокислоты) (либо их гомополимеры, либо нестатистические сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля (ППГ) и другие полиалкиленоксиды, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, колоновые кислоты или другие полисахаридные полимеры, фиколл или декстран и их смеси. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из глюкозных субъединиц, связанных преимущественно α1-6-связями. Декстран существует в широких диапазонах молекулярных масс, например, приблизительно от 1 кД до 100 кД, или приблизительно от 5, 10, 15 или 20 кД до 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 кД.

В некоторых вариантах изобретения, гидрофильной группой является цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ) или другой водорастворимый полимер, который ковалентно связан с боковой цепью аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях 16, 17, 21, 24, 29, 40 указанного родственного глюкагону пептида, в пределах C-концевого удлинения или у C-концевой аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, нативная аминокислота в этом положении заменена аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для перекрестного связывания с гидрофильными группами, что облегчает связывание гидрофильной группы с пептидом. Репрезентативными аминокислотами являются Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или ацетилфенилаланин (Ac-Phe). В других вариантах изобретения, аминокислота модифицирована так, что она содержит гидрофильную группу, присоединенную к пептиду у С-конца.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, гидрофильная группа, например, полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей примерно из 500-40000 дальтон. В некоторых вариантах изобретения, полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей примерно из 500-5000 дальтон, или примерно 1000-5000 дальтон. В другом варианте изобретения, гидрофильная группа, например, полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу примерно от 10000 до 20000 дальтон. В других репрезентативных вариантах, гидрофильная группа, например, полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу примерно 20000-40000 дальтон.

Рассматриваются также гидрофильные полимеры с прямой или разветвленной цепью. Полученные препараты конъюгатов могут быть, в основном, монодисперсными или полидисперсными, и могут иметь примерно 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 или 2 полимерных группы на пептид.

Ацилирование

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) модифицирован так, что он содержит ацильную группу. Так, например, родственным глюкагону пептидом может быть пептид класса 1, класса 2 или класса 3, и этот пептид может содержать ацильную группу, которая является ненативной по отношению к природной аминокислоте. Ацилирование может быть осуществлено в любом положении родственного глюкагону пептида, включая любое из положений 1-29, положение в С-концевом удлинении или у C-концевой аминокислоты, при условии, что активность, сообщаемая неацилированным пептидом, родственным глюкагону, будет сохраняться после ацилирования. Так, например, если неацилированный пептид обладает глюкагон-агонистической активностью, то ацилированный пептид сохраняет такую глюкагон-агонистическую активность. Кроме того, например, если неацилированный пептид обладает глюкагон-антагонистической активностью, то ацилированный пептид сохраняет такую глюкагон-антагонистическую активность. Например, если неацилированный пептид обладает GLP-1-агонистической активностью, то ацилированный пептид сохраняет такую GLP-1-агонистическую активность. Неограничивающими примерами являются ацилирование в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то ацилирование может быть осуществлено в любом из положений 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). Ацильная группа может быть ковалентно связана непосредственно с аминокислотой родственного глюкагону пептида, либо она может быть связана с аминокислотой родственного глюкагону пептида посредством спейсера, где указанный спейсер расположен между аминокислотой родственного глюкагону пептида и ацильной группой. Родственные глюкагону пептиды могут быть ацилированы в том же самом положении аминокислоты, в котором присоединена гидрофильная группа, либо в другом положении. Неограничивающими примерами являются ацилирование в положении 10 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) и ПЭГилирование в одном или нескольких положениях в С-концевой части пептида глюкагона, например, в положениях 24, 28 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) в C-концевом удлинении или у C-конца (например, посредством присоединения C-концевого Cys).

В конкретном аспекте изобретения, родственный глюкагону пептид модифицируют посредством прямого ацилирования амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты родственного глюкагону пептида так, чтобы он содержал ацильную группу. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид подвергают прямому ацилированию посредством амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, ацилирование осуществляют в положениях 10, 20, 24 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). В соответствии с этим, ацилированный пептид, родственный глюкагону, может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 701, или модифицированную аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько описанных здесь аминокислотных модификаций, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована любой аминокислотой, содержащей амин, гидроксил или тиол боковой цепи. В некоторых конкретных вариантах изобретения, прямое ацилирование родственного глюкагону пептида осуществляют посредством амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты в положении 10 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа).

В некоторых вариантах изобретения, аминокислотой, содержащей амин боковой цепи, является аминокислота формулы I:

В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, аминокислотой формулы I является аминокислота, где n равно 4 (Lys) или n равно 3 (Orn).

В других вариантах изобретения, аминокислотой, содержащей гидроксил боковой цепи, является аминокислота формулы II:

В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, аминокислотой формулы II является аминокислота, где n равно 1 (Ser).

В других вариантах изобретения, аминокислотой, содержащей тиол боковой цепи, является аминокислота формулы III:

В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, аминокислотой формулы III является аминокислота, где n равно 1 (Cys).

В других вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол боковой цепи, представляет собой дизамещенную аминокислоту, имеющую такую же структуру, как и аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III, за исключением того, что атом водорода, связанный с альфа-углеродом аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III, заменен второй боковой цепью.

В некоторых вариантах изобретения, ацилированный пептид, родственный глюкагону, содержит спейсер, расположенный между пептидом и ацильной группой. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид ковалентно связан со спейсером, который, в свою очередь, ковалентно связан с ацильной группой. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид модифицируют так, чтобы он содержал ацильную группу, где такую модификацию осуществляют посредством реакции ацилирования амина, гидроксила или тиола спейсера, где указанный спейсер присоединен к боковой цепи аминокислоты в положениях 10, 20, 24 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) или у C-концевой аминокислоты родственного глюкагону пептида. Аминокислотой, к которой присоединен спейсер, может быть любая аминокислота, содержащая группу, способную образовывать связь со спейсером. Так, например, подходящей является аминокислота, содержащая -NH2, -OH, или -COOH боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). Кроме того, что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то подходящей является аминокислота (например, аминокислота, имеющая одно или два замещения в α-положении), содержащая -NH2, -OH или -COOH боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). В соответствии с этим, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 701 или ее модифицированную аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько описанных здесь аминокислотных модификаций, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа), заменена любой аминокислотой, содержащей амин, гидроксил или карбоксилат боковой цепи.

В некоторых вариантах изобретения, спейсер представляет собой аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол боковой цепи, либо дипептид или трипептид, включающий аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол боковой цепи. В некоторых вариантах изобретения, аминокислотный спейсер не является γ-Glu. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный спейсер не является γ-Glu-γ-Glu.

Если ацилирование происходит посредством аминогруппы аминокислоты спейсера, то такое ацилирование может происходить посредством альфа-амина аминокислоты или амина боковой цепи. В случае, если альфа-амин является ацилированным, то спейсерной аминокислотой может быть любая аминокислота. Так, например, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. В некоторых вариантах изобретения, в которых пептидом, родственным глюкагону, является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсерной аминокислотой может быть, например, гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аминогексановая кислота, 5-аминовалериановая кислота, 7-аминогептановая кислота, 8-аминооктановая кислота. Альтернативно, спейсерной аминокислотой может быть кислотный остаток, например, Asp и Glu. В случае если амин боковой цепи спейсерной аминокислоты является ацилированным, то спейсерной аминокислотой является аминокислота, содержащая амин боковой цепи, например, аминокислота формулы I (например, Lys или Orn). В этом случае, альфа-амин и амин боковой цепи спейсерной аминокислоты могут быть ацилированы, в результате чего пептид глюкагона становится диацилированным. Такие диацилированные молекулы являются вариантами настоящего изобретения.

Если ацилирование происходит посредством гидроксильной группы аминокислоты спейсера, то такой аминокислотой или одной из аминокислот дипептида или трипептида может быть аминокислота формулы II. В конкретном репрезентативном варианте, такой аминокислотой является Ser.

Если ацилирование происходит посредством тиоловой группы аминокислоты спейсера, то такой аминокислотой или одной из аминокислот дипептида или трипептида может быть аминокислота формулы III. В конкретном репрезентативном варианте, такой аминокислотой является Cys.

В некоторых вариантах изобретения, спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В конкретном варианте изобретения, спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В соответствии с этим, спейсер может содержать, например, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, где m равно любому целому числу от 1 до 6, а n равно любому целому числу от 2 до 12, например, 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту, которая поставляется фирмой Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

В некоторых вариантах изобретения, относящихся только к родственным глюкагону пептидам класса 1, класса 2 и класса 3, спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или более реакционноспособных групп, например, амин, гидроксильную группу, тиоловую группу и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиоловую группу и карбоксилат.

В некоторых вариантах изобретения, в которых пептидом, родственным глюкагону, является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсером является гидрофобный бифункциональный спейсер. Гидрофобные бифункциональные спейсеры известны специалистам. См., например, публикацию Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или более реакционноспособных группы, например, амин, гидроксильную группу, тиоловую группу и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиоловую группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобные бифункциональные спейсеры, содержащие карбоксилат, гидроксильную группу или тиоловую группу, известны специалистам, и такими спейсерами являются, например, 8-гидроксиокатновая кислота и 8-меркаптооктановая кислота.

В некоторых вариантах изобретения, бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, не является дикарбоновой кислотой, содержащей неразветвленный метилен, состоящий из 1-7 атомов углерода, расположенных между карбоксилатными группами. В некоторых вариантах изобретения, бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, представляет собой дикарбоновую кислоту, содержащую неразветвленный метилен, состоящий из 1-7 атомов углерода, расположенных между карбоксилатными группами.

В конкретных вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер (например, аминокислота, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер) имеет длину в 3-10 атомов (например, 6-10 атомов (например, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов). В более конкретных вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет длину примерно 3-10 атомов (например, 6-10 атомов), а ацильной группой является жирная C12-C18-ацильная группа, например, жирная C14-ацильная группа, жирная C16-ацильная группа, в результате чего общая длина спейсера и ацильной группы составляет 14-28 атомов, например, приблизительно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 атомов. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длина спейсера и ацильной группы составляет 17-28 (например, 19-26, 19-21) атомов.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или природную аминокислоту (включая, но не ограничиваясь ими, любую из описанных здесь аминокислот), содержащую аминокислотный остов длиной в 3-10 атомов (например, 6-аминогексановую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). Альтернативно, спейсером, присоединенным к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, может быть дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов длиной 3-10 атомов (например, 6-10 атомов). Каждая аминокислота дипептидного или трипептидного спейсера, присоединенного к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, может быть идентична другой(им) аминокислоте(ам) дипептида или трипептида, либо она может отличаться от этой(их) аминокислоты (аминокислот), и такие аминокислоты могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из природных и/или неприродных аминокислот, включая, например, любой из D- или L-изомеров природных аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), или любой из D- или L-изомеров неприродных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: β-аланина (β-Ala), N-α-метилаланина (Me-Ala), аминомасляной кислоты (Abu), γ-аминомасляной кислоты (γ-Abu), аминогексановой кислоты (ε-Ahx), аминоизомасляной кислоты (Aib), аминометилпирролкарбоновой кислоты, аминопиперидинкарбоновой кислоты, аминосерина (Ams), аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, аргинин-N-метокси-N-метиламида, β-аспарагиновой кислоты (β-Asp), азетидинкарбоновой кислоты, 3-(2-бензотиазолил)аланина, α-трет-бутилглицина, 2-амино-5-уреидо-н-валериановой кислоты (цитруллина, Cit), β-циклогексилаланина (Cha), ацетамидометилцистеина, диаминобутановой кислоты (Dab), диаминопропионовой кислоты (Dpr), дигидроксифенилаланина (DOPA), диметилтиазолидина (DMTA), γ-глутаминовой кислоты (γ-Glu), гомосерина (Hse), гидроксипролина (Hyp), N-метокси-N-метиламида изолейцина, метилизолейцина (MeIle), изонипекотиновой кислоты (Isn), метиллейцина (MeLeu), метиллизина, диметиллизина, триметиллизина, метанопролина, сульфоксида метионина (Met(O)), метионинсульфона (Met(О2)), норлейцина (Nle), метилнорлейцина (Me-Nle), норвалина (Nva), орнитина (Orn), пара-аминобензойной кислоты (PABA), пеницилламина (Pen), метилфенилаланина (MePhe), 4-хлорфенилаланина (Phe(4-Cl)), 4-фторфенилаланина (Phe(4-F)), 4-нитрофенилаланина (Phe(4-NO2)), 4-цианофенилаланина ((Phe(4-CN)), фенилглицина (Phg), пиперидинилаланина, пиперидинилглицина, 3,4-дегидропролина, пирролидинилаланина, саркозина (Sar), селеноцистеина (Sec), O-бензил-фосфосерина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты (Sta), 4-амино-5-циклогексил-3-гидроксигептановой кислоты (ACHPA), 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты (AHPPA), l,2,3,4-тетрагидро-изохинолин-3-карбоновой кислоты (Tic), тетрагидропиранглицина, тиенилаланина (Thi), O-бензил-фосфотирозина, O-фосфотирозина, метокситирозина, этокситирозина, О-(бис-диметиламино-фосфоно)тирозина, тетрабутиламина сульфата тирозина, метилвалина (MeVal) и алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты.

В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет общий отрицательный заряд, например, он содержит одну или две отрицательно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептид не является любым из дипептидов общей структуры A-B, где A выбран из группы, состоящей из Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe и Pro, а B выбран из группы, состоящей из Lys, His, Trp. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептидный спейсер выбран из группы, состоящей из Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляной кислоты-γ-аминомасляной кислоты и γ-Glu- γ-Glu.

В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, указанный родственный глюкагону пептид модифицирован так, что он содержит ацильную группу, введенную посредством ацилирования длинноцепочечного алкана родственным глюкагону пептидом. В конкретных аспектах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит амин, гидроксильную группу или тиоловую группу (например, октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол), которые реагируют с карбоксильной группой или активированной формой такой группы пептида, родственного глюкагону. Карбоксильная группа или ее активированная форма родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 может представлять собой часть боковой цепи аминокислоты (например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты) родственного глюкагону пептида, либо она может представлять собой часть пептидного остова.

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют так, чтобы он содержал ацильную группу, введенную путем ацилирования длинноцепочечного алкана спейсером, который присоединен к пептиду глюкагона. В конкретных аспектах изобретения, длинноцепочечный алкан содержит амин, гидроксильную или тиоловую группу, которые реагируют с карбоксильной группой или активированной формой такой группы спейсера. Подходящие спейсеры, содержащие карбоксильную группу или ее активированную форму, описаны в настоящей заявке, и такими спейсерами являются, например, бифункциональные спейсеры, например, аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры.

Используемый здесь термин «активированная форма карбоксильной группы» означает карбоксильную группу общей формулы R(C=О)X, где X представляет собой уходящую группу, а R представляет собой родственный глюкагону пептид или спейсер. Так, например, активированными формами карбоксильных групп могут быть, но не ограничиваются ими, ацилхлориды, ангидриды и сложные эфиры. В некоторых вариантах изобретения, активированной карбоксильной группой является сложный эфир с N-гидроксисукцинимидной (NHS) уходящей группой.

В тех аспектах изобретения, в которых длинноцепочечный алкан ацилирован родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3 или спейсером, длинноцепочечный алкан может иметь любой размер и может содержать углеродную цепь любой длины. Длинноцепочечный алкан может быть прямым или разветвленным. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечным алканом является C4-C30-алкан. Так, например, длинноцепочечным алканом может быть любой из таких алканов, как C4-алкан, C6-алкан, C8-алкан, C10-алкан, C12-алкан, C14-алкан, C16-алкан, C18-алкан, C20-алкан, C22-алкан, C24-алкан, C26-алкан, C28-алкан или C30-алкан. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан включает C8-C20-алкан, например, C14-алкан, C16-алкан или С18-алкан.

Кроме того, в некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, амин, гидроксильная группа или тиоловая группа родственного глюкагону пептида ацилированы холестериновой кислотой. В конкретном варианте изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 связан с холестериновой кислотой посредством алкилированного дез-амино-Cys-спейсера, то есть, спейсера, представляющего собой алкилированную 3-меркаптопропионовую кислоту.

Подходящие методы ацилирования пептидов посредством аминов, гидроксилов и тиолов известны специалистам. См, например, Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); и Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (методы ацилирования посредством гидроксила); и San and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (методы ацилирования посредством тиола); Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989).

Ацильная группа ацилированного пептида, родственного глюкагону, может иметь любой размер, например, углеродную цепь любой длины, и такая группа может быть прямой или разветвленной. В некоторых конкретных вариантах изобретения, ацильной группой является жирная C4-C30-кислота. Так, например, ацильной группой может быть любая из таких жирных кислот, как жирная C4-кислота, жирная C6-кислота, жирная C8-кислота, жирная C10-кислота, жирная C12-кислота, жирная C14-кислота, жирная C16-кислота, жирная C18-кислота, жирная C20-кислота, жирная C22-кислота, жирная C24-кислота, жирная C26-кислота, жирная C28-кислота или жирная C30-кислота. В некоторых вариантах изобретения, ацильной группой является жирная C8-С20-кислота, например, жирная C14-кислота или жирная C16-кислота.

В альтернативном варианте изобретения, ацильной группой является желчная кислота. Желчной кислотой может быть любая подходящая желчная кислота, включая, но не ограничиваясь ими, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и холестериновую кислоту.

Описанные здесь ацилированные пептиды, родственные глюкагону, могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они включали гидрофильную группу. В некоторых конкретных вариантах изобретения, гидрофильная группа может содержать полиэтиленгликолевую (ПЭГ) цепь. Введение гидрофильной группы может быть осуществлено любыми подходящими методами, такими как любой из описанных здесь методов. В соответствии с этим, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать SEQ ID NO: 701, включая любые описанные здесь модификации, в которых по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) содержит ацильную группу, и по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 16, 17, 21, 24 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа), в положении С-концевого удлинения или в положении С-концевой аминокислоты заменены на Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, а боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильной группой (например, ПЭГ). В некоторых вариантах изобретения, ацильная группа присоединена в положении 10 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно, посредством спейсера, содержащего Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, а гидрофильная группа введена в положение 24 остатка Cys.

Альтернативно, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать спейсер, где указанный спейсер был ацилирован и модифицирован так, чтобы он содержал гидрофильную группу. Неограничивающими примерами подходящих спейсеров являются спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

Алкилирование

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, родственный глюкагону пептид, например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5 были модифицированы так, чтобы они содержали алкильную группу, связанную с родственным глюкагону пептидом посредством эфирной, тиоэфирной или аминовой связи в целях увеличения времени полужизни в кровотоке и/или замедления начала их действия и/или увеличения продолжительности их действия, и/или повышения резистентности к протеазам, таким как DPP-IV. В репрезентативных вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом являются родственные глюкагону пептиды класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид содержит алкильную группу, которая не является нативной для природной аминокислоты.

Алкилирование может быть осуществлено в любом положении родственного глюкагону пептида, включая любое из положений 1-29, положение в С-концевом удлинении или С-концевое положение аминокислоты, при условии, что при этом, родственный глюкагону пептид будет сохранять агонистическую или антагонистическую активность по отношению к рецептору глюкагона, GLP-1 или другого родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах изобретения, если неалкилированный пептид обладает глюкагон-агонистической активностью, то алкилированный пептид сохраняет глюкагон-агонистическую активность. В других вариантах изобретения, если неалкилированный пептид обладает глюкагон-антагонистической активностью, то алкилированный пептид сохраняет глюкагон-антагонистическую активность. В некоторых вариантах изобретения, если неалкилированный пептид обладает GLP-1-агонистической активностью, то алкилированный пептид сохраняет GLP-1-агонистическую активность. Неограничивающими примерами является алкилирование в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то алкилирование может происходить в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). Алкильная группа может быть ковалентно связана непосредственно с аминокислотой родственного глюкагону пептида, либо она может быть связана с аминокислотой родственного глюкагону пептида посредством спейсера, где указанный спейсер расположен между аминокислотой родственного глюкагону пептида и алкильной группой. Родственные глюкагону пептиды могут быть алкилированы в том же самом положении аминокислоты, в котором присоединена гидрофильная группа, либо в другом положении аминокислоты. Неограничивающими примерами являются алкилирование в положении 10 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) и ПЭГилирование в одном или нескольких положениях в С-концевой части родственного глюкагону пептида, например, в положениях 24, 28 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) в С-концевом удлинении или у C-конца (например, посредством присоединения C-концевого Cys).

В конкретном аспекте изобретения, родственный глюкагону пептид модифицируют так, чтобы он содержал алкильную группу, и такую модификацию осуществляют посредством прямого алкилирования амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид подвергают прямому алкилированию посредством амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, алкилирование осуществляют в положениях 10, 20, 24 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). В соответствии с этим, алкилированный пептид, родственный глюкагону, может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 701, или модифицированную аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько описанных здесь аминокислотных модификаций, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) заменена любой аминокислотой, содержащей амин, гидроксил или тиол боковой цепи. В некоторых конкретных вариантах изобретения, прямое алкилирование родственного глюкагону пептида осуществляют посредством амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты в положении 10 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа).

В некоторых вариантах изобретения, аминокислотой, содержащей амин боковой цепи, является аминокислота формулы I. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, аминокислотой формулы I является аминокислота, где n равно 4 (Lys) или n равно 3 (Orn).

В других вариантах изобретения, аминокислотой, содержащей гидроксил боковой цепи, является аминокислота формулы II. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, аминокислотой формулы II является аминокислота, где n равно 1 (Ser).

В других вариантах изобретения, аминокислотой, содержащей тиол боковой цепи, является аминокислота формулы III. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, аминокислотой формулы III является аминокислота, где n равно 1 (Cys).

В других вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол боковой цепи, представляет собой дизамещенную аминокислоту, имеющую такую же структуру, как и аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III, за исключением того, что атом водорода, связанный с альфа-углеродом аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III, заменен второй боковой цепью.

В некоторых вариантах изобретения, алкилированный пептид, родственный глюкагону, содержит спейсер, расположенный между пептидом и алкильной группой. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид ковалентно связан со спейсером, который, в свою очередь, ковалентно связан с алкильной группой. В некоторых репрезентативных вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид модифицируют так, чтобы он содержал алкильную группу, посредством реакции алкилирования амина, гидроксила или тиола спейсера, где указанный спейсер присоединен к боковой цепи аминокислоты в положениях 10, 20, 24 или 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) родственного глюкагону пептида. Аминокислотой, к которой присоединен спейсер, может быть любая аминокислота, содержащая группу, способную образовывать связь со спейсером. Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то аминокислотой, к которой присоединен спейсер, может быть любая аминокислота (например, аминокислота, имеющая одно замещение в α-положении или α,α-дизамещенная аминокислота), содержащая группу, обеспечивающую связь со спейсером. Так, например, подходящей является аминокислота, содержащая -NH2, -OH или -COOH боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). В соответствии с этим, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 701 или ее модифицированную аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько описанных здесь аминокислотных модификаций, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) заменена любой аминокислотой, содержащей амин, гидроксил или карбоксилат боковой цепи.

В некоторых вариантах изобретения, спейсер представляет собой аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол боковой цепи, либо дипептид или трипептид, включающий аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол боковой цепи. В некоторых вариантах изобретения, аминокислотный спейсер не является γ-Glu. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный спейсер не является γ-Glu-γ-Glu.

Если алкилирование происходит посредством аминогруппы аминокислоты спейсера, то оно может быть осуществлено посредством альфа-амина аминокислоты или амина боковой цепи. В случае, если альфа-амин является алкилированным, то спейсерной аминокислотой может быть любая аминокислота. Так, например, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. Альтернативно, спейсерной аминокислотой может быть кислотный остаток, например, Asp и Glu. В репрезентативных вариантах изобретения, в которых пептидом, родственным глюкагону, является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аминогексановая кислота, 5-аминовалериановая кислота, 7-аминогептановая кислота, 8-аминооктановая кислота. Альтернативно, спейсерной аминокислотой, присоединенной к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, может быть кислотный остаток, например, Asp и Glu, при условии, что алкилирование будет происходить на альфа-амине кислотного остатка. В случае, если амин боковой цепи спейсерной аминокислоты является алкилированным, то спейсерной аминокислотой является аминокислота, содержащая амин боковой цепи, например, аминокислота формулы I (например, Lys или Orn). В этом случае, альфа-амин и амин боковой цепи спейсерной аминокислоты могут быть алкилированы, в результате чего пептид глюкагона становится диалкилированным. Такие диалкилированные молекулы являются вариантами настоящего изобретения.

Если алкилирование происходит посредством гидроксильной группы аминокислоты спейсера, то такой аминокислотой или одной из аминокислот спейсера может быть аминокислота формулы II. В конкретном репрезентативном варианте, такой аминокислотой является Ser.

Если алкилирование происходит посредством тиоловой группы аминокислоты спейсера, то такой аминокислотой или одной из аминокислот спейсера может быть аминокислота формулы III. В конкретном репрезентативном варианте, такой аминокислотой является Cys.

В некоторых вариантах изобретения, спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В конкретном варианте изобретения, спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В соответствии с этим, спейсер может содержать, например, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, где m равно любому целому числу от 1 до 6, а n равно любому целому числу от 2 до 12, например, 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту, которая поставляется фирмой Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

В некоторых вариантах изобретения, родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или более реакционноспособных группы, например, амин, гидроксильную группу, тиоловую группу и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофильный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиоловую группу и карбоксилат.

В некоторых вариантах изобретения, спейсером, присоединенным к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, является гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или более реакционноспособных группы, например, амин, гидроксильную группу, тиоловую группу и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах изобретения, гидрофобный бифункциональный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиоловую группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобные бифункциональные спейсеры, содержащие карбоксилат, гидроксильную группу или тиоловую группу, известны специалистам, и такими спейсерами являются, например, 8-гидроксиокатновая кислота и 8-меркаптооктановая кислота.

В конкретных вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер (например, аминокислота, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер) имеет длину в 3-10 атомов (например, 6-10 атомов (например, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов)). В более конкретных вариантах изобретения, спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину примерно 3-10 атомов (например, 6-10 атомов), а алкильной группой является C12-C18-алкильная группа, например, C14-алкильная группа, C16-алкильная группа, в результате чего общая длина спейсера и алкильной группы составляет 14-28 атомов, например, приблизительно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 атомов. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длина спейсера и алкила составляет 17-28 (например, 19-26, 19-21) атомов.

В соответствии с некоторыми вышеуказанными вариантами изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или неприродную аминокислоту, содержащую аминокислотный остов длиной в 3-10 атомов (например, 6-аминогексановую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). Альтернативно, спейсером, присоединенным к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, может быть дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов длиной 3-10 атомов (например, 6-10 атомов). Дипептидный или трипептидный спейсер, присоединенный к родственному глюкагону пептиду класса 1, класса 2 или класса 3, может состоять из природных и/или неприродных аминокислот, включая, например, любую из упомянутых здесь аминокислот. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет общий отрицательный заряд, например, он содержит одну или две отрицательно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептидный спейсер выбран из группы, состоящей из Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляной кислоты-γ-аминомасляной кислоты и γ-Glu-γ-Glu. В некоторых вариантах изобретения, дипептидный спейсер не является γ-Glu-γ-Glu.

Подходящие методы алкилирования пептидов посредством аминов, гидроксилов и тиолов известны специалистам. Так, например, для образования эфирной связи между родственным глюкагону пептидом и алкильной группой может быть проведена реакция синтеза простого эфира Уильямсона. Кроме того, образование эфирной, тиоэфирной или аминовой связи может быть достигнуто посредством реакции нуклеофильного замещения пептида с алкилгалогенидом.

Алкильная группа алкилированного пептида, родственного глюкагону, может иметь любой размер, например, углеродную цепь любой длины, и такая группа может быть прямой или разветвленной. В некоторых вариантах изобретения, алкильной группой является C4-C30-алкил. Так, например, алкильной группой может быть любой из алкилов, таких как C4-алкил, C6-алкил, C8-алкил, C10-алкил, C12-алкил, C14-алкил, C16-алкил, C18-алкил, C20-алкил, C22-алкил, C24-алкил, C26-алкил, C28-алкил или C30-алкил. В некоторых вариантах изобретения, алкильной группой является C8-С20-алкил, например, C14-алкил или C16-алкил.

В некоторых конкретных вариантах изобретения, алкильная группа содержит стероидную часть желчной кислоты, например, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты, таурохолевой кислоты, гликохолевой кислоты и холестериновой кислоты.

В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, указанный родственный глюкагону пептид модифицирован так, что он содержит алкильную группу, посредством реакции нуклеофильного замещения длинноцепочечного алкана с родственным глюкагону пептидом, где указанный родственный глюкагону пептид содержит уходящую группу, подходящую для проведения реакции нуклеофильного замещения. В конкретных аспектах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, нуклеофильная группа длинноцепочечного алкана содержит амин, гидроксильную группу или тиоловую группу (например, октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол). Уходящей группой родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 может быть часть боковой цепи аминокислоты или часть пептидного остова. Подходящими уходящими группами являются, например, N-гидроксисукцинимид, галогены и сложные эфиры сульфоновой кислоты.

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 модифицирован так, что он содержит алкильную группу, посредством реакции нуклеофильного замещения длинноцепочечного алкана со спейсером, присоединенным к родственному глюкагону пептиду, где указанный спейсер содержит уходящую группу. В конкретных аспектах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит амин, гидроксильную группу или тиоловую группу. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсером, содержащим уходящую группу, может быть любой из обсуждаемых здесь спейсеров, например, аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры, которые дополнительно включают подходящую уходящую группу.

В тех аспектах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, и в которых длинноцепочечный алкан алкилирован родственным глюкагону пептидом или спейсером, длинноцепочечный алкан может иметь любой размер и может содержать углеродную цепь любой длины. Длинноцепочечный алкан может быть линейным или разветвленным. В некоторых аспектах изобретения, длинноцепочечным алканом является C4-C30-алкан. Так, например, длинноцепочечным алканом может быть любой из таких алканов, как C4-алкан, C6-алкан, C8-алкан, C10-алкан, C12-алкан, C14-алкан, C16-алкан, C18-алкан, C20-алкан, C22-алкан, C24-алкан, C26-алкан, C28-алкан или C30-алкан. В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит C8-C20-алкан, например, C14-алкан, C16-алкан или C18-алкан.

Кроме того, в некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, алкилирование может происходить между родственным глюкагону пептидом и холестериновой группой. Так, например, гидроксильная группа холестерина может заменять уходящую группу на длинноцепочечном алкане с образованием продукта «холестерин - пептид глюкагон».

Описанные здесь алкилированные пептиды, родственные глюкагону, могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они включали гидрофильную группу. В некоторых конкретных вариантах изобретения, гидрофильная группа может содержать полиэтиленгликолевую (ПЭГ) цепь. Введение гидрофильной группы может быть осуществлено любыми подходящими методами, такими как любой из описанных здесь методов. В соответствии с этим, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать SEQ ID NO: 701 или ее модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько описанных здесь аминокислотных модификаций, в которых по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) содержит алкильную группу, и по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 16, 17, 21, 24 или 29, в положении С-концевого удлинения или в положении С-концевой аминокислоты заменены на Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, а боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильной группой (например, ПЭГ). В некоторых вариантах изобретения, алкильная группа присоединена в положении 10 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно, посредством спейсера, содержащего Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, а гидрофильная группа введена в положение 24 остатка Cys.

Альтернативно, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать спейсер, где указанный спейсер был алкилирован и модифицирован так, чтобы он содержал гидрофильную группу. Неограничивающими примерами подходящих спейсеров являются спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

Стабилизация альфа-спиральной структуры

В некоторых вариантах изобретения, для стабилизации трехмерной структуры карбокси-концевой части (например, аминокислот 12-29 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа)) родственного глюкагону пептида, между двумя аминокислотными боковыми цепями создают внутримолекулярный мостик. Две аминокислотных боковых цепи могут быть связаны друг с другом посредством водородных связей, ионных взаимодействий, таких как образование солевых мостиков, или посредством ковалентных связей.

В некоторых вариантах изобретения, внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые находятся на расстоянии 3 аминокислот, например, аминокислот в положениях i и i+4, где i равно любому целому числу от 12 до 25 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25) в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа. Более конкретно, боковые цепи аминокислотных пар 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28 (аминокислотных пар, в которых i = 12, 16, 20 или 24) в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа связаны друг с другом, и тем самым, стабилизируют альфа-спираль глюкагона. Альтернативно, i может быть равно 17.

В некоторых вариантах изобретения, где аминокислоты в положениях i и i+4 связаны внутримолекулярным мостиком, размер линкера составляет примерно 8 атомов или примерно 7-9 атомов.

В других вариантах изобретения, внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые находятся на расстоянии 2 аминокислот, например, аминокислот в положениях j и j+3, где j равно любому целому числу от 12 до 26 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 26) в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа. В некоторых конкретных вариантах изобретения, j равно 17.

В некоторых конкретных вариантах изобретения, где аминокислоты в положениях j и j+3 связаны внутримолекулярным мостиком, размер линкера составляет примерно 6 атомов или примерно 5-7 атомов.

В других вариантах изобретения, внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые находятся на расстоянии 6 аминокислот, например, аминокислот в положениях k и k+7, где k равно любому целому числу от 12 до 22 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22) в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа. В некоторых конкретных вариантах изобретения, k=12, 13 или 17. В репрезентативном варианте изобретения, k равно 17.

Примерами аминокислотных пар, способных ковалентно связываться с образованием 6-атомного линкерного мостика, являются Orn и Asp, Glu и аминокислота формулы I, где n равно 2, и гомоглутаминовая кислота и аминокислота формулы I, где n равно 1, и где соединение формулы I представляет собой:

Примерами аминокислотных пар, обладающих способностью ковалентно связываться с образованием 7-атомного линкерного мостика, являются Orn-Glu (лактамовое кольцо); Lys-Asp (лактам); или гомоSer-гомоGlu (лактон). Примерами аминокислотных пар, которые могут образовывать 8-атомный линкер, являются Lys-Glu (лактам); гомоLys-Asp (лактам); Orn-гомоGlu (лактам); 4-аминоPhe-Asp (лактам) или Tyr-Asp (лактон). Примерами аминокислотных пар, которые могут образовывать 9-атомный линкер, являются гомоLys-Glu (лактам); Lys-гомоGlu (лактам); 4-аминоPhe-Glu (лактам); или Tyr-Glu (лактон). Любая из боковых цепей на этих аминокислотах может быть дополнительно замещена другими химическими группами, при условии, что это не будет приводить к разрушению трехмерной структуры альфа-спирали. Для среднего специалиста в данной области очевидно, что в целях создания стабилизирующей структуры аналогичного размера с нужным эффектом могут быть использованы альтернативные пары или альтернативные аминокислотные аналоги, включая химически модифицированные производные. Так, например, дисульфидный мостик между двумя гомоцистеинами имеет длину в 6 атомов и может быть дополнительно модифицирован для сообщения ему нужного эффекта. Даже в отсутствии ковалентной связи, аминокислотные пары, описанные выше, или аналогичные пары, известные среднему специалисту в данной области, могут также стабилизировать альфа-спираль посредством нековалентных связей, например, посредством образования солевых мостиков или водородных связей.

Размер лактамового кольца может варьироваться в зависимости от боковых цепей аминокислоты, а в некоторых вариантах изобретения, лактам образуется посредством связывания боковых цепей лизина с боковой цепью глутаминовой кислоты. Другими репрезентативными вариантами (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) являются нижеследующие пары, которые связаны, но необязательно, лактамовыми мостиками, а именно: Glu в положении 12 с Lys в положении 16; нативный Lys в положении 12 с Glu в положении 16; Glu в положении 16 с Lys в положении 20; Lys в положении 16 с Glu в положении 20; Glu в положении 20 с Lys в положении 24; Lys в положении 20 с Glu в положении 24; Glu в положении 24 с Lys в положении 28; Lys в положении 24 с Glu в положении 28.

Альтернативно, порядок амидной связи в лактамовом кольце может быть обратным (например, лактамовое кольцо может быть образовано между боковыми цепями Lys12 и Glu16 или, альтернативно, между Glu12 и Lys16).

Внутримолекулярные мостики, не являющиеся лактамовым мостиком, могут быть использованы для стабилизации альфа-спирали родственных глюкагону пептидов. В некоторых вариантах изобретения, внутримолекулярным мостиком является гидрофобный мостик. В этом случае, внутримолекулярный мостик необязательно присутствует между боковыми цепями двух аминокислот, которые являются частью гидрофобной поверхности альфа-спирали родственного глюкагону пептида. Так, например, одной из аминокислот, связанных гидрофобным мостиком, может быть аминокислота в положении 10, 14 и 18 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа).

В одном из конкретных аспектов, для перекрестного связывания одного или двух «витков» альфа-спирали родственного глюкагону пептида проводят реакцию метатезиса олефинов, осуществляемую с использованием полностью углеводородной системы перекрестного связывания. В этом случае, родственный глюкагону пептид может содержать α-метилированные аминокислоты, несущие олефиновые боковые цепи, имеющие различную длину и стереохимическую R- или S-конфигурацию в положениях i и i+4 или i+7. Так, например, олефиновая боковая цепь может содержать (CH2)n, где n равно любому целому числу от 1 до 6. В некоторых вариантах изобретения, при длине перекрестной связи в 8 атомов, n равно 3. Подходящие методы образования таких внутримолекулярных мостиков описаны в литературе. См, например, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) и Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004). Альтернативно, пептид глюкагона может содержать остатки O-аллил-Ser, расположенные на смежных спиральных витках, которые образуют мостик в результате проведения катализируемой рутением реакции метатезиса с замыканием кольца. Такие методы перекрестного связывания описаны, например, Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998).

В другом конкретном аспекте изобретения, для перекрестного связывания одного «витка» альфа-спирали используют неприродную аминокислоту тио-диаланин, лантионин, который широко применяется в качестве пептидомиметика цистина. Подходящие методы циклизации на основе лантионина известны специалистам. См., например, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45:1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51:432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); и Osapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).

В некоторых вариантах изобретения, для стабилизации альфа-спирали пептида глюкагона используют α,ω-диаминоалкановые линкеры, например, 1,4-диаминопропан и 1,5-диаминопентан, расположенные между двумя остатками Glu в положениях i и i+7. Такие связи приводят к образованию мостика длиной в 9 атомов или более, в зависимости от длины диаминоалканового линкера. Подходящие методы получения пептидов, перекрестно связанных друг с другом посредством таких линкеров, описаны в литературе. См., например, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997).

В другом варианте изобретения, для перекрестного связывания одного или двух витков альфа-спирали родственного глюкагону пептида используют дисульфидный мостик. Альтернативно, для стабилизации альфа-спирали родственного глюкагону пептида используют модифицированный дисульфидный мостик, в котором один или оба атома серы заменены метиленовой группой с последующей изостерической макроциклизацией. Подходящие методы модификации пептидов посредством образования дисульфидных мостиков или реакции циклизации с атомом серы, описаны, например, Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) и Rudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964).

В другом варианте изобретения, альфа-спираль родственного глюкагону пептида стабилизируют посредством связывания атома металла с двумя остатками His или парой остатков His и Cys, расположенных в положениях i и i+4. Атомом металла может быть, например, Ru(III), Cu(II), Zn(II) или Cd(II). Такие методы стабилизации альфа-спирали посредством связывания с металлом известны специалистам. См., например, Andrews and Tabor, Tetrahedron 55:11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112:1630-1632 (1990); и Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997).

Альфа-спираль родственного глюкагону пептида может быть альтернативно стабилизирована другими методами циклизации пептидов, описанными Davies, J. Peptide. Sci. 9:471-501 (2003). Альфа-спираль может быть стабилизирована посредством образования амидного мостика, тиоэфирного мостика, мостика из сложного тиоэфира, карбамидного мостика, карбаматного мостика, сульфонамидного мостика и т.п. Так, например, мостик из сложного тиоэфира может быть образован между С-концом и боковой цепью остатка Cys. Альтернативно, сложный тиоэфир может быть образован посредством боковых цепей аминокислот, имеющих тиол (Cys) и карбоновую кислоту (например, Asp, Glu). В другом методе, перекрестно-сшивающий агент, такой как дикарбоновая кислота, например, субериновая кислота (октандионовая кислота) и т.п., могут вводить связь между двумя функциональными группами аминокислотной боковой цепи, такими как свободная аминогруппа, гидроксильная группа, тиоловая группа и их комбинации.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, альфа-спираль родственного глюкагону пептида стабилизируют путем введения гидрофобных аминокислот в положения i и i+4. Так, например, i может представлять собой Tyr, а i+4 может представлять собой Val или Leu; i может представлять собой Phe, а i+4 может представлять собой Cys или Met; I может представлять собой Cys, а i+4 может представлять собой Met; или i может представлять собой Phe, а i+4 может представлять собой Ile. Следует отметить, что в целях настоящего изобретения, вышеуказанные аминокислотные пары могут быть расположены в обратном порядке, например, указанная аминокислота в положении i может, альтернативно, присутствовать в положении i+4, а аминокислота в положении i+4 может присутствовать в положении i.

В соответствии с другими вариантами изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является пептид, обладающий глюкагон-агонистической активностью, GIP-агонистической активностью, глюкагон-антагонистической активностью и GLP-1-активностью, альфа-спираль стабилизируют посредством включения (путем замены или инсерции аминокислот) одной или нескольких альфа-спираль-стабилизирующих аминокислот в С-концевой части родственного глюкагону пептида (приблизительно аминокислот 12-29 в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа). В конкретном варианте изобретения, альфа-спираль-стабилизирующей аминокислотой является α,α-дизамещенная аминокислота, включая, но не ограничиваясь ими, любую из таких аминокислот, как аминоизомасляная кислота (AIB), аминокислота, замещенная в двух положениях одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктана или циклогептана (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновой кислоты). В некоторых вариантах изобретения, аминокислоты в одном, двух, трех, четырех или более положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 родственного глюкагону пептида заменены α,α-дизамещенной аминокислотой. В конкретном варианте изобретения, аминокислоты в одном, двух, трех, четырех или во всех положениях 16, 20, 21 и 24 заменены AIB.

Конъюгаты

В настоящем описании также рассматриваются конъюгаты, в которых родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) связан, необязательно посредством ковалентной связи и, необязательно, посредством линкера, с другой частью конъюгата. Связывание может быть осуществлено посредством ковалентных химических связей, физических сил, таких как электростатические силы; водородных связей, ионных связей, ван-дер-ваальсовых связей, либо гидрофобных или гидрофильных взаимодействий. При этом могут быть использованы различные системы нековалентного связывания, включая биотин-авидин, лиганд/рецептор, фермент/субстрат, нуклеиновая кислота/белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, липид/белок, связывающийся с липидом, партнеры по связыванию с молекулой клеточной адгезии или любые партнеры по связыванию или их фрагменты, обладающие аффинностью по отношению друг к другу.

Родственный глюкагону пептид может быть связан с частями конъюгата посредством прямой ковалентной связи путем проведения реакции взаимодействия нужных аминокислотных остатков пептида с органическим дериватизирующим агентом, способным вступать в реакцию взаимодействия с выбранными боковыми цепями или с N- или C-концевыми остатками этих нужных аминокислот. Реакционноспособными группами на пептиде или на части конъюгата являются, например, альдегид, аминогруппа, сложный эфир, тиол, α-галогенацетил, малеимидогруппа или гидразиногруппа. Дериватизирующими агентами являются, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидоэфир (конъюгированный посредством цистеиновых остатков), N-гидроксисукцинимид (конъюгированный посредством лизиновых остатков), глутаральдегид, ангидрид янтарной кислоты или другие агенты, известные специалистам. Альтернативно, части конъюгата могут быть связаны с пептидом посредством промежуточных носителей, таких как полисахаридные или полипептидные носители. Примерами полисахаридных носителей являются аминодекстран. Примерами подходящих полипептидных носителей являются полилизин, полиглутаминовая кислота, полиаспарагиновая кислота, их сополимеры и смешанные полимеры этих и других аминокислот, например, серинов, сообщающие загруженному носителю нужные свойства, такие как растворимость.

Цистеинильные остатки чаще всего подвергают реакции взаимодействия с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с получением карбоксиметиловых или карбоксиамидометиловых производных. Цистеиниловые остатки также дериватизируют посредством реакции взаимодействия с бромтрифторацетоном, альфа-бром-β-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлорбензоатом ртути, 2-хлор-ртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.

Гистидильные остатки дериватизируют посредством реакции взаимодействия с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5-7,0, поскольку этот агент обладает относительной специфичностью к гистидиловой боковой цепи. Может быть также использован пара-бромфенацилбромид, при этом, реакцию, предпочтительно, осуществляют в 0,1 M какодилате натрия при pH 6,0.

Лизинильные и амино-концевые остатки подвергают реакции взаимодействия с ангидридами янтарной кислоты или другой карбоновой кислоты. Дериватизация этими агентами приводит к изменению заряда лизинильных остатков на противоположный. Другими подходящими реагентами для дериватизации альфа-амино-содержащих остатков являются сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, фосфат пиридоксаля, пиридоксаль, хлорборогидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, O-метилизомочевина, 2,4-пентандион и катализируемая трансаминазой реакция с глиоксилатом.

Аргинильные остатки модифицируют посредством реакции взаимодействия с одним или несколькими стандартными реагентами, такими как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. При дериватизации аргининовых остатков необходимо, чтобы эта реакция была осуществлена в основных условиях, что обусловлено высоким pKa функциональной группы гуанидина. Кроме того, эти реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина.

Может быть осуществлена специфическая модификация тирозильных остатков, которая представляет особый интерес с точки зрения введения спектральных меток в тирозильные остатки посредством реакции взаимодействия с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Для получения О-ацетилтирозильных молекул и 3-нитропроизводных чаще всего используют N-ацетилимидазол и тетранитрометан, соответственно.

Боковые карбоксильные группы (аспартильную или глутамильную) селективно модифицируют посредством реакции взаимодействия с карбодиимидами (R-N=C=N-R'), где R и R' представляют собой различные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки превращают в аспарагинильные и глутаминильные остатки посредством реакции взаимодействия с ионами аммония.

Другими модификациями являются гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование альфа-аминогрупп лизиновых, аргининовых и гистидиновых боковых цепей (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), дезамидирование аспарагина или глутамина, ацетилирование N-концевого амина и/или амидирование или эстерификация С-концевой группы карбоновой кислоты.

Ковалентная модификация другого типа включает химическое или ферментативное связывание гликозидов с пептидом. Сахар(а) может(могут) быть присоединен(ы) (a) к аргинину и гистидину, (b) к свободным гидроксильным группам, (c) к свободным сульфгидрильным группам, таким как сульфгидрильные группы цистеина, (d) к свободным гидроксильным группам, таким как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина, (e) к ароматическим остаткам, таким как остатки тирозина или триптофана, или (f) к амидной группе глутамина. Эти методы описаны в заявке WO87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и в публикации Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Репрезентативными частями конъюгата, которые могут быть связаны с любым из описанных здесь родственных глюкагону пептидов, являются, но не ограничиваются ими, гетерологичный пептид или полипептид (включая, например, белок плазмы), нацеливающий агент, иммуноглобулин или его часть (например, вариабельная область, CDR или Fc-область), диагностическая метка, такая как радиоизотоп, флуорофор или ферментативная метка, полимер, включая водорастворимые полимеры или другие терапевтические или диагностические агенты. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему родственный глюкагону пептид согласно изобретению и белок плазмы, где указанный белок плазмы выбран из группы, состоящей из альбумина, трансферина, фибриногена и глобулинов. В некоторых вариантах изобретения, белок плазмы, который является частью конъюгата, представляет собой альбумин или трансферин. В некоторых вариантах изобретения, линкер содержит цепь длиной примерно от 1 до 60 атомов или от 1 до 30 атомов или более, а также от 2 до 5 атомов, от 2 до 10 атомов, от 5 до 10 атомов или от 10 до 20 атомов. В некоторых вариантах изобретения, все атомы цепи представляют собой атомы углерода. В некоторых вариантах изобретения, атомы цепи в остове линкера выбраны из группы, состоящей из C, O, N и S. Атомы цепи и линкеры могут быть выбраны по их предполагаемой растворимости (гидрофильности), в результате чего может быть получен более растворимый конъюгат. В некоторых вариантах изобретения, линкер вводит функциональную группу, которую подвергают расщеплению ферментом или другим катализатором, или создают гидролитические условия, существующие в ткани- или в органе- или в клетке-мишени. В некоторых вариантах изобретения, линкер имеет длину, достаточную для снижения потенциала, создающего стерическое затруднение. Если линкер является ковалентной связью или пептидильной связью, а конъюгатом является полипептид, то весь конъюгат может представлять собой гибридный белок. Такие пептидильные линкеры могут иметь любую длину. Репрезентативные линкеры имеют длину примерно от 1 до 50, от 5 до 50, от 3 до 5, от 5 до 10, от 5 до 15 или от 10 до 30 аминокислот. Такие гибридные белки могут быть альтернативно получены методами рекомбинантных ДНК, известными среднему специалисту в данной области.

Как указывалось выше, в некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды являются конъюгированными, например, они присоединены к иммуноглобулину или к его части (например, к вариабельной области, CDR или Fc-области). Иммуноглобулинами известных типов (Ig) являются IgG, IgA, IgE, IgD или IgM. Fc-область представляет собой C-концевую область тяжелой цепи Ig, которая ответственна за связывание с Fc-рецепторами, обладающими активностью, такой как рециклинг (увеличивающий время полужизни), антителозависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC).

Так, например, в соответствии с некоторыми определениями, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 до С-конца тяжелой цепи. «Шарнирная область» обычно простирается от Glu216 до Pro230 человеческого IgG1 (шарнирные области IgG других изотипов могут быть сопоставлены с последовательностью IgG1 путем их выравнивания и сравнения цистеинов, участвующих в образовании цистеиновых связей). Fc-область IgG включает два константных домена, CH2 и CH3. Домен CH2 Fc-области человеческого IgG обычно простирается от аминокислоты 231 до аминокислоты 341. Домен CH3 Fc-области человеческого IgG обычно простирается от аминокислоты 342 до аминокислоты 447. Положения аминокислот иммуноглобулинов или их фрагментов или областей указаны в соответствии с нумерацией по Кэбату (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.). В родственном варианте изобретения, Fc-область может содержать одну или несколько нативных или модифицированных константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина, отличающихся от CH1, например, CH2- и CH3-области IgG и IgA, или CH3- и CH4-области IgE.

Подходящими частями конъюгата являются части последовательности иммуноглобулина, включающие FcRn-связывающий сайт. FcRn, рецептор «спасения», ответственен за рециклинг иммуноглобулинов и за их возвращение в кровоток. Область Fc-части IgG, которая связывается с FcRn-рецептором, была охарактеризована с помощью рентгеновского кристаллографического анализа (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Основная область контакта Fc с FcRn расположена рядом с областью стыка CH2- и CH3-доменов. Все контакты Fc-FcRn осуществляются в одной тяжелой цепи Ig. Основными контактными сайтами являются аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 CH2-домена и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 CH3-домена.

Некоторыми частями конъюгата могут быть, а могут и не быть, сайт(ы) связывания с FcγR. FcγR ответственен за ADCC и CDC. Примерами положений в Fc-области, в которых осуществляется непосредственный контакт с FcγR, являются аминокислоты 234-239 (нижняя часть шарнирной области), аминокислоты 265-269 (петля B/C), аминокислоты 297-299 (петля C'/E) и аминокислоты 327-332 (петля F/G) (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). Нижняя часть шарнирной области IgE также участвует в связывании с FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Остатки, участвующие в связывании с рецептором IgA, описаны в публикации Lewis et al., (J Immunol. 175:6694-701, 2005). Аминокислотные остатки, участвующие в связывании с рецептором IgE, описаны в публикации Sayers et al. (J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004).

Аминокислотные модификации могут быть внесены в Fc-область иммуноглобулина. Такие модифицированные Fc-области содержат по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в CH3-домене Fc-области (остатки 342-447) и/или по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в СН2-домене Fc-области (остатки 231-341). Очевидно, что мутациями, сообщающими повышенную аффинность по отношению к FcRn, являются T256A, T307A, E380A и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591). Другие мутации могут снижать уровень связывания Fc-области с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA, но при этом, значительного снижения аффинности по отношению к FcRn не происходит. Так, например, замена остатка Asn в положении 297 Fc-области остатком Ala или другой аминокислотой приводит к удалению в высокой степени консервативного сайта N-гликозилирования и может приводить к снижению иммуногенности и одновременно к увеличению времени полужизни Fc-области, а также к снижению уровня связывания с FcγR (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). В положениях 233-236 IgG1 были сделаны аминокислотные модификации, снижающие уровень связывания с FcγR (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Некоторые репрезентативные аминокислотные замены описаны в патентах США № 7355008 и 7381408, каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

рПЭГ

В некоторых вариантах изобретения, конъюгат согласно изобретению содержит пептид, принадлежащий к суперсемейству глюкагонов, включая родственные глюкагону пептиды, остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, связанные со вспомогательным пептидом, обладающим способностью образовывать удлиненную конформацию, аналогичную конформации химического ПЭГ (например, рекомбинантную молекулу ПЭГ (рПЭГ)), такую как конформация, описанная в публикации Международной патентной заявки № WO2009/023270 и в публикации заявки на патент США № US2008/0286808. Молекула рПЭГ не является полиэтиленгликолем. В некоторых аспектах изобретения, молекулой рПЭГ является полипептид, содержащий одну или несколько аминокислот, таких как глицин, серин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аланин или пролин. В некоторых аспектах изобретения, рПЭГ представляет собой гомополимер, например, поли-глицин, поли-серин, поли-глутаминовую кислоту, поли-аспарагиновую кислоту, поли-аланин или поли-пролин. В других вариантах изобретения, рПЭГ содержит повторы аминокислот двух типов, например, поли(Gly-Ser), поли(Gly-Glu), поли(Gly-Ala), поли(Gly-Asp), поли(Gly-Pro), поли(Ser-Glu) и т.п. В некоторых аспектах изобретения, рПЭГ содержит аминокислоты трех типов, например, поли(Gly-Ser-Glu). В конкретных аспектах изобретения, рПЭГ увеличивает время полужизни пептида, принадлежащего к суперсемейству глюкагонов, или остеокальцина. В некоторых аспектах изобретения, рПЭГ имеет суммарный положительный или суммарный отрицательный заряд. В некоторых аспектах изобретения, рПЭГ не имеет вторичной структуры. В некоторых вариантах изобретения, рПЭГ имеет длину, равную 10 аминокислотам или более, а в некоторых вариантах изобретения, он имеет длину примерно от 40 до 50 аминокислот. В некоторых аспектах изобретения, вспомогательный пептид присоединен к N- или C- концу пептида согласно изобретению посредством пептидной связи или сайта расщепления протеиназой, или встроен в петли пептида согласно изобретению. В некоторых аспектах изобретения, рПЭГ содержит аффинную метку или связан с ПЭГ, который имеет размер более 5 кДа. В некоторых вариантах изобретения, рПЭГ сообщает пептиду согласно изобретению повышенный гидродинамический радиус, увеличение время полужизни в сыворотке, повышенную резистентность к протеазе или повышенную растворимость, а в некоторых аспектах изобретения, пониженную иммуногенность.

Гибридные пептиды - C-концевое удлинение

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид может содержать C-конец или C-концевую аминокислотную последовательность, включая, но не ограничиваясь ими: COOH, CONH2, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:710), GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO: 711), карбокси-концевое удлинение оксинтомодулина, KRNRNNIA (SEQ ID NO:714) или KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO:713). Так, например, десять концевых аминокислот экзендина-4 (то есть, последовательность SEQ ID NO: 710 (GPSSGAPPPS)) присоединены к карбокси-концу родственного глюкагону пептида класса 1, родственного глюкагону пептида класса 2, родственного глюкагону пептида класса 3, родственного глюкагону пептида класса 4 или родственного глюкагону пептида класса 5 согласно изобретению.

Другим соединением, которое индуцирует снижение массы тела, является оксинтомодулин, природный пищеварительный гормон, присутствующий в тонком кишечнике (см. Diabetes 2005; 54:2390-2395). Оксинтомодулин представляет собой пептид, который состоит из 37 аминокислот (SEQ ID NO: 706) и содержит последовательность глюкагона из 29 аминокислот, за которыми следует карбокси-концевое удлинение из 8 аминокислот SEQ ID NO: 714 (KRNRNNIA). В соответствии с этим, в некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пролекарственным производным родственных глюкагону пептидов, которые также содержат карбокси-концевое удлинение, имеющее последовательность SEQ ID NO: 714 или удлинение из четырех аминокислот, имеющее последовательность KRNR.

Модификация глюкагона в положении 3

Описанные здесь родственные глюкагону пептиды класса 1-3 могут быть модифицированы в положении 3 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) в целях сохранения или повышения активности по отношению к рецептору глюкагона.

В некоторых вариантах изобретения, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, сохранение или повышение активности по отношению к рецептору глюкагона может быть достигнуто путем замены Gln в положении 3 глутаминовым аналогом. Так, например, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий глутаминовый аналог в положении 3, может обладать активностью, которая составляет примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 50%, или примерно 85% или более от активности нативного глюкагона (SEQ ID NO: 701) по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий глутаминовый аналог в положении 3, может обладать активностью, которая составляет примерно 20%, примерно 50%, примерно 75%, примерно 100%, примерно 200% или примерно 500% или более от активности соответствующего пептида глюкагона, имеющего такую же аминокислотную последовательность, как и пептид, содержащий глутаминовый аналог, за исключением замены аминокислоты в положении 3, по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий глутаминовый аналог в положении 3, обладает повышенной активностью по отношению к рецептору глюкагона, и такая повышенная активность составляет не более, чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона или соответствующего родственного глюкагону пептида, имеющего такую же аминокислотную последовательность, как и пептид, содержащий глутаминовый аналог, за исключением замены аминокислоты в положении 3.

В некоторых вариантах изобретения, глутаминовый аналог представляет собой природную или неприродную аминокислоту, содержащую боковую цепь структуры I, II или III:

где: R1 представляет собой C0-3алкил или C0-3гетероалкил; R2 представляет собой NHR4 или C1-3алкил; R3 представляет собой C1-3алкил; R4 представляет собой H или C1-3алкил; X представляет собой NH, O или S; а Y представляет собой NHR4, SR3 или OR3. В некоторых вариантах изобретения, X представляет собой NH или Y представляет собой NHR4. В некоторых вариантах изобретения, R1 представляет собой C0-2алкил или C1гетероалкил. В некоторых вариантах изобретения, R2 представляет собой NHR4 или C1алкил. В некоторых вариантах изобретения, R4 представляет собой H или C1алкил. В своих репрезентативных вариантах, в которых родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, настоящее изобретение относится к аминокислоте, содержащей боковую цепь структуры I, где R1 представляет собой CH2S, X представляет собой NH, а R2 представляет собой CH3 (ацетамидометилцистеин, C(Acm)); R1 представляет собой CH2, X представляет собой NH, а R2 представляет собой CH3 (ацетилдиаминобутановую кислоту, Dab(Ac)); R1 представляет собой C0алкил, X представляет собой NH, R2 представляет собой NHR4, а R4 представляет собой H (карбамоилдиаминопропановую кислоту, Dap(мочевину); или R1 представляет собой CH2CH2, X представляет собой NH, а R2 представляет собой CH3 (ацетилорнитин, Orn(Ac)). В своих репрезентативных вариантах, настоящее изобретение относится к аминокислоте, содержащей боковую цепь структуры II, где R1 представляет собой CH2, Y представляет собой NHR4, а R4 представляет собой CH3 (метилглутамин, Q(Me)). В своих репрезентативных вариантах, настоящее изобретение относится к аминокислоте, содержащей боковую цепь структуры III, где R1 представляет собой CH2, а R4 представляет собой H (сульфоксид метионина, M(O)). В конкретных вариантах изобретения, аминокислота в положении 3 заменена Dab(Ac).

Димеры

Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то такой родственный глюкагону пептид может быть частью димера, тримера или мультимера более высокого порядка, содержащего по меньшей мере два, три или более пептидов, связанных посредством линкера, где по меньшей мере один пептид или оба пептида представляют собой родственный глюкагону пептид. Димером может быть гомодимер или гетеродимер. В некоторых вариантах изобретения, линкер выбран из группы, состоящей из бифункционального тиолового перекрестно-связывающего линкера и бифункционального аминового перекрестно-связывающего линкера. В некоторых вариантах изобретения, линкером является ПЭГ, например, 5 кДа-ПЭГ, 20 кДа-ПЭГ. В некоторых вариантах изобретения, линкером является дисульфидная связь. Так, например, каждый мономер димера может содержать остаток Cys (например, концевой или внутренний Cys), а атом серы каждого остатка Cys участвует в образовании дисульфидной связи. В некоторых аспектах изобретения, мономеры соединены концевыми аминокислотами (например, N-концевыми или C-концевыми), внутренними аминокислотами или концевой аминокислотой по меньшей мере одного мономера и внутренней аминокислотой по меньшей мере одного другого мономера. В конкретных аспектах изобретения, мономеры не связаны друг с другом N-концевой аминокислотой. В некоторых аспектах изобретения, мономеры мультимера связаны друг с другом в ориентации «хвост к хвосту», в которой С-концевые аминокислоты каждого мономера связаны друг с другом. Часть конъюгата может быть ковалентно связана с любыми описанными здесь родственными глюкагону пептидами, включая димер, тример или мультимер более высокого порядка.

Методы получения родственных глюкагону пептидов

Описанные здесь родственные глюкагону пептиды (и пролекарства) могут быть получены стандартными методами синтеза, методами рекомбинантных ДНК или любыми другими методами получения пептидов и гибридных белков. Хотя некоторые неприродные аминокислоты не могут быть экспрессированы с применением стандартных методов рекомбинантных ДНК, однако, существуют методы их получения, которые известны специалистам. Соединения согласно изобретению, включающие непептидные части, могут быть синтезированы путем проведения, помимо стандартных реакций пептидного синтеза, стандартных реакций органического синтеза, если это возможно.

Классы родственных глюкагону пептидов более подробно описаны выше. В каждом разделе настоящей заявки, относящемся к родственным глюкагону пептидам классов 1, 2, 3, 4 и 5, описаны модификации, введенные в часть родственного глюкагону пептида (Q) пролекарственного соединения, подробно описанного выше. Таким образом, структурные элементы, описанные для класса родственных глюкагону пептидов, представляют собой структурные элементы Q, которые были затем модифицированы с получением пролекарственного соединения, описанного выше.

Родственные глюкагону пептиды класса 1

В некоторых вариантах изобретения, родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 1, описанный в настоящей заявке и в Международной патентной заявке No. PCT US2009/47437 (поданной 16 июня 2009), в Международной патентной заявке No. WO 2008/086086, опубликованной 17 июля 2008, и в предварительной заявке на патент США No. 61/090415, содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Биологические последовательности, упоминаемые в следующем разделе (SEQ ID NN: 801-915), относятся к родственным глюкагону пептидом класса 1, и соответствуют последовательностям SEQ ID NN: 1-115, описанным в Международной патентной заявке No. PCT US2009/47437.

Активность

Пептиды глюкагона класса 1 сохраняют активность по отношению к рецептору глюкагона, аналогичную активности нативного пептида глюкагона (SEQ ID NO: 801). Так, например, пептид глюкагона может сохранять по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% от активности нативного глюкагона (как было вычислено по обратному отношению концентрации EC50 для пептида глюкагона к концентрации EC50 для глюкагона, измеренным, например, по уровню продуцирования cAMP с помощью анализа, который в общих чертах описан в примере 5). В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 1 обладают такой же активностью, как и глюкагон или еще большей активностью (или «эффективностью», этот термин используется здесь как синоним «активности»). В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона обладают активностью, которая составляет примерно не более, чем 100%, 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного пептида глюкагона.

Любой из описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 1 может иметь EC50 по отношению к рецептору человеческого глюкагона, которая составляет 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ или менее, как показал тест на индуцирование cAMP в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих рецептор глюкагона, например, в анализе, описанном в примере 5. Обычно, ПЭГилированные пептиды имеют более высокую EC50 по сравнению с неПЭГилированным пептидом. Так, например, описанные родственные глюкагону пептиды класса 1, если они являются неПЭГилированными, могут обладать активностью по отношению к рецептору глюкагона, которая составляет по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, 100%, 150%, 200%, 400%, 500% или более) от активности нативного глюкагона (SEQ ID NO: 801) по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь родственные глюкагону пептиды класса 1 имеют указанный % активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона, если они не содержат гидрофильной группы, и имеют низкий % активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона, если они содержат гидрофильную группу. Так, например, описанные здесь родственные глюкагону пептиды класса 1, если они являются ПЭГилированными, могут обладать активностью по отношению к рецептору глюкагона, которая составляет по меньшей мере 2% (например, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, или по меньшей мере 10%) от активности нативного глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь родственные глюкагону пептиды класса 1 могут обладать любой из вышеуказанных активностей, которая составляет не более, чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона.

В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 1 обладают менее, чем примерно 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от активности GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1, и/или селективностью по отношению к рецептору глюкагона, которая примерно более, чем в 5 раз, 10 раз или 15 раз превышает селективность по отношению к рецептору GLP-1. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 1 обладают менее, чем 5% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1, и селективностью по отношению к рецептору глюкагона, которая более, чем в 5 раз превышает селективность по отношению к рецептору GLP-1.

Повышенная растворимость

Нативный глюкагон имеет плохую растворимость в водном растворе, а в частности, при физиологическом рН, и при этом, он имеет тенденцию к образованию агрегатов и к осаждению за определенный период времени. В противоположность этому, в некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 1 обладают растворимостью, которая, например, через 24 часа при 25°C повышается по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз или более по сравнению с растворимостью нативного глюкагона при рН 6-8, или 6-9, например, при рН 7.

В соответствии с этим, в некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1, по сравнению с пептидом дикого типа, таким как His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 801), был модифицирован в целях повышения растворимости пептида в водных растворах, а в частности, при рН примерно от 5,5 до 8,0, но с сохранением биологической активности нативного пептида.

Так, например, растворимость любых описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 1 может быть еще больше увеличена путем присоединения гидрофильной группы к пептиду. Введение таких групп также приводит к увеличению продолжительности действия, например, как было измерено по увеличению времени полужизни в кровотоке. Гидрофильные группы также описаны в настоящей заявке.

Модификация заряженными остатками

В некоторых вариантах изобретения, растворимость улучшают путем сообщения заряда родственному глюкагону пептиду класса 1 посредством замены нативных незаряженных аминокислот заряженными аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, или посредством добавления заряженных аминокислот к амино- или к карбокси-концу пептида.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 обладает повышенной растворимостью, что обусловлено тем, что указанный пептид был модифицирован путем аминокислотных замен и/или добавлений, которые вводят заряженную аминокислоту в С-концевую часть пептида, а в некоторых вариантах изобретения, в положение со стороны С-конца от положения 27 SEQ ID NO: 801. Одна, две или три заряженных аминокислоты могут быть введены, но необязательно, в С-концевую часть, а в некоторых вариантах изобретения, со стороны С-конца от положения 27. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, нативная(ые) аминокислот(ы) в положениях 28 и/или 29 заменена(ы) заряженной аминокислотой, и/или 1-3 заряженных аминокислоты добавлены к С-концу пептида, например, за положениями 27, 28 или 29. В репрезентативных вариантах изобретения, одна, две, три заряженных аминокислоты или все эти аминокислоты имеют отрицательный заряд. В других вариантах изобретения, одна, две, три заряженных аминокислоты или все эти аминокислоты имеют положительный заряд.

В конкретных репрезентативных вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 может содержать любую одну или две из нижеследующих модификаций: замену N28 на E; замену N28 на D; замену T29 на D; замену T29 на E; инсерцию E за положениями 27, 28 или 29; инсерцию D за положениями 27, 28 или 29. Такими заменами, например, являются замены D28E29, E28E29, E29E30, E28E30, D28E30.

В соответствии с одним из репрезентативных вариантов изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 811, или ее аналог, которые содержат 1-3 дополнительных аминокислотных модификаций (описанных здесь для агонистов глюкагона) по сравнению с нативным глюкагоном или аналогом агониста глюкагона. Последовательность SEQ ID NO: 811 представляет собой модифицированный родственный глюкагону пептид класса 1, где аспарагиновый остаток в положении 28 нативного белка заменен аспарагиновой кислотой. В другом репрезентативном варианте изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 838, где аспарагиновый остаток в положении 28 нативного белка был заменен глутаминовой кислотой. Другими репрезентативными вариантами являются родственные глюкагону пептиды класса 1, имеющие последовательности SEQ ID NN: 824, 825, 826, 833, 835, 836 и 837.

Замена природной аминокислоты в положении 28 и/или 29 зараженными аминокислотами и/или добавление одной или двух заряженных аминокислот у карбокси-конца родственного глюкагону пептида класса 1 приводит к повышению растворимости и стабильности пептидов глюкагона в водных растворах при физиологически приемлемых рН (то есть, при pH примерно 6,5-7,5) по меньшей мере в 5 раз и максимум в 30 раз. В соответствии с этим, в некоторых вариантах изобретения, пептиды глюкагона класса 1 сохраняют глюкагоновую активность и имеют растворимость, которая, через 24 часа при 25°C становится по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 15 раз, в 25 раз, в 30 раз или выше, чем растворимость нативного глюкагона при данном рН, составляющем примерно 5,5-8, например, pH 7.

В родственный глюкагону пептид класса 1 могут быть введены дополнительные модификации, например, консервативные замены, описанные в настоящей заявке, что будет приводить к сохранению глюкагонной активности этих пептидов.

Повышенная стабильность

Любой из пептидов глюкагона класса 1 может иметь еще большую стабильность и/или меньшую способность к разложению, например, через 24 часа при 25°С, он может сохранять по меньшей мере 95% свойств исходного пептида. Любой из описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 1 может иметь еще большую стабильность при рН 5,5-8, например, через 24 часа при 25°С, он может сохранять по меньшей мере 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% свойств исходного пептида. В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 1 согласно изобретению обладают повышенной стабильностью, например, их концентрация может составлять по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, более, чем 95%, и до 100%) от концентрации пептида, при этом, менее, чем примерно 25% (например, менее, чем 20%, менее, чем 15%, менее, чем 10%, менее, чем 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, и до 0%) разлагаемого пептида детектируется на 280 нм на детекторе ультрафиолетового (УФ) излучения примерно через 1 или более недель (например, примерно через 2 недели, примерно через 4 недели, примерно через 1 месяц, примерно через два месяца, примерно через три месяца, примерно через четыре месяца, примерно через шесть месяцев, примерно через восемь месяцев, примерно через десять месяцев, примерно через двенадцать месяцев) в растворе при температуре по меньшей мере 20°C (например, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, по меньшей мере 27,5°C, по меньшей мере 30°C, по меньшей мере 35°C, по меньшей мере 40°C, по меньшей мере 50°C), и менее, чем 100°C, менее, чем 85°C, менее, чем 75°C, или менее, чем 70°C. Родственные глюкагону пептиды класса 1 могут иметь дополнительные модификации, которые изменяют его фармацевтические свойства, например, повышают активность, увеличивают время полужизни в кровотоке, увеличивают срок хранения, снижают степень осаждения или агрегации и/или снижают степень разложения, например, снижают вероятность разложения или возникновения химических изменений после хранения.

В других репрезентативных вариантах изобретения, любой из вышеупомянутых родственных глюкагону пептидов класса 1 может быть дополнительно модифицирован в целях повышения стабильности посредством модификации аминокислоты в положении 15 SEQ ID NO: 801 для снижения степени разложения пептида за определенный период времени, а в частности, в кислотных или в основных буферах. В репрезентативных вариантах изобретения, Asp в положении 15 заменен на Glu, гомо-Glu, цистеиновую кислоту или гомоцистеиновую кислоту.

Альтернативно, любой из описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 1 может быть дополнительно модифицирован для повышения стабильности посредством замены аминокислоты в положении 16 SEQ ID NO: 801. В репрезентативных вариантах изобретения, относящихся к родственным глюкагону пептидам класса 1, в целях повышения их активности по отношению к рецептору глюкагона, Ser в положении 16 заменяют Thr или AIB, или любой из описанных здесь аминокислот. Такие модификации предотвращают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16.

В некоторых вариантах изобретения, любой из описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 1 может быть дополнительно модифицирован в целях снижения уровня расщепления в различных положениях аминокислот посредством модификации любой одной, двух, трех или всех четырех аминокислот в положениях 20, 21, 24 или 27. Репрезентативными вариантами являются замена Gln в положении 20 аминокислотами Ser, Thr, Ala или AIB, замена Asp в положении 21 аминокислотой Glu, замена Gln в положении 24 аминокислотой Ala или AIB, замена Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle. Удаление или замена метионина приводит к снижению уровня расщепления, обусловленного окислением метионина. Удаление или замена Gln или Asn приводит к снижению уровня расщепления, обусловленного дезамидированием Gln или Asn. Удаление или замена Asp приводит к снижению уровня расщепления, обусловленного дегидратацией Asp с образованием циклического сукцинимидного промежуточного соединения с последующей его изомеризацией в изоаспартат.

Повышенная активность

В соответствии с другим своим вариантом, настоящее изобретение относится к родственным глюкагону пептидам класса 1, которые обладают повышенной активностью по отношению к рецептору глюкагона, где указанные пептиды имеют аминокислотную модификацию в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO: 801). В неограничивающем примере, такая повышенная активность может быть достигнута путем замены природного серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой одной из таких аминокислот, как глутамин, гомоглутаминовая кислота или гомоцистеиновая кислота, или заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P), и боковую цепь длиной примерно в 4 атома (или 3-5 атомов). Замена серина в положении 16 глутаминовой кислотой приводит к повышению активности по отношению к рецептору глюкагона по меньшей мере в 2 раза, 4 раза, 5 раз и до 10 раз или более. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 имеет селективность к рецептору глюкагона, которая, например, по меньшей мере в 5, 10 или 15 раз превышает селективность к рецепторам GLP-1.

Резистентность к DPP-IV

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона класса 1 дополнительно модифицируют в положении 1 или 2 для снижения восприимчивости к расщеплению дипептидил-пептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 в положении 1 и/или в положении 2 заменяют описанной(ыми) здесь аминокислотой(ами), резистентной(ыми) к DPP-IV. В некоторых вариантах изобретения, аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминоизомасляной кислотой. В некоторых вариантах изобретения, аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, глицина, N-метилсерина и ε-аминомасляной кислоты. В другом варианте изобретения, аминокислоту в положении 2 родственного глюкагону пептида класса 1 заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, глицина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положении 2 не является D-серином.

Снижение глюкагонной активности после модификации аминокислот в положении 1 и/или в положении 2 пептида глюкагона может быть устранено посредством стабилизации альфа-спиральной структуры в C-концевой части пептида глюкагона (аминокислоты примерно 12-29). Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, путем образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика (например, лактамового мостика, расположенного между боковыми цепями аминокислот в положениях «i» и «i+4», где i равно целому числу от 12 до 25), замены аминокислот в положениях приблизительно 12-29 аминокислотой, стабилизирующей альфа-спираль (например, α,α-дизамещенной аминокислотой), и/или инсерции указанной аминокислоты в указанных положениях, как описано в настоящей заявке.

Модификации в положении 3

Активность по отношению к рецептору глюкагона может быть снижена путем модификации аминокислот в положении 3 (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа), например, замены природного глутамина в положении 3 кислотной, основной или гидрофобной аминокислотой. Так, например, замена в положении 3 глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином приводит к значительному снижению или устранению активности по отношению к рецептору глюкагона.

Сохранение или усиление активности по отношению к рецептору глюкагона может быть достигнуто путем замены Gln в положении 3 аналогом глутамина, описанным в настоящей заявке. Так, например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873 и SEQ ID NO: 874.

Повышение GLP-1 активности путем введения С-концевых амидов и сложных эфиров

Повышение активности по отношению к рецептору GLP-1 может быть достигнуто путем замены карбоксильной группы С-концевой аминокислоты нейтральной группой, такой как амид или сложный эфир. И наоборот, сохранение нативной карбоновой кислоты у С-конца пептида сообщает относительно более высокую селективность родственного глюкагону пептида класса 1 по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1 (например, приблизительно более, чем в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз).

Другие модификации и комбинации

В родственный глюкагону пептид класса 1 могут быть введены дополнительные модификации, которые могут повышать растворимость и/или стабильность и/или глюкагоновую активность. Родственный глюкагону пептид класса 1 может альтернативно включать и другие модификации, которые не оказывают значительного влияния на растворимость или стабильность, и не приводят к значительному снижению глюкагоновую активности. В репрезентативных вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 может содержать вплоть до 11, 12, 13 или 14 аминокислотных модификаций по сравнению с нативной последовательностью глюкагона. Так, например, консервативные или неконсервативные замены, добавления или делеции могут быть сделаны в любом из положений, таких как положения 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29.

Репрезентативными модификациями родственного глюкагону пептида класса 1 являются, но не ограничиваются ими:

(a) неконсервативные замены, консервативные замены, добавления или делеции, по меньшей мере частично сохраняющие глюкагон-агонистическую активность, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях, таких как положения 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, замена Tyr в положении 10 аминокислотой Val или Phe, замена Lys в положении 12 аминокислотой Arg, замена в одном или нескольких положениях аминокислотой Ala;

(b) делеция аминокислот в положениях 29 и/или 28, и необязательно, в положении 27, по меньшей мере частично сохраняющая глюкагон-агонистическую активность;

(c) модификация аспарагиновой кислоты в положении 15, например, замена глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой, которая может приводить к снижению уровня разложения; или модификация серина в положении 16, например, путем его замены треонином, AIB, глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой одной из таких аминокислот, как глутамин, гомоглутаминовая кислота или гомоцистеиновая кислота, где указанная замена аналогичным образом может приводить к снижению степени разложения, обусловленного расщеплением связи Asp15-Ser16;

(d) добавление гидрофильной группы, такой как описанный здесь водорастворимый полимер полиэтиленгликоль, например, в положениях 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или у C-концевой аминокислоты, где указанное добавление может приводить к повышению растворимости и/или к увеличению времени полужизни;

(e) модификация метионина в положении 27, например, путем замены лейцином или норлейцином, в целях снижения степени окислительного разложения;

(f) модификация Gln в положении 20 или 24, например, путем замены аминокислотами Ser, Thr, Ala или AIB, в целях снижения степени разложения, обусловленного дезамидированием Gln;

(g) модификация Asp в положении 21, например, путем замены аминокислотой Glu, в целях снижения степени разложения, обусловленного дегидратацией Asp с образованием циклического сукцинимидного промежуточного соединения и его последующей изомеризацией в изоаспартат;

(h) описанные здесь модификации в положении 1 или 2, повышающие резистентность к расщеплению ферментом DPP-IV, необязательно в комбинации с внутримолекулярным мостиком, таким как лактамовый мостик, расположенный между положениями «i» и «i+4», где i равно целому числу от 12 до 25, например, 12, 16, 20, 24;

(i) ацилирование или алкилирование описанного здесь пептида глюкагона, которое может приводить к повышению активности по отношению к рецептору глюкагона и/или рецептору GLP-1, к увеличению времени полужизни в кровотоке и/или к увеличению продолжительности действия и/или замедлению начала действия, необязательно, в комбинации с добавлением гидрофильной группы, дополнительно или альтернативно, необязательно, в комбинации с модификацией, которая приводит к селективному снижению активности по отношению к пептиду GLP-1, например, модификацией Thr в положении 7, такой как замена Thr в положении 7 аминокислотой, не содержащей гидроксильной группы, например, Abu или Ile; делеция аминокислот со стороны C-конца по отношению к аминокислоте в положении 27 (например, делеция одной или обеих аминокислот в положениях 28 и 29, с получением пептида длиной в 27 или 28 аминокислот);

(j) C-концевые удлинения, описанные в настоящей заявке;

(k) гомодимеризация или гетеродимеризация, описанные в настоящей заявке; и

комбинации модификаций (a)-(k).

В некоторых вариантах изобретения, репрезентативными модификациями родственного глюкагону пептида класса 1 являются по меньшей мере одна аминокислотная модификация, выбранная из группы A, и одна или несколько аминокислотных модификаций, выбранных из группы B и/или группы C,

где модификация группы A представляет собой:

замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой;

замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

замену в положении 28 аминокислотами Asn, Asp или Glu;

замену в положении 28 аминокислотой Asp;

замену в положении 28 аминокислотой Glu;

замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой;

замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

замену в положении 29 аминокислотами Asp, Glu или Lys;

замену в положении 29 аминокислотой Glu;

инсерцию 1-3 заряженных аминокислот в положении, находящемся за положением 29;

инсерцию Glu или Lys за положением 29;

инсерцию Gly-Lys или Lys-Lys за положением 29;

или их комбинации;

модификация группы B представляет собой:

замену Asp в положении 15 аминокислотой Glu;

замену Ser в положении 16 аминокислотой Thr или AIB;

и где модификация группы C представляет собой:

замену His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая снижает восприимчивость пептида глюкагона к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV),

замену Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая снижает восприимчивость пептида глюкагона к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV),

замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg;

замену Gln в положении 20 аминокислотами Ser, Thr, Ala или AIB;

замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu;

замену Gln в положении 24 аминокислотами Ser, Thr, Ala или AIB;

замену Met в положении 27 аминокислотами Leu или Nle;

делецию аминокислот в положениях 27-29;

делецию аминокислот в положениях 28-29;

делецию аминокислоты в положении 29;

или их комбинации.

В репрезентативных вариантах изобретения, Lys в положении 12 заменен Arg. В других репрезентативных вариантах изобретения, аминокислоты в положениях 29 и/или 28, и, необязательно, в положении 27, делетированы.

В некоторых конкретных вариантах изобретения, пептид глюкагона содержит (a) аминокислотную модификацию в положении 1 и/или 2, которая сообщает резистентность к ферменту DPP-IV, например, замену DMIA в положении 1 или замену AIB в положении 2, (b) внутримолекулярный мостик в положениях 12-29, например, в положениях 16 и 20, или одну или несколько замен аминокислот в положениях 16, 20, 21 и 24 α,α-дизамещенной аминокислотой, необязательно (c) связанной с гидрофильной группой, такой как ПЭГ, например, посредством Cys в положении 24, 29 или в положении C-концевой аминокислоты, необязательно, (d) модификацию аминокислоты в положении 27, то есть, замену Met например, аминокислотой Nle, необязательно, (e) аминокислотные модификации в положениях 20, 21 и 24, снижающие степень разложения и, необязательно, (f) аминокислоты, связанные с SEQ ID NO: 820. Если пептид глюкагона связан с SEQ ID NO: 820, то в некоторых вариантах изобретения, аминокислотой в положении 29 является Thr или Gly. В других конкретных вариантах изобретения, пептид глюкагона содержит (a) Asp28Glu29, или Glu28Glu29 или Glu29Glu30, или Glu28Glu30 или Asp28Glu30, и необязательно (b) аминокислотную модификацию в положении 16, то есть, замену Ser, например, на Thr или AIB, и необязательно, (c) аминокислотную модификацию в положении 27, то есть, замену Met, например, на Nle, и необязательно, (d) аминокислотные модификации в положениях 20, 21 и 24, которые снижают степень разложения. В конкретном варианте изобретения, пептид глюкагона представляет собой T16, A20, E21, A24, Nle27, D28, E29.

В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность:

X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO: 839) с 1-3 аминокислотными модификациями,

где X1 и/или X2 представляет собой ненативную аминокислоту, которая снижает восприимчивость (или повышает резистентность) пептида глюкагона к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV),

где Z выбран из группы, состоящей из -COOH (природного С-концевого карбоксилата), -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y представляет собой 1-2 аминокислоты, и

где внутримолекулярный мостик, связанный предпочтительно ковалентной связью, соединяет боковые цепи аминокислоты в положении i и аминокислоты в положении i+4, где i равно 12, 16, 20 или 24.

В некоторых вариантах изобретения, внутримолекулярным мостиком является лактамовый мостик. В некоторых вариантах изобретения, аминокислотами в положениях i и i+4 SEQ ID NO: 839 являются Lys и Glu, например, Glu16 и Lys20. В некоторых вариантах изобретения, X1 выбран из группы, состоящей из D-His, N-метил-His, альфа-метил-His, имидазолуксусной кислоты, дез-амино-His, гидроксил-His, ацетил-His, гомо-His и альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA). В других вариантах изобретения, X2 выбран из группы, состоящей из D-Ser, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, Val и альфа-аминоизомасляной кислоты (AIB). В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона ковалентно связан с гидрофильной группой в любом из положений аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, в области C-концевого удлинения или у C-концевой аминокислоты. В репрезентативных вариантах изобретения, эта гидрофильная группа ковалентно связана с остатками Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином в любом из этих положений. Репрезентативными гидрофильными группами являются полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий, например, молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до 40000 дальтон, или примерно от 20000 дальтон до 40000 дальтон.

В других вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса I содержит аминокислотную последовательность:

X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO: 839),

где X1 и/или X2 представляет собой ненативную аминокислоту, которая снижает восприимчивость (или повышает резистентность) пептида глюкагона к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV),

где аминокислоты в одном, двух, трех, четырех или более положениях 16, 20, 21 и 24 пептида глюкагона заменены α,α-дизамещенной аминокислотой, и

где Z выбран из группы, состоящей из -COOH (природного C- концевого карбоксилата), -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y представляет собой 1-2 аминокислоты.

Другими репрезентативными аминокислотными модификациями вышеупомянутых родственных глюкагону пептидов класса 1 или его аналогов являются замена Thr в положении 7 аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, аминомасляной кислотой (Abu), Ile, необязательно, в комбинации с заменой или добавлением аминокислоты, содержащей боковую цепь, ковалентно связанную (например, посредством спейсера) с ацильной или алкильной группой, где указанная ацильная или алкильная группа является ненативной по отношению к природной аминокислоте; замена Lys в положении 12 аминокислотой Arg; замена Asp в положении 15 аминокислотой Glu; замена Ser в положении 16 аминокислотой Thr или AIB; замена Gln в положении 20 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB; замена Asp в положении 21 аминокислотой Glu; замена Gln в положении 24 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB; замена Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle; замена Asn в положении 28 заряженной аминокислотой; замена Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замена в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu; замена в положении 28 аминокислотой Asp; замена в положении 28 аминокислотой Glu; замена Thr в положении 29 заряженной аминокислотой; замена Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замена в положении 29 аминокислотой Asp, Glu, или Lys; замена в положении 29 аминокислотой Glu; инсерция 1-3 заряженных аминокислот за положением 29; инсерция Glu или Lys в положении 30 (то есть, за положением 29), необязательно с инсерцией Lys в положении 31; добавление SEQ ID NO: 820 к C-концу, где аминокислотой в положении 29 является, но необязательно, Thr или Gly; замена или добавление аминокислоты, ковалентно связанной с гидрофильной группой; или их комбинации.

Любая из вышеописанных модификаций, относящихся к агонистам глюкагона класса 1, которая приводит к повышению активности по отношению к рецептору глюкагона, сохранению частичной активности по отношению к рецептору глюкагона, повышению растворимости, повышению стабильности или снижению степени разложения, может быть введена в пептиды глюкагона класса 1 либо отдельно, либо в комбинации. Таким образом, могут быть получены родственные глюкагону пептиды класса 1, которые, через 24 часа при 25°С, сохраняют по меньшей мере 20% активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона, являются растворимыми при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH 6-8 или 6-9 (например, pH 7), и сохраняют, но необязательно, по меньшей мере 95% активности исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагались или расщеплялись). Альтернативно, могут быть получены пептиды глюкагона класса 1 с высокой активностью, которые, через 24 часа при 25°С, сохраняют по меньшей мере примерно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона, или в 10 раз или более превышают такую активность, и необязательно, являются растворимыми при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH 6-8 или 6-9 (например, pH 7), и, необязательно, сохраняют по меньшей мере 95% активности исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагаются или расщепляются). В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона класса 1 могут иметь по меньшей мере любую из вышеуказанных уровней активности по отношению к рецептору глюкагона, однако, она составляет не более, чем 10000%, 100000% или 1000000% активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона.

Примеры вариантов родственных глюкагону пептидов класса 1

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, нативный пептид глюкагона SEQ ID NO: 801 модифицируют путем замены нативной аминокислоты в положении 28 и/или 29 отрицательно заряженной аминокислотой (например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой) и, необязательно, добавления отрицательно заряженной аминокислоты (например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) к карбокси-концу пептида. В альтернативном варианте изобретения, нативный пептид глюкагона SEQ ID NO: 801 модифицируют путем замены нативной аминокислоты в положении 29 положительно заряженной аминокислотой (например, лизином, аргинином или гистидином), и, необязательно, добавления одной или двух положительно заряженных аминокислот (например, лизина, аргинина или гистидина) к карбокси-концу пептида. В соответствии с некоторыми своими вариантами, настоящее изобретение относится к аналогу глюкагона, имеющему повышенную растворимость и стабильность, где указанный аналог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 834, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота в положении 28 или 29 заменена кислотной аминокислотой и/или дополнительная аминокислота добавлена к карбокси-концу SEQ ID NO: 834. В некоторых вариантах изобретения, кислотные аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты.

В соответствии с некоторыми своими вариантами, настоящее изобретение относится к агонисту глюкагона, имеющему повышенную растворимость и стабильность, где указанный агонист содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 833, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 27, 28 или 29 заменена ненативным аминокислотным остатком (то есть, по меньшей мере одна аминокислота, присутствующая в положениях 27, 28 или 29 данного аналога, представляет собой аминокислоту, отличающуюся от аминокислоты, присутствующей в соответствующем положении SEQ ID NO: 801). В соответствии с некоторыми своими вариантами, настоящее изобретение относится к агонисту глюкагона, содержащему SEQ ID NO: 833, при условии, что если аминокислотой в положении 28 является аспарагин, а аминокислотой в положении 29 является треонин, то такой пептид также содержит одну или две аминокислоты, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, добавленных к карбокси-концу пептида глюкагона.

Сообщалось, что некоторые положения нативного пептида глюкагона могут быть модифицированы, но при этом, они могут сохранять по меньшей мере некоторую активность родительского пептида. В соответствии с этим, авторами настоящего изобретения было высказано предположение, что одна или несколько аминокислот, расположенных в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 пептида SEQ ID NO: 811, могут быть заменены аминокислотой, отличающейся от аминокислоты, присутствующей в нативном пептиде глюкагона, но при этом, будет сохраняться повышенная активность, стабильность при физиологическом рН и биологическая активность родительского пептида глюкагона. Так, например, в соответствии с некоторыми вариантами изобретения, в целях предупреждения окислительного разложения пептида, метиониновый остаток, присутствующий в положении 27 нативного пептида, заменяют лейцином или норлейцином.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к аналогу глюкагона SEQ ID NO: 833, где 1-6 аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 данного аналога, отличаются от соответствующих аминокислот SEQ ID NO: 801. В соответствии с другим своим вариантом, настоящее изобретение относится к аналогу глюкагона SEQ ID NO: 833, где 1-3 аминокислоты, выбранные из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 данного аналога, отличаются от соответствующих аминокислот SEQ ID NO: 801. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к аналогу глюкагона SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808 или SEQ ID NO: 834, где 1 или 2 аминокислоты, выбранные из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 данного аналога, отличаются от соответствующих аминокислот SEQ ID NO: 801, а в другом варианте, эти 1 или 2 отличающиеся аминокислоты представляют собой консервативные аминокислотные замены по сравнению с аминокислотами, присутствующими в нативной последовательности (SEQ ID NO: 801). В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пептиду глюкагона SEQ ID NO: 811 или SEQ ID NO: 813, где указанный пептид глюкагона также содержит одну, две или три аминокислотных замены, выбранные из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27 или 29. В некоторых вариантах изобретения, заменами в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 27 или 29 являются консервативные аминокислотные замены.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к агонисту глюкагона, содержащему пептидный аналог SEQ ID NO: 801, где указанный аналог отличается от SEQ ID NO: 801 тем, что он имеет аминокислоту в положении 2, не являющуюся серином, а в положении 28 или 29, он имеет, вместо нативной аминокислоты, кислотную аминокислоту или кислотную аминокислоту, добавленную к карбокси-концу пептида SEQ ID NO: 801. В некоторых вариантах изобретения, кислотной аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к аналогу глюкагона SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 или SEQ ID NO: 832, который отличается от родительской молекулы тем, что он имеет замену в положении 2. Более конкретно, аминокислота в положении 2 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, аланина, D-аланина, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к агонисту глюкагона, содержащему пептидный аналог SEQ ID NO: 801, где указанный аналог отличается от SEQ ID NO: 801 тем, что он имеет аминокислоту в положении 1, не являющуюся гистидином, а в положении 28 или 29, он имеет, вместо нативной аминокислоты, кислотную аминокислоту или кислотную аминокислоту, добавленную к карбокси-концу пептида SEQ ID NO: 801. В некоторых вариантах изобретения, кислотной аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к аналогу глюкагона SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 или SEQ ID NO: 832, который отличается от родительской молекулы тем, что он имеет замену в положении 1. Более конкретно, аминокислота в положении 2 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из DMIA, D-гистидина, дезаминогистидина, гидрокси-гистидина, ацетил-гистидина и гомогистидина.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, модифицированный пептид глюкагона содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 и SEQ ID NO: 832. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к пептиду глюкагона, содержащему последовательность SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 или SEQ ID NO: 832, которые также включают одну или две аминокислоты, добавленные к С-концу SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 или SEQ ID NO: 832, где дополнительные аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp Glu, цистеиновой кислоты или гомоцистеиновой кислоты. В некоторых вариантах изобретения, дополнительные аминокислоты, добавленные к карбокси-концу, выбраны из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, или в другом варианте изобретения, дополнительными аминокислотами являются Asp или Glu.

В другом варианте изобретения, пептид глюкагона содержит последовательность SEQ ID NO: 7 или ее аналог агониста глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, указанный пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 812 и SEQ ID NO: 813. В другом варианте изобретения, указанный пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810 и SEQ ID NO: 811. В некоторых вариантах изобретения, указанный пептид глюкагона содержит последовательности SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810 и SEQ ID NO: 811, а также дополнительную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asp и Glu, добавленных к С-концу пептида глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона содержит последовательность SEQ ID NO: 811 или SEQ ID NO: 813, а в другом варианте изобретения, пептид глюкагона содержит последовательность SEQ ID NO: 811.

В соответствии с некоторыми своими вариантами, настоящее изобретение относится к агонисту глюкагона, содержащему модифицированный пептид глюкагона, выбранный из группы, состоящей из:

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 834),

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO: 811) и

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO: 813),

где Xaa в положении 15 представляет собой Asp, Glu, цистеиновую кислоту, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 28 представляет собой Asn или кислотную аминокислоту, Xaa в положении 29 представляет собой Thr или кислотную аминокислоту, а R представляет собой кислотную аминокислоту, COOH или CONH2, при условии, что остаток кислотной аминокислоты присутствует в одном из положений 28, 29 или 30. В некоторых вариантах изобретения, R представляет собой COOH, а в другом варианте изобретения, R представляет собой CONH2.

Настоящее изобретение также охватывает гибридные пептиды глюкагона, где второй пептид был присоединен к С-концу пептида глюкагона в целях повышения стабильности и растворимости пептида глюкагона. Более конкретно, гибридный пептид глюкагона может включать аналог агониста глюкагона, содержащий пептид глюкагона NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 834), где R представляет собой кислотную аминокислоту или связь и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO: 822 (KRNR), связанные с карбокси-концевой аминокислотой пептида глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 807 или SEQ ID NO: 808, также содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO: 822 (KRNR), связанные с карбокси-концевой аминокислотой пептида глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, гибридный пептид глюкагона содержит последовательности SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 805 и SEQ ID NO: 806 или их аналог агониста глюкагона, а также аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO: 822 (KRNR), связанные с аминокислотой в положении 29 пептида глюкагона. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, гибридный пептид также содержит ПЭГ-цепь, связанную с аминокислотой в положении 16, 17, 21, 24, 29, в области C-концевого удлинения или у C-концевой аминокислоты, где указанная ПЭГ-цепь имеет размер 500-40000 дальтон. В некоторых вариантах изобретения, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO: 822 (KRNR) связана с аминокислотой в положении 29 пептида глюкагона посредством пептидной связи. В некоторых вариантах изобретения, часть пептида глюкагона, входящая в состав гибридного пептида глюкагона, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811 и SEQ ID NO: 813. В некоторых вариантах изобретения, часть пептида глюкагона, входящая в состав гибридного пептида глюкагона, содержит последовательность SEQ ID NO: 811 или SEQ ID NO: 813, где ПЭГ-цепь присоединена в положении 21, 24, 29, в области C-концевого удлинения или у С-концевой аминокислоты, соответственно.

В другом варианте изобретения, последовательность пептида глюкагона, входящая в состав гибридного пептида, содержит последовательность SEQ ID NO: 811, а также аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO: 822 (KRNR), связанные с аминокислотой в положении 29 пептида глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, гибридный пептид глюкагона содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 825 и SEQ ID NO: 826. Обычно, гибридные пептиды согласно изобретению имеют С-концевую аминокислоту со стандартной карбоксильной группой. Однако, в качестве вариантов настоящего изобретения также рассматриваются аналоги этих последовательностей, в которых С-концевая аминокислота, вместо карбоксильной группы, содержит амид. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, гибридный пептид глюкагона содержит аналог агониста глюкагона, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811 и SEQ ID NO: 813, а также включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 823 (GPSSGAPPPS-CONH2), связанную с аминокислотой в положении 29 пептида глюкагона.

Агонисты глюкагона согласно изобретению могут быть также модифицированы для повышения растворимости и стабильности пептида в водных растворах и сохранения биологической активности пептида глюкагона. В некоторых вариантах изобретения было высказано предположение, что введение гидрофильных групп в одном или нескольких положениях, выбранных из положений 16, 17, 20, 21, 24 и 29 пептида SEQ ID NO: 811, или его аналога агониста глюкагона, будет приводить к повышению растворимости и стабильности аналога глюкагона при соответствующем рН. Более конкретно, в некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 813 или SEQ ID NO: 832 был модифицирован так, чтобы он содержал одну или несколько гидрофильных групп, ковалентно связанных с боковыми цепями аминокислот, присутствующих в положениях 21 и 24 пептида глюкагона.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, пептид глюкагона SEQ ID NO: 811 был модифицирован так, чтобы он содержал одну или несколько аминокислотных замен в положениях 16, 17, 20, 21, 24 и/или 29, где нативная аминокислота была заменена аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для перекрестного связывания с гидрофильными группами, включая, например, ПЭГ. Нативный пептид может быть заменен природной аминокислотой или синтетической (неприродной) аминокислотой. Синтетические или неприродные аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, могут быть включены в описанные здесь пептидные структуры.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к агонисту глюкагона SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811 или SEQ ID NO: 813, где последовательность нативного пептида глюкагона была модифицирована так, чтобы она содержала природную или синтетическую аминокислоту по меньшей мере в одном из положений 16, 17, 21, 24, 29, в области С-концевого удлинения или в положении С-концевой аминокислоты нативной последовательности, где аминокислотная замена также содержит гидрофильную группу. В некоторых вариантах изобретения, замена присутствует в положении 21 или 24, а в другом варианте изобретения, гидрофильной группой является ПЭГ-цепь. В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона SEQ ID NO: 811 заменен по меньшей мере одним цистеиновым остатком, где боковая цепь цистеинового остатка также модифицирована реагентом, взаимодействующим с тиолом, включая, например, малеимидо, винилсульфон, 2-пиридилтио, галогеналкил и галогенацил. Эти реагирующие с тиолом реагенты могут содержать карбокси-, кето-, гидроксильную и эфирную группы, а также другие гидрофильные группы, такое как полиэтиленгликолевые звенья. В альтернативном варианте изобретения, нативный пептид глюкагона заменен лизином, а боковая цепь замещающего лизинового остатка также модифицирована с использованием реагирующих с амином реагентов, таких как активные сложные эфиры (сукцинимидо, ангидрид и т.п.) карбоновых кислот или альдегиды гидрофильных групп, таких как полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 818 и SEQ ID NO: 819.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, ПЭГилированный пептид глюкагона содержит две или более полиэтиленгликолевых цепи, ковалентно связанных с пептидом глюкагона, где общая молекулярная масса глюкагоновых цепей составляет примерно 1000-5000 дальтон. В некоторых вариантах изобретения, ПЭГилированный агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO: 806, где ПЭГ-цепь ковалентно связана с аминокислотным остатком в положении 21 и в положении 24, и где общая молекулярная масса двух ПЭГ-цепей составляет примерно 1000-5000 дальтон. В другом варианте изобретения, ПЭГилированный агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO: 806, где ПЭГ-цепь ковалентно связана с аминокислотным остатком в положении 21 и в положении 24, и где общая молекулярная масса двух ПЭГ-цепей составляет примерно 5000-20000 дальтон.

Полиэтиленгликолевая цепь может быть прямой или разветвленной. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, полиэтиленгликолевая цепь имеет среднюю молекулярную массу примерно 500-40000 дальтон. В некоторых вариантах изобретения, полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу примерно 500-5000 дальтон. В другом варианте изобретения, полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу примерно 20000-40000 дальтон.

Любой из описанных выше пептидов глюкагона может быть дополнительно модифицирован так, чтобы он включал ковалентный или нековалентный внутримолекулярный мостик или аминокислоту, стабилизирующую альфа-спираль, в С-концевой части пептида глюкагона (в положении аминокислот 12-29). В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, пептид глюкагона содержит любую одну или несколько из обсуждаемых выше модификаций, а также аминокислотную замену в положениях 16, 20, 21 или 24 (или их комбинации), то есть, замену α,α-дизамещенной аминокислотой, например AIB. В соответствии с другим вариантом изобретения, пептид глюкагона содержит любую одну или несколько из обсуждаемых выше модификаций, а также внутримолекулярный мостик, например, лактам, присутствующий между боковыми цепями аминокислот в положениях 16 и 20 пептида глюкагона.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, пептид глюкагона содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 877, где Xaa в положении 3 представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь структуры I, II или III:

где:

R1 представляет собой C0-3алкил или C0-3гетероалкил; R2 представляет собой NHR4 или C1-3алкил; R3 представляет собой C1-3алкил; R4 представляет собой H или C1-3алкил; X представляет собой NH, O или S; а Y представляет собой NHR4, SR3 или OR3. В некоторых вариантах изобретения, X представляет собой NH или Y представляет собой NHR4. В некоторых вариантах изобретения, R1 представляет собой C0-2алкил или C1гетероалкил. В некоторых вариантах изобретения, R2 представляет собой NHR4 или C1алкил. В некоторых вариантах изобретения, R4 представляет собой H или C1алкил. В своих репрезентативных вариантах, настоящее изобретение относится к аминокислоте, содержащей боковую цепь структуры I, где R1 представляет собой CH2S, X представляет собой NH, а R2 представляет собой CH3 (ацетамидометилцистеин, C(Acm)); R1 представляет собой CH2, X представляет собой NH, а R2 представляет собой CH3 (ацетилдиаминобутановую кислоту, Dab(Ac)); R1 представляет собой C0алкил, X представляет собой NH, R2 представляет собой NHR4, а R4 представляет собой H (карбамоилдиаминопропановую кислоту, Dap(мочевину); или R1 представляет собой CH2CH2, X представляет собой NH, а R2 представляет собой CH3 (ацетилорнитин, Orn(Ac)). В своих репрезентативных вариантах, настоящее изобретение относится к аминокислоте, содержащей боковую цепь структуры II, где R1 представляет собой CH2, Y представляет собой NHR4, а R4 представляет собой CH3 (метилглутамин, Q(Me)). В своих репрезентативных вариантах, настоящее изобретение относится к аминокислоте, содержащей боковую цепь структуры III, где R1 представляет собой CH2, а R4 представляет собой H (сульфоксид метионина, M(O)). В конкретных вариантах изобретения, аминокислота в положении 3 заменена Dab(Ac). Так, например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873 и SEQ ID NO: 874.

В некоторых вариантах изобретения, пептидом глюкагона является аналог пептида глюкагона SEQ ID NO: 877. В конкретных аспектах изобретения, описанный здесь аналог содержит любую из аминокислотных модификаций, включая, но не ограничиваясь ими, замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 28 аминокислотами Asn, Asp, или Glu; замену в положении 28 аминокислотой Asp; замену в положении 28 аминокислотой Glu; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 29 аминокислотами Asp, Glu или Lys; замену в положении 29 аминокислотой Glu; инсерцию 1-3 заряженных аминокислот за положением 29; инсерцию Glu или Lys за положением 29; инсерцию Gly-Lys или Lys-Lys за положением 29; и их комбинации.

В некоторых вариантах изобретения, аналог пептида глюкагона SEQ ID NO: 877 содержит α,α-дизамещенную аминокислоту, такую как AIB, в одном, двух, трех или во всех положениях 16, 20, 21 и 24.

В некоторых вариантах изобретения, аналог пептида глюкагона SEQ ID NO: 877 содержит одну или несколько из нижеследующих модификаций: замену His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая снижает восприимчивость пептида глюкагона к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV), замену Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая снижает восприимчивость пептида глюкагона к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP-IV), замену Thr в положении 7 аминокислотой, не содержащей гидроксильной группы, например, Abu или Ile; замену Tyr в положении 10 аминокислотой Phe или Val; замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg; замену Asp в положении 15 аминокислотой Glu, замену Ser в положении 16 аминокислотами Thr или AIB; замену Gln в положении 20 аминокислотами Ala или AIB; замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu; замену Gln в положении 24 аминокислотами Ala или AIB; замену Met в положении 27 аминокислотами Leu или Nle; делецию аминокислот в положениях 27-29; делецию аминокислот в положениях 28-29; делецию аминокислоты в положении 29; добавление аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 820 к C-концу, где аминокислотой в положении 29 является Thr или Gly, или их комбинацию.

В соответствии с конкретными вариантами изобретения, пептид глюкагона содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NN: 862-867 и 869-874.

В некоторых вариантах изобретения, аналог пептида глюкагона, включающий SEQ ID NO: 877, содержит гидрофильную группу, например ПЭГ, ковалентно связанную с аминокислотой в любом из положений 16, 17, 20, 21, 24 и 29 или в положении C-концевой аминокислоты.

В некоторых вариантах изобретения, аналог пептида глюкагона, включающий SEQ ID NO: 877, содержит аминокислоту, имеющую боковую цепь, ковалентно связанную, но необязательно, посредством спейсера, с ацильной группой или алкильной группой, где указанная ацильная группа или алкильная группа является ненативной для данной природной аминокислоты. В некоторых вариантах изобретения, ацильной группой является ацильная группа жирной C4-C30-кислоты. В других вариантах изобретения, алкильной группой является C4-C30-алкил. В конкретных аспектах изобретения, ацильная группа или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 10. В некоторых вариантах изобретения, аминокислотой в положении 7 является Ile или Abu.

Агонист глюкагона может представлять собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NN: 801-919, имеющую, но необязательно, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных модификаций, которые обеспечивают сохранение активности агониста глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, агонист глюкагона содержит аминокислоты любой из SEQ ID NN: 859-919.

Родственные глюкагону пептиды класса 2

В некоторых вариантах изобретения, родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 2, описанный в настоящей заявке и в Международной патентной заявке No. PCT US2009/47447 (поданной 16 июня, 2009), в предварительной заявке на патент США No. 61/090448 и в заявке на патент США No. 61/151349, содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Биологические последовательности, описанные в следующем разделе (SEQ ID NN: 1001-1262), относящемся к родственным глюкагону пептидам класса 2, соответствуют последовательностям SEQ ID NN: 1-262, представленным в Международной патентной заявке No. PCT US2009/47447.

Активность

Нативный глюкагон не активирует рецептор GIP, и обычно, его активность составляет примерно 1% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1. Модификации, введенные в описанную здесь последовательность нативного глюкагона, приводят к продуцированию родственных глюкагону пептидов класса 2, которые могут обладать сильной глюкагоновой активностью, эквивалентной активности нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1001), или более высокой активностью; сильной GIP-активностью, эквивалентной активности нативного GIP (SEQ ID NO: 1004), или более высокой активностью, и/или сильной GLP-1-активностью, эквивалентной активности нативного GLP-1 или более высокой активностью. В соответствии с этим, родственным глюкагону пептидом класса 2 может быть один из таких пептидов, как двойной агонист глюкагона/GIP, тройной агонист глюкагона/GIP/GLP-1, двойной агонист GIP/GLP-1 или пептид глюкагона-агониста GIP, также описанные в настоящей заявке.

В некоторых вариантах изобретения, EC50 описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 2 в отношении активации рецептора GIP составляет примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. В некоторых вариантах изобретения, EC50 описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 2 в отношении активации рецептора глюкагона составляет примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. В некоторых вариантах изобретения, EC50 описанных здесь родственных глюкагону пептидов класса 2 в отношении активации рецептора GLP-1 составляет примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. Активация рецептора может быть измерена с помощью анализов in vitro путем оценки уровня индуцирования cAMP в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих данный рецептор, например, с помощью анализа клеток HEK293, ко-трансфецированных ДНК, кодирующей этот рецептор, и геном люциферазы, сцепленным с cAMP-отвечающим элементом, как описано в примере 5.

В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют активность, которая по меньшей мере примерно на 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% или 200% или более превышает активность нативного GIP (GIP-активность) по отношению к рецептору GIP. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона обладают активностью по отношению к рецептору GIP, которая составляет не более, чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного GIP. В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют активность, которая по меньшей мере примерно на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% или 500% или более превышает активность нативного глюкагона (глюкагоновая активность) по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона обладают активностью по отношению к рецептору глюкагона, которая составляет не более, чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активности нативного глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют активность, которая по меньшей мере примерно на 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% или 200% или более превышает активность нативного GLP-1 (GLP-1 -активность) по отношению к рецептору GLP-1. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона обладают активностью по отношению к рецептору GLP-1, которая составляет не более, чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активности нативного GLP-1. Активность родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору по сравнению с нативным лигандом рецептора вычисляют как обратное отношение EC50 для родственного глюкагону пептида класса 2 к ЕС50 нативного лиганда.

В некоторых вариантах изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают активностью по отношению к рецептору глюкагона и к рецептору GIP («двойные агонисты глюкагона/GIP»). Эти родственные глюкагону пептиды класса 2, в отличие от нативного глюкагона, обладают специфичностью к рецептору глюкагона и к рецептору GIP. В некоторых вариантах изобретения, EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору GIP примерно менее, чем в 50 раз, 40 раз, 30 раз или в 20 раз отличается (является выше или ниже) от EC50 по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 примерно менее, чем в 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (является выше или ниже) от его глюкагоновой активности. В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору GIP, деленное на концентрацию EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору глюкагона, составляет менее, чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 по отношению к рецептору GIP, деленной на концентрацию EC50 по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах изобретения, отношение GIP-активности родственного глюкагону пептида класса 2 к глюкагоновой активности родственного глюкагону пептида класса 2, составляет примерно менее, чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах изобретения, отношение активности по отношению к рецептору GIP, деленной на активность по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах изобретения, GLP-1-активность в значительной степени снижается или ингибируется, например, посредством аминокислотной модификации в положении 7, то есть, делеции аминокислоты (аминокислот) со стороны С-конца по отношению к аминокислоте в положении 27 или 28 с образованием пептида, состоящего из 27 или 28 аминокислот, или их комбинации.

В другом аспекте изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают активностью по отношению к рецептору глюкагона, GIP и GLP-1 («тройные агонисты глюкагона/GIP/GLP-1»). Эти родственные глюкагону пептиды класса 2, в отличие от нативных глюкагонов обладают специфичностью к рецептору глюкагона, а также к рецептору GIP и к рецептору GLP-1. В некоторых вариантах изобретения, EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору GIP примерно менее, чем в 50 раз, в 40 раз, в 30 раз или в 20 раз отличается (является выше или ниже) от EC50 по отношению к рецептору глюкагона и GLP-1. В некоторых вариантах изобретения, GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 примерно менее, чем в 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (является выше или ниже) от его глюкагоновой активности и GLP-1-активности. В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 тройного агониста по отношению к рецептору GIP, деленной на концентрацию EC50 тройного агониста по отношению к рецептору GLP-1, составляет менее, чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах настоящего изобретения, отношение, равное концентрации EC50 по отношению к рецептору GIP, деленной на концентрацию EC50 по отношению к рецептору GLP-1, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах изобретения, отношение GIP-активности тройного агониста по сравнению с GLP-1-активностью тройного агониста, составляет примерно менее, чем 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах изобретения, отношение активности по отношению к рецептору GIP, деленной на активность по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В родственных вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 тройного агониста по отношению к рецептору GIP, деленной на концентрацию EC50 тройного агониста по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно менее, чем 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 по отношению к рецептору GIP, деленной на концентрацию EC50 по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах изобретения, отношение GIP-активности тройного агониста к глюкагоновой активности тройного агониста составляет примерно менее, чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах изобретения, отношение активности к рецептору GIP, деленной на активность к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 тройного агониста по отношению к рецептору GLP-1, деленной на концентрацию EC50 тройного агониста по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно менее, чем 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах настоящего изобретения, указанное отношение концентрации EC50 по отношению к рецептору GLP-1, деленное на концентрацию EC50 по отношению к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах настоящего изобретения, отношение GLP-1-активности тройного агониста к глюкагоновой активности тройного агониста составляет примерно менее, чем 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное активности к рецептору GLP-1, деленной на активность к рецептору глюкагона, составляет примерно 1 или примерно менее, чем 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2).

В другом аспекте изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают активностью по отношению к рецепторам GLP-1 и GIP («двойные агонисты GIP/GLP-1»), но их глюкагоновая активность была в значительной степени снижена или ингибирована например, посредством аминокислотной модификации в положении 3. Так, например, замена в этом положении кислотной, основной или гидрофобной аминокислотой (глутаминовой кислотой, орнитином, норлейцином) приводит к снижению глюкагоновой активности. В некоторых вариантах изобретения, EC50 пептида глюкагона по отношению к рецептору GIP по меньшей мере в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (является выше или ниже) от EC50 по отношению к рецептору GLP-1. В некоторых вариантах изобретения, GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 примерно менее, чем в 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (является выше или ниже) его GLP-1-активности. В некоторых вариантах изобретения, эти родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают активностью, которая составляет примерно 10% или менее от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона, например, примерно 1-10% активностью, или примерно 0,1-10% активностью, или более, чем примерно 0,1% активностью, но менее, чем примерно 10% активностью. В некоторых вариантах изобретения, отношение, равное концентрации EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору GIP, деленной на концентрацию EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 по отношению к рецептору GLP-1, составляет примерно менее, чем 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5, но не менее, чем 1. В некоторых вариантах изобретения, отношение GIP-активности родственного глюкагону пептида класса 2 к GLP-1-активности родственного глюкагону пептида класса 2 составляет примерно менее, чем 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5, но не менее, чем 1.

В другом аспекте изобретения, родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают активностью по отношению к рецептору GIP, но при этом, глюкагоновая активность и GLP-1-активность были значительно снижены или ингибированы («пептиды глюкагона-агониста GIP»), например, посредством аминокислотных модификаций путем замены аминокислоты в положении 3 аминокислотой Glu и аминокислотой в положении 7 аминокислотой Ile. В некоторых вариантах изобретения, эти родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают активностью, которая составляет 10% или менее от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона, например, 1-10%, или примерно 0,1-10%, или примерно более 0,1%, 0,5%, или 1%, но примерно менее, чем 1%, 5%, или 10%. В некоторых вариантах изобретения, эти родственные глюкагону пептиды класса 2 также обладают активностью, которая составляет примерно 10% или менее от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1, например, примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или примерно более, чем 0,1%, 0,5%, или 1%, но примерно менее, чем 1%, 5% или 10%.

В некоторых вариантах изобретения, если родственный глюкагону пептид не является ПЭГилированным, то EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении активации рецептора GIP составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, либо его аналог обладает активностью, которая составляет по меньшей мере примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% от активности нативного GIP по отношению к рецептору GIP. В родственных вариантах изобретения, EC50 неПЭГилированного родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении активации рецептора GLP-1 составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, либо составляет по меньшей мере примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1. В других родственных вариантах изобретения, EC50 неПЭГилированного родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении активации рецептора глюкагона составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, либо она составляет по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15% или 20% от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, неПЭГилированный родственный глюкагону пептид класса 2 обладает активностью, которая составляет примерно менее, чем 1% от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона. В других вариантах изобретения, неПЭГилированный родственный глюкагону пептид класса 2 обладает активностью, которая составляет примерно менее, чем 10%, 5% или 1% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1.

В тех вариантах изобретения, в которых родственные глюкагону пептиды класса 2 связаны с гидрофильными группами, такими как ПЭГ, относительные EC50 для одного или более рецепторов могут быть выше, например, в 10 раз. Так, например, EC50 ПЭГилированного аналога в отношении активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее, либо родственный глюкагону пептид класса 2 обладает активностью, которая составляет по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или 0,5% от активности нативного GIP по отношению к рецептору GIP. В родственных вариантах изобретения, EC50 ПЭГилированного родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении активации рецептора GLP-1 составляет примерно 10 нМ или менее, либо он составляет по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или 0,5% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1. В других родственных вариантах изобретения, EC50 ПЭГилированного родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении активации рецептора глюкагона составляет примерно 10 нМ или менее, либо по меньшей мере примерно 0,5%, 1%, 1,5% или 2% от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 2 обладает активностью, которая составляет примерно менее, чем 1% от активности нативного глюкагона по отношению к рецептору глюкагона. В других вариантах изобретения, родственный глюкагону пептид класса 2 обладает активностью, которая составляет примерно менее, чем 10%, 5% или 1% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1.

Модификации

Модификации, описанные здесь для родственного глюкагону пептида класса 2, позволяют осуществлять манипуляции с глюкагоном (SEQ ID NO: 1001) в целях создания пептидов глюкагона, обладающих повышенной GIP-активностью, глюкагоновой активностью и/или GLP-1-активностью. Другие описанные здесь модификации родственного глюкагону пептида класса 2 позволяют продлить время полужизни, улучшают растворимость или повышают стабильность полученного пептида. Другие описанные здесь модификации родственного глюкагону пептида класса 2 не влияют на активность, либо эти модификации могут быть внесены так, чтобы они не подавляли нужную(ые) активность(и). Любые комбинации описанных родственных глюкагону пептидов класса 2, используемые в тех же самых целях (например, для повышения GIP-активности), могут быть введены отдельно или в комбинации. Любая одна из комбинаций или серия комбинаций родственного глюкагону пептида класса 2, которые приводят к улучшению свойств, могут быть введены отдельно или в комбинации, например, повышение GIP- и/или GLP-1-активности может быть объединено с увеличением времени полужизни. В родственных вариантах изобретения, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более аминокислотных модификаций могут представлять собой неконсервативные замены, добавления или делеции. В некоторых вариантах изобретения, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более аминокислотных модификаций могут представлять собой консервативные замены.

Модификации, которые влияют на GIP-активность

Повышение активности по отношению к рецептору GIP достигается посредством аминокислотной модификации в положении 1. Так, например, His в положении 1 заменен крупной ароматической аминокислотой, необязательно, Tyr, Phe, Trp, амино-Phe, нитро-Phe, хлор-Phe, сульфо-Phe, 4-пиридил-Ala, метил-Tyr или 3-амино-Tyr. Комбинация Tyr в положении 1 со стабилизацией альфа-спирали в области, соответствующей аминокислотам 12-29, сообщает родственному глюкагону пептиду класса 2 способность активировать рецептор GIP, а также рецептор GLP-1 и рецептор глюкагона. Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, посредством образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика, или замены аминокислот, находящихся приблизительно в положениях 12-29, аминокислотой, стабилизирующей альфа-спираль (например, α,α-дизамещенной аминокислотой), и/или инсерции таких аминокислот.

Повышенная активность по отношению к рецептору GIP также достигается посредством аминокислотных модификаций в положениях 27 и/или 28, и, необязательно в положении 29. Так, например, Met в положении 27 заменяют крупной алифатической аминокислотой, необязательно, Leu; Asn в положении 28 заменяют небольшой алифатической аминокислотой, необязательно, Ala, а Thr в положении 29 заменяют небольшой алифатической аминокислотой, необязательно, Gly. Замена LAG в положениях 27-29 приводит к повышению GIP-активности по сравнению с активностью нативной последовательности MNT в этих положениях.

Повышение активности по отношению к рецептору GIP также достигается посредством аминокислотной модификации в положении 12. Так, например, аминокислоту в положении 12 заменяют крупной алифатической неполярной аминокислотой, необязательно, Ile.

Повышенная активность по отношению к рецептору GIP также достигается посредством аминокислотной модификации в положениях 17 и/или 18. Так, например, аминокислоту в положении 17 заменяют полярным остатком, необязательно, Gln, а аминокислоту в положении 18 заменяют небольшой алифатической аминокислотой, необязательно, Ala. Замена QA в положениях 17 и 18 приводит к повышению GIP-активности по сравнению с активностью нативной последовательности RR в этих положениях.

Повышение активности по отношению к рецептору GIP достигается посредством модификаций, которые приводят к образованию внутримолекулярного мостика между боковыми цепями аминокислоты в положениях 12-29. Так, например, внутримолекулярный мостик может образовываться посредством ковалентной связи между боковыми цепями двух аминокислот в положениях i и i+4 или между положениями j и j+3, или между положениями k и k+7. В репрезентативных вариантах изобретения, указанный мостик расположен между положениями 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, 24 и 28, или 17 и 20. В других вариантах изобретения, нековалентные связи, такие как солевые мостики, могут образовываться между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами в этих положениях.

Любая из вышеописанных модификаций, которая приводит к повышению активности рецептора GIP, может быть введена отдельно или в комбинации. Комбинации модификаций, которые приводят к повышению активности рецептора GIP, в основном, дают более высокую GIP-активность, чем любая из таких модификаций, введенных отдельно.

Модификации, которые влияют на глюкагоновую активность

В некоторых вариантах изобретения, повышенная глюкагоновая активность достигается посредством аминокислотной модификации в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1001). В неограничивающем примере, такая повышенная активность может достигаться посредством замены природного серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой одной из таких аминокислот, как глутамин, гомоглутаминовая кислота или гомоцистеиновая кислота, или заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P), и боковую цепь длиной примерно в 4 атома (или 3-5 атомов). В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона сохраняет свою природную селективность к рецептору глюкагона, но не к рецептору GLP-1.

Активность по отношению к рецептору глюкагона может быть снижена посредством аминокислотной модификации в положении 3, например, замены природного глутамина в положении 3 кислотной, основной или гидрофобной аминокислотой. Так, например, замена аминокислоты в положении 3 глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином, в основном, приводит к снижению или ингибированию активности по отношению к рецептору глюкагона.

Сохранение или повышение активности по отношению к рецептору глюкагона может быть достигнуто посредством замены Gln в положении 3 аналогом глутамина, описанным в настоящей заявке. Так, например, агонисты глюкагона могут содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NN: 1243-1248, 1250, 1251 и 1253-1256.

Восстановление глюкагоновой активности, которая была снижена в результате аминокислотных модификаций в положениях 1 и 2, достигается посредством модификаций, которые стабилизируют альфа-спиральную структуру С-концевой части (аминокислоты 12-29) пептида глюкагона или его аналога. Так, например, внутримолекулярный мостик может образовываться посредством ковалентной связи между боковыми цепями двух аминокислот в положениях i и i+4 или между положениями j и j+3, или между положениями k и k+7. В других вариантах изобретения, нековалентные связи, такие как солевые мостики, могут образовываться между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами в этих положениях. В других вариантах изобретения, одну или несколько α,α-дизамещенных аминокислот встраивают или вводят путем замены в эту С-концевую часть (аминокислоты 12-29) в положениях, которые обеспечивают сохранение нужной активности. Так, например, аминокислоты а одном, двух, трех или во всех положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Модификации, которые влияют на GLP-1-активность

Повышение активности по отношению к рецептору GLP-1 достигается путем замены карбоксильной группы C-концевой аминокислоты нейтральной группой, такой как амид или сложный эфир.

Повышение активности по отношению к рецептору GLP-1 может быть также достигнуто путем стабилизации альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагона (примерно в положениях аминокислот 12-29), например, посредством образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями двух аминокислот или посредством замены аминокислот примерно в положениях аминокислот 12-29 аминокислотой, стабилизирующей альфа-спиральную структуру (например, α,α-дизамещенной аминокислотой) и/или инсерции этой аминокислоты, также описанной в настоящей заявке. В репрезентативных вариантах изобретения, боковые цепи аминокислотных пар в положениях 12 и 16, 13 и 17, 16 и 20, 17 и 21, 20 и 24 или 24 и 28 (аминокислотные пары, в которых i=12, 16, 20 или 24) связаны друг с другом и стабилизируют альфа-спираль глюкагона. В некоторых вариантах изобретения, указанный мостик или линкер имеет длину примерно в 8 (или примерно 7-9) атомов, в частности, когда этот мостик находится между положениями i и i+4. В некоторых вариантах изобретения, указанный мостик или линкер имеет длину примерно в 6 (или примерно 5-7) атомов, в частности, когда этот мостик находится между положениями j и j+3.

В некоторых вариантах изобретения, внутримолекулярные мостики образуются (a) в результате замены природного серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или, альтернативно, любой одной из таких аминокислот, как глутамин, гомоглутаминовая кислота или гомоцистеиновая кислота, либо заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P) и боковую цепь длиной примерно в 4 атома (или 3-5 атомов), и (b) в результате замены природного глутамина в положении 20 другой гидрофильной аминокислотой, имеющей боковую цепь, которая представляет собой либо заряженную боковую цепь, либо боковую цепь, обладающую способностью к образованию водородной связи и имеющую длину по меньшей мере примерно в 5 (или примерно 4-6) атомов, например, лизином, цитруллином, аргинином или орнитином. Боковые цепи таких аминокислот в положениях 16 и 20 могут образовывать солевой мостик или способны ковалентно связываться. В некоторых вариантах изобретения, две аминокислоты связаны друг с другом с образованием лактамового кольца.

В некоторых вариантах изобретения, стабилизация альфа-спиральной структуры в С-концевой части пептида глюкагона может быть достигнута посредством образования внутримолекулярного мостика, не являющегося лактамовым мостиком. Так, например, подходящими методами ковалентного связывания являются любой один или несколько таких методов, как метатезис олефинов, циклизация на основе лантионина, образование дисульфидного мостика или модифицированного мостика, содержащего серу, применение α,ω-диаминоалкановых связей, образование мостиков, содержащих атом металла и другие методы циклизации пептидов, применяемые для стабилизации альфа-спирали.

В других вариантах изобретения, одну или несколько α,α-дизамещенных аминокислот включают или вводят путем замены в С-концевую часть (аминокислоты 12-29) в положения, которые ответственны за сохранение нужной активности. Так, например, аминокислоты в одном, двух, трех или во всех положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Повышение активности по отношению к рецептору GLP-1 достигается посредством аминокислотной модификации в положении 20 как описано в настоящей заявке.

Повышение активности по отношению к рецептору GLP-1 достигается путем добавления GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096) к С-концу. GLP-1-активность в таких аналогах может быть также повышена путем модификации аминокислоты в положениях 18, 28 или 29, или в положениях 18 и 29, как описано в настоящей заявке.

Дополнительное небольшое увеличение GLP-1-активности достигается путем модификации аминокислоты в положении 10 посредством введения крупного ароматического аминокислотного остатка, необязательно, Trp.

Снижение активности по отношению к рецептору GLP-1 достигается, например, путем модификации аминокислоты в положении 7 как описано в настоящей заявке.

Активность по отношению к рецептору GLP-1 может быть еще больше увеличена путем замены нативного аргинина аланином в положении 18.

Любая из вышеописанных модификаций, введенная в родственный глюкагону пептид класса 2 и приводящая к увеличению активности по отношению к рецептору GLP-1, может быть внесена отдельно или в комбинации с другими модификациями. Комбинации модификаций, которые приводят к повышению активности по отношению к рецептору GLP-1, и которые, в основном, еще больше повышают GLP-1-активность, чем любая из таких модификаций, введенных отдельно. Так, например, настоящее изобретение относится к пептидам глюкагона, которые содержат модификации в положении 16, в положении 20 и в C-концевой карбоксильной группе, необязательно посредством ковалентной связи между аминокислотами в положениях 16 и 20; к пептидам глюкагона, которые содержат модификации в положении 16 и в C-концевой карбоксильной группе; к пептидам глюкагона, которые содержат модификации в положениях 16 и 20, необязательно, посредством ковалентной связи между аминокислотами в положениях 16 и 20; и к пептидам глюкагона, которые содержат модификации в положении 20 и в C-концевой карбоксильной группе.

Модификации, повышающие резистентность к DPP-IV

Модификации в положении 1 и/или 2 могут повышать резистентность пептидов к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP IV). Так, например, аминокислоты в положении 1 и/или в положении 2 могут быть заменены аминокислотой, резистентной к DPP-IV, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положении 2 заменена N-метилаланином.

Было обнаружено, что модификации в положении 2 (например, AIB в положении 2), а в некоторых случаях, модификации в положении 1 (например, DMIA в положении 1) могут снижать глюкагоновую активность, а иногда значительно; причем, неожиданно было обнаружено, что такая пониженная глюкагоновая активность может быть доведена до исходного уровня посредством стабилизации альфа-спиральной структуры в С-концевой части глюкагона (аминокислоты приблизительно 12-29), например, посредством образования ковалентной связи между боковыми цепями двух аминокислот, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах изобретения, ковалентная связь присутствует между аминокислотами в положениях «i» и «i+4», или в положениях «j» и «j+3», например, между положениями 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, 24 и 28, или 17 и 20. В репрезентативных вариантах изобретения, такой ковалентной связью является лактамовый мостик, расположенный между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20. В некоторых вариантах изобретения, такой ковалентной связью является внутримолекулярный мостик, но не лактамовый мостик, как описано в настоящей заявке.

Модификации, которые снижают степень разложения

В других репрезентативных вариантах изобретения, любой из родственных глюкагону пептидов класса 2 может быть дополнительно модифицирован для повышения стабильности посредством модификации аминокислоты в положении 15 и/или 16 SEQ ID NO: 1001 в целях снижения степени разложения пептида в течение определенного периода времени, в частности, в кислотных или основных буферах. Такие модификации снижают степень расщепления пептидной связи Asp15-Ser16. В репрезентативных вариантах изобретения, модификацией аминокислоты в положении 15 является делеция или замена Asp глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В других репрезентативных вариантах изобретения, модификацией аминокислоты в положении 16 является делеция или замена Ser на Thr или AIB. В других репрезентативных вариантах изобретения, Ser в положении 16 заменен глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой одной из таких аминокислот, как глутамин, гомоглутаминовая кислота или гомоцистеиновая кислота.

В некоторых вариантах изобретения, метиониновый остаток в положении 27 нативного пептида модифицируют, например, путем делеции или замены. Такие модификации могут предотвращать окислительное разложение пептида. В некоторых вариантах изобретения, Met в положении 27 заменен лейцином, изолейцином или норлейцином. В некоторых конкретных вариантах изобретения, Met в положении 27 заменен лейцином или норлейцином.

В некоторых вариантах изобретения, Gln в положениях 20 и/или 24 модифицируют, например, путем делеции или замены. Такие модификации могут снижать степень разложения, обусловленного дезамидированием Gln. В некоторых вариантах изобретения, Gln в положениях 20 и/или 24 заменен Ser, Thr, Ala или AIB. В некоторых вариантах изобретения, Gln в положениях 20 и/или 24 заменен Lys, Arg, Orn или цитруллином.

В некоторых вариантах изобретения, Asp в положении 21 модифицируют, например, путем делеции или замены. Такие модификации могут снижать степень разложения, обусловленного дегидратацией Asp с образованием циклического сукцинимидного промежуточного соединения, с последующей его изомеризацией в изоаспартат. В некоторых вариантах изобретения, аминокислота в положении 21 заменена Glu, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых конкретных вариантах изобретения, аминокислота в положении 21 заменена Glu.

Стабилизация альфа-спиральной структуры

Стабилизация альфа-спиральной структуры в C-концевой части родственного глюкагону пептида класса 2 (аминокислоты приблизительно 12-29) приводит к повышению GLP-1 и/или GIP-активности и к восстановлению глюкагоновой активности, которая была снижена в результате аминокислотных модификаций в положениях 1 и/или 2. Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, посредством образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика, или замены аминокислот в положениях приблизительно 12-29 аминокислотой, стабилизирующей альфа-спираль (например, α,α-дизамещенной аминокислотой), и/или инсерции указанных аминокислот. Стабилизация альфа-спиральной структуры агониста GIP может быть осуществлена как описано в настоящей заявке.

Ацилирование и алкилирование

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, описанные здесь пептиды глюкагона модифицируют так, чтобы они содержали ацильную группу или алкильную группу, например, ацильную группу или алкильную группу, которая является ненативной для природной аминокислоты, описанной в настоящей заявке. Ацилирование или алкилирование может приводить к увеличению времени полужизни пептида глюкагона в кровотоке. Ацилирование или алкилирование может преимущественно замедлять начало действия и/или увеличивать продолжительность действия по отношению к рецепторам глюкагона и/или GLP-1 и/или повышать резистентность к протеазам, таким как DPP-IV, и/или повышать растворимость. Активность пептида глюкагона по отношению к рецепторам глюкагона и/или GLP-1 и/или GIP может быть сохранена после ацилирования. В некоторых вариантах изобретения, активность ацилированных пептидов глюкагона сравнима с активностью неацилированных вариантов пептидов глюкагона. Родственные глюкагону пептиды класса 2 могут быть ацилированы или алкилированы в том же самом положении аминокислоты, в котором была присоединена гидрофильная группа, или в другом положении аминокислоты, как описано в настоящей заявке.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к пептиду глюкагона, модифицированному так, чтобы он содержал ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 пептида глюкагона. Пептид глюкагона может также содержать спейсер, расположенный между аминокислотой в положении 10 пептида глюкагона и ацильной группой или алкильной группой. В некоторых вариантах изобретения, ацильной группой является жирная кислота или желчная кислота или их соль, например, жирная C4-C30-кислота, жирная C8-C24-кислота, холевая кислота, C4-C30-алкил, C8-C24- алкил, или алкил, содержащий стероидную группу желчной кислоты. Спейсером является любая часть, имеющая подходящие реакционноспособные группы для присоединения ацильной или алкильной групп. В репрезентативных вариантах изобретения, спейсер включает аминокислоту, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах изобретения, спейсер выбран из группы, состоящей из Trp, Glu, Asp, Cys и спейсера, содержащего NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, где m равно любому целому числу от 1 до 6, а n равно любому целому числу от 2 до 12. Такие ацилированные или алкилированные пептиды глюкагона могут также содержать гидрофильную группу, необязательно, полиэтиленгликоль. Любой из вышеуказанных пептидов глюкагона может содержать две ацильных группы или две алкильных группы или их комбинацию.

Конъюгаты и гибриды

Агонист GIP может быть присоединен, необязательно, посредством ковалентного присоединения, и необязательно, посредством линкера, к части конъюгата, описанного в настоящей заявке.

В других вариантах изобретения, вторым пептидом является XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096), где X выбран из 20 наиболее распространенных аминокислот, например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой аминокислоты или глицина. В некоторых вариантах изобретения, X представляет собой аминокислоту, например, Cys, которая также содержит гидрофильную группу, ковалентно связанную с боковой цепью этой аминокислоты. Такие C-концевые удлинения повышают растворимость и могут также повышать GIP- или GLP-1-активность. В некоторых вариантах изобретения, в которых пептид глюкагона также содержит карбокси-концевое удлинение, такая карбокси-концевая аминокислота в области удлинения заканчивается амидной группой или сложноэфирной группой, но не карбоксильной группой.

В некоторых вариантах изобретения, например, в пептиде глюкагона, содержащем С-концевое удлинение, треонин в положении 29 нативного пептида глюкагона заменен глицином. Так, например, пептид глюкагона, имеющий замену треонина глицином в положении 29 и содержащий C-концевое удлинение GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095), обладает активностью по отношению к рецептору GLP-1, которая в четыре раза превышает активность модифицированного нативного глюкагона, содержащего то же самое С-концевое удлинение. Такая замена T29G может быть использована в комбинации с другими описанными здесь модификациями в целях повышения аффинности пептидов глюкагона по отношению к рецептору GLP-1. Так, например, замена T29G может быть объединена с аминокислотными заменами S16E и N20K, необязательно, с образованием лактамового мостика между аминокислотами 16 и 20, и необязательно, с добавлением описанной здесь ПЭГ-цепи.

В некоторых вариантах изобретения, аминокислоту добавляют к C-концу, и такая дополнительная аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

Модификации, повышающие растворимость

В другом варианте изобретения, растворимость любого из пептидов глюкагона может быть повышена посредством аминокислотных замен и/или добавлений, которые вводят заряженную аминокислоту в С-концевую часть пептида, предпочтительно, в положении со стороны С-конца по отношению к положению 27 SEQ ID NO: 1001. Одна, две или три заряженных аминокислоты могут быть введены, но необязательно, в С-концевую часть, а предпочтительно, со стороны С-конца по отношению к положению 27. В некоторых вариантах изобретения, нативную(ые) аминокислоту(ы) в положениях 28 и/или 29 заменяют одной или двумя заряженными аминокислотами, и/или в другом варианте изобретения, 1-3 заряженных аминокислоты также добавляют к С-концу пептида. В репрезентативных вариантах изобретения, одна две или все заряженные аминокислоты имеют отрицательный заряд. В некоторых вариантах изобретения, отрицательно заряженной аминокислотой (кислотной аминокислотой) является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота.

В пептид глюкагона могут быть введены дополнительные модификации, например, консервативные замены, позволяющие сохранять GIP-активность (и необязательно, GLP-1-активность и/или глюкагоновую активность).

Другие модификации

Любая из вышеописанных модификаций, введенная в пептид класса 2, которая приводит к повышению или снижению GIP-активности, к повышению или снижению активности по отношению к рецептору глюкагона, и к повышению активности по отношению к рецептору GLP-1, может быть включена отдельно или в комбинации с другими модификациями. Любая из вышеописанных модификаций, введенная в родственный глюкагону пептид класса 2, может быть также объединена с другими модификациями, которые сообщают другие нужные свойства, такие как повышенная растворимость и/или стабильность и/или увеличенная продолжительность действия, как описано в настоящей заявке для родственных глюкагону пептидов класса 2. Альтернативно, любая из вышеописанных модификаций, введенная в родственные глюкагону пептиды класса 2, может быть также объединена с другими модификациями, описанными здесь для родственных глюкагону пептидов класса 2, где указанные модификации не оказывают значительного влияния на растворимость, стабильность или активность. Репрезентативными модификациями являются, но не ограничиваются ими:

(A) Повышение растворимости, например, путем введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в С-концевую часть нативного глюкагона, а предпочтительно, в положении со стороны С-конца по отношению к положению 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена путем замены нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28 или 29, или альтернативно, путем добавления заряженной аминокислоты, например, за положениями 27, 28 или 29. В репрезентативных вариантах изобретения, одна, две, три или все заряженные аминокислоты имеют отрицательный заряд. В других вариантах изобретения, одна, две, три или все заряженные аминокислоты имеют положительный заряд. Такие модификации, как было определено через 24 часа при 25°С, приводят к повышению растворимости, например, в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 15 раз, в 25 раз, в 30 раз или более по сравнению с растворимостью нативного глюкагона при pH 5,5-8, например, при pH 7;

(B) Повышение растворимости и увеличение продолжительности действия или времени полужизни в кровотоке путем добавления гидрофильной группы, такой как описанная здесь полиэтиленгликолевая цепь, например, в положениях 16, 17, 20, 21, 24 или 29, в C-концевом удлинении и в положении C-концевой аминокислоты пептида;

(C) Повышение растворимости и/или увеличение продолжительности действия или времени полужизни в кровотоке и/или замедление начала действия путем ацилирования или алкилирования пептида глюкагона, как описано в настоящей заявке;

(D) Увеличение продолжительности действия или времени полужизни в кровотоке посредством сообщения резистентности к расщеплению дипептидил-пептидазой IV (DPP IV) путем модификации аминокислоты в положении 1 или 2, как описано в настоящей заявке;

(E) Повышение стабильности посредством модификации Asp в положении 15, например, путем делеции или замены глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. Такие модификации могут снижать степень разложения или расщепления при рН в пределах 5,5-8, например, позволяют сохранять целостность исходного пептида по меньшей мере на 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и до 100% через 24 часа при 25°C. Такие модификации снижают степень расщепления пептидной связи между Asp15-Ser16;

(F) Повышение стабильности посредством модификации Ser в положении 16, например, путем замены на Thr или AIB. Такие модификации также снижают степень расщепления пептидной связи между Asp15-Ser16;

(G) Повышение стабильности посредством модификации метионина в положении 27, например, путем замены лейцином или норлейцином. Такие модификации могут снижать степень окислительного разложения. Стабильность может быть также повышена посредством модификации Gln в положении 20 или 24, например, путем замены на Ser, Thr, Ala или AIB. Такие модификации могут снижать степень разложения, обусловленного дезамидированием Gln. Стабильность может быть повышена посредством модификации Asp в положении 21, например, путем замены на Glu. Такие модификации могут снижать степень разложения, обусловленного дегидратацией Asp с образованием циклического сукцинимидного промежуточного соединения с последующей его изомеризацией в изоаспартат;

(H) Неконсервативные или консервативные замены, добавления или делеции, которые не оказывают значительного влияния на активность, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29; замена в одном или нескольких из этих положений на Ala; делеция аминокислот в одном или нескольких положениях 27, 28 или 29; или делеция аминокислоты 29, необязательно, в комбинации с С-концевым амидом или сложным эфиром, введенными вместо С-концевой карбоксильной группы; замена Lys в положении 12 на Arg; замена Tyr в положении 10 на Val или Phe.

Сохранение активности после ПЭГилирования достигается путем добавления GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) к С-концу.

Некоторые положения нативного пептида глюкагона могут быть модифицированы с сохранением по меньшей мере некоторой активности родительского пептида. В соответствии с этим, авторами настоящего изобретения было высказано предположение, что одна или несколько аминокислот в положениях 2, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 могут быть заменены аминокислотой, отличающейся от аминокислоты, присутствующей в нативном пептиде глюкагона, с сохранением активности по отношению к рецептору глюкагона.

В некоторых вариантах изобретения, аминокислоту в положении 18 заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Ser или Thr. В некоторых вариантах изобретения, аминокислоту в положении 20 заменяют Ser, Thr, Lys, Arg, Orn, цитруллином или AIB. В некоторых вариантах изобретения, аминокислоту в положении 21 заменяют Glu, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых вариантах изобретения, пептид глюкагона содержит 1-10 аминокислотных модификаций, выбранных из модификаций в положениях 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 и 29. В репрезентативных вариантах изобретения, модификациями являются одна или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из Gln17, Ala18, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 и Gly29. В некоторых вариантах изобретения, 1 или 2 аминокислоты, выбранных из аминокислот в положениях 17-26, отличаются от аминокислот родительского пептида. В других вариантах изобретения, 1 или 2 аминокислоты, выбранных из аминокислот в положениях 17-22, отличаются от аминокислот родительского пептида. В других вариантах изобретения, модификациями являются Gln17, Ala18, Glu21, Ile23 и Ala24.

В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько аминокислот добавляют к карбокси-концу пептида глюкагона. Аминокислоту обычно выбирают из 20 наиболее распространенных аминокислот, а в некоторых вариантах изобретения, аминокислота имеет амидную группу вместо карбоксильной кислоты нативной аминокислоты. В репрезентативных вариантах изобретения, добавленная аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

Другими модификациями, которые не приводят к ингибированию активности, являются W10 или R20.

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь родственные глюкагону пептиды класса 2 модифицируют посредством усечения у C-конца на один или два аминокислотных остатка с сохранением активности и эффективности по отношению к рецепторам глюкагона, GLP-1 и/или GIP. В соответствии с этим, аминокислота в положениях 29 и/или 28 может быть делетирована.

Репрезентативные варианты

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, аналог глюкагона (SEQ ID NO: 1001), обладающий GIP-агонистической активностью, включает SEQ ID NO: 1001, имеющую (a) аминокислотную модификацию в положении 1, которая сообщает GIP-агонистическую активность, (b) модификацию, стабилизирующую альфа-спиральную структуру С-концевой части (аминокислоты 12-29) аналога, и (c) необязательно, 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) дополнительных аминокислотных модификаций. В некоторых вариантах изобретения, аналог обладает по меньшей мере примерно 1% активностью нативного GIP по отношению к рецептору GIP или любой другой активностью по отношению к описанному здесь рецептору GIP.

В некоторых вариантах изобретения, модификацией, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру, является модификация, которая способствует образованию или введению внутримолекулярного мостика, включая, например, ковалентный внутримолекулярный мостик, такой как любой из описанных здесь мостиков. В некоторых вариантах изобретения, ковалентным внутримолекулярным мостиком является лактамовый мостик. Лактамовый мостик аналога этих вариантов может представлять собой лактамовый мостик, описанный в настоящей заявке. Описание лактамовых мостиков можно найти, например, в разделе «Стабилизация альфа-спиральной структуры». Так, например, лактамовым мостиком может быть мостик, расположенный между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, а j равно 17. В некоторых вариантах изобретения, лактамовый мостик может присутствовать между аминокислотами в положениях 16 и 20, где одна из аминокислот в положениях 16 и 20 заменена Glu, а другая аминокислота в положениях 16 и 20 заменена Lys.

В альтернативных вариантах изобретения, модификацией, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру, является введение одной, двух, трех или четырех α,α-дизамещенных аминокислот в положении(ях) 16, 20, 21 и 24 данного аналога. В некоторых вариантах изобретения, α,α-дизамещенной аминокислотой является AIB. В некоторых аспектах изобретения. α,α-дизамещенной аминокислотой (например, AIB) является аминокислота в положении 20, а аминокислота в положении 16 заменена положительно заряженной аминокислотой, такой как, например, описанная здесь аминокислота формулы IV. Аминокислотой формулы IV может быть гомоLys, Lys, Orn или 2,4-диаминомасляная кислота (Dab).

В конкретных аспектах настоящего изобретения, аминокислотной модификацией в положении 1 является замена His аминокислотой, не содержащей имидазоловой боковой цепи, например, крупной ароматической аминокислотой (например, Tyr).

В некоторых аспектах изобретения, аналог глюкагона включает аминокислотные модификации в одном, двух или во всех положениях 27, 28 и 29. Так, например, аминокислота Met в положении 27 может быть заменена крупной алифатической аминокислотой, необязательно, Leu, аминокислота Asn в положении 28 может быть заменена небольшой алифатической аминокислотой, необязательно, Ala, аминокислота Thr в положении 29 может быть заменена небольшой алифатической аминокислотой, необязательно, Gly, либо может быть осуществлена комбинация из двух или трех вышеуказанных замен. В конкретных вариантах изобретения, аналог глюкагона включает Leu в положении 27, Ala в положении 28 и Gly или Thr в положении 29.

В некоторых вариантах изобретения, аналог глюкагона содержит удлинение из 1-21 аминокислот со стороны C-конца по отношению к аминокислоте в положении 29. Удлинение может содержать, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1095 или 1096. Дополнительно или альтернативно, аналог глюкагона может иметь удлинение, в котором 1-6 аминокислот представляют собой положительно заряженные аминокислоты. Положительно заряженными аминокислотами могут быть аминокислоты формулы IV, включая, но не ограничиваясь ими, Lys, гомоLys, Orn и Dab.

В некоторых вариантах изобретения, аналог глюкагона ацилируют или алкилируют как описано в настоящей заявке. Так, например, ацильная или алкильная группа может быть присоединена к аналогу глюкагона посредством спейсера или без спейсера в положениях 10 или 40 указанного аналога, как описано в настоящей заявке. Аналог может быть дополнительно или альтернативно модифицирован так, чтобы он содержал гидрофильную группу, также описанную в настоящей заявке. Кроме того, в некоторых вариантах изобретения, аналог содержит любую одну или комбинацию нижеследующих модификаций:

(a) замену Ser в положении 2 аминокислотами D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(b) замену Tyr в положении 10 аминокислотами Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val:

(c) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(d) замену Lys в положении 12 аминокислотами Arg или Ile;

(e) замену Ser в положении 16 аминокислотами Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly или AIB;

(f) замену Arg в положении 17 аминокислотой Gln;

(g) замену Arg в положении 18 аминокислотами Ala, Ser, Thr или Gly;

(h) замену Gln в положении 20 аминокислотами Ser, Thr, Ala, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(i) замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(j) замену Val в положении 23 аминокислотой Ile;

(k) замену Gln в положении 24 аминокислотами Asn, Ser, Thr, Ala или AIB; и

(l) консервативную замену в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 8 19 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

В репрезентативных вариантах изобретения, аналог глюкагона (SEQ ID NO: 1001), обладающий GIP-агонистической активностью, имеет нижеследующие модификации:

(a) аминокислотную модификацию в положении 1, которая сообщает GIP-агонистическую активность,

(b) лактамовый мостик, расположенный между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, а j равно 17,

(c) аминокислотные модификации в одном, двух или во всех положениях 27, 28 и 29, например, аминокислотные модификации в положении 27 и/или 28, и

(d) 1-9 или 1-6 дополнительных аминокислотных модификаций, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных аминокислотных модификаций, и

где EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

Лактамовый мостик аналога этих вариантов может представлять собой лактамовый мостик, описанный в настоящей заявке. Описание лактамовых мостиков можно найти, например, в разделе «Стабилизация альфа-спиральной структуры». Так, например, лактамовым мостиком может быть мостик, расположенный между аминокислотами в положениях 16 и 20, где одна из аминокислот в положениях 16 и 20 заменена Glu, а другая аминокислота в положениях 16 и 20 заменена Lys.

В соответствии с этими вариантами изобретения, аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NN: 1005-1094.

В других репрезентативных вариантах изобретения, аналог глюкагона (SEQ ID NO: 1001), обладающий GIP-агонистической активностью, имеет нижеследующие модификации:

(a) аминокислотную модификацию в положении 1, которая сообщает GIP-аго