Способ прогнозирования развития острого повреждения почки в условиях тепловой ишемии в эксперименте в зависимости от возраста и пола животных
Владельцы патента RU 2583950:
федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к экспериментальной медицине, онкологии и может быть использовано для прогнозирования развития острого повреждения почки в условиях тепловой ишемии в эксперименте в зависимости от возраста и пола животных. При росте содержания цистатина С у молодых самцов в 1,7 раза, у старых самок в 1,3 раза и/или при росте содержания L-FABP у молодых самцов в 1,8 раз, у старых самок в 5,8 раз при длительности ишемии 15 минут прогнозируют развитие острой почечной недостаточности. При росте содержания цистатина С в 1,2 раза у молодых самок и в 1,5 раза у старых самцов и/или при росте содержания L-FABP в 1,6 раза у старых самцов при длительности ишемии 25 минут прогнозируют развитие острой почечной недостаточности. Способ позволяет доступно провести прогнозирование развития острой почечной недостаточности за счет оценки уровня цистатина С, L-FABP в зависимости от возраста и пола животных и длительности тепловой ишемии. 2 табл.
Краеугольным камнем при резекции почки остается время тепловой ишемии. Изучение результатов резекций почек, выполненных в условиях тепловой ишемии и без нее, показало, что вероятность развития острой почечной недостаточности была значительно выше в группе пациентов, перенесших вмешательство в условиях ишемии, причем каждая минута пережатия почечных сосудов усиливала этот риск (см. Thompson R.H. Every minute counts when the renal hilum is clamped during partial nephrectomy / R.H. Thompson [et al.] // European Urology. - 2010. - Vol. 58. - P. 340-345; см. Thompson R.H. comparison of warm ischemia versus no ischemia during partial nephrectomy on a solitary kidney / R.H. Thompson [et al.] // European Urology. - 2010. - Vol.58. P. 331-336).
Имеются данные, указывающие, что продолжительная тепловая ишемия почки вызывает стойкое снижение скорости клубочковой фильтрации уже через 3 месяца после операции, без тенденции к дальнейшему ухудшению. Причем среди пациентов с исходной скоростью клубочковой фильтрации >30 мл/мин/1,73 м2 и резекцией почки, выполненной с тепловой ишемией, риск развития хронической болезни почек тяжелой стадии в течение 3 лет после операции был гораздо выше (см. Porpiglia F. Long-term functional evaluation of the treated kidney in a prospective series of patients who underwent laparoscopic partial nephrectomy for small renal tumors / F. Porpiglia [et al.] // European Urology. - 2012. - Vol. 62. - P. 130-135).
На сегодняшний день рекомендованная максимальная продолжительность тепловой ишемии год от года становится все меньше, и рассчитывать на хорошие ранние и отдаленные функциональные результаты резекции можно, если продолжительность тепловой ишемии не превышает 20 минут (см. Becker et al. Assessing the impact of ischaemia time during partial nephrectomy // European Urology. - 2009. - Vol. 56. - P. 625-635).
Была исследована связь между шкалами оценки опухоли и временем тепловой ишемии в ходе открытой резекции почки. По данным КТ опухоли 78 пациентов были охарактеризованы с использованием трех систем: нефрометрической шкалы R.E.N.A.L.1, PADUA и С index. Средние значения для трех систем составили соответственно 7, 8 и 3,9. Среднее время тепловой ишемии равнялось 23,4 мин. Диаметр опухоли, близость к полостной системе, передняя/задняя локализация, медиальная/латеральная локализация и вовлечения полостной системы были чрезвычайно связаны с продолжительностью ишемии. Со временем ишемии были значительно связаны только высокие значения R.E.N.A.L. и PADUA, но не С index (см. Lavallee L.T. The association between renal tumour scoring systems and ischemia time during open partial nephrectomy / L.T. Lavallee [et al.] // Can Urol Assoc J. - 2012. - Vol. 15. - P.1 - 8.1).
В другом исследовании была показана ценность шкалы R.E.N.A.L. для прогноза времени тепловой ишемии, объема кровопотери и интраоперационного повреждения полостной системы почки в ходе лапароскопической и робот-ассистированной резекции (см. Mayer W.A. Higher RENAL Nephrometry Score is predictive of longer warm ischemia time and collecting system entry during laparoscopic and robotic-assisted partial nephrectomy / W.A. Mayer [et al.] // Urology. - 2012. - Vol. 79 (5). - P. 1052-1056). Авторы делают вывод, что шкала R.E.N.A.L. в целом, а также уровни N и R могут помочь спрогнозировать время тепловой ишемии и вероятность нарушения целостности полостной системы почки в ходе указанных операций, что позволит спланировать ход оперативного вмешательства.
Интересно, что опыт хирурга, размер и другие анатомические характеристики опухоли, определенные по шкале PADUA, а также необходимость восстановления полостной системы почки являются независимыми предикторами времени тепловой ишемии >20 мин.
Аналогично, опыт хирурга, размер опухоли, другие анатомические характеристики опухоли, определенные по шкале PADUA, являются независимыми предикторами осложнений в целом (см. Ficarra V. Predictors of warm ischemia time and perioperative complications in a multicenter, international series of robot-assisted partial nephrectomy / V. Ficarra [et al.] // European Urology. - 2012. - Vol. 61 (2). - P. 395-402).
Таким образом, не определен безопасный порог времени тепловой ишемии, т.к. каждая ее минута вносит свой вклад в развитие острого повреждения почки (ОПП) и снижение почечной функции.
Необходимо выявлять повреждение почки на самом раннем этапе, чтобы предотвращать развитие острой, а затем и хронической почечной недостаточности (см. Мосоян М.С., Аль-Шукри С.Х., Есаян A.M., Ильин Д.М., Корза С.В. Резекция почки в условиях регионарной ишемии// Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова, 2013. - Т. 8. - №2. - С. 43-47). Для этого необходимо изучение на этапах ишемии основных функциональных показателей повреждения почек. Неоценимую помощь в этом вопросе может дать эксперимент.
На сегодняшний день совершенствование методов диагностики и прогноза развития ОПП связывают с определением биологических маркеров, не зависящих от фильтрационной функции почек и связанных с ранней стадией развития ОПП (см. Devarajan P. Emerging urinary biomarkers in the diagnosis of acute kidney injury // Expert. Opin. Med. Diag. 2008; 2 (4): 387-398). К ним относятся липокалин-2 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin-NGAL), интерлейкин-18 (ИЛ-18), молекула почечного повреждения-1 (Na+/H+ обменник типа 3 - NHE-3), ряд ферментов, обычно локализующихся в щеточной кайме проксимальных канальцев, и другие показатели (см. Melnikov V.Y., Molitoris В.A. Improvements in the diagnosis of acute kidney injury // Saudi J Kidney Dis Transpl. 2008; 19 (4): 537-544; Waikar S.S., Liu K.D., Chertow G.M. Diagnosis, epidemiology and outcomes of acute kidney injury // Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2008; 3 (3): 844-861).
Техническим результатом является прогнозирование развития острой почечной недостаточности в зависимости от длительности тепловой ишемии, возраста и пола животныхт
Технический результат достигается тем, что при росте содержания цистатина С у молодых самцов в 1,7 раза, у старых самок в 1,3 раза и/или при росте содержания L-FABP у молодых самцов в 1,8 раз, у старых самок в 5,8 раз при длительности ишемии 15 минут; при росте содержания цистатина С в 1,2 раза у молодых самок и в 1,5 раза у старых самцов и/или при росте содержания L-FABP в 1,6 раза у старых самцов при длительности ишемии 25 минут прогнозируют развитие острой почечной недостаточности.
Способ осуществляется следующим образом.
Моделирование ишемического повреждения проводят на правой почке. Наркотизированных животных размещают в положении «на спине». Шерсть на животе удаляют, операционное поле обрабатывают антисептиками (хлоргексидин и 70% этанол).
Разрез проводят вдоль белой линии живота от мечевидного отростка грудины до лобка, рассекают кожу и соединительную ткань.
Выделяют почечную ножку, подводят под нее шелковую лигатуру, затягивают простым узлом.
Рану на протяжении периода ишемии прикрывают салфеткой, смоченной антисептиками.
Через определенные промежутки времени животных забивают декапитацией, не выводя из наркоза.
Для исследования забирают правую (ишемизированную) почку.
100 мг ткани промывают 1х фосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизируют в 1 мл lx PBS и оставляют на ночь при -20 C.
Для полного разрушения клеточных мембран проводят два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугируют 5 мин при 5000g (2-8°C).
Супернатант отбирают, делят на аликвоты и хранят при -20°C или -80°C.
Перед измерением размороженные образцы центрифугируют.
Исследование проводят в ткани коркового вещества ишемизированной почки методом ИФА с применением стандартных тест-систем изучают уровень цистатина С, нг/г тк (BioVendor, Чехия), L-FABP, нг/г тк (HycultBiotechnology, Нидерланды).
При росте содержания цистатина С у молодых самцов в 1,7 раза, у старых самок в 1,3 раза и/или при росте содержания L-FABP у молодых самцов в 1,8 раз, у старых самок в 5,8 раз при длительности ишемии 15 минут; при росте содержания цистатина С в 1,2 раза у молодых самок и в 1,5 раза у старых самцов и/или при росте содержания L-FABP в 1,6 раза у старых самцов при длительности ишемии 25 мин прогнозируют развитие острой почечной недостаточности.
Были исследованы 170 белых беспородных крыс обоего пола массой 180-200 г (молодые животные) и 300-350 г (старые животные).
Из них интактную группу составили 40 животных соответствующего возрата (по 10 животных на каждую возрастную группу).
Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета Statistica 6,0 (Stat-Soft, 2001).
Оценку достоверности производили с использованием t-критерия Стьюдента. Уровень р<0,05 принимали как значимый.
Результаты содержания цистатина С и L-FABP в тканях почки, подвергнутой острой ишемии, представлены в табл. 1-2.
Через 15 мин ишемии в корковом веществе ишемизированной почки обнаружено повышение уровня цистатина С в 1,7 раза относительно интактных групп животных у молодых самцов и в 1,3 раза у старых самок.
В ткани ишемизированной почки молодых самок и старых самцов исследуемый маркер оставался на уровне интактной ткани.
Через 20 мин ишемии уровень маркера продолжал достоверно повышаться у старых самок (в 1,5 раза) и у молодых самцов (в 1,7 раза - так же, как и в предыдущем сроке).
В ткани ишемизированной почки молодых самок и старых самцов исследуемый маркер оставался на уровне интактной ткани.
Через 25 мин ишемии наблюдалось продолжающееся повышение роста содержания цистатина С у старых самок (в 1,6 раза). У молодых самцов этот показатель сохранялся на том же повышенном уровне.
Однако, в ткани ишемизированной почки молодых самок наблюдался рост этого показателя в 1,2 раза и у старых самцов в 1,5 раз, по сравнению с интактными животными.
Такие изменения содержания цистатина С свидетельствуют о нарушении его метаболизма вследствие ишемии почек: у молодых самцов и у старых самок уже через 15 мин ишемии, а у молодых самок и старых самцов через 25 мин.
В процессе ишемизации обнаружена различная динамика маркера, также зависящая от пола и возраста животных.
Через 15 мин ишемии в корковом веществе ишемизированной почки молодых самцов наблюдалось повышение этого показателя (в 1,8 раз) с той же динамикой через 20 мин и 25 мин тепловой ишемии (табл. 2).
У старых самок через 15 мин ишемии в 5,8 раза возрастало содержание L-FABP с последующим, хотя и незначительным, нарастанием в сроки 20 мин (в 6,7 раза) и 25 мин (в 6,7 раза).
Иная динамика содержания L-FABP обнаружена в тканях ишемизированных почек старых самцов и молодых самок. Так, в корковом веществе ишемизированной почки старых самцов повышение уровня маркера в 1,6 раза зарегистрировано лишь через 25 мин.
Не найдено увеличение содержания L-FABP в корковом веществе ишемизированной почки молодых самок. Поскольку считается, что увеличение содержания L-FABP в моче при ОПП происходит преимущественно за счет повреждения проксимальных канальцев, логично предположить более раннее развитие событий в почках старых самок и молодых самцов, наступающее уже через 15 мин ишемии.
Изобретение «Способ прогнозирования развития острого повреждения почки в условиях тепловой ишемии в эксперименте в зависимости от возраста и пола животных» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели прогнозирования развития острой почечной недостаточности с целью разработки методов экспериментальной терапии этой патологии.
Способ экономичен, доступен, обеспечивает возможность прогнозирования развития острой почечной недостаточности в зависимости от длительности тепловой ишемии.
Способ прогнозирования развития острого повреждения почки в условиях тепловой ишемии в эксперименте в зависимости от возраста и пола животных, характеризующийся тем, что при росте содержания цистатина С у молодых самцов в 1,7 раза, у старых самок в 1,3 раза и/или при росте содержания L-FABP у молодых самцов в 1,8 раз, у старых самок в 5,8 раз при длительности ишемии 15 минут; при росте содержания цистатина С в 1,2 раза у молодых самок и в 1,5 раза у старых самцов и/или при росте содержания L-FABP в 1,6 раза у старых самцов при длительности ишемии 25 минут прогнозируют развитие острой почечной недостаточности.
