Способ консервации клеток и культур клеток



Способ консервации клеток и культур клеток
Способ консервации клеток и культур клеток
Способ консервации клеток и культур клеток
Способ консервации клеток и культур клеток
Способ консервации клеток и культур клеток
Способ консервации клеток и культур клеток
A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2583179:

ЭДВАНСТ ПРЕЗЕРВЕЙШНЗ ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЭлЭлСи (US)

Изобретение относится к консервации клеток, образующих ядро, а именно к способу снижения апоптоза хранящихся клеток и к охлажденной композиции, содержащей клетки, образующие ядро, где клетки находятся в контейнере и хранятся с помощью указанного выше способа. Способ включает: 1) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере; 2) добавление газа в указанный контейнер таким образом, чтобы давление внутри контейнера достигало 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона; 3) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°C-37°C; 4) после указанного первого периода времени снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°C-10°C с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды; 5) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше чем указанный первый период времени; и 6) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°C-37°C. Осуществление способа позволяет снизить апоптоз клеток. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

[0001] Данная заявка утверждает приоритет заявки США с серийным номером 61/436441, зарегистрированной 7 февраля 2011 г, раскрытие которой включено в данную работу ссылкой.

Область техники, к которой относится изобретение

[0002] Настоящее изобретение в общем относится к консервации клеток и более конкретно к консервации эукариотных, образующих ядро клеток in vitro.

Уровень изобретения

[0003] Хранение биологического материала, содержащего живые клетки в течение как короткого так и длинного периодов времени, представляет собой один из самых значительных стимулов в современной медицинской науке. Охлаждение до температуры внутри интервала от -20°С до -176°С в присутствии криозащитных веществ до сих пор представляет собой самый широко применяемый способ хранения живых клеток. Механизм криозащиты включает защитное действие на образование кристаллов льда, которые разрушают клетки и/или клеточные компоненты. Однако данные и другие общепринятые способы консервации клеток вызывают стресс в клетках, которые хранятся, и апоптоз почти всегда индуцирован в части клеток, которые подвержены манипуляциям, возникшим при хранении. (См., например, de Boer F., et al. J. Hematother. Stem Cell Res. 2002 Dec; 11(6):951-63; Shapiro AM, et al. Diabetes Technol. Ther. 2000 Autumn; 2(3):449-52; Cookson P., et al. Transfus Med. 2010 Dec; 20(6):392-402). Кроме того, клетки, которые получены непосредственно от органов и тканей и не культивировались, часто повреждаются в течение хранения и транспортировки. Таким образом, существует постоянная и нереализованная потребность в улучшенных способах для консервации клеток и защиты их от летальных событий, таких как апоптоз, в течение хранения и/или транспортировки. Настоящее изобретение удовлетворяет данной и другим потребностям.

Сущность изобретения

[0004] Настоящее изобретение относится к способу снижения апоптоза. Способ включает основные стадии, включающие: i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере и добавление газа, содержащего ксенон, в контейнер, так что давление внутри контейнера достигает 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды; ii) хранение контейнера из i) при 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в продолжение периода времени, в течение которого температура в контейнере равна 22°С-37°С; iii) снижение температуры в контейнере до 0,1°С-10°С с одновременным установлением давления 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды; iv) хранение контейнера при 0,1°С-10°С и давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в течение периода времени; и v) последовательно снижение давления в контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры до 22°С-37°С. Клетки, обработанные согласно данной процедуре, претерпевают меньше апоптоза чем эталон.

[0005] В различных вариантах осуществления, период времени, в течение которого контейнер хранится при 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды при 22°С-37°С, составляет от 15 минут до 24 часов. Период времени, в течение которого контейнер хранится при 0,1°С-10°С и давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды составляет от 2 часов до трех недель, который включает, но не обязательно ограничен, периодом от 2 часов до 24 часов, или по меньшей мере до 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток, 12 суток, 13 суток, 14 суток, и т.д., вплоть до трех недель. Способ включает снижение апоптоза в клетках млекопитающего, которые могут быть клетками человека.

[0006] Изобретение также относится к охлажденной композиции, содержащей клетки, образующие ядро, где клетки присутствуют в контейнере и хранятся при температуре 0,1°С-10°С и где давление внутри контейнера составляет 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды из-за введения в контейнер газа, содержащего ксенон.

Краткое описание чертежей

[0007] Фиг. 1 показывает процентное содержание клеток U-937 клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы человека, определенное методом поточной цитометрии после 24 часов (фиг. 1А) и 7 суток (фиг. 1В) хранения в чашках Петри в течение указанного периода либо в контейнере либо в стандартном инкубаторе с СО2 при 37°С, сделанном для культивирования клеток (“контроль”). После удаления из хранилища, клеткам постепенно снижали давление в продолжение периода в 60 минут, окрашивали с помощью антиCD14 антитела и сортировали поточной цитометрией. АнтиCD14 антитело является маркером моноцитов и макрофагов. Наносили на график процент общих клеток, которые положительно окрашивали АнтиCD14 антитело.

[0008] Фиг. 2 показывает процентное содержание живых клеток Jurkat клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы по отношению к общему числу клеток за 24 часа хранения при давлении в 4 атм избыточного ксенона. Клетки обрабатывали, как описано для фиг. 1. Клетки хранили в присутствии или в отсутствие апоптического индуктора доксорубицина (доксо) при указанных температурах. Живые клетки отличали от погибших клеток, используя стандартный метод исключения голубого трипана.

[0009] Фиг. 3 показывает изменение в количествах живых клеток Jurkat в культуре после переноса их из условий хранения и помещения их в стандартные условия культивирования (37°С в воздухе с 5% СО2). Клетки окрашивали красителем трипаном голубым перед и после 24 часов инкубирования при стандартном условии для определения числа клеток. Клетки контрольной группы культивировали в стандартных условиях культивирования при давлении окружающей среды, включая период хранения. Клетки контроля брали в нулевые сутки эксперимента из той же самой колбы, что и экспериментальные клетки и помещали в чашки Петри. Фиг. 4 показывает, что избыточное давление в 4 атм, полученное введением газа, содержащего ксенон, в контейнер препятствовало развитию как спонтанного (серии no Doxo на диаграмме) так и индуцированного (серии Doxo на диаграмме) апоптоза в клетках Jurkat. В данном наборе опытов контролировали активность каспазы 3 после 24 часов хранения. Фиг.5 показывает окрашивание клеток U-937 клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы (хранившихся согласно вышеописанному методу в течение 24 часов (фиг. 5А) и 7 суток (фиг. 5В) под давлением на 4 атм выше окружающего давления Хе) с красящим агентом JC-1, что делает возможной оценку состояния митохондрий с помощью поточной цитометрии.

[0010] Фиг. 6 показывает окрашивание клеток U-937 клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы, сохраняемых в соответствии со способом изобретения, в 1, 14, и 28 сутки хранения. Клетки окрашивали, используя красящий комплект аннексин-FITC/иодид пропидия, который позволяет провести различие между живыми, некротическими, апоптическими клетками на ранней и поздней стадиях. После окончания периода хранения, среду заменяли и клетки дополнительно культивировали в течение 1 суток в обычных условиях для оценки степени восстановления. 'Xe+4': газовая смесь из 95% Хе+5% СО2 (избыточное давление 4 атм) при +4С, 'NG+4': хранение при давлении окружающей среды и при температуре +4С; NG+37 сделанные эталонные образцы, которые культивировали при 37°С, 5% СО2 с замещением культуральной среды каждые трое суток.

Подробное описание изобретения

[0011] Настоящее изобретение относится к способам ингибирования апоптоза. Способ основан на открытии авторов, состоящего в том, что обработка образующих ядро клеток, имеющихся в атмосфере, содержащей ксенон, при определенных давлениях и температурах, как далее описано в данной заявке, приводит к пониженному апоптозу в клетках. Данное изобретение особенно пригодно для снижения апоптоза в клетках при хранении и/или транспортировке. В различных вариантах воплощения, обработанные клетки с использованием способа изобретения можно хранить под давлением при температуре от 0,1°С до +10°С в течение периода вплоть до двух недель. Данное изобретение можно практиковать без применения обычных средств для предотвращения замораживания.

[0012] В целом, изобретение включает следующие последовательные стадии: i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере и добавление в контейнер ксенона или газовой смеси, содержащей Хе, так что давление внутри контейнера достигает 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды (абсолютное давление 1,5-5,0 атм); ii) хранение контейнера из i) при давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в продолжение периода времени, в течение которого температура в контейнере равна 22°С-37°С; iii) снижение температуры в контейнере до 0,1°С-10°С с одновременным установлением давления 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды; iv) хранение контейнера при 0,1°С-10°С и давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в течение периода времени; и v) снижение давления в контейнере в iv) до давления окружающей среды и повышение температуры до 22°С-37°С. При выполнении данных стадий, клетки из v) претерпевают меньше апоптоза чем эталон.

[0013] Эталон, по которому можно сравнивать клетки, обработанные согласно способу изобретения, может быть любым подходящим эталоном. Например, эталон может быть контролем для клеток, которые не были подвергнуты воздействию одного или нескольких параметров, использованных для обработки клеток, применяющихся по способу изобретения. Эталон может представлять собой типовую кривую, площадь под кривой, график, таблицу, или любое другое изображение данных, по которым можно делать сравнение эффектов способа изобретения.

[0014] В одном варианте воплощения, давление для хранения клеток представляет собой 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды, и все давления до десятичной доли располагаются между данными значениями. Все давления, указанные в данном описании, если не отмечено особо, означают избыточную атм (гипербарная или гиператмосферная). Давление окружающей среды означает нормальное атмосферное давление без дополнительного давления, которое обычно находится в интервале 0,84-1,07 атм, со средним давлением окружающей среды, принятым равным 1 атм.

[0015] Изобретение, как ожидают, будет подходящим для ингибирования апоптоза в любой клетке(ах), образующей ядро. В различных вариантах воплощения, клетки, предназначенные для данного способа изобретения, способны к пролиферации. Клетки могут иметь потенциал, чтобы различаться по одному или многократным происхождениям. Таким образом, клетки могут иметь тотипотентность, плюрипотентность, мультипотентность или унипотентность. Соответственно клетки могут быть стволовыми клетками, включающими но без ограничения только ими, стволовые клетки взрослых особей, тканевые определенные стволовые клетки, фетальные стволовые клетки, зародышевые стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, такие как мезенхимные стволовые клетки или кроветворные стволовые клетки. Например, миобласты и кардиомицеты могут быть произведены из мезенхимных стволовых клеток, в то время как кроветворные стволовые клетки могут быть произведены из стволовых клеток костного мозга. В одном варианте воплощения, клетки могут быть гаплоидными, такими как неоплодотворенные ооциты.

[0016] В некоторых вариантах воплощения, клетки могут быть иммортализированы, такие как клеточные линии, которые обычно устанавливаются размножением и/или пассированием клеток, отделенных от первоначального источника. В других вариантах воплощения использован способ для ингибирования апоптоза в клетках, которые были выделены из первичной ткани, а именно, в одноразовых суспензиях клеток, полученных от образца первичной ткани. В другом варианте воплощения, клетки, обработанные согласно способу изобретения, могут быть частью ткани, включающей, но без ограничения, биопсию ткани, срез ткани, или культуру ткани. В одном варианте воплощения, клетки, обработанные с применением способов изобретения, представляют собой свободные пластинки. В другом варианте воплощения, клетки, обработанные с применением способа изобретения, не присутствуют в органе. Клетки можно получать или производить от любого животного. В одном варианте воплощения, животное является млекопитающим. В одном варианте воплощения, млекопитающее является человеком.

[0017] Как обсуждено выше, способ изобретения первоначально включает хранение клеток, образующих ядро, в контейнере и добавление в контейнер ксенона (или газовой смеси, содержащей Хе), так что давление внутри контейнера достигает 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды, включительно, и при этом включаются все значения до десятичной доли, которые располагаются между данными значениями. В данном отношении, контейнер может быть любым контейнером, который подходит для хранения сосуда, в котором клетки выращивают и/или хранят in vitro. В частности, любой сосуд, такой как тест-пробирка, чашка Петри, пробирка Эппендорфа, чашка для культуры ткани, многолуночный планшет для культуры, и т.д., в котором присутствуют клетки, может быть помещен в контейнер. Следует осознавать, что когда сосуд, в котором присутствуют клетки, помещают в контейнер, сосуд располагают так, чтобы клетки в нем подвергались действию добавленного ксенона и давлению в контейнере. Например, если сосуд, в котором присутствуют клетки, является тест-пробиркой, то тест-пробирку не запаивают, что позволяет ксенону, добавленному в контейнер, осуществлять давление на клетки и быть включенным в клетки.

[0018] Контейнер, в который добавлен ксенон и который защищает сосуд, в котором присутствуют клетки, может представлять собой любой подходящий контейнер. Подходящие контейнеры могут быть твердыми, такими как банка, колба, резервуар или пробирка. Контейнер должен обладать способностью к поддержанию герметичной для газа окружающей среды. Таким образом, контейнер может обладать способностью к тому, чтобы быть герметично запаянным. Контейнер также может быть эластичным, способным к запечатыванию контейнером, пример которого включает, но без ограничения, пакет. Его предпочитают для контейнера, и ксенон (или газовая смесь с Хе), который добавляют в него, должен быть стерильным. При осуществлении способа изобретения, можно использовать любую подходящую систему для установления атмосферы, в которой клетки сохраняются, чтобы обеспечивать атмосферу при требуемом парциальном или общем давлении ксенона. Общие черты такой системы включают резервуар для газа, в силу чего резервуар предпочтительно реально присоединен к контейнеру. Подходящие газовые системы могут содержать компоненты, включающие, но без ограничения, клапаны, насосы, насадки, входные и выходные отверстия, и их комбинации, а также контролирующее устройство для контроля компонентов системы и тем самым количества газа, доставленного в контейнер, и скорости, с которой доставляется газ. Данная система может дополнительно включать один или несколько компонентов, применяемых для удаления ксенонсодержащей атмосферы из контейнера и/или для создания вакуума в контейнере. Вся система или любой компонент или порция компонента могут быть запущены вручную, или могут быть автоматизированы, чтобы управляться компьютерами и компьютерными программами.

[0019] В одном варианте воплощения, клетки хранят или подвергают экспозиции газовой смесью ксенона СО2 и необязательно содержащей азот. Таким образом, газовая смесь может содержать от 9% ксенона, 5% СО2 и остаток N2 до 95% ксенона и 5% СО2. В одном варианте воплощения, ксенон (или газовую смесь, содержащую ксенон), вводят в атмосферу внутри контейнера с удалением или без удаления загрязнителя имеющегося газа/воздуха до тех пор, пока концентрация ксенона в газовой атмосфере внутри контейнера не составляет по меньшей мере 9%. В одном варианте воплощения, атмосфера в контейнере состоит из ксенона. В альтернативном варианте воплощения, атмосфера может состоять из ксенона и следовых примесей. Таким образом, в одном варианте воплощения, атмосфера может состоять в основном из ксенона и по меньшей мере из 5% СО2.

[0020] Температура, при которой ксенон на начальной стадии добавляют в контейнер, является изменчивой и будет зависеть от типа клеток, которые подвергаются обработке. В целом, температура может находиться в интервале от 22°С до 37°С, включительно, и при этом включаются все целые числа между данными значениями и все числа между следующими друг за другом целыми числами до значения десятичных долей. Не зависимые от температуры в течение добавления ксенона или газовой смеси, содержащей Хе, как только давление внутри контейнера достигает 0,5-4 атм выше давления окружающей среды, клетки сохраняются в контейнере под давлением в продолжение периода времени, в течение которого температура в контейнере составляет от 22°С до 37°С, включительно, и при этом включаются все значения до десятичных долей между ними. Период времени, в течение которого клетки сохраняются при данной температуре и интервале давления, может изменяться от 15 минут до 24 часов, включая все интервалы времени между ними. В связи с этим, и без намерения ограничиваться любой конкретной теорией полагают, что сохранение клеток при 22°С-37°С и 0,5-4 атм выше давления окружающей среды приводит к клеткам, которые становятся насыщенными ксеноном, и что это, вместе с проведением оставшихся стадий данного способа приводит к ингибированию апоптоза в клетках, что улучшает долговечность клеток в течение хранения и транспортировки.

[0021] После того как клетки сохранялись при 0,5-4 атм выше давления окружающей среды при 22°С-37°С в течение от 15 минут до 24 часов, температуру в контейнере снижали до 0,1°С-10°С, включительно, и при этом включаются все целые числа между данными значениями и все числа между следующими друг за другом целыми числами до значения десятичных долей, в то же время устанавливается давление 0,5-4 атм выше давления окружающей среды. В одном варианте воплощения, температуру в контейнере снижали помещением контейнера в охлаждаемый кожух. Данный интервал температуры и давления поддерживают в течение периода времени, который мог изменяться от 2 часов до 3 недель, включая все интервалы времени между ними, но не меньшего времени, чем требуется для клеток внутри контейнера для достижения температуры от 0,1°С до 10°С. Таким образом, данное изобретение применимо для хранения клеток при пониженной температуре и повышенном давлении в течение 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, или более суток.

[0022] После хранения клеток при 0,5-4 атм выше давления окружающей среды и от 0,1°С до 10°С, давление в контейнере снижают до давления окружающей среды (как, например, открытием клапана или крышки) и температуру контейнера поднимают до 22°С-37°С, включительно, и при этом включаются все целые числа между данными значениями и все числа между следующими друг за другом целыми числами до значения десятичных долей. Данные клетки претерпевают меньший апоптоз чем эталон.

[0023] Контейнер, содержащий клетки, обработанные в соответствии со способом изобретения, можно перевозить в местность и/или индивидууму или в хозяйственный объект для применения во множестве процедур, и клетки еще будут претерпевать меньший апоптоз чем эталон.

[0024] Изобретение также относится к охлаждаемой композиции, содержащей клетки, образующие ядро, которые подвержены воздействию повышенной концентрации ксенона или газовой смеси, содержащей Хе под давлением, но претерпевают меньший апоптоз чем клетки, которые не были подвержены воздействию повышенной концентрации ксенона под давлением.

[0025] Следующий пример предназначен для того, чтобы иллюстрировать, но не ограничивать данное изобретение.

[0026] Для получения данных, представленных в этих примерах, клетки U-937 лейкемической моноцитной лимфомы культивировали в среде RPMI-1640, снабженной 15% эмбриональной бычьей сывороткой и 10 мкг/мл гентамицина в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Чашки Петри, содержащие культуру клеток в фазе экспоненциального роста, помещали на удерживающую подставку и переносили в контейнеры, имеющие внутренний объем приблизительно в 1,5 л, которые были сделаны для сохранения гипербарных условий. Смесь газов Хе-СО2 (95% и 5% соответственно) использовали для создания давления от 0,5 до 4,0 атм выше давления окружающей среды в течение периода из 5-10 минут, с конкретными параметрами, представленными на фигурах, присутствующих в данном описании. Температуру выдерживали от 22°С до 37°С в данном варианте воплощения изобретения. Газы смешивали в отдельном сосуде (или в контейнере/пробирке) на основе расчета их парциального давления. Контейнер с чашками Петри выдерживали при данной температуре и данном давлении в течение 2 часов. Затем контейнер переносили в холодильник с пониженной температурой (от 0,1°С до +5°С), с одновременным сохранением давления. Контейнер выдерживали при данных условиях в течение приблизительно 4 недель. После этого, давление снимали и контейнер, содержащий клетки, выдерживали в течение 7 суток в помещении при температуре от +4°С до +10°С и атмосферном давлении.

[0027] Авторы выбрали для обработки клетки Jurkat и клетки U-937 согласно вышеприведенной процедуре, потому что они обладают ядерным и полномасштабным апоптическим каскадным механизмами. В соответствии с этим, данные клетки отвечают за большое число как внеклеточных так и внутриклеточных проапоптических сигналов и использовались в качестве модельных клеток для анализа апоптоза (Pimentel-Muinos FX, Seed B. Regulated commitment of TNF receptor signaling: a molecular switch for death or activation. Immunity. 1999 Dec; 11(6):783-93; Karas M, Zaks TZ, Liu JL, LeRoith D. T cell receptor-induced activation and apoptosis in cycling human T cells occur throughout the cell cycle. Mol. Biol. Cell. 1999 Dec; 10(12):4441-50; Valavanis C, Hu Y, Yang Y, Osborne BA, Chouaib S, Greene L, Ashwell JD, Schwartz LM. Model cell lines for the study of apoptosis in vitro. Methods Cell Biol. 2001; 66:417-36).

[0028] После осуществления на клетках способа данного изобретения, авторы анализировали количество живых клеток (фиг. 1), активность каспазы-3, которая является указанием на интенсивность апоптоза (фиг. 2). Данные, представленные на фиг. 1 и 2, показали, что способ изобретения ингибирует спонтанную гибель клеток.

[0029] Обработка ксеноном также улучшала рост клеток после экспозиции доксорубицина (фиг. 3). В частности, клетки эталона (контроля) продолжали претерпевать гибель, вызванную доксорубицином, в то время как наблюдалось повышение числа живых клеток в образцах, обработанных ксеноном (Хе+37 доксо, Хе+4 доксо). Ксенон предотвращал развитие как спонтанного (не доксо и необработанного) так и индуцированного (доксо) апоптоза как в клетках Jurkat (фиг. 4), так и в клетках U-937 (фиг. 5).

[0030] Доксорубицин, будучи известным индуктором апоптоза, вызывает поражение митохондрального мембранного потенциала. Ксенон (как в комбинации с охлаждением так и без охлаждения) оказывает защитное действие на клеточные митохондрии. Например, в присутствии ксенона процентное содержание обработанных доксорубицином клеток с неповрежденными митохондриями было существенно выше, чем в клетках, хранившихся без ксенона (фиг. 5) как после 24 ч так и 7 суток хранения. После 7 суток хранения, ксенон также значительно снижал поражение митохондрий по сравнению с контролем (без газа, 37°С), что обусловлено ростом клеток без клеточного деления в среде - обычно данные клетки делятся каждые 2-3 суток. Полагают, что защита митохондрий происходит из-за того, что присутствие ксенона защищает органеллы от действия холода (фиг. 2, группы Хе+4 и NG+4 с доксо и без доксо).

[0031] Хотя данное изобретение описано подробно с целями иллюстрации, понятно, что такая подробность дается исключительно для такой цели, и варианты могут быть сделаны здесь специалистами в данной области без отклонения от сути и охвата изобретения, которое определено следующими пунктами формулы изобретения.

1. Способ снижения апоптоза, включающий:
i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере;
ii) добавление газа в указанный контейнер, так что давление внутри контейнера достигает 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона;
iii) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°C-37°C;
iv) после указанного первого периода времени, снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°C-10°C с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды;
v) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше, чем указанный первый период времени; и
vi) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°C-37°C.

2. Способ по п. 1, где указанный первый период времени равен от 15 минут до 24 часов.

3. Способ по п. 1, где указанный второй период времени равен от 2 часов до трех недель.

4. Способ по п. 1, где указанный второй период времени равен по меньшей мере 2 суткам, предпочтительно, по меньшей мере 7 суткам, еще более предпочтительнее, по меньшей мере 14 суткам.

5. Способ по п. 1, где указанное давление в указанном контейнере в течение указанного второго периода времени на 3 атм - 4 атм выше давления окружающей среды.

6. Способ по п. 1, где указанная температура в течение указанного второго периода времени равна 4°C-10°C.

7. Способ по п. 1, где указанное давление постепенно снижают в указанном контейнере после второго периода времени на протяжении третьего периода времени, причем указанный третий период времени составляет вплоть до 60 минут.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный газ представляет собой газ ксенона.

9. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный газ представляет собой смесь газов, которая включает газ ксенона, газ диоксида углерода и газ азота, причем содержание указанного газа ксенона больше, чем содержание указанного газа диоксида углерода и меньше, чем содержание указанного газа азота.

10. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный газ представляет собой смесь газов, которая включает газ ксенона, газ диоксида углерода, причем содержание указанного газа ксенона больше, чем содержание указанного газа диоксида углерода.

11. Способ по любому из пп. 1-7, где указанные клетки представляют собой клетки млекопитающего или клетки человека.

12. Охлажденная композиция, содержащая клетки, образующие ядро, где клетки присутствуют в контейнере и хранятся с помощью способа, определенного в любом из пп. 1-11.

13. Охлажденная композиция, определенная в п. 12, где указанный контейнер содержит газ под давлением, который включает ксенон.

14. Охлажденная композиция, определенная в п. 12 или 13, где указанные клетки представляют собой клетки человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринарии и биологии. Состав жидкости для изучения и демонстрации артериального русла животных включает смесь желатина пищевого, зубного порошка, акриловой краски для окрашивания массы до желаемого оттенка, сернокислого бария и воды дистиллированной (t 80°С).

Изобретение относится к медицине. Осуществляют консервацию кадаверных свиных глаз для офтальмохирургического тренажера путем очистки глаз от придатков и последующей заморозки при температуре -20°C в среде сбалансированного физиологического раствора или стандартного физиологического раствора хлорида натрия на срок до 15 суток.
Изобретение относится к способам пластинации анатомических препаратов для изготовления как фиксированных, так и подвижных пластинатов для получения демонстрационных учебных медицинских экспонатов.

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН 7,4.

Изобретение относится к области криобиологии. Предложен способ консервации биоматериала.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин 4,5-6,5, фосфолипиды сои 0,04-2,00, высокомолекулярное поверхностно-активное вещество 0,01-1, вода бидистиллированная остальное.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к посмертной патоморфологической диагностике бифуркационной недостаточности сосудов артериального круга большого мозга.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для борьбы с эктопаразитами и эндопаразитами у животных. Заявлена ветеринарная композиция для наружного применения для лечения или предотвращения паразитарных инфекций или инвазий у животного, содержащая: (a) комбинацию четырех активных агентов, содержащую фипронил, регулятор роста насекомых, празиквантел и авермектиновый или милбемициновый активный агент; и (b) фармацевтически приемлемый носитель; где указанная композиция является жидкой композицией для наружного нанесения.

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток крови проводят путем добавления ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовки полученной взвеси к замораживанию путем холодовой адаптации при +4,0°C в течение 10 минут.

Группа изобретений относится к области криоконсервации биологических объектов. Устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов млекопитающих при использовании в качестве носителя полого волокна состоит из отрезка полого волокна диаметром 180-200 мкм и капилляра диаметром 1,00-1,50 мм, длиной 7,00-10,00 см, с конусообразным кончиком, наружный диаметр которого не превышает внутренний диаметр используемого волокна. При этом отрезок полого волокна прикрепляется непосредственно к капилляру одноразового использования путем надевания отрезка полого волокна на конусообразный кончик. Система для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих состоит из устройства для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов и контейнера. Причем контейнер представляет собой цилиндрическую тонкостенную трубку длиной 12,50-13,50 см, имеющую диаметр, не превышающий 3-кратный диаметр чехла, выполненную из пластической массы, замкнутую с одной стороны, в которую помещается. Использование системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих позволяет увеличить их выход после отогревания. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при изготовлении макроскопических препаратов и бальзамировании трупов. Консервант анатомических препаратов для фиксации биологических тканей представляет собой 1-10%-ный водный раствора бензоата натрия. Изобретение позволяет улучшить качество, информативность и эстетичность анатомических препаратов. 2 пр.

Изобретение относится к технологии переработки пантов марала, изюбра, северного оленя для получения биологически активного концентрата в виде порошка и может быть использовано в медицине и ветеринарии. Способ получения растворимого концентрата из консервированных пантов заключается в том, что панты измельчают до частиц размером 100 мкм, смешивают с водой в соотношении панты:вода 1:3-1:4 и подвергают ферментативному гидролизу, при этом в качестве ферментативного комплекса используют штамм бактерий Bacillus licheniformis-60 ВКМ В-2366 и папаин из расчета по 3750-6250 ME действия каждого на 1,0 кг пантов, а ферментацию проводят под действием ультразвука мощностью 37 кГц в течение 8-10 часов при температуре от 40 до 50°С и рН 5,0-8,0 и после фильтрации экстракт сушат при температуре 45-50°С. Способ обеспечивает выход сухого вещества (концентрата) на уровне 64%. 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ стимулирования естественной защиты и индуцирования устойчивости к болезни, вызываемой Candidatus Liberibacter asiaticus, у цитрусовых растений (Huanglongbing), характеризующийся нанесением на растения соединения брассиностероида. Представлена композиция для стимулирования естественной защиты и индуцирования устойчивости к болезни, вызываемой Candidatus Liberibacter asiaticus, у цитрусовых растений (Huanglongbing), содержащая природный брассиностероид или аналог брассиностероида. Описан способ предупреждения или лечения болезни Huanglongbing (HLB) у цитрусовых, характеризующийся периодическим нанесением брассиностероида на растения. Описано применение брассиностероида для изготовления композиции, предназначенной для стимулирования естественной защиты и индуцирования устойчивости к болезни, вызываемой Candidatus Liberibacter asiaticus, у цитрусовых растений (Huanglongbing), при котором проводят периодическое нанесение указанной композиции. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 8 пр.
Изобретение относится к области медицины, хирургии. Выполняют транзиторный забор комплекса органов брюшной полости и забрюшинного пространства путем эвисцерации с реплантацией в эксперименте на модели больного. После вскрытия брюшной полости устанавливают временные подмышечно-бедренные артериальный и венозный шунты. Изымают комплекс и осуществляют холодовой перфузионный арест органов. Располагают комплекс на операционном столе. Моделируют оперативное лечение органов-мишеней, после чего снимают временные шунты, реплантируют комплекс органов брюшной полости. Выполняют реплантацию, восстанавливая артериальное и венозное кровообращение и целостность пересеченных анатомических структур. Способ обеспечивает возможность моделирования трансплантации, оперативного вмешательства, пригодность органов брюшной полости и забрюшинного пространства для последующего использования. 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии. Для изготовления анатомического препарата полый орган или его фрагмент выделяют из эвисцерированного комплекса органов, промывают полость проточной водой, препарируют, после чего его полость заполняют универсальным водостойким клеем на основе акриловой водной дисперсии, например клеем «Момент монтаж», до тех пор, пока внешний рельеф полого органа, его консистенция и степень наполнения не будут соответствовать аналогичным прижизненным характеристикам. Отверстия полого органа, через которые заполняли полость, прошивают, тампонируют ватой и перевязывают, после чего полый орган оставляют в герметичной емкости в парах консервирующего бактерицидного вещества, например 10%-ного водного раствора формалина, до полной фиксации. Способ позволяет изготовить анатомический препарат полого органа, который по внешнему рельефу и консистенции максимально напоминает соответствующий полый орган при жизни, при увеличении срока эксплуатации изготовленного анатомического препарата и повышении безопасности технологического процесса за счет отказа от использования токсичных и легковоспламеняющихся растворителей. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к области медицины, преимущественно к нормальной и патологической анатомии, зоологии и эмбриологии. Для восстановления ранее фиксированных и бальзамированных анатомических препаратов используют 1-10%-ный раствор бензоата натрия. Способ позволяет улучшить качество, информативность и эстетичность анатомических препаратов за счет частичного восстановления их естественной окраски, консистенции и размеров, а также приводит к увеличению срока службы препаратов, упрощению и удешевлению процесса реставрации, устранению факторов профессиональной вредности персонала анатомических и патолого-анатомических лабораторий.

Изобретение относится к криобиологии и медицине. Для получения мультипотентных стромальных клеток (МСК) из криозамороженных тканей фетоплацентарного комплекса (пуповины, плодной части плаценты, амниона) пуповину и плаценту, полученные в ходе операции кесарева сечения, в течение не более 24 часов транспортируют в культуральную лабораторию, где их нарезают на фрагменты толщиной не более 10 мм и выдерживают в течение 20-25 минут в криопротекторной среде на основе аутоплазмы, полученной из пуповинной крови, либо фосфатно-солевого буфера рН=7,4, дополненного тестированным человеческим альбумином до 15 г/л, содержащей 1,5 моль/л пропандиола и 0,1 моль/л сахарозы. Далее фрагменты ткани подвергают постепенному охлаждению: понижение стартовой комнатной температуры до +4°C со скоростью 10°C/мин, охлаждение до -6°C со скоростью 2°C/мин, инициацию кристаллизации при -6°C, выполнение пошагового охлаждения до температуры -30°C со скоростью 0,3°C/мин, погружение в жидкую фазу азота с температурой -196°C для длительного криохранения. Для размораживания пробирки помещают на водяную баню, нагретую до +37°C, после чего отмывают от криопротектора нагретой до +37°C полной культуральной средой, не содержащей ксеногенных компонентов. Затем из фрагментов пупочного канатика удаляют эпителий и кровеносные сосуды, из фрагментов плаценты удаляют ворсины хориона и хорионический трофобласт, из фрагментов амниона удаляют амниотический эпителий, а оставшуюся ткань (вартонов студень пупочного канатика, строму плодной части плаценты и строму амниона) измельчают с помощью хирургических инструментов в небольшом объеме культуральной среды до получения эксплантов объемом 1-2 мм3, которые переносят в культуральную посуду и получают первичную культуру клеток. Дальнейшее наращивание и характеристику МСК проводят с использованием стандартных культуральных методик. Изобретение позволяет получить культуры МСК из криозамороженных тканей фетоплацентарного комплекса за счет сохранения жизнеспособности клеточного компонента стромы при криоконсервировании ткани без использования ксеногенных и токсичных компонентов сред. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к устройствам для витрификации биообъектов. Автономное устройство для витрификации биообъектов с использованием криогенного хладагента имеет коаксиальную конструкцию, включающую цилиндрический корпус, внутри которого установлена цилиндрическая аксиально удлиняемая опора, конец которой соединен с цанговым зажимом, обеспечивающим фиксацию трубки контейнера с биообъектами, пусковую пружину, которая взаимодействует с цилиндрической опорой и обеспечивает перемещение контейнера с биообъектами в сосуд с криогенным хладагентом через его горловину, цилиндрический теплоизоляционный экран с подвижной крышкой, защитный дисковый экран, фиксируемый на наружных выступах цилиндрического корпуса, и расположенную в верхней части устройства управляющую кнопку. Изобретение позволяет повысить надежность и уменьшить массу устройства, увеличить его аксиальную длину при пуске контейнера с биообъектами в сосуд Дьюара и увеличить скорость его охлаждения. 8 з.п. ф-лы, 18 ил.

Изобретение относится к способу получения 3-[(фенилсульфанил)метил]пентан-2,4-диона формулы (1) Сущность способа заключается во взаимодействии смеси формальдегида и тиофенола с 2,4-пентандиом с участием катализатора NiCl2⋅6H2O при мольном соотношении формальдегид:тиофенол:2,4-пентандион:NiCl2⋅6H2O=1:1:1:(0,03-0,07) в смеси растворителей CHCl3-С2Н5ОН (1:1, об.), при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 6-8 ч. Полученные соединения проявляют фунгицидную активность по отношению к микромицетам фитопатогенных грибов Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-05-10 2016-05-10T17:05:54
Наверх