Способ получения микрокапсулированной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы для перорального применения


 


Владельцы патента RU 2583923:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук (RU)
Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека" Федерального медико-биологического агентства (RU)

Изобретение относится к области высокомолекулярной химии и фармакологии и предназначено для использования в качестве пероральной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы (СОД). Изобретение заключается во введении СОД в пористые кальций карбонатные (CaCO3) ядра методом соосаждения растворов Na2CO3 и CaCl2×2H2O и дальнейшем формировании альгинатных микрокапсул (АМК), содержащих эти ядра. Для подавления пептидазной активности в кишечной среде в систему введен ингибитор пептидаз - овомукоид (ОМ), который, как и СОД, но независимо от него, включен в ядра. Ядра CaCO3 формируются согласно следующей методике: равные объемы 0.33 М растворов Na2CO3 и CaCl2×2H2O сливают и перемешивают 30 с. Суспензия созревает в течение 15 мин, затем ядра промывают водой и ацетоном, отфильтровывают и сушат при Т=40°С. Формирование АМК, содержащих ядра с белками, проводили методом ионотропной сшивки. Размеры АМК составляют 800-900 мкм. Включение СОД и ОМ в них составляет 10-30 мкг/мг и 5-20 мкг/мг соответственно. Такая конфигурация системы пероральной доставки сохраняет активность СОД в присутствии кишечного фермента трипсина. Высвобождение СОД в среду, имитирующую желудочную (0.05 М НС1 рН=1.2), минимально. В среду, имитирующую кишечную (фосфатный буфер, рН=8.0), СОД высвобождается на 60% за 24 часа, что обеспечивает пролонгированное действие препарата. 2 ил., 2 пр.

 

Предложение относится к области высокомолекулярной химии и фармакологии и предназначено для использования в качестве микрокапсулированной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы (СОД) для перорального применения.

В литературе приведены различные способы получения инкапсулированных форм СОД в биодеградируемые микрокапсулы (МК). Препараты на базе хитозановых МК, полученных соосаждением [Ö. Çelik, J. Akbuğa. Preparation of superoxide dismutase loaded chitosan microspheres: Characterization and release studies. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 66 (2007) 42-47], или на основе МК, сформированных эмульсионным способом с использованием поли(D,L-лактида-ко-гликолида) [S. Giovagnoli, P. Blasi, M. Ricci, and C. Rossi. Biodegradable Microspheres as Carriers for Native Superoxide Dismutase and Catalase Delivery, AAPS Pharm Sci Tech, 5 (2004) 1-9], обладают способностью пролонгировать процесс высвобождения СОД с частичным сохранением ферментативной активности. Существенным недостатком этих способов является получение инъекционных форм препаратов, тогда как применение пероральных препаратов намного удобнее для пациентов и смягчает требования к обеспечению стерильности процесса изготовления лекарственных форм. Существенным недостатком аэрозольного препарата СОД, полученного методом двойной эмульсии «твердое вещество/масло/вода» на основе поликетала [V.F. Fiore, M.C. Lofton, S. Roser-Page, S.C. Yang, J. Roman, N. Murthy, T.H. Barker. Polyketal microparticles for therapeutic delivery to the lung, Biomaterials, 31 (2010) 810-817], является использование дихлорметана - вредного органического растворителя.

Вместе с тем в настоящее время не известны препараты СОД для перорального применения. Для пероральных лекарственных форм необходимо обеспечить устойчивость в кислой среде желудка и в щелочной среде кишечника. Для белковых лекарственных форм существенную опасность представляют, кроме того, и протеолитические ферменты кишечника трипсин, химотрипсин, эластаза и др.

Наиболее близким по сущности является способ получения перорального инкапсулируемого инсулина, заключающийся в формировании микрочастиц, которые получали постадийной адсорбцией противоположно заряженных полиэлектролитов на матрице, представляющей собой нерастворимый комплекс белков - инсулина и ингибиторов кишечных пептидаз с полианионом (декстрансульфатом и хитозаном) [Печенкин М.А., Балабушевич Н.Г., Зоров И.Н., Изумрудов В.А., Клячко Н.Л., Кабанов А.В., Ларионова Н.И. Использование ингибиторов протеаз в составе полиэлектролитных микрочастиц для увеличения биодоступности капсулируемых белков при пероральном применении. ХФЖ 47 (2013) 49-56].

Существенным недостатком этого способа получения пероральной микрокапсулированной формы белка является то, что способ разработан для инкапсулирования именно инсулина. В случае использования способа для инкапсулирования белка с другими характеристиками (прежде всего с другим значением изоэлектрической точки) совместное введение целевого белка и ингибиторов пептидаз в процессе их соосаждения с полимером не исключает взаимодействия составляющих системы и уменьшения их активности. Агрегаты белков с полимером крайне неоднородны по размерам и морфологии. Стадия формирования микрокапсулы методом полиэлектролитной адсорбции крайне трудоемка и приводит к потерям целевого продукта.

Технической задачей и положительным результатом заявляемого способа является разработка методики получения микрокапсулированной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы для перорального применения в виде двухуровневой микрокапсулы, обладающей устойчивостью к воздействию кислой среды желудка и с пролонгированным выделением в щелочную среду кишечника, а для защиты СОД от кишечных пептидаз в препарат введен ингибитор пептидаз - овомукоид (ОМ).

Указанная задача и технический результат достигается в способе получения микрокапсулированной пероральной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы, включающем раздельное введение методом соосаждения целевого фермента - СОД и ингибитора пептидаз - ОМ в первичные носители - пористые кальций карбонатные ядра с последующим совместным включением их во вторичную оболочку - альгинатную МК, формируемую методом ионотропной сшивки. А именно: целевой белок супероксиддисмутаза, как и овомукоид - игибитор пептидазной активности в кишечной среде, вводят независимо друг от друга в пористые кальций карбонатные (СаСО3) ядра методом соосаждения равных объемов 0.33 М растворов Na2CO3 и CaCl2×2H2O (в последнем содержатся белки СОД или ОМ в концентрации 2-3 мг/мл) при перемешивании в течение 30 с, после созревания суспензии в течение 15 мин ядра промывают на фильтре Шотта №16 водой, отфильтровывают, затем промывают ацетоном и сушат в термостате при Т=40-50°C; в дальнейшем альгинатные микрокапсулы (АМК), служащие наружной оболочкой для обоих типов ядер, формируют методом ионотропной сшивки, согласно следующей процедуре: дисперсию ядер в 3% растворе альгината натрия (не более 200 мг ядер в 1 мл раствора) вводят при перемешивании по каплям в осадительную ванну, содержащую 1% раствор СаС12 в 0.2-0.5% растворе хитозана в 1% уксусной кислоте, затем фильтруют на воронке Бюхнера, промывают водой и сушат при комнатной температуре; размеры полученных таким способом АМК составляют 800-900 мкм, включение СОД и ОМ в предлагаемые системы составляет 10-30 мкг/мг и 5-20 мкг/мг соответственно.

Более полно способ излагается на приводимых примерах, где в экспериментах использовали следующие реактивы: ОМ (Реахим, Россия), трипсин (Sigma-Aldrich), Na2CO3, СаС12×2 H2O и безводный СаС12 - все puriss p.a. (Sigma-Aldrich), Na2HPO4, NaH2PO4 - чда (Реахим Россия), кислота уксусная, чда (Вектон Россия), вода деионизованная extra pure reagent grade III (Acros Organics), альгинат Na низковязкий медицинский (Архангельский комбинат), хитозан кислоторастворимый, ТУ 15-01482-88 с ММ=560 кДа и ММ=35 кДа, набор реагентов Ransod (SD125) для определения активности СОД (Randox).

Пример 1. Двухуровневые АМК, содержащие СаСО3 ядра с включенными в них антиоксидантным ферментом СОД и пептидазным ингибитором ОМ, получали следующим образом. Супероксиддисмутаза (СОД) является ключевым ферментом антиоксидантной защиты организма. Физиологическое действие связано с детоксикацией супероксидных радикалов, образующихся при развитии различных патологических состояний. Основное ограничение при терапевтическом использовании СОД - короткий период полувыведения из плазмы - всего 6 минут. В работе использовали препарат Рексод (ВНИИ ОЧБП), основным действующим веществом которого является рекомбинантная СОД человека, получаемая из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, штамм Y2134. Рексод - оригинальный препарат, в зарубежных фармакопеях не описан. Регистрационное удостоверение ЛСР-007164/09 от 10.09.2009. ОМ - ингибитор пептидазных ферментов, содержащихся в кишечнике - трипсина, химотрипсина и эластазы. Первый уровень инкапсулирования соосаждение СОД в пористые ватериты СаСО3- проводили следующим образом: равные объемы 0.33 М растворов Na2CO3 и СаС12×2H2O (в последнем содержатся белки СОД или ОМ в концентрации 2-3 мг/мл) сливали и перемешивали в течение 30 с. Суспензия созревала в течение 15 мин, затем ядра на фильтре Шотта №16 промывали 6-кратным объемом воды, отфильтровывали, затем промывали ацетоном и сушили в термостате при Т=40-50°C. Температурный режим влияет на морфологию кристаллов СаСО3. Сушка геля CaCO3 при Т ниже 30°C приводит к формированию непористых кальцитов, при Т выше 50°C формируется смесь пористых сферических ватеритов и непористых арагонитов, с ростом температуры увеличивается доля арагонитов. Введение ингибитора пептидаз ОМ на первом уровне инкапсулирования проводили аналогично введению СОД. Размеры карбонатных ядер, содержащих белки СОД или ОМ, составляют 4-6 мкм. Второй уровень инкапсулирования - формирование АМК, содержащих ядра с белками, проводили методом ионотропной сшивки. Дисперсию ядер (не более 200 мг на 1 мл раствора) в 3% растворе альгината натрия вводили при перемешивании по каплям в осадительную ванну, содержащую 1% водный раствор СаСl2. Для улучшения качества поверхности АМК вводят добавки хитозана, для этого осадительная ванна СаСl2 содержала 0.2-0.5% раствор хитозана в 1% уксусной кислоте. При попадании в ванну альгинат натрия в составе капли пространственно сшивается двухвалентными ионами кальция, образуя прочную эластичную АМК, внутри которой заключены карбонатные ядра с белком. Затем АМК фильтровали, промывали водой и сушили при комнатной температуре. Размеры АМК составляют 800-900 мкм. Полученные АМК являются основным компонентом перорального препарата СОД пролонгированного действия. Включение СОД и ОМ в предлагаемые системы составляет 10-30 мкг/мг и 5-20 мкг/мг соответственно. Высвобождение СОД в среду, имитирующую желудочную (0.05 М НСl, рН=1.2), минимально. В среду, имитирующую кишечную (Na фосфатный буфер, рН=8.0), СОД высвобождается на 60% за 24 часа, что обеспечивает пролонгированное действие препарата. Кривые высвобождения СОД в модельную кишечную среду из двухуровневой системы, а также из АМК без карбонатных ядер и только из СаСО3 - системы первого уровня приведены на фиг. 1. Видно, что карбонатные ядра практически не задерживают СОД в кишечной среде. Сравнение профилей высвобождения СОД из заявляемой двухуровневой системы и АМК о более значительной пролонгации процесса в первом случае.

Пример 2. Отличается от Примера 1 тем, что на первом уровне инкапсулирования проводили совместное соосаждение СОД и ОМ.

Этот пример приведен для сравнения эффективности систем доставки различной конфигурации в присутствии ингибитора протеолитических ферментов.

Испытания активности АМК, содержащих СОД, полученных по заявленному изобретению (Пример 1), и по методикам, приведенным в Примере 2, проводились in vitro. Активность СОД определяли с помощью набора реагентов Ransod (SD125) производства фирмы Randox. Расчет активности СОД осуществляли по величине ингибирования реакции образования формазана в результате окисления хромогена (2-(4-иодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолий хлорид) кислородными радикалами, генерируемыми ксантиноксидазой в ходе окисления ксантина. Измерения оптической плотности растворов осуществляли с использованием планшетного фотометра FLx800 (Biotek). Пробы разводили в 3000 раз 10 мМ натрий-фосфатным буфером. В 96-луночный планшет вносили по 6 мкл разведенной пробы или стандартов и 200 мкл реагента 1 (ксантин) и перемешивали. Затем добавляли 30 мкл реагента 2, содержащего ксантиноксидазу, перемешивали и измеряли начальную оптическую плотность Ан при длине волны 505 нм. Через 8 минут инкубации измеряли конечную оптическую плотность Ак. Все измеренные значения для стандартов и проб (средние из двух измерений) переводили в проценты ингибирования: Ing=100-[dAH/dAK]·100%. В качестве калибровочной кривой использовали кривую зависимости ингибирования реакции образования формазана от логарифма (Log10) активности СОД в стандарте, выраженной в Ед/мл. Временные профили изменения активности СОД при высвобождении фермента из двухуровневых АМК различного состава, соответствующего Примерам 1-2, в модельную кишечную среду, а именно: в 0.07М Фосфатный буфер, рН=7,8, содержащий трипсин в концентрации 0.125 мг/мл, приведены на фиг. 2. Попытка ввести пептидазный ингибитор ОМ в CaCO3 ядра совместно с СОД (Пример 2) не привела к ожидаемому результату. Не исключено взаимодействие белков в ходе процедуры формирования системы инкапсулирования.

Предпочтительной является микрокапсулированная форма СОД, полученная по способу, описанному в Примере 1, когда ОМ включен в СаСО3 ядра независимо от СОД. Такая конфигурация системы пероральной доставки эффективно сохраняет активность СОД in vitro в присутствии кишечного фермента трипсина. Высвобождение СОД в среду, имитирующую желудочную (рН=1.2), минимально. В среду, имитирующую кишечную (фосфатный буфер, рН=8.0), СОД высвобождается на 60% за 24 часа, что обеспечивает пролонгированное действие препарата.

В заявленном способе весь технологический процесс проводится с применением водных растворов, экологически безвреден, пожаробезопасен. Это позволяет получить препарат, обладающий следующими положительными характеристиками: пероральная форма приема препарата СОД намного удобнее, чем парентеральная как для пациента, так и для персонала. При производстве пероральных форм требования к стерильности производства менее жесткие, чем при производстве парентеральных форм. При прохождении желудочно-кишечного тракта пероральная микрокапсулированная форма СОД обеспечивает защиту терапевтического белка в желудочной среде и обеспечивает ее постепенное высвобождение в среду кишечника. Пролонгированное действие препарата позволяет сократить количество приемов лекарственного средства. Благодаря оптимальному варианту включения ингибитора кишечных пептидаз предлагаемый препарат сохраняет активность терапевтического белка СОД в присутствии кишечного фермента трипсина.

Способ получения микрокапсулированной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы для перорального применения, включающий формирование двухуровневой микрокапсулы, содержащей внутри целевой белок и ингибитор пептидаз, отличающийся тем, что целевой белок супероксиддисмутаза, как и овомукоид - ингибитор пептидазной активности в кишечной среде, вводят независимо друг от друга в пористые кальций карбонатные (СаСО3) ядра методом соосаждения равных объемов 0.33 М растворов Na2CO3 и CaCl2×2H2O, в последнем содержатся белки СОД или ОМ в концентрации 2-3 мг/мл, при перемешивании в течение 30 с, после созревания суспензии в течение 15 мин ядра промывают на фильтре Шотта №16 водой, отфильтровывают, затем промывают ацетоном и сушат в термостате при Т=40-50°C; в дальнейшем альгинатные микрокапсулы, служащие наружной оболочкой для обоих типов ядер, формируют методом ионотропной сшивки, согласно следующей процедуре: дисперсию ядер в 3% растворе альгината натрия не более 200 мг ядер в 1 мл раствора вводят при перемешивании по каплям в осадительную ванну, содержащую 1% раствор CaCl2 в 0.2-0.5% растворе хитозана в 1% уксусной кислоте, затем фильтруют на воронке Бюхнера, промывают водой и сушат при комнатной температуре; размеры полученных таким способом альгинатных микрокапсул составляют 800-900 мкм, включение супероксиддисмутазы и овомукоида в них составляет 10-30 мкг/мг и 5-20 мкг/мг соответственно.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области фармацевтики. Описан способ получения микрокапсул лекарственных препаратов путем диспергирования капсулируемого вещества в растворе полимера и осаждения полимера на поверхности частиц дисперсии.
Изобретение относится к способу получения микрокапсул цефотаксима. Указанный способ характеризуется тем, что к 1% водному раствору интерферона человеческого лейкоцитарного в альфа- или бета-форме добавляют порошок цефотаксима и препарат Е472с в качестве поверхностно-активного вещества, полученную смесь перемешивают, после растворения компонентов реакционной смеси до образования прозрачного раствора медленно по каплям приливают бутанол в качестве первого осадителя, а затем ацетон - в качестве второго осадителя, полученную суспензию микрокапсул отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат.

Изобретение относится к области нанотехнологии, фармакологии, фармацевтики и ветеринарной медицины. Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул и увеличение выхода по массе.

Изобретение относится в области нанотехнологии, медицины, фармакологии и ветеринарной медицины. Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул и увеличение выхода по массе.

Изобретение относится к области медицины, а именно к контрастным средствам, предназначенным для увеличения контрастности визуализируемого изображения при МРТ-диагностике печени и может быть использовано в экспериментальных и клинических исследованиях.

Изобретение относится в области нанотехнологии, в частности к способу получения нанокапсул антисептика-стимулятора Дорогова (АСД) 2 фракция в оболочке натрий карбоксиметилцеллюлозе, характеризующемуся тем, что АСД 2 фракция диспергируют в суспензию натрий карбоксиметилцеллюлозы в бензоле в присутствии препарата Е472с, приливают ацетонитрил в качестве осадителя, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре.

Изобретение относится в области нанотехнологии, медицины, фармакологии и ветеринарной медицины. Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул и увеличение выхода по массе.

Изобретение относится в области нанотехнологии, в частности растениеводства. Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул и увеличение выхода по массе.

Изобретение относится в области нанотехнологии и пищевой промышленности. Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул и увеличение выхода по массе.
Изобретение относится в области нанотехнологии. Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул и увеличение выхода по массе. Отличительной особенностью предлагаемого способа является использование кверцетина и дигидрокверцетина, оболочки нанокапсул хитозана, а также использование осадителя - 1,2-дихлорэтана при получении нанокапсул физико-химическим методом осаждения нерастворителем.

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической микросферной композиции, включающей ротиготин или его фармацевтически приемлемую соль; по крайней мере один полилактид-гликолид (ПЛГлА) с молекулярной массой 5000-100000 Да и полимеризационным соотношением лактид:гликолид от 95:5 до 5:95; и, по меньшей мере, одну жирную кислоту, имеющую 8-24 атомов углерода, где ротиготин или его фармацевтически приемлемая соль составляет 20-40%, ПЛГлА составляет 45-79%, и, по меньшей мере, одна жирная кислота составляет 1-15% по весу относительно общего веса композиции. Группа изобретений также касается способа лечения болезни Паркинсона с применением описанных композиций. Группа изобретений обеспечивает состав ротиготина, который существенно уменьшает взрывное высвобождение препарата. 3 н. и 20 з.п.ф-лы, 28 пр., 12 табл., 38 ил.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности. Описано два вида многочастичных композиций для доставки плохо растворимых в среде желудочно-кишечного тракта лекарственных средств. В первом варианте указанная композиция состоит из гранул, которые содержат: придающий растворимость поверхностно-активный агент, расположенный вокруг инертного субстрата; полупроницаемое покрытие; частицы лекарственного средства, имеющие эффективный средний размер приблизительно 2 мкм, расположенные между слоем поверхностно-активного агента и полупроницаемым покрытием; поверхностный стабилизатор, адсорбированный на поверхности частиц лекарственного средства. Второй вариант указанной композиции может содержать: ядро; поверхностный стабилизатор, адсорбированный на поверхности частиц лекарственного средства с размерами частиц приблизительно 2 мкм; полупроницаемое покрытие; придающий растворимость агент в форме слоя pH-изменяющего агента, расположенного между слоем лекарственного средства и полупроницаемым покрытием. Изобретение направлено на улучшение доставки слаборастворимых лекарственных средств, проявляющих низкую растворимость в среде желудочно-кишечного тракта. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 7 пр.

Изобретение относится к водной дисперсии микрокапсул, пищевому продукту, содержащему указанную дисперсию. Микрокапсулы содержат, по меньшей мере, одно гидрофобное вещество и граничный слой вокруг упомянутого вещества. Граничный слой содержит белковые агрегаты и отрицательно заряженный полимер с блочным распределением заряда в молекуле, такой как пектин. Водная дисперсия имеет рН менее 3,5. Белковые агрегаты получают нагреванием водного раствора по меньшей мере одного белка при температуре от 60˚С до 200˚С. Белковые агрегаты включают денатурированный белок, который денатурирован по меньшей мере на 50%. Изобретение относится к пищевому продукту, содержащему микрокапсулы, рН которого составляет от 1,5-3,8. Микрокапсулы обладают высокой стабильностью при низком рН без флокуляции, образования осадка и окисления гидрофобного вещества. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области нанотехнологии, в частности к способу получения нанокапсул, и описывает способ получения нанокапсул экстракта зеленого чая. Способ характеризуется тем, что качестве оболочки используется каррагинан, а в качестве ядра используется экстракт зеленого чая, при осуществлении способа экстракт зеленого чая добавляют в суспензию каррагинана в бутаноле в присутствии поверхностно-активного вещества E472c, при этом соотношение ядро:оболочка при пересчете на сухое вещество составляет от 1:1 до 1:5, затем при перемешивании приливают серный эфир, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. Способ обеспечивает упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул, уменьшение потерь при получении нанокапсул. 1 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области нанотехнологии, в частности к способу получения нанокапсул, и описывает способ получения нанокапсул экстракта зеленого чая. Способ характеризуется тем, что качестве оболочки используется натрий карбоксиметилцеллюлоза, а в качестве ядра используется экстракт зеленого чая, при осуществлении способа экстракт зеленого чая добавляют в суспензию натрий карбоксиметилцеллюлозы в бутаноле в присутствии поверхностно-активного вещества E472c, при этом соотношение ядро:оболочка при пересчете на сухое вещество составляет от 1:1, или 1:3, или 1:5, затем при перемешивании приливают хлористый метилен, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. Способ обеспечивает упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул, уменьшение потерь при получении нанокапсул. 1 ил., 4 пр.
Наверх