Способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Сущность способа состоит в том, что проводят количественное определение в ядрах сперматозоидов тиоловых групп. При окрашивании 25-30% ядер живых сперматозоидов путем обработки пробы спермы реагентом MitoTrackerRed диагностируют наличие аномалии дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность диагностики аномалии дифференцировки сперматозоидов. 1 пр.

 

Изобретение относится к области репродуктивной медицины и предназначено для диагностики идиоматических (не выявляемым известными в настоящее время методами) патологий спермиогенеза.

Актуальность разработки эффективных методов диагностики причин бесплодия обусловлена сложной демографической ситуацией в стране и большим количеством бесплодных браков (15% супружеских пар), причем у половины этих пар бесплодие связано с мужским фактором. Бесплодие является полиэтиологичным заболеванием. Оно может быть вызвано множеством различных факторов как эндогенных (первичные, или генетически обусловленные заболевания мужчин и женщин), так и экзогенных (вторичные заболевания). Выявление причин бесплодия, в первую очередь, необходимо для выбора тактики лечения, в том числе и для определения возможности применения консервативного лечения или методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Особое значение имеет разработка методов прижизненной диагностики патологии сперматозоидов, так как она позволяет отбирать нормальные сперматозоиды в практике искусственного оплодотворения.

Известен (RU, патент 2118822, опубл. 10.09.1998) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов. Согласно известному способу состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.

Недостатком известного способа следует признать, что метод не является строго количественным и, как и при использовании для деконденсации гепарина, лишь косвенно отражает аномалии в упаковке хроматина. Кроме того, этот метод требует сложного и дорогостоящего оборудования и не может использоваться для широкого скрининга.

Известен (RU, патент 2426993 опубл. 20.08.2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации способа образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с pH 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-НСl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°C, останавливают гидролиз с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и растворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Недостатком известного способа следует признать его длительность, а также трудоемкость.

Одним из подходов к диагностики мужского бесплодия является количественное определение в сперматозоидах тиоловых групп, которыми обогащены белки-протамины.

Сульфгидрильные группы (тиоловые группы, меркаптогруппы)

- SH-группы органических соединений, обладающие высокой реакционной способностью. Сульфгидрильные группы входят в состав многих веществ биологического происхождения; участвуют в создании и поддержании нативного состояния белков, а также в образовании активных центров ферментов и др. Взаимодействием с сульфгидрильными группами обусловлено действие многих отравляющих веществ, ионизирующей радиации, ионов тяжелых металлов.

Важную структурную и физиологическую роль тиоловые группы играют в формировании сперматозоидов человека. При дифференцировке сперматозоидов происходит процесс, который принято обозначать как ремоделирование хроматина. Суть процесса - замещение канонических белков - гистонов белками протаминами. Завершающий этап созревания сперматозоидов осуществляется в семенном протоке (эпидидимусе). Когда сперматозоиды выходят в эпидидимус, геном стабилизируется путем окисления тиоловых групп в цистеиновых остатках протаминов с образованием S-S связей. Показано, что у человека около 95% SH групп протаминов формирует S-S связи. Окисление тиоловых групп является конечным этапом стабилизации ДНК генома в зрелых сперматозоидах. Считается, что разрыв S-S связей в нуклеопротаминовом хроматине сперматозоидов может индуцироваться оксидативным стрессом, что впоследствии приводит к включению программы апоптоза.

Известен (Ramos L Incomplete nuclear transformation of human spermatozoa in oligo-astheno-teratospermia: characterization by indirect immunofluorescence of chromatin and thiol status. «Department of Obstetrics and Gynaecology, Radboud University Nijmegen Medical Centre, PO Box 9101, 6500 HB Nijmegen, The Netherlands.) способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе in vitro, включающий количественное определение в ядрах сперматозоидах тиоловых групп и определение по измеренному значению качество спермы. Количественные показатели были определены путем определения тиоловых групп в сперматозоидах здоровых доноров и пациентов с выраженной олигоастенотератоспермией. В качестве индикатора использовали флуорохром монобромобиман. Показано, что у инфертильных пациентов значительно повышено количество свободных тиоловых групп, что коррелирует с нарушениями в ремоделлировании хроматина.

Существенным недостатком данной работы является использование фиксированных клеток, что исключает возможность прижизненной диагностики.

Указанный источник информации выбран в качестве ближайшего аналога.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании тест-системы диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе in vivo.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в доступности его для клиник, не обладающих уникальным оборудованием, обслуживаемым специально подготовленным персоналом, что дает возможность использовать разработанный способ для широкого скрининга населения, представленного группами риска и занятых профессиональной деятельностью на вредных производствах.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе in vivo. Согласно разработанному способу проводят количественное определение в ядрах сперматозоидах тиоловых групп и определение по измеренному значению качества спермы, причем определение тиоловых групп в сперматозоидах проводят путем обработки пробы спермы реагентом MitoTrackerRed, при этом диагностику проводят по количеству окрашенных ядер.

Предпочтительно количественное определение тиоловых групп проводят с использованием цитометрии.

Разработанный способ представляет собой новый метод выявления свободных тиоловых групп в хроматине сперматозоидов. Метод основан на использовании в качестве индикатора SH групп реагента MitoTrackerRed, который применяется для прижизненного окрашивания митохондрий. Установлено, что после проникновения в живые сперматозоиды MitoTrackerRed окисляется и в окисленном виде входит в митохондрии, при этом в митохондриях MitoTrackerRed связывается с тиоловыми группами белков митхондриального матрикса.

Установлено также, что в эякуляте инфертильных пациентов в части живых сперматозоидов MitoTrackerRed окрашивает ядра.

Объяснить этот феномен можно только наличием в ядрах некоторых сперматозоидов свободных тиоловых групп протаминов. Для проверки этого предположения были использованы сперматозоиды, в которых S-S связи были редуцированы с использованием дитиотрсйтола (ДТТ).

После обработки сперматозоидов ДТТ хроматин сперматозоидов декомпактизуется и окрашивается реагентом MitoTrackerRed. Это означает, что MitoTrackerRed, как и в матриксе митохондрий, связывается со свободными тиоловыми группами протаминов.

Суть предлагаемого подхода для создания биомедицинской тест-системы (БМТС) - выявление аномалий дифференцировки сперматозоидов по доступности хроматина для реагента, взаимодействующего со свободными тиоловыми группами протаминов.

Известно, что при созревании сперматозоидов происходит глобальное ремоделирование хроматина, при котором гистоны в комплексе с ДИК практически полностью замещаются протаминами.

Экспериментально было установлено, что в некоторых сперматозоидах инфертильных пациентов наличие свободных тиоловых групп легко тестируется с использованием реагента MitoTrackerRed, который используется для прижизненного окрашивания митохондрий, при этом ядра сперматозоидов, полученных от здоровых доноров, практически не окрашиваются этим реагентом. Разработан метод окрашивания ядер на препаратах живых сперматозоидов и количественное определение доли окрашенных ядер методом цитометрии.

Разработанный способ был реализован следующим образом.

Свежеполученный эякулят инкубировали для разжижения 30 минут при 37°C. Имеющийся объем эякулята (3-5 мл) разбавляли PBS до 10 мл и осаждали сперматозоиды. Здесь и далее для осаждения нефиксированных сперматозоидов использовали центрифугирование при 400g в течение 2 минут. Удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 10 мл PBS и повторно осаждали сперматозоиды.

Удаляли супернатант и ресуспендировали осадок в 1 мл PBS, содержащем 200 нМ Mitotrackcr Red CMXRos (Cat. No. M7512, Invitrogen, США). Инкубировали сперматозоиды в красящем растворе 30 минут при 37°C. Отмывали сперматозоиды от красящего раствора двумя сменами PBS по 5 минут каждая.

Во второй смене PBS сперматозоиды осаждали, удаляли супернатант и ресуспендировали в минимальном объеме PBS (менее 100 мкл). С использованием автоматической пипетки на предметное стекло, покрытое полилизином (Menzel-Glaser, Германия), наносили 10 мкл суспензии сперматозоидов и равномерно распределяли их с использованием мазка. Мазку давали подсохнуть в течение примерно 1 минуты при комнатной температуре (до исчезновения слоя жидкости на стекле).

Стекло с мазком помещали в вертикальные полиэтиленовые контейнеры и инкубировали в 4% растворе формальдегида на PBS в течение 20 минут. Отмывали от фиксатора двумя сменами PBS по 5 минут каждая.

Стекло с мазком извлекали из контейнера и удаляли лишний PBS промакиванием о фильтровальную бумагу. На область мазка наносили 50 мкл синтетической монтировочной среды Mowiol (Calbiochem, США) с добавлением 50 мг/мл Dabco (Sigma, США). Каплю среды накрывали покровным стеклом 24x24 мм (Menzel-Glaser, Германия). Для затвердения монтировочной среды препараты оставляли на ночь при комнатной температуре и в дальнейшем хранили про 14°C в защищенном от света месте.

Контроль окрашенных ядер проводили с использованием микроскопа Zeiss Axiovert 200М, оснащенного флуоресцентной приставкой и камерой Hamamatsu Отса-II HRG-2 (размер пиксела 6,45×6,45 мкм), управляемой программным комплексом AxioVision v 4.3. Съемку на большом увеличении производили с использованием объектива Plan-Apochromat ×100/1.4 (Zeiss, Германия). Диагностируют наличие аномалии дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии, если флуоресценция MitoTrackerRed регистрируют в 25-30% ядер живых сперматозоидов.

Разработанный способ может быть использован в центрах репродукции человека как для увеличения частоты наступления беременности, так и при установлении причины бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой ДНК. Низкая себестоимость метода и его доступность для клиник, не обладающих уникальным оборудованием, обслуживаемым специально подготовленным персоналом, дает возможность использовать тест-систему для широкого скрининга населения РФ, представленного группами риска и занятых профессиональной деятельностью на вредных производствах (нефтедобывающем, горнорудном, химическом, металлургическом и т.д.).

Способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии путем исследования суспензии сперматозоидов в виде мазка, отличающийся тем, что проводят количественное определение в ядрах сперматозоидов тиоловых групп по количеству окрашенных ядер путем обработки пробы спермы реагентом MitoTrackerRed, диагностируют наличие аномалии дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии при окрашивании 25-30% ядер живых сперматозоидов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации.

Изобретение относится к области нанотехнологий и молекулярной биологии. Предложен способ детекции проникновения углеродных нанотрубок (УНТ) в биологическую ткань, геном клеток которой содержит промотор гена теплового шока, сшитый с кодирующей областью дрожжевого транскрипционного фактора Gal4, и генетическую репортерную конструкцию UAS-GFP.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования течения энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) путем обработки сыворотки крови 20% раствором поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000) при объемном соотношении сыворотка: ПВП (1:0,84), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, агрегаты ммЛНП осаждают центрифугированием, декантируют, осадок ммЛНП растворяют в буфере без ПВП, добавляют аутологичные отмытые стандартизованные эритроциты человека, инкубируют в течение 48 часов при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 620 нм, по калибровочному графику определяют степень лизиса и при лизисе более 10% констатируют повышенную литическую активность ммЛНП.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для неинвазивного определения сахара в крови. Для этого осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, при этом в качестве пробы применяют дозу слюны пациента, а в качестве реагента используют первичный конгломерат монореактива Глюкоза-Ново, где глюкозооксидаза дополнительно содержит мутаротазу.

Изобретение относится к поглощающему изделию, выполненному с возможностью определения ионной силы мочи. Изделие включает непроницаемый для жидкости слой; проницаемый для жидкости слой; поглощающий внутренний слой, расположенный между непроницаемым для жидкости слоем и проницаемым для жидкости слоем; устройство с латеральным потоком, интегрированное в изделие и расположенное таким образом, что оно находится в жидкостном соединении с потоком мочи, выделяемой пользователем изделия.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и представляет собой бактериальную клетку, способную реплицироваться в среде, содержащей по меньшей мере один тяжелый металл, выбранный из ртути, кадмия, цинка и свинца.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения кислотной устойчивости эритроцитов. Способ заключается в том, что в пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (трилон Б) из расчета 10 мкл на 2 мл крови.

Группа изобретений относится к медицине и описывает композицию реактивов для измерения количества лития в биологических образцах, отличающуюся тем, что указанная композиция реактивов для измерения количества лития представляет собой водный раствор, содержащий соединение, которое имеет структуру, представленную формулой (I), смешиваемый с водой органический растворитель, выбранный из диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF) и диметилацетамида (DMA), и модификатор pH для доведения pH до значения в диапазоне от pH 5 до pH 12, концентрация соединения формулы (I) составляет от 0,1 до 1,0 г/л.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для количественного определения карнозина в тканях и физиологических жидкостях. Определение карнозина в биологических материалах осуществляют высокоселективным методом масс-спектрометрии с применением электроспрейной ионизации. При этом предварительно осуществляют депротеинизацию плазмы крови с помощью 10% водного раствора трихлоруксусной кислоты. Затем к депротеинизированному образцу добавляют аликвоту раствора внутреннего стандарта L-аланил-карнозина. А разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм с температурой разделения 35°C и скоростью подачи элюента 0,7 мл/мин. Причем в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 3.7, и смесь ацетонитрила с 10 мМ ацетатом аммония в соотношении 90:10, взятые в процентном соотношении 10:90 соответственно. Детектирование карнозина проводят по четырем дочерним ионам с m/z 110.0, 156.1, 180.0, 210.1, образующимся в результате распада молекулярного иона карнозина с m/z 227.1. А концентрацию карнозина рассчитывают по отношению площади хроматографического пика карнозина к площади пика внутреннего стандарта - L-аланил-карнозина. Изобретение обеспечивает высокоселективный и чувствительный хроматомасс-спектрометрический метод количественного определения карнозина в биологических субстратах. 6 ил., 2 табл., 1 пр.

Группа изобретений относится к молекулярной биологии, биофизике, биохимии и биотехнологии и касается способа анализа взаимодействий между молекулами, флуоресцирующими в ультрафиолетовой (УФ) области спектра, включая белки, пептиды, гликопротеины, протеогликаны и другие соединения, последовательность которых содержит один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp), и биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа), при котором анализ взаимодействий производится на основе измерения интенсивности УФ-флуоресценции аминокислотных остатков триптофана. Группа изобретений также касается устройства для осуществления указанного способа анализа в УФ области спектра. Группа изобретений обеспечивает возможность исключения применения флуоресцентных меток для регистрации связывания и обеспечивает анализ взаимодействия биологических молекул с молекулами на биочипе по УФ-флуоресценции природного флуорофора - аминокислотного остатка триптофана. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 пр., 8 ил.
Наверх