Способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка при ее атрофических изменениях


 


Владельцы патента RU 2584750:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики" (НИИМББ) (RU)

Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что в сыворотке крови пациента определяют концентрации пепсиногенов I и II, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. При величине данного отношения, равной или ниже нижней границы нормы, определяют концентрацию интерферона-γ (IFNγ) в супернатанте пробы крови данного пациента после ее инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния (ИВ) РЭА на продукцию IFNγ (ИВ РЭА IFNγ) клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови без ее инкубации с РЭА, и при величине ИВ РЭА IFNγ, равной или ниже 1,2, делают вывод о наличии у пациента дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, а при величине ИВ РЭА IFNγ, превышающей 1,2, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у данного пациента или о наличии у него дисплазии 1-й степени. При использовании для иммуноферментного анализа наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» нижнюю границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II принимают равной трем. Способ позволяет выявить дисплазию (клеточный атипизм) эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени у пациентов, у которых еще не была обнаружена атрофия слизистой оболочки желудка, т.е. предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска пациентов по развитию у них опухолевой патологии желудка и проводить ее профилактику. Способ высокочувствителен, высокоспецифичен, низкоинвазивен. 1 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка.

Дисплазия - нарушение структуры ткани, характеризующееся патологической пролиферацией и атипией эпителия. В слизистой оболочке желудка дисплазия может быть трех степеней: легкая - 1-я степень, умеренная - 2-я степень и тяжелая - 3-я степень

(http://guzood.ru/index.php?what=page&id=10).

Известны способы выявления дисплазии (атипических клеток) эпителия слизистой оболочки желудка при атрофическом гастрите и аденомах, которые относят к предраковым состояниям.

1. Проведение эндоскоцической биопсии, при которой у пациента берут ткань слизистой оболочки желудка, затем биоптат окрашивают и под микроскопом определяют наличие или отсутствие атипичных клеток. Недостатком этого способа является инвазивность, вероятность получения материала из участков без дисплазии, что может привести к ложноотрицательным результатам [Lee SB, Kang HY, Kim KI, Arm DH. The diagnostic accuracy of endoscopic biopsy for gastric dysplasia // J Gastric Cancer. 2010. Vol. 10, №4. - P. 175-181].

2. Определение экспрессии Toll-like рецепторов, являющихся маркерами дисплазии в биоптатах слизистой оболочки желудка. Метод инвазивен и при его осуществлении также имеется вероятность получения материала из участков, не имеющих дисплазии, что может привести к ложноотрицательным результатам [Pimentel-Nunes P1, Afonso L, Lopes Р, Roncon-Albuquerque R Jr, Goncalves N, Henrique R, Moreira-Dias L, Leite-Moreira AF, Dinis-Ribeiro M. Increased expression of toll-like receptors (TLR) 2, 4 and 5 in gastric dysplasia // Pathol Oncol Res. 2011. - Vol. 17, №3. - P. 677-683].

3. Определение провоспалительных цитокинов IL-6, VEGF и C-реактивного белка в сыворотке крови пациентов, по уровню которых можно судить об остроте воспалительного процесса (прототип). Однако этот способ не является специфичным, поскольку многие патологические процессы, в частности воспаления различной локализации, могут приводить к повышению уровней этих цитокинов в сыворотке крови, и многие клетки организма могут быть их источниками: моноциты-макрофаги, лимфоциты, гранулоциты, гепатоциты, кератиноциты, жировые клетки и т.п. [Jang JS, Choi SR, Han SY, Roh MH, Lee JH, Lee SW, Jeung JS, Kim MC, Son YK, Baek YH. Predictive significance of serum IL-6, VEGF, and CRP in gastric adenoma and mucosal carcinoma before endoscopic submucosal dissection // Korean J Gastroenterol. 2009. - Vol. 54, №2. - P. 99-107].

Известно, что информативными маркерами атрофических изменений в теле желудка могут служить уровни пепсиногена I (PG1) и пепсиногена II (PG2) в сыворотке крови и величина отношения уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II [Успенская М.Н., Калиновский В.П., Ткаченко Е.И. Биохимические и иммунологические критерии оценки состояния слизистой оболочки желудка при ее опухолевой и неопухолевой патологии // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53, №3. - С. 304 - 310; Song H.J., Jang S.J., Yun S.C:, et al. Low Levels of Pepsinogen I and Pepsinogen I/II Ratio are Valuable Serologic Markers for Predicting Extensive Gastric Corpus Atrophy in Patients Undergoing Endoscopic Mucosectomy. // Gut Liver. - 2010. - Vol. 4. - №4. - Р. 475-480].

Пепсиногены I и II - функционально неактивные белки-предшественники фермента пепсина, который образуется из них в присутствии соляной кислоты желудочного сока. У здоровых людей количество секретируемого PG1 в три и более раз выше, чем PG2. Хронический атрофический гастрит обнаруживается у 90% больных раком желудка. Поэтому в настоящее время считают, что своевременная диагностика атрофии слизистой оболочки желудка должна стать первым этапом определения риска развития рака желудка. Чувствительность и специфичность количественного анализа пепсиногенов для диагностики атрофического гастрита (в том числе его ранней бессимптомной формы) составляет более 90%, а достоверность получаемых результатов заметно выше, чем при использовании эндоскопии и гистологии (Молчанова А.Р., Сорокина Н.Н., Рукавишников М.Ю. Диагностическая значимость комплексного лабораторного исследования пепсиногенов // Новости «Вектор-Бест», 2010, №2 (56). http://www.vector-best.ru/publ/nvb/n56.pdf).

Раскрытие изобретения

Предлагаемый способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка характеризуется тем, что определяют концентрации пепсиногена I и пепсиногена II в сыворотке крови пациента, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. При величине данного отношения, равной нижней границе нормы или меньше ее, определяют концентрацию интерферона-γ (IFNγ) в супернатанте пробы крови данного пациента после ее инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния (ИВ) РЭА на продукцию IFNγ (ИВ РЭА IFNγ) клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови без ее инкубации с РЭА, и при величине ИВ РЭА IFNγ, равной 1,2 или ниже 1,2, делают вывод о наличии у пациента дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, а при величине ИВ РЭА IFNγ, превышающей 1,2, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у данного пациента или о наличии у него дисплазии 1 степени.

Величина нижней границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II может меняться в зависимости от наборов реагентов, используемых при определении концентраций пепсиногена I и пепсиногена II в сыворотке крови. При использовании для иммуноферментного анализа наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» нижнюю границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II принимают равной трем.

Технические результаты:

1) высокая чувствительность способа выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка: дисплазия 2-й и 3-й степени была выявлена с помощью предлагаемого способа у всех 5 пациентов, у которых после гистологического исследования биоптата была также выявлена дисплазия слизистой оболочки желудка 2-й и 3-й степени - т.е. в 100% случаев;

2) высокая специфичность предлагаемого способа: отсутствие дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка или выявление дисплазии 1-й степени было установлено на основе предлагаемого способа у всех 4-х пациентов, у которых после гистологического исследования биоптата также было установлено либо отсутствие дисплазии, либо дисплазия 1 степени - т.е. в 100% случаев;

3) выявление дисплазии (клеточного атипизма) эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени у пациентов, у которых еще не была обнаружена атрофия эпителия слизистой оболочки желудка, т.е. предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска среди пациентов по развитию у них предрака и/или рака желудка и проводить у них профилактику опухолевой патологии желудка;

4) низкая инвазивность способа, обусловленная взятием крови из пальца или вены пациента (а не биоптата из желудка);

5) отличное качество модели (диагностического способа), определенное с помощью ROC-анализа с расчетом показателя AUC (Area Under Curve) при помощи метода трапеций.

Осуществление способа

Концентрации пепсиногенов I и II в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» согласно методике, приложенной к указанным наборам, и выражают в мкг/л. Затем вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. У пациентов, у которых данное отношение равно 3-м или ниже 3-х, проводят вычисление ИВ РЭА на продукцию клетками крови IFNγ согласно приведенной ниже методике.

Цельную кровь, взятую из вены пациента в количестве 1 мл, помещают в стерильный флакон с 4 мл среды (стерильная питательная среда ДМЕМ), содержащей гепарин 2,5 МЕ/мл и гентамицин 100 мкг/мл. Аккуратно перемешивают содержимое, флакона, затем из него в стерильных условиях забирают две пробы. Одну пробу объемом 0,98 мл помещают в стерильный флакон, содержащий 0,02 мл РЭА (Canceroembryonic Antigen Human Colon Adenocarcinoma Cell Line) производства Calbiochem, Германия, концентрация РЭА составляет 2 мкг/мл.

Другую пробу объемом 0,98 мл помещают также в стерильный флакон, содержащий 0,02 мл питательной среды ДМЕМ (внутренний контроль без РЭА - определение спонтанной продукции IFNγ). Концентрация клеток в пробах и объемы проб в обоих стерильных флаконах одинаковы.

Содержимое флаконов аккуратно перемешивают и помещают в термостат при 37°C на 24 часа. В течение первого часа инкубации содержимое флаконов аккуратно перемешивают 1 раз. После инкубации осаждают клетки крови путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут и отбирают пробы из супернатанта крови, инкубированной с РЭА (продукция IFNγ под влиянием РЭА) и из супернатанта крови, инкубированной без РЭА (спонтанная продукция IFNy). С помощью стандартной тест-системы для определения IFNγ твердофазным иммуноферментным анализом производства ЗАО «Вектор-Бэст» определяют согласно приложенной инструкции концентрацию IFNγ в обеих пробах. ИВ РЭА IFNγ клетками крови вычисляют по формуле: ИВ РЭА=А/Б, где А - концентрация IFNγ в пробе супернатанта крови, после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в пробе супернатанта крови без ее инкубации с РЭА.

Обоснование способа

Было обследовано 24 пациента. Пациенты были взяты в исследование на основании жалоб и в связи с подозрением на развитие у них гастропатологии. Всем пациентам была проведена фиброгастроскопия и гистологическое исследование биоптата, на основании чего был выставлен диагноз, который сравнивался с результатами исследования, полученными с помощью предлагаемого способа.

У 15 пациентов отношение PG1/PG2 было больше 3-х. У этих пациентов при эндоскопии не было обнаружено атрофии слизистой оболочки желудка.

У остальных 9 (из 24) пациентов отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II оказалось ниже 3-х или равным 3-м. В данной группе пациентов ИВ РЭА IFNγ от 0 до 1,20 был обнаружен у 5-ти человек, т.е. у них согласно предлагаемому способу была выявлена дисплазия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени. У этих 5-ти пациентов при эндоскопическом исследовании желудка и гистологическом исследовании биоптатов также была выявлена дисплазия эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, т.е. выявленная по предлагаемому способу дисплазия 2-й или 3-й степени в 100% случаев подтверждалась патогистологическим исследованием.

У остальных 4-х из 9 пациентов ИВ РЭА IFNγ был выше 1,20. У этих 4-х пациентов, т.е. в 100% случаев, в эпителии слизистой оболочки желудка дисплазии не было выявлено либо была выявлена дисплазия 1 степени. Наличие/отсутствие дисцлазии эпителия слизистой оболочки желудка контролировали путем патогистологического исследования биоптатов.

Оценка статистической значимости различий проводилась с использованием точного метода Фишера, р=0,008.

Для получения численного значения клинической значимости предлагаемого способа выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка использовали ROC-анализ с определением показателя AUC (Area Under Curve), который рассчитывали при помощи метода трапеций. О качестве теста судят по экспертной шкале для значений AUC: 0,9-1,0 - отличное качество модели, 0,8-0,9 - очень хорошее качество модели, 0,7-0,8 - хорошее качество модели, 0,6-0,7 - среднее качество модели, 0,5-0,6 - неудовлетворительное качество модели.

Предлагаемый способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка показал отличное качество модели.

Клинические примеры

1. Больная Д., 72 года, у пациентки были признаки патологии желудочно-кишечного тракта.

На основании эндоскопического и гистологического исследований ей был выставлен диагноз - хронический атрофический гастрит. Заключение патоморфолога: дисплазия 0 баллов (нет), согласно действующей классификации ВОЗ-отсутствие интраэпителиальной неоплазии/дисплазии.

При обследовании пациентки в соответствии с предлагаемым способом было обнаружено, что отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II у нее равно 1,4, а ИВ РЭА IFNγ равно 5, что дает возможность сделать вывод об отсутствии у данной пациентки дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка или о наличии у нее дисплазии 1 степени.

2. Б-ная М., 61 год, признаки патологии желудочно-кишечного тракта. На основании эндоскопического и гистологического исследований ей был выставлен диагноз - хронический атрофический гастрит, аденома желудка. Заключение патоморфолога: дисплазия 2-й степени, согласно действующей классификаций ВОЗ-интраэпителиальная неоплазия высокой степени/дисплазия.

При обследовании пациентки в соответствии с предлагаемым способом было обнаружено, что отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II у нее равно 1,7, а ИВ РЭА IFNγ равно 1, что приводит к выводу о наличии у пациентки дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени.

1. Способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка, характеризующийся тем, что определяют концентрации пепсиногена I и пепсиногена II в сыворотке крови пациента, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II; при величине данного отношения, равной нижней границе нормы или меньше ее, определяют концентрацию интерферона-γ (IFNγ) в супернатанте пробы крови данного пациента после ее инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния (ИВ) РЭА на продукцию IFNγ (ИВ РЭА IFNγ) клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови без ее инкубации с РЭА, и при величине ИВ РЭА IFNγ, равной или ниже 1,2, делают вывод о наличии у пациента дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, а при величине ИВ РЭА IFNγ, превышающей 1,2, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у данного пациента или о наличии у него дисплазии 1-й степени.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрации пепсиногена I и пепсиногена II определяют методом иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест», а нижнюю границу нормы для отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II принимают равной 3-м.



 

Похожие патенты:
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса Пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы.
Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для дооперационного прогноза осложненного течения раннего посттрансплантационного периода.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования тяжести течения послеоперационного периода у больных калькулезным холециститом.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и аллергологии, и может быть использовано для прогнозирования развития атопических заболеваний у новорожденных.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи. Разделение типов иммунного ответа на первичный и вторичный осуществляют на основании рассчитанных с помощью ROC-анализа пороговых критериев для IgG1 и IgG3 субклассов по результатам определения количества специфических антител. Определяют субклассы IgG1 и IgG3 с помощью ИФА-анализа. При получении пороговых значений для IgG1<62,76% и для IgG3>18,63% от общего количества противокраснушных IgG-антител диагностируют первичный иммунный ответ. При получении пороговых значений для IgG1>62,76%, и для IgG3<18,63% от общего количества противокраснушных IgG-антител диагностируют вторичный иммунный ответ. Использование данного способа позволяет провести дифференциальную диагностику первичного и вторичного иммунного ответа на вирусы краснухи, позволяющего независимо от способа получения этого иммунитета (вакцинация или инфекция) четко различать первый или повторный контакт организма с вирусом краснухи, что способствует выявлению среди лиц с неизвестным прививочным анамнезом группу первичных больных краснухой. 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиатрии, и может быть использовано при оценке активности туберкулезной инфекции у детей и подростков. Для этого в пробы цельной крови пациента вносят специфические антигены: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридного белка CFP10-ESAT-6. Определяют уровень ИФН-γ в пробах через 72 часа после внесения в кровь специфических антигенов. При увеличении уровня ИФН-γ - положительной реакции на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной - отсутствие изменения уровня ИФН-γ - на гибрид CFP10-ESAT-6 диагностируют латентную туберкулезную инфекцию. При положительной на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и гибрид CFP10-ESAT-6 - активную туберкулезную инфекцию. При положительной на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - поствакцинальную аллергию. Использование данного способа позволяет проводить дифференциальную диагностику латентной и активной туберкулезной инфекции у детей, что способствует ранней постановке диагноза и назначению специфического лечения. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.
Наверх