Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека



Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека

 


Владельцы патента RU 2583871:

Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест" (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) (RU)

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии. Из образца опухолевой ткани головного мозга выделяют суммарный пул РНК (в том числе содержащий и микроРНК) любым из известных способов. Далее проводят измерение уровней экспрессии 10 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -31, -124, -125b, -16, -451, -191, -181b, -223 (диагностируемые микроРНК) в опухолевых образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Заключение о наличии и типе глиальной опухоли составляют на основании комплексного критерия (К), рассчитанного по значениям уровней экспрессии микроРНК в разных типах глиальных опухолей, характеризующихся специфическим профилем экспрессии. При значении К, равного или больше 1, делают заключение о наличии глиобластомы, при значении К, лежащего в интервале от 0 до -3, делают заключение о наличии диффузной астроцитомы, а при значении К, равного или ниже -4, делают заключение о наличии анапластической астроцитомы. Данный способ позволяет упростить дифференциальную диагностику глиальных опухолей и повысить ее точность. 1 з.п. ф-лы, 7 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, нейрохирургии и медицины, в частности к онкологии, и предназначено для быстрого определения типа глиальных опухолей головного мозга человека.

В нейроонкологической практике наиболее часто встречаются внутримозговые нейроэпителиальные опухоли головного мозга (глиомы), растущие из клеток нейроглии. Глиальные клетки окружают все нервные волокна нервной системы. Астроциты являются одними из типов глиальных клеток звездчатой формы, соответственно, происходящие из них астроцитарные опухоли являются разновидностью глиальных опухолей и первым подтипом нейроэпителиальных опухолей головного мозга. По степени злокачественности глиомы астроцитарного подтипа делятся на 4 группы (grade, грейды по классификации ВОЗ 2007 года):

I степень злокачественности, грейд 1, пилоцитарная астроцитома - доброкачественная опухоль с четкими границами, растет медленно. В основном локализируется в мозжечке, стволе мозга и зрительных нервах. Признаки злокачественности отсутствуют.

II степень злокачественности, грейд 2, диффузная астроцитома - опухоль без четких границ, растет медленно. Встречается у больных 20-30 лет. Имеет, как правило, один признак злокачественности - клеточную атипию.

III степень злокачественности, грейд 3, анапластическая астроцитома - злокачественная опухоль без четких границ, растет быстро, прорастает в мозговую ткань. Возраст у больных 30-50 лет, чаще болеют мужчины. Имеет два признака злокачественности из трех, исключая некрозы.

IV степень злокачественности, грейд 4, мультиформная глиобластома (далее глиобластома) - наиболее злокачественная опухоль без четких границ, растет очень быстро, прорастает в мозговую ткань. Возраст у больных 40-70 лет, чаще болеют мужчины. На клеточном уровне имеет отличительные особенности злокачественности: гетерогенность состава, быструю пролиферацию, ангиогенез, экстенсивную инвазию, гипоксию и некроз.

Диагностика опухолей головного мозга основывается на методах КТ (компьютерная томография) и МРТ (магнитная резонансная томография), которые позволяют в большинстве случаев различить внутри- и внемозговые опухоли, определить локализацию и размер патологического процесса, однако далеко не всегда способны достоверно определить гистопринадлежность опухоли [1].

В настоящее время основным методом диагностики является цитологическое и гистологическое исследование биоптата опухоли, забранного в момент прямого оперативного вмешательства, направленного на ее удаление.

Известен стандартный способ дифференциальной диагностики глиом, включающий гистологическое исследование, на основании которого чаще всего ставится окончательный диагноз [2]. Образец опухоли, забранный в момент ее удаления, переносят на предметное стекло, вторым предметным стеклом смещают на расстояние 1-1.5 см, после чего помещают в фиксатор (формалин). Полученный мазок-отпечаток подсушивают на воздухе (10-15 мин), фиксируют в этаноле 96%, окрашивают гематоксилин-эозином, помещают в бальзам под покровное стекло, а через 24 часа готовят гистологический препарат. В общей сложности на диагностику уходит 4-5 суток. Если позволяет количество материала биопсии, то применяют также цитологические методы исследования, которые, в свою очередь, могут быть использованы для дополнительных методов исследования: иммуноцитохимических, флюоресцентных, электронно-микроскопических.

Для уточнения гистопатологического строения опухолей глубинной, труднодоступной локализации в функционально важных зонах головного мозга применяют стереотаксическую биопсию [3]. Проведение данной операции в силу разнородности структуры глиомы в 10-15% не позволяет точно установить степень ее злокачественности.

В целом любой способ получения материала опухоли головного мозга является инвазивным, а результат гистопатологического анализа клеточной структуры опухоли не всегда необходимо точный, не количественный, достаточно субъективный, требующий большого практического опыта врача-нейрохирурга и врача-патогистолога при визуальной оценке клеточных структур опухоли на препаратах.

Известен способ дифференциальной диагностики глиом, включающий взятие образца опухолевой ткани головного мозга, выделение микроРНК из образца, измерение уровня экспрессии диагностических микроРНК с помощью микрочипа, с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии диагностических микроРНК и составлением заключения о наличии и типе глиальной опухоли, при этом измеряют уровень экспрессии 7 групп микроРНК, выбранных из общего количества проанализированных 756 микроРНК [4].

Для того, чтобы отличить норму от астроцитомы, были выбраны 53 микроРНК с повышенной экспрессией (группа 1) и 24 - с пониженной экспрессией (группа 2); для того чтобы отличить астроцитому и глиобластому, выбраны 56 микроРНК с повышенной экспрессией (группа 3) и 11 микроРНК с пониженной экспрессией (группа 4); для того чтобы отличить первичную и вторичную астроцитомы выбраны 2 микроРНК с повышенной экспрессией (группа 5) и 5 микроРНК с пониженной экспрессией (группа 6). Для анализа степени прогрессии опухоли (вторичная или первичная глиобластома) были выбраны 21 микроРНК (группа 7). Выбор диагностических микроРНК для каждого типа опухолей, вошедших в состав 7 групп, осуществляли специальным статистическим методом SAM (Significance Analysis Microarrays).

Недостатками известного способа являются сложность, громоздкость, многоэтапность определения и анализа, ограниченные функциональные возможности, поскольку способ служит для распознавания только двух типов глиом из грейдов 3 и 4 - анапластической астроцитомы и глиобластомы, соответственно. Кроме того, диапазон количественных измерений при использовании микрочипов значительно уже, этот метод дает практически на порядок менее точные результаты, чем метод ПНР в реальном времени.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ дифференциальной диагностики глиальных опухолей головного мозга, включающий взятие образца опухолевой ткани головного мозга, выделение микроРНК из образца, измерение уровня экспрессии микроРНК на основе микрочипа (технология microarray) и составление заключения о наличии и типе опухоли [5]. Способ заключается в измерении экспрессии 2-х групп микроРНК: первая состоит из 5 микроРНК (hsa-miR-155, hsa-miR-210, hsa-miR-10a, hsa-miR-409, hsa-miR-134), а вторая - из 14 микроРНК (hsa-miR-126, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-20a, hsa-let-7a, hsa-let-7e, hsa-let-7d, hsa-miR-374, hsa-miR-339, hsa-miR-127, hsa-miR-151, hsa-miR-26b, hsa-miR-34b*). Способ заключается в проведении сравнения экспрессии выбранных микроРНК в исследуемом образце с экспрессией этих же микроРНК в нормальном эталонном образце, в эталонных образцах глиобластомы и олигодендроглиомы. При этом рассматривают все вероятные сочетания микроРНК из разных групп, т.е. каждую микроРНК из 1-й группы сравнивают с каждой микроРНК из 2-й группы. Группа из 5 микроРНК отличается тем, что эти микроРНК имеют значительно более высокую экспрессию в глиобластоме (грейд 4) по сравнению с олигодендроглиомой (грейд 2). За эталонный образец принимают опухоль или здоровую ткань других пациентов с диагнозом, подтвержденным иными методами (гистология, экспрессия онкогенов).

Вывод о наличии в исследуемом образце глиобластомы делают, когда:

(I) уровень экспрессии микроРНК из 1-й группы, по крайней мере, в 3 раза больше или меньше, чем уровень экспрессии этих же микроРНК в здоровом эталонном образце;

(II) уровень экспрессии микроРНК из 1-й группы в указанном образце, по крайней мере, в 3 раза больше, чем уровень экспрессии этих же микроРНК, измеренных в эталонном образце олигодендроглиомы;

(III) уровень экспрессии микроРНК из 2-й группы, измеренных в исследуемом образце, по крайней мере, в 3 раза больше или меньше, чем уровень экспрессии этих же микроРНК, измеренных в здоровом эталонном образце;

(IV) уровень экспрессии микроРНК из 2-й группы, измеренных в исследуемом образце, не более чем на 20%, в ту или другую сторону, отличается от уровня экспрессии этих же микроРНК в эталонном образце глиобластомы.

Вывод о наличии в исследуемом образце олигодендроглиомы делают, когда:

(I) уровень экспрессии микроРНК из 1-й группы, по крайней мере, в 3 раза больше или меньше, чем уровень экспрессии этих же микроРНК в здоровом эталонном образце,

(II) уровень экспрессии микроРНК из 1-й группы, измеренных в исследуемом образце, по крайней мере, в 3 раза меньше, чем уровень экспрессии этих же микроРНК, измеренных в эталонном образце глиобластомы,

(III) уровень экспрессии микроРНК из 2-й группы, измеренных в исследуемом образце, по крайней мере, в 3 раза больше или меньше, чем уровень экспрессии этих же микроРНК, измеренных в здоровом эталонном образце,

(IV) уровень экспрессии микроРНК из 2-й группы, измеренных в исследуемом образце, не более чем на 20%, в ту или другую сторону, отличается от уровня экспрессии этих же микроРНК в эталонном образце олигодендроглиомы.

Дальнейшее исследование заключается в сравнении уровней экспрессии пары микроРНК из 1-й группы с любой парой микроРНК из 2-й группы. Алгоритм сравнения аналогичный. Рассматривают все возможные сочетания пар из 1-й и 2-й групп. По результатам из коэффициентов соотношений строят 2- и 3-мерные диаграммы и проводят сравнение данных от исследуемых образцов опухоли с данными, полученными как для нормальной ткани, так и для глиобластомы и олигодендроглиомы.

Недостатками известного способа являются длительность, трудоемкость, сложность анализа и ограниченные функциональные возможности, поскольку способ обеспечивает распознавание только двух типов глиом: олигодендроглиомы и глиобластомы (грейды 2 и 4) и не обеспечивает типирование других опухолевых патологий головного мозга.

Кроме этого, поскольку прототип основан на использовании микрочипов (технология microarray), то диапазон количественных измерений дает практически на порядок менее точные результаты, чем метод ПЦР в реальном времени. Поэтому технология microarray неприемлема для быстрого анализа материала в клинической практической онкологии. Более того, в силу вариабельности индивидуальной экспрессии использование чужеродной нормальной ткани головного мозга в качестве эталонного контрольного образца для сравнения некорректно.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение способа, сокращение его длительности, повышение точности анализа, расширение функциональных возможностей способа за счет обеспечения возможности диагностики глиом различной степени злокачественности (диффузной астроцитомы, анапластической астроцитомы и глиобластомы, грейды 2-3-4).

Технический результат: упрощение способа, повышение его точности и расширение функциональных возможностей.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Забор образца опухолевой ткани головного мозга человека осуществляют при операции или с помощью биопсии. Из полученных образцов выделяют суммарный пул РНК (в том числе содержащий и микроРНК) любым пригодным методом выделения нуклеиновых кислот [6].

Далее проводят измерение уровней экспрессии 10 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -31, -124, -125b, -16, -451, -191, -181b, -223 (диагностируемые микроРНК) в опухолевых образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа) [7], позволяющим селективно выявлять зрелые микроРНК с высокой чувствительностью и специфичностью. Метод ОТ-ПЦР включает в себя обратную транскрипцию зрелой микроРНК с помощью длинного праймера со шпилькой с последующей детекцией полученной кДНК с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U58A, которая характеризуется стабильной экспрессией. Сочетание времени и температуры на каждом этапе протокола реакции подбирают специально для эффективной реакции с используемыми олигонуклеотидами (праймерами).

Заключение о наличии и типе глиальной опухоли головного мозга составляют на основании значений комплексного критерия (К), рассчитанного на основе значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах глиальных опухолей, характеризующихся специфическим профилем экспрессии, представленного в классификаторе (таблица 1). Значение критерия, по которому определяют злокачественность образца, получают путем суммирования всех слагаемых, каждое из которых соответствует значению уровня экспрессии конкретной диагностической микроРНК.

В соответствии с таблицей 1, если в образце опухолевой ткани головного мозга, из специфического профиля экспрессии 10-ти микроРНК, получено значение К, равное или больше 1, то делают заключение о наличии глиобластомы, если значение К лежит в интервале от 0 до -3, то делают заключение о наличии диффузной астроцитомы, а если значение К меньше либо равно -4, то делают заключение о наличии анапластической астроцитомы.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) В образцах опухолевой ткани головного мозга измеряют уровни экспрессии экспериментально подобранных 10-ти микроРНК (микроРНК-21, -221, -31, -124, -125b, -16, -451, -191, -181b, -223), что позволяет упростить способ в сравнении с прототипом, вследствие подбора минимально значимого количества диагностируемых микроРНК, ускорить проведение диагностики (5-6 часов или один рабочий день, вместо как минимум трех рабочих дней по прототипу);

2) Заключение о наличии и типе глиальной опухоли головного мозга составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного по значениям уровней экспрессии микроРНК в разных типах глиальных опухолей, характеризующихся специфическим профилем экспрессии, представленного в классификаторе (таблица 1), что позволяет расширить функциональные возможности способа за счет обеспечения возможности диагностики глиом разной степени злокачественных (грейдов 2, 3 и 4, т.е. диффузной астроцитомы, анапластической астроцитомы и глиобластомы).

Преимущественно, измерение уровня экспрессии 10 микроРНК в образцах тканей головного мозга проводят методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа), что позволяет расширить диапазон количественной характеристики экспрессии, по сравнению с методом microarray (прототип). Кроме этого, метод microarray имеет более низкую специфичность, чем qRT-PCR, что соответственно снижает точность анализа.

Выбранные для анализа микроРНК являются онкогенными (микроРНК-21, микроРНК-221, микроРНК-223) или онкосупрессорными (микроРНК-451) или имеющими непосредственное отношение к процессу метастазирования, например микроРНК-31 (по эпителиально-мезенхимной трансформации, способности стимулировать или подавлять образование метастазов), или отличающимися по степени участия в процессах апоптоза, ангиогенеза и инвазивности. Данные 10 микроРНК являются оптимальными и достаточными для определения типов глиом 2, 3 и 4 грейдов.

Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений микроРНК был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии 10 человеческих микроРНК: микроРНК-21, микроРНК-221, микроРНК-31, микроРНК-124, микроРНК-125b, микроРНК-16, микроРНК-451, микроРНК-191, микроРНК-181b и микроРНК-223 в 62 образцах операционного материала и биоптатов различных гистопатологических типов глиом головного мозга, различающихся по степени злокачественности (грейды 2, 3 и 4). Согласно данным гистологического заключения образцы распределились следующим образом: 45 случаев - глиобластома, 12 случаев - анапластическая астроцитома, 5 - диффузная астроцитома.

Уровень экспрессии каждой микроРНК в образце (fold change) по отношению к нормализатору U58A (во сколько раз) вычисляли по формуле [8]:

где Ct - пороговый цикл реакции микроРНК или малой РНК U58A (нормализатора).

При проведении сравнительного анализа уровней экспрессии 10 онкогенных и онкосупрессорных микроРНК в разных типах глиом человека, различающихся степенью злокачественности, были определены характерные для каждого вида новообразования специфические изменения экспрессии микроРНК. По изменению уровней экспрессии для каждой микроРНК были подсчитаны слагаемые (таблица 2), суммирование которых позволило определить значение комплексного критерия (К), что отражено в классификаторе (таблица 1). Комплексный критерий заключается в том, что для каждого типа глиальных опухолей по 10 диагностируемым микроРНК экспериментально установлено специфическое изменение экспрессии этих микроРНК, которое характеризует именно конкретный тип глиальной опухоли головного мозга. При этом каждый тип глиальной опухоли характеризуется специфическим профилем из 10 микроРНК, что соответствует определенному значению критерия К.

Предлагаемый способ позволяет просто, быстро и точно идентифицировать и различать типы глиом головного мозга человека: глиобластому, анапластическую астроцитому и диффузную астроцитому.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Пациент №210 (мужчина, 52 года) на фоне полного здоровья заболел 2 февраля 2014 года, когда появился первый приступ с потерей сознания и судорожным синдромом. МРТ головного мозга с контрастным усилением выявила картину кистозно-солидного образования правой лобной доли. Проведена костно-пластическая трепанация черепа в правой лобно-теменной области, микрохирургическое удаление внутримозговой кистозно-солидной опухоли под нейронавигационным контролем. Гистологическое заключение: диффузная астроцитома, грейд 2.

Во время операции были взяты образцы ткани опухоли и исследованы заявляемым способом.

Выделение РНК. Выделение суммарного пула РНК, содержащего также и микроРНК, из образцов ткани проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. К 50 мг ткани добавляли 500 мкл лизирующего гуанидинового буфера, содержащего 4 М гуанидин изотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,3% саркозил, 3% дитиотреитол. Ткань в растворе интенсивно перемешивали и оставляли в термошейкере при 65°C на 10 мин. Раствор центрифугировали 2 мин на 10000 об/мин, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли к нему равный объем изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, супернатант сливали, а осадок промывали с помощью 500 мкл 70% этанола, затем 300 мкл ацетона. РНК растворяли в 200 мкл деионизованной воды.

Реакция обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции для получения кДНК проводили в объеме 50 мкл. Использовали готовые реакционные смеси «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Реакция обратной транскрипции содержала: 3 мкл выделенной РНК, 16.2 мкл 40% раствора трегалозы, 3 мкл 10х буфера для обратной транскрипции, 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), 100 e.a.M-MLV обратной транскриптазы, 1.5 мкл 10 мкМ раствора соответствующего праймера для обратной транскрипции. Использованные праймеры приведены в таблице 3.

Реакцию проводили в течение 30 мин при 42°C, после чего реакционную смесь инкубировали 2 мин при 95°C для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.

ПЦР в реальном времени. Измерение уровней экспрессии 10-ти микроРНК-124, -125b, -16, -181b, -191, -21, -221, -223, -31, -451 проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве нормализатора использовали малую РНК U58A. Использовали праймеры и зонды, приведенные в таблице 3. Реакцию проводили в объеме 30 мкл: 3 мкл полученной кДНК, 14 мкл H2O, 3 мкл 10х буфера для ПЦР (ЗАО «Вектор-Бест»), 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора BSA, 1 е.a. Taq-полимеразы (ЗАО «Вектор-Бест») в комплексе с моноклональными антителами к ее активному центру (Clontech, США), 3 мкл раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ).

Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 94°C - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°C - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°C - 20 сек.

Уровень экспрессии каждой из 10 микроРНК в образце опухоли по отношению к нормализатору U58A (во сколько раз) вычисляли по формуле [8]:

где Ct - пороговый цикл реакции микроРНК (miR) или малой РНК U58A (нормализатор).

После определения значений уровней экспрессии 10 диагностических микроРНК, для каждой из них были подсчитаны слагаемые по описанному выше алгоритму, суммирование которых позволило определить значение критерия К, а также степень злокачественности новообразования по классификатору.

Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК пациента №210, представленные в таблице 4, показали, что значение К равно 12 (сумма слагаемых), поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента глиобластомы.

После уточнения диагноза заявляемым способом, а именно выявления более злокачественной опухоли - глиобластомы, для пациента проведена индивидуальная дополнительная коррекция дальнейшего лечения.

Пример 2.

Пациент №93 (мужчина, 55 лет), в 2011 году поставлен диагноз: внутримозговое объемное образование лобных долей головного мозга с распространением на валик мозолистого тела и передние рога боковых желудочков. В 2012 году для определения типа опухоли проведена пункционная стереотаксическая биопсия внутримозгового образования под навигационным контролем.

Гистологическое заключение: диффузная астроцитома (грейд 2), нельзя исключить анапластическую астроцитому (грейд 3). Взятые во время биопсии образцы ткани опухоли исследованы заявляемым способом аналогично примеру 1.

Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образца пациента №93, представлены в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что изменение уровней экспрессии микроРНК пациента №93 соответствует значению К, равному 8 (сумма слагаемых), поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента анапластической астроцитомы (грейд 3).

Пример 3.

Пациент №120 (мужчина, 52 года), в 2012 году поставлен диагноз: анапластическая астроцитома головного мозга (грейд 3) левой лобно-височной локализации с элементами моторной афазии, правосторонний гемипарез. В 2012 году проведена пункционная стереотаксическая биопсия объемного образования головного мозга лобно-височной локализации с применением нейронавигации. Гистологическое заключение: анапластическая астроцитома (грейд 3). Взятые во время биопсии образцы ткани опухоли были исследованы заявляемым способом аналогично примеру 1. Представленные в таблице 6 результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК у пациента №120, показали, что значение К равно 13 (сумма слагаемых), поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента глиобластомы (грейд 4).

Пример 4.

Пациент №135 (женщина, 64 года), в 2012 году выявлено объемное кистозно-солидное образование в левой теменной области, сенсорно-моторная афазия. В 2013 году проведена костно-пластическая трепанация черепа в левой теменной области, удалена внутримозговая опухоль с использованием микрохирургической техники под нейронавигационным контролем. Гистологическое заключение: глиобластома (грейд 4).

Взятые во время операции 2 образца ткани из разных отделов опухоли были исследованы заявляемым способом, аналогично примеру 1. Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК пациента №135, представленные в таблице 7, показали, что в первом образце значение К равно 3, что согласно классификатору (таблица 1) соответствует глиобластоме. Во втором образце значение К равно 8, что также соответствует глиобластоме.

Таким образом, заявляемый способ диагностики глиальных опухолей головного мозга человека является более точным и надежным, чем гистологический и цитологический, что позволяет избежать ошибок в диагностике опухолевых патологий головного мозга.

Заявляемый способ позволит просто, быстро и точно диагностировать тип глиомы до или после операции, чтобы подтвердить или скорректировать результаты, полученные при гистологическом исследовании, своевременно выбрать правильную тактику последующего лечения пациента.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Hashemi R.Н., Bradley W.G., Lisanti C.J. MRI: the basics. Lippincott Williams & Wilkins, 2004. C. 353.

2. Батороев Ю.К. Цитологическая диагностика опухолей центральной нервной системы, возможности и особенности: возможности и границы применения. Сибирский медицинский журнал. - 2009. - №2. - с. 5-9.

3. Elder J.В., Amar А.P., Apuzzo L.J. Stereotactic and Image-Guided Biopsy / Lozano A.M., Gildenberg Ph.L., Tasker R.R. // Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery. Second Edition. 2009. P. 679-698.

4. Somasundaram K., Mahabala RAO S.A., Santosh V. MicroRNAa (miRNA) as biomarkers for diagnosing different grades of gliomas and pathways of glioma progression. - Patent WO 2011121610 A1, Pub. 25.10.2011.

5. Berger F., Issartel J-P., Atifi-Borel M.E., Lages E., Guttin A. Use of mirnas as biomarkers in glioma diagnosis. - Patent WO 2011070297 A3, Pub. 20.12.2012.

6. Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. - V. 2009 (2009). - Article ID 574398, 10 pages. - doi: 10.1155/2009/574398.

7. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J., Guegler K.J. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33. - №20. - e179, doi:10.1093/nar/gni178.

8. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR //Nucleic Acids Res. - 2001. - V. 29. - №9. - e45.

1. Способ дифференциальной диагностики глиальных опухолей головного мозга человека, включающий взятие образца опухолевой ткани головного мозга, выделение микроРНК из образца, измерение уровня экспрессии диагностических микроРНК с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии диагностических микроРНК и составлением заключения о наличии и типе глиальной опухоли, отличающийся тем, что измеряют уровень экспрессии 10 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -31, -124, -125b, -16, -451, -191, -181b, -223, а заключение о наличии и типе глиальной опухоли у пациента составляют на основании комплексного критерия (К), рассчитанного на основе значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах глиальных опухолей, характеризующихся специфическим профилем экспрессии микроРНК, и при значении К, равного или больше 1, делают заключение о наличии глиобластомы, при значении К, лежащего в интервале от 0 до -3, делают заключение о наличии диффузной астроцитомы, а при значении К, равного или ниже -4, делают заключение о наличии анапластической астроцитомы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение уровня экспрессии 10 микроРНК в образцах тканей головного мозга проводят методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа).



 

Похожие патенты:

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК из образца крови беременной женщины, приготовление геномных библиотек и их обогащение регионами генома, секвенирование, картирование полученных чтений на референсный геном, корректировку полученного значения покрытия для каждого региона генома на общее покрытие генома, сравнение скорректированного значения покрытия со значениями покрытий, полученных для обучающей выборки и определение наличия анеуплоидий плода.

Изобретение относится к областям биологии и генетической инженерии. Предложен выделенный пептид для терапевтических целей, содержащий последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную SEQ ID NO:4 (GG00444), или его фрагмент или вариант, способные связываться со слизью кишечника человека, а также содержащая его ворсинчатая структура, пищевой продукт, фармацевтическая композиция, полинуклеотид, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, кластер генов, антитело, способ лечения и способ скрининга пробиотических бактериальных штаммов.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологиии. Представлен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза С.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ выявления мутации p.Q368X (с.1102С>Т) в гене MYOC, сопровождающейся развитием наследственной формы первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его функциональному фрагменту, которые способны связывается с cMet. Также раскрыты мышиная гибридома, способная секретировать указное антитело, нуклеиновая кислота, которая экспрессирует указанное антитело и набор для прогнозирования эффективности лечения онкогенного расстройства, включающий указанное антитело.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ тестирования нуклеиновых кислот на подложке, включающий иммобилизацию одной или нескольких нуклеиновых кислот посредством сшивания, где каждая из иммобилизованных нуклеиновых кислот содержит участок нуклеотидов с одним видом оснований, получение меченых олигонуклеотидов, комплементарных указанному участку нуклеотидов, и определение показателя, отражающего состояние указанных нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен набор дифференцирующих олигонуклеотидов для анализа полиморфизма в генах АВ0, HLA-DQA1, AMEL, DARC, NAT2 с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов (биочипов).

Настоящее изобретение относится к аналитической биоорганической химии. Предложенные флуоресцентно-меченные дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и рибонуклеозидтрифосфаты имеют общую формулу H-Л-Ф, где Н - модифицированный по конечному атому фосфора природный дезоксирибонуклеозидтрифосфат или рибонуклеозидтрифосфат, Л - линкерная группа, присоединенная к конечному атому фосфора и построенная на основе вторичных диаминов, Ф - репортерная флуоресцентная группа, присоединенная к линкеру посредством вторичной аминогруппы.

Изобретение относится к биохимии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом ПЦР в реальном времени.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и молекулярной биологии. Предложен набор, содержащий два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ПЦР-детекции Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens и Eggerthella spp. в клиническом материале. Осуществляют выделение ДНК, амплификацию и электрофорез. Проводят мультиплексную ПЦР с использованием специфичных праймеров в циклическом режиме. При электрофоретическом обнаружении ампликонов размерами 286 п.н., и/или 768 п.н., и/или 135 п.н., и/или 428 п.н. определяют наличие Atopobium vaginae, и/или Leptotrichia amnionii, и/или Sneathia sanguinegens, и/или Eggerthella spp. соответственно. Изобретение обеспечивает одновременное выявление в клиническом материале до 4 видов ассоциируемых с бактериальным вагинозом бактерий. 1 ил., 2 табл., 10 пр.

Изобретение относится к области молекулярной генетики и микологии и предназначено для диагностики онихомикоза. Осуществляют выделение ДНК из биологического материала ногтей, проведение ПЦР и детекцию полученных результатов с помощью электрофореза в агарозном геле. Анализируют следующий спектр грибов: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности, используя мультиплексное решение для ПЦР с применением праймеров в двух реакциях, причем для определения грибов родов Aspergillus и Fusarium используют общий обратный праймер. В I реакции при детекции полосы, соответствующей 168 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Scopulariopsis brevicaulis, 120 п.н. - Candida spp., 600-650 п.н. - онихомикоз вызван любым микромицетом. Во II реакции при детекции полосы, соответствующей 302 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Trichophyton spp., 221 п.н. - Fusarium spp., 193 п.н. - Aspergillus spp. Изобретение обеспечивает эффективный способ одновременной идентификации всех этиологических агентов, клинически значимых для онихомикоза России. 1 ил., 4 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты для обнаружения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), которая содержит: 5′-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3′ (SEQ ID NO: 10) или 5′-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3′ (SEQ ID NO: 11) и набор, содержащий данную молекулу и инструкцию, где p = универсальный нуклеотид, который представляет собой 3-нитропиррол, 2′-дезоксинуклеозид и 5-нитроиндол или 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он, и n = аналог цитидина, имеющий модификацию С-5. Представлена композиция для обнаружения ВИЧ, содержащая эффективное количество описанной молекулы, а также первый прямой праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и первый обратный праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, и дополнительные реагенты. Представлен способ обнаружения ВИЧ в образце, включающий проведение ПЦР с использованием праймера, содержащего SEQ ID NO: 10, и праймера, содержащего SEQ ID NO: 11. 7 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к травматологии, и предназначено для прогнозирования нарушения консолидации при переломах костей конечностей. Осуществляют выделение ДНК, проводят анализ полиморфизмов гена TGFβ1 и гена EGFR. При выявлении генотипа -25Pro/Pro гена TGFβ1 и генотипа -2073Т/Т гена EGFR прогнозируют вероятность развития нарушения консолидации перелома. Изобретение обеспечивает повышение точности прогноза. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при разработке методов молекулярно-генетической диагностики. Заявлен способ селективного отбора целевых участков ДНК. Сущность способа заключается в следующем. Геномная ДНК расщепляется случайным образом УЗ на короткие, размером 150-500 нуклеотидов, участки. Синтезируются якорные олигонуклеотиды, которые комплементарны целевым участкам генома. Якорные олигонуклеотиды ковалентно связываются с магнитными микросферами. Связанные с магнитными частицами якорные олигонуклеотиды используются для гибридизации в растворе с расщепленной геномной ДНК. Далее методом магнитной сепарации проводится удаление неспецифически связавшейся ДНК. Далее проводится анализ результатов гибридизации методом ПЦР в реальном времени с использованием праймеров с последовательностями, комплементарными геномной ДНК вне последовательностей якорных олигонуклеотидов. Изобретение позволяет с высокой скоростью и эффективностью проводить целевой отбор участков ДНК. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к влиянию мутаций гена KRAS на восприимчивость к химиотерапии, и может быть использовано в предсказании терапевтического эффекта химиотерапии. Способ предсказания терапевтического эффекта химиотерапии, при которой используется противоопухолевый агент, содержащий α,α,α-трифтортимидин и 5-хлор-6-(1-(2-иминопирролидинил)метил)-урацил гидрохлорид при молярном отношении 1:0,5, на пациента с раком ободочной и прямой кишки включает стадии: (1) детектирования присутствия или отсутствия мутации кодона 12 и/или кодона 13 гена KRAS в биологическом образце, полученном от пациента; и (2) предсказания того, что химиотерапия имеет терапевтический эффект в отношении указанного пациента, когда детектируется мутация гена KRAS на стадии (1). Изобретение позволяет повысить эффективность химиотерапии. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению Axl в качестве биомаркера для распознавания наступления эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) у субъекта, где показателем наступления EMT является повышающая регуляция экспрессии Axl. Также изобретение относится к способу распознавания наступления эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) у субъекта посредством измерения экспрессии Axl, к идентификации веществ, способных ингибировать или обращать EMT, к способу прогнозирования восприимчивости субъекта к лечению ингибитором Axl. Изобретение позволяет использовать определение экспрессии Axl как полезный маркер для распознавания наступления EMT, что может быть использовано для диагностики, прогнозирования и терапии рака. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике. Способ предусматривает картирование положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК. Способ включает выделение высокоочищенной геномной ДНК, которую гидролизуют в реакционном буфере метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой GlaI в течение времени и при температуре, достаточных для полного гидролиза продукта с получением смеси фрагментов геномной ДНК. Выделяют указанную смесь фрагментов ДНК из раствора осаждением, а для дальнейшего анализа отбирают GlaI-фрагменты ДНК размером 150-500 п.н., наиболее оптимально подходящие для NGS-секвенирования. Определяют нуклеотидный состав концов образовавшихся коротких GlaI фрагментов геномной ДНК методами NGS-секвенирования, программно фильтруют полученные данные для исключения фрагментов с низким качеством чтения, с концами, неспецифичными для GlaI-фрагментов, и по признаку присутствия динуклеотида GPy на 5′-концах последовательностей и определяют положения в референсном геноме нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy отфильтрованных GlaI-фрагментов с использованием любого программного обеспечения класса «геномный ассемблер». Применение данного способа позволяет упростить, повысить надежность и достоверность способа определения позиций (картирования) большого числа метилированных сайтов PuCGPy в геноме. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются набора синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа его использования. Представленный набор включает две пары праймеров, имеющих следующую структуру - FIV F: 5′-AAGAGTCCCAAATATGCCATAGG-3′ и FIV R: 5′-TCCATCCAAATTGCTACTGTTC-3′; FeLV F: 5′-GAATAAACCTCTTGCTGTTTGC-3′ и FeLV R: 5′-AATCAGATCGAATGACAGAGACAC-3′. Представленные праймеры не содержат полиндромные повторы нуклеотидов, не образуют выраженные вторичные структуры и не имеют протяженных G-C участков, а температуру отжига имеют 55°C для обеих пар олигонуклеотидов. Охарактеризованный способ включает подготовку реакционной смеси путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,4 мкл, праймеров FIV F, FIV R, FeLV F и FeLV R (15 пмоль/мкл) по 1 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 1,5 мкл, бидистиллированной воды - 11,4 мкл и пробы ДНК - 5 мкл, при этом амплификацию проводят в следующем режиме: тотальная денатурация 95°C - 3 мин, цикл денатурация (95°C - 20 или 60 сек) - отжиг (55°C - 20 или 60 сек) - элонгация (72°C - 40 или 60 сек), причем цикл денатурация-отжиг-элонгация повторяется 35 раз, заключительная элонгация 72°C - 5 мин, хранение 4°C - 10 мин, а детекция полученных результатов осуществляется методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. По наличию или отсутствию амплифицируемых фрагментов нуклеотидных последовательностей длиной 397 п.н. для FIV (feline immunodeficiency virus) и 221 п.н. для FeLV (feline leukemia virus) судят о наличии или отсутствии вирусов в организме кошки. Изобретения могут быть использованы в научных исследованиях для обнаружения генетического материала вирусов иммунодефицита - FIV и лейкемии FeLV кошек методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в крови животных. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и генодиагностики, а именно к синтетическим праймерам, комплементарным высококонсервативной области гена N генома вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС) и способу выявления ЭДС. Способ выявления вируса основан на постановке полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции с использованием праймеров 5′-accagcaaattgggtactg-3′, 5′-cctgttccgaggtagtagaa-3′ и TaqMan зонда 5′-FAM-ccgtggt(RTQ1)gagcgaattgaacaacc-3′. Далее проводят амплификацию РНК вируса. Затем осуществляют оценку проведения реакции, при этом результат реакции считается положительным, если Ct>33. Использование данных изобретений позволяет повысить чувствительность метода ПЦР. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.
Наверх