Способ определения антител к аллогенным hla-g

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения антител к аллогенным HLA-G в сыворотки крови. Для этого используют тест перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента. Проводят анализ субпопуляций мононуклеаров с помощью проточной цитофлуорометрии на связывание моноклональных антител HLA-G и оценивают степень экспрессии HLA-G на опытных и контрольных мононуклеарах донора. При этом значимыми являются субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, по которым рассчитывают коэффициент подавления (КП) в опытной постановке по отношению к контрольной по формуле:

КП HLA-G = ( H L A G О П H L A G К О Н Т ) H L A G К О Н Т × 100,

где HLA-Gоп - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в опытной постановке, %; HLA-Gконт - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в контрольной постановке, %. При этом наличие сенсибилизации к аллогенным HLA-G диагностируют при отрицательном значении КПHLA-G. Использование данного способа позволяет выявлять аллогенную сенсибилизацию к HLA-G с помощью проточной цитофлуориметрии, определяя субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+. 3 пр., 3 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения сенсибилизации организма к антигенам HLA-G.

Известно, что на поверхности практически всех клеток организма представлены молекулы (белки), которые носят название антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигены). Эти молекулы выполняют роль своеобразных "антенн" на поверхности клеток, которые позволяют организму распознавать собственные и чужие клетки (бактерии, вирусы, раковые клетки и т.д.) и при необходимости запускать иммунный ответ, обеспечивающий выработку специфических антител и удаление чужеродного агента из организма. Кроме того, доказана взаимосвязь между HLA-антигенами и предрасположенностью человека к ряду заболеваний, таких как анкилозирующий спондилит, синдром Рейно, сахарный диабет и т.д., а несовместимость супругов по HLA-антигенами и отличие плода от материнского организма является важным моментом, необходимым для сохранения и вынашивания беременности.

Известен способ молекулярно генетического определения HLA-фенотипа с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), при котором очищенную ДНК размещают на рабочей станции PROTRANS в планшет с лиофилизированными праймерами из набора Protrans HLA-А, В, DRBI и Tag полимеразой, осуществляя амплификацию в термоцикле по установленной программе (Пат. 2423524 Рос. Федерация: МПК C12N 15/10. Способ HLA - типирования цельной крови [Текст] / А.Б. Смолянинов, Е.А. Котелевская, С.А. Смирнова и др.; заявитель и правообладатель Смолянинов A.B. (RU), ООО «Покровский банк стволовых клеток» (RU). - №2009149410/10; заяв. 29.12.2009; опубл. 10.07.2011. - Бюл. №19. - 5 с.). Визуализацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза агарозным гелем, подкрашенным бромистым этидием и размещенным в электрофоретической ячейке. Под действием тока молекулы ДНК проходят через гель. По наличию продукта в лунке планшета со специфическими праймерами определяют HLA-генотип.

Недостатком известного способа является то, что он не позволяет достоверно оценить перекрестную совместимость доноров и реципиентов при трансплантации органов, а также прогнозировать вероятность иммунологических репродуктивных потерь в супружеских парах.

Известен способ иммунологического исследования сыворотки крови реципиента для выявления антител к антигенам HLA системы с помощью методики Luminex, при котором в качестве носителя (твердой фазы) используют полистироловые микросферы с интегрированными в их состав двумя флуорофорами и покрытые очищенными рекомбинантными HLA-антигенами (Руководство по диагностическому лабораторному обеспечению трансплантации солидных органов, оригинал документа доступен на сайте: www.beaumont.ie). При наличии в сыворотке антител на поверхности микросферы образуется комплекс АГ-АТ. После добавления к сыворотке коньюгата проводят ее исследование в потоке направляющей жидкости, при этом каждая микросфера подвергается облучению двумя лазерами с разной длиной волны и сигнал, испускаемый флуорофорами, регистрируется датчиками прибора. Таким образом, анализируется одновременно тип микросферы и наличие (концентрация) искомого аналита на соответствующем типе частиц.

Недостатком известного способа является то, что он позволяет проводить идентификацию антител к классическим HLA-антигенам I (А, В и С) и II (DR, DQ) классов и не определяет низко полиморфные молекулы главного комплекса гистосовместимости - HLA-G и HLA-Е.

Надо отметить, что в настоящее время отводится особая роль эмбриональным HLA-антигенам в регуляции иммунитета при репродукции. Молекулы HLA-G и HLA-E презентируют антигены трофобласта γσТ-клеткам, ограничивая иммунный ответ к ним. Кроме того, через взаимодействие HLA-G с киллингингибирующими рецепторами NK-лимфоцитов (CD94+NKG2A+) происходит ингибирование NK-активности, что способствует вынашиванию беременности (Grzywacz М., Gorski В., Jakubowska A. et al. Association between HLA-G01018 allele pregnancy complications // J. Reprod. Immunol. 2003. V. 58. №2. P. 162; King A., Allan D.S., Bowen M. et al. HLA-E expressed on trophoblast and interacts with CD94/NKG2 receptors on decidual NK cells // Eur. J. Immunol. 2000. V. 30. P. 1623-1631; Kovats S., Main E., Librach C. HLA-G expressed in human trophoblast // Science. 1990. V. 248. P. 220-223; Тарбаева Д.А., Кузник Б.И., Загородняя Э.Д., Иозефсон С.А. Функция HLA в репродуктивной системе // Забайкальский медицинский вестник. - 2009. - №1. - с. 6-19). С этих позиций разработка современных методов определения антител в сыворотке крови к HLA-G является актуальной задачей клинической иммунологии.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ оценки перекрестной совместимости (cross-match) донора и реципиента с использованием проточной цитофлуорометрии (The National Histocompatibility And Immunogenetics Service For Solid Organ Transplantation-NHISSOT - 8 издание, Beaumont Hospital, Дублин, Ирландия, 2011). Перекрестную пробу на совместимость проводят путем инкубации лимфоцитов донора, полученных из периферической крови с сывороткой реципиента, после чего выполняют окрашивание клеток флуоресцентными красителями или флюоресцирующими моноклональными антителами. Далее с помощью проточной цитофлуорометрии проводят анализ на наличие антител к HLA-антигенам донора.

Недостатком способа является отсутствие стандартизации при интерпритации полученных данных между разными лабораториями, а также отсутствие рекомендаций по определению антител к аллоНLА-G.

Техническим результатом предложенного изобретения является повышение качества и достоверности определения сенсибилизации донора к аллоНLА-G, за счет определения экспрессии молекул HLA-G на поверхности мононуклеров крови и расчета коэффициента подавления в опытных и контрольных образцах по субпопуляциям CD3+HLA-G+ и CD3-HLA-G+.

Ввиду того, что антитела к HLA-G индуцируются во время беременности и максимально представлены у многорожавших женщин, предложенный способ определения антител к аллоHLA-G исследовали у 13 семейных пар, имеющих двух и более детей, а также не имеющих общих антигенов HLA I и II классов. Соответственно наличие антител к HLA-G исследовали в женской сыворотке крови, а в качестве донаторов аллоНLА-G использовали мононуклеары их супругов (мужей). В качестве контроля принимали образцы мононуклеаров, обработанные отрицательным реагентом, не содержащим антител к HLA-G. Исследование проведено на базе ЗАО «Современные медицинские технологии» г. Кемерово.

Способ осуществляют следующим образом. Для получения мононуклеаров венозную кровь, полученную от мужчины (супруга) в объеме 3 мл, инкубируют в вакутейнере с антикоагулянтом (ЭДТА). А для получения исследуемой сыворотки кровь женщины в объеме 4 мл забирают в вакутейнер с активаторами свертывающей системы.

Кровь, полученную от донора моноклеаров (мужчины), разводят в 2 раза, добавляя 3 мл раствора однократного натрий-фосфатного буфера (PBS). Разведенную венозную кровь в объеме 6 мл переносят в центрифужную пробирку, содержащую 3 мл раствора фиколл-верографина плотностью 1,077. Центрифугирование пробирки (с уравновешиванием), содержащей фиколл-верографин, и разведенную венозную кровь проводят на 500 g, 30 минут при температуре +10°C. По окончании центрифугирования из пробирки отбирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеары, и выполняют их отмывку от раствора фиколл-верографина. Для этого в новую центрифужную пробирку переносят отобранные мононуклеары и добавляют 7 мл однократного PBS, последовательно выполняя пипетирование мононуклеаров и центрифугирование пробирки на 500 g в течение 7 минут при температуре +10°С. После этого надосадочную жидкость удаляют, а процедуру отмывки повторяют еще раз. После последней отмывки мононуклеары разводятся в 1000 мкл однократного PBS - окончательное разведение мононуклеаров.

Кровь от донора сыворотки (женщины) инкубируют в течение 35 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют в течение 30 минут при температуре +10°С на 500 g. Полученную сыворотку отбирают в отдельную пластиковую пробирку в объеме 1,5-2 мл.

Подготовленные мононуклеары донора разносят в четыре разные пробирки по 200 мкл в каждую. В первые две пробирки (1 и 2) к мононуклеарам добавляют по 50 мкл исследуемой сыворотки (опытные образцы), а в последующие две (3 и 4) по 50 мкл однократного PBS (контрольные образцы). Все образцы инкубируют в строго одинаковых условиях при температуре 37°С в течение 30 минут.

Далее выполняют двукратную отмывку мононуклеаров в опытных и контрольных образцах, для чего в каждую пробирку добавляют по 2 мл однократного PBS, мононуклеары пипетируют и центрифугируют на 500 g, 5 минут при температуре 10°С. Надосадочную жидкость удаляют, при этом остаточный объем жидкости не должен превышать 50 мкл.

Для проведения проточной цитофлуорометрии во все четыре пробирки вносят по 5 мкл смеси моноклональных антител с различными флуоресцентными красителями к:

- HLA-G конъюгированных с фикоэритрином (РЕ),

- CD3 с флуорисцеином изотиоцианатом (FITC),

- CD45 конъюгированных с алофикоцианином (АРС).

Далее все четыре пробирки с мононуклеарами инкубируют при 37°С, в течение 30 минут, и осуществляют двухкратную отмывку от не связавшихся моноклональных антител. После этого в каждую пробирку добавляют 200 мкл однократного фиксатора связи моноклональных антител с соответствующими рецепторами на мононуклеарах.

Окрашивание клеток крови через маркер CD45 позволяет выделить лейкоцитарные клетки, а добавление маркера CD3 позволяет дополнительно выделить CD3+ лимфоциты (Т-лимфоциты). Именно на Т-лимфоцитах экспрессируется HLA-G и это позволит увидеть снижение Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-G при наличии антител к ним в опытной постановке по отношению к контрольной.

Проточную цитофлуорометрию мононуклеаров проводят поочередно в опытной постановке по пробиркам 1 и 2 (для дублирования) и контрольной постановке по пробиркам 3 и 4 (для дублирования).

При наличии антител к аллоНLА-G в исследуемой сыворотке во время инкубации образуются иммунные комплексы и дополнительное внесение в опытные образцы моноклональных антител к HLA-G не приведет к специфическому взаимодействию, поскольку молекулы HLA-G уже блокированы сывороточными аллоантителами. Напротив, в контрольных образцах процесс образования иммунных комплексов с моноклональными антителами HLA-G будет идти активно, так как молекулы HLA-G на них свободны.

Для оценки сенсибилизации по HLA-G значимыми являются субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+. Поэтому выявленные при проточной цитофлуорометрии скопления мононуклеаров с маркером CD45 из каждой пробирки дополнительно анализируют по этим двум субпопуляциям.

После снятия результатов для каждой субпопуляции рассчитывают коэффициент подавления (КП) по формуле:

КП HLA-G = ( H L A G О П H L A G К О Н Т ) H L A G К О Н Т × 100,

где HLA-Gоп - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G+ + CD3+HLA-G+) в опытной постановке, %;

HLA-Gконт - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G+ + CD3+HLA-G+) в контрольной постановке, %.

Коэффициент подавления - это процентное снижения удельного веса субпопуляций, экспрессирующих HLA-G, опытной постановки по отношению к таковому в контрольной постановке.

Наличие сенсибилизации к аллогенным HLA-G диагностируют при отрицательном значении КПHLA-G, рассчитанного из соотношения суммарных популяций CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, в опытной и контрольной постановках.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 изображен протокол проточной цитофлуорометрии в контрольной постановке, а на фиг. 2 - протокол в опытной постановке, при этом А и В - точечная диаграмма мононуклеаров с маркером CD45, R2 - гейт мононуклеаров с маркером CD45, Б и Г - выделение монуклеаров по субполяции CD3+HLA-G+ и CD3-HLA-G+.

При проведении перекрестной реакции с исследуемой женской сывороткой, мононуклеарами супруга и моноклональными антителами к HLA-G выявлено достоверно значимое различие между удельным весом HLA-G+ мононуклеаров в опытной и контрольной постановках.

По результатам исследования уровень CD3+HLA-G+ в опытной группе составил 2,33±0,17%, в то время как в контроле он был равен 5,04+0,11% (p<0,05). Относительное количество CD3-HLA-G+ в опытной группе было 0,29±0,11%, в то время как в контроле этот показатель был равен 0,53±0,09% (p<0,05) (таблица 1).

Представленные данные указывают на то, что с помощью предложенного способа в неродственных по HLA семейных парах антитела к HLA-G определяются в 100% случаев.

В исследовании для каждой семейной пары были выявлены средние значения коэффициентов подавления (КП) для субпопуляции CD3+HLA-G+ и для CD3-HLA-G+. Был рассчитан процент отклонения от среднего значения как для максимального значения КП, так и для минимального КП. В таблице 2 представлены значения среднего отклонения для субпопуляций CD3+HLA-G+ и CD3-HLA-G+.

Также указаны данные о максимальном и минимальном отклонении для каждой субпопуляции. Проведенное исследование показало, что воспроизводимость метода для субпопуляции CD3+HLA-G+ составляет 96%, а для субпопуляции CD3-HLA-G+ - 91%.

Ниже представлены примеры реализации предложенного способа.

Представим пример №1 определения антител к аллоНLА-G в семейных парах, имеющих двух детей и неродственных по HLA.

Семейная пара П.А.М. и П.О.И. проходила обследования в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №5-14-631 ж/м). Донором мононуклеаров выступил супруг П.А.М., мужчина, 32 лет. Исследовалась на наличие антител к аллоНLА сыворотка крови женщины (супруги) П.О.И., 25 лет. У данной семейной пары было двое общих детей. По данным клинико-лабораторных исследований оба супруга были здоровы и не имели урогенитальных инфекций. Молекулярно-генетическое типирование локуса HLA-DRB1 выявило, что у мужчины был генотип HLA-DRB1*11,13; а у женщины - HLA-DRB1*01,17. В данной семейной паре общих аллелей не обнаружено.

Кроме того, проведено типирование гена HLA-G на полиморфизм HLA-G 3′UTR 14 bp - делеция / 14 bp - инсерция. Наборы разработаны в лаборатории фармакогеномики (зав. лаб. - к.б.н. М.Л. Филиппенко) НИИХБФМ СО РАН (директор - академик В.В. Власов). Результаты генотипирования представлены на рисунке 1 (женщина П.О.И., дорожка на электрофорезе №3207; супруг П.А.М., дорожка на электрофорезе №3206). Как видно из рисунка, женщина имеет делецию в гомозиготном состоянии в гене HLA-G, а муж имеет гетерозиготное носительство делеции и инсерции. Тем самым их генотипы HLA-G не схожи.

В сыворотке крови женщины проведено исследование антител к аллоНLА-G, экспрессированных на мононуклеарах мужчины. В ходе проведенного исследования получены результаты, на основании которых был рассчитан коэффициент подавления (КПHLA-G), согласно вышеописанной формуле:

КПHLA-G=(((CD3+HLA-G+оп+CD3-HLA-G+оп)-(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))/(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))*100=(((4,07%+3,11%)-(5,26%+4,22%))(5,26%+4,22%))*100=-24,26%.

Тем самым, на основании полученного отрицательного КПHLA-G можно документировать наличие антител к аллоНLА-G супруга.

Пример 2. Семейная пара Н.О.С и Н.Е.В. проходила прегравидарную подготовку в ЗАО «Современные медицинские технологии» на этапе планирования беременности (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №5-14-983/ж). Клиническое обследование показало, что женщина Н.О.С (34 лет) не имеет хронической соматической и генитальной патологии. Обследование на заболевания, передающиеся половым путем, не выявило инфекций. Было проведено молекулярно-генетическое типирование гена HLA-DRB1 коммерческими наборами НПФ «ДНК-технология» (г. Москва). Выявлено, что у женщины обнаружен генотип HLA-DRB1*14,15.

Мужчина Н.Е.В., 35 лет, также не имеет трансплацентарных и урогенильных инфекций, осмотрен терапевтом и урологом. Диагноз - здоров. Молекулярно-генетическое типирование локуса HLA-DRB1 выявило у него следующий генотип HLA-DRB1*04,10.

Проведено типирование гена HLA-G на полиморфизм HLA-G 3′UTR 14 bp - делеция / 14 bp - инсерция. Результаты представлены на рисунке 1 (женщина Н.О.С., дорожка на электрофорезе №3209; супруг Н.Е.В., дорожка на электрофорезе №3208). Как видно из рисунка, женщина имеет делецию в гомозиготном состоянии в гене HLA-G, а муж имеет гетерозиготное носительство делеции и инсерции. Это показывает, что их генотипы HLA-G не схожи.

Тем самым в семейной паре в целом - общих HLA аллелей не обнаружено.

В сыворотке крови женщины проведено исследование антител к аллоНLА-G, экспрессированных на мононуклеарах мужчины. В ходе проведенного исследования получены результаты, на основании которых был рассчитан коэффициент подавления (КПHLA-G), согласно вышеописанной формуле:

КПHLA-G=(((CD3+HLA-G+оп+CD3-HLA-G+оп)-(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))/(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))*100=(((2,11%+3,21%)-(4,33%+5,02%))(4,33%+5,02%))*100=-43,11%.

Тем самым, на основании полученного отрицательного КПHLA-G можно документировать наличие антител к аллоНLА-G супруга.

В качестве примера, где антител к HLA-G не должно быть, представляем исследования сыворотки крови двух близнецов.

Пример №3. Донор X. (№1), 21 год мужчина проходил лабораторное обследование в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №3-14-711). Донор С. (№2), 21 год (брат-близнец донора №1), также проходил лабораторное обследование в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №3-14-712). Обоим донорам было проведено молекулярно-генетическое типирование гена HLA-DRB1 коммерческими наборами НПФ «ДНК-технология» (г. Москва). Выявлено, что у донора №1 и донора №2 общий генотип HLA-DRB1*15,16.

Проведено типирование гена HLA-G на полиморфизм HLA-G 3′UTR 14 bp - делеция / 14 bp - инсерция. Результаты представлены на рисунке 1 (донор X., дорожка на электрофорезе №3210; донор С, дорожка на электрофорезе №3211). Как видно из рисунка, оба донора (брата) имеют и делецию, и инсерцию. Тем самым их генотипы HLA-G схожи.

При проведении исследований антител к аллоНLА-G были получены следующие результаты.

Используя известную формулу, выявили следующие коэффициенты для пары (I) «мононуклеары донора №2 - сыворотка донора №1», и наоборот - (II) «мононуклеары донора №1 - сыворотка донора №2»:

(I) КПHLA-G=(((CD3+HLA-G+оп+CD3-HLA-G+оп)-(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))/(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))*100=(((3,23%+3,71%)-(3,21%+3,59%))(3,21%+3,59%))*100=+2,05%.

(II) КПHLA-G=(((CD3+HLA-G+оп+CD3-HLA-G+оп)-(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))/(CD3+HLA-G+конт+CD3-HLA-G+конт))*100=(((3,45%+3,58%)-(3,44%+3,36%))(3,44%+3,36%))*100=+3,38%.

Тем самым, по всем коэффициентам, рассчитанных для определения антител к аллоHLA-G в сыворотке крови донор №1 на мононуклеары донора №2 и, наоборот, в сыворотке крови донора №2 - к мононуклеарам донора №1 были получены положительные коэффициенты. Это указывает на то, что в сыворотках отсутствуют антитела к аллоHLА-G и они не блокируют соответствующие молекулы. Поэтому субпопуляции контрольных и опытных постановок были сопоставимы, более того в опытных пробах удельный вес субпопуляций, экспрессирующих HLA-G, было больше чем в контроле. Эти данные вполне справедливы, так как выбранные доноры были братья-близнецы, имели общий HLA-генотип и не могли сенсибилизировать друг друга по антигенам тканевой совместимости. Факт общности доноров по HLA был документирован молекулярно-генетическим типированием на коммерческих наборах НПФ «ДНК-технологии» и наборами НИИХБФМ СО РАН.

Метод исследования является скрининговым и достаточно специфичным для лабораторных исследований сенсибилизации к аллогенным HLA-G, что можно использовать при обследовании супругов, для диагностики иммунных причин репродуктивных потерь.

Предлагаемый способ является нетрудоемким, и может быть использован в клинико-диагностических лабораториях. Показана 100% эффективность и 91% воспроизводимость метода.

Способ определения антител к аллогенным HLA-G, включающий выполнение теста перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента, анализ субпопуляций мононуклеаров с помощью проточной цитофлуорометрии на связывание моноклональных антител HLA-G, отличающийся тем, что дополнительно оценивают степень экспрессии HLA-G на опытных и контрольных мононуклеарах донора, при этом значимыми являются субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, по которым рассчитывают коэффициент подавления (КП) в опытной постановке по отношению к контрольной по формуле:
КП HLA-G = ( H L A G О П H L A G К О Н Т ) H L A G К О Н Т × 100,
где HLA-Gоп - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в опытной постановке, %;
HLA-Gконт - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в контрольной постановке, %,
при этом наличие сенсибилизации к аллогенным HLA-G диагностируют при отрицательном значении КПHLA-G, рассчитанного из соотношения суммарных популяций CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, в опытной и контрольной постановках.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Для этого используют бруцеллин для специфической активации лимфоцитов.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики нагноившейся постнекротической псевдокисты поджелудочной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики наследственной оптической нейропатии (НОН). Для этого проводят клинические и цитологические исследования и дополнительно из кожи пациента получают культуру фибробластов плотностью 5000-10000 клеток на см2, окрашивают митохондриальным потенциалзависимым флюоресцентным красителем TMRE до конечной концентрации 25 нМ.

Изобретение относится к медицине и описывает хемилюминесцентный реактив для определения присутствия и/или количества анализируемого вещества в образце с предполагаемым содержанием анализируемого вещества, при этом реактив является недисперсным и растворимым в водной среде и содержит партнера по связыванию для анализируемого вещества и хемилюминесцентную композицию, содержащую олефиновое соединение и хелат металла, где олефиновое соединение является соединением, которое способно реагировать с синглетным кислородом присоединением 2+2 с образованием диоксетана или которое способно реагировать с синглетным кислородом с циклоприсоединением 4+2 с диенами, и где металл или хелат металла представляет собой редкоземельный металл или металл Группы VIII, и где металл координирован с двумя или более атомами той же молекулы или хелирующего агента, где два или более атомов выбраны из группы, состоящей из кислорода, азота и серы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для определения еx-vivo эффективности лечения рака. Для этого после введения одной или более доз иммуногенной композиции субъекту измеряют уровень активированных Т-лимфоцитов (CD3+ CD69+) в организме.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Изобретение касается способа определения биологической активности эмбрионированных яиц Trichuris. Охарактеризованный способ включает осуществление по меньшей мере 3-х анализов, выбранных из: - оценки и/или подтверждения стадии эмбрионального развития яиц с помощью метода количественной ПЦР с использованием пригодных маркерных последовательностей для определения количества копий геномной ДНК, - оценки метаболической активности эмбрионированных яиц с помощью биохимических и/или молекулярно-биологических методов, - оценки индуцибельности генной экспрессии в эмбрионированных яйцах, - оценки подвижности личинок Trichurs с помощью микроскопа в течение продолжительных периодов наблюдения после предварительной инкубации при повышенных температурах и/или - оценки коэффициента вылупляемости личинок Trichuris в организме лабораторного животного.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска сердечно-сосудистой летальности у пациентов с постинфарктной хронической сердечной недостаточностью, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива угрожающего выкидыша. Для этого проводят иммунологическое исследование периферической венозной крови в 7-12 недель гестации у женщин с угрозой невынашивания беременности. После проведенного лечения угрозы прерывания беременности определяют относительное содержание CD45RA-CD62L- в популяции CD8+ лимфоцитов. При его значении более 23,9% прогнозируют возникновение угрожающего выкидыша во втором триместре у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет прогнозировать рецидив угрожающего выкидыша во втором триместре гестации, что позволит выбрать правильную тактику ведения беременной женщины, позволит снизить частоту данного осложнения. 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для контроля эффективности облучения донорской крови. Способ включает постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов. Постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови. После чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как Эоб=Сднтло-Сднтлк, где Эоб - эффективность облучения, Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови), Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови). При разнице с контролем более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента. Использование данного способа позволяет определять эффективность облучения донорской крови методом проточной цитометрии.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и позволяет прогнозировать угрожающий поздний выкидыш у беременных женщин. Для этого в сроке 5-12 недель гестации определяют относительное количество CD178+ моноцитов гестации в периферической венозной крови. При его значении равном 37,7% или менее в моноцитарном гейте прогнозируют угрожающий поздний выкидыш у женщин с угрозой прерывания беременности ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет выбрать правильную тактику ведения беременности, провести комплекс лечебно-профилактических мероприятий и снизить риск развития осложнений и неблагоприятных исходов беременности в группе женщин с высоким риском невынашивания беременности. 3 пр., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается выбора тактики ведения беременных с плацентарной недостаточностью и синдромом задержки роста плода (СЗРП). Для этого у пациенток с фетоплацентарной недостаточностью и ЗРП в сыворотке крови иммуноферментным методом определяют активность супероксиддисмутазы, содержание фактора роста плаценты, эндоглина и мелатонина. По этим показателям рассчитывают прогностический коэффициент П по формуле: П=(0,0001*COD+0,0255*Mel+0,1636*CD105+(-0,0487*PGF)-8,5389, где COD - супероксиддисмутаза, пг/мл, Mel - мелатонин, пг/мл, CD 105 - эндоглин, пг/мл, PGF - фактор роста плаценты, пг/мл. При величине П равной 0,64 и более прогнозируют высокий риск развития критического состояния плода в антенатальном периоде, что требует завершения беременности путем операции кесарево сечение в экстренном порядке в интересах плода. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования критического состояния плода антенатально, что позволяет своевременно выбрать адекватную тактику ведения пациентки. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к отоларингологии, и может быть использовано для дифференциальной экспресс-диагностики острых вирусных и бактериальных тонзиллитов у взрослых. Для этого проводят забор периферической крови и определяют относительное содержание субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов, одновременно экспрессирующих CD16, CD11b на поверхностной мембране. Принимают за норму наличие субпопуляции CD16brightCD11bdimНГ% от 80 и до 99,9% с высокой плотностью экспрессии CD16 и низкой плотностью экспрессии CD11b. При условии выявления субпопуляции CD16brightCD11bbrightНГ или CD16dimCD11bbrightНГ в количестве от 40% и более определяют соответственно острую вирусную инфекцию или острую бактериальную инфекцию. Использование данного способа позволяет обеспечить точность дифференциальной диагностики острых вирусных и бактериальных тонзиллитов у взрослых. 3 пр., 1 табл.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных. Характеризуется использованием как минимум пяти иммунохроматографических стрип-тестов, размещенных в едином корпусе. При этом в первом и втором каналах корпуса устройства находятся стрип-тесты для выявления токсинов, в третьем канале - стрип-тест для выявления вегетативных форм бактерий, в четвертом - споровых форм бактерий, а в пятом - стрип-тест для выявления питательной среды культивирования вирусов и риккетсий. Тестирование ведут путем укладки корпуса иммунохроматических стрип-тестов в теплоизолирующий цефленовый пакет, состоящий из двух слоев цефлена, с теплоизолирующей прокладкой из пористого теплоизолирующего материала между ними, а корпус иммунохроматографических стрип-тестов внутри пакета нагревают источником постоянного тепла, причем отверстие пакета закрывают механическим зажимом и считают этот момент началом тестирования. Также предложено устройство для иммунохроматографического анализа. Группа изобретений позволяет увеличить производительность иммунохроматографического анализа, расширить температурный диапазон иммунохроматографического анализа от минус 20 до плюс 50°C, сократить время получения результата до 10 мин по сравнению с анализом при комнатной температуре (20 мин), при условии достижения одинаковой чувствительности, повысить чувствительность анализа по сравнению с анализом, проводимым при комнатной температуре. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 8 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для ранней диагностики и мониторинга заболевания у субъекта с использованием циркулирующих тканевых макрофагов. Способ включает этапы: a) обеспечения биологического образца для тестирования от указанного субъекта, причем указанный образец содержит циркулирующие тканевые макрофаги (СТМ); b) окрашивания указанных СТМ с использованием панели дифференциально меченых различных антител против опорных маркеров CD14, CD16, CD300e, CD36 и HLADR с целью идентификации и подсчета различных субпопуляций СТМ; c) фиксации, пермеабилизации и окрашивания СТМ с использованием одного или нескольких антител для обнаружения против одного или более эпитопов по меньшей мере одного протеазо-индуцированного фрагмента белка, полученного в результате внутриклеточной деградации не принадлежащего СТМ белка, отдельными СТМ в тканях, из которых они происходят, тем самым идентифицируя по меньшей мере одну субпопуляцию циркулирующих тканеспецифических макрофагов (CTSM). Далее проводят анализ с применением многопараметрической проточной цитометрии указанных окрашенных СТМ и CTSM путем селективного пропускания по опорным маркерам CD14, CD16, CD300e, CD36 и HLADR с целью определения количества сигналов каждого определенного меченого антитела, связанного с отдельными клетками. Определяют относительное и абсолютное количество отдельных клеток в каждой субпопуляции СТМ и каждой специфической субпопуляции CTSM, экспрессирующих каждый из измеренных внутриклеточных эпитопов. Расчет относительного и абсолютного количества клеток проводят в каждой субпопуляции СТМ и каждой специфической субпопуляции CTSM, каждое из которых происходит из различных нормальных и измененных тканей, что определяют с помощью оцениваемого набора отдельных протеазо-индуцированных фрагментов белка. Проводят определение количества связанного с антителами сигнала, ассоциированного с каждым отдельным оцениваемым внутриклеточным пептидом, с целью получения профиля окрашивания CTSM. А также сравнивают тестируемый профиль окрашивания CTSM с нормальным профилем окрашивания CTSM для каждой оцениваемой ткани, причем повышенное количество CTSM свидетельствует о наличии заболевания. Группа изобретений относится также к набору для ранней диагностики и мониторинга заболевания у субъекта с использованием циркулирующих тканевых макрофагов. Использование данной группы изобретений позволяет проводить раннюю диагностику и мониторинг заболевания у субъекта с использованием циркулирующих тканевых макрофагов по опорным маркерам CD14, CD16, CD300e, CD36 и HLADR. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 7 ил.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для детекции маркеров заболеваний. Для этого создают суспензионные микрочипы путем оптического кодирования микросфер различного диаметра флуоресцентными красителями с их последующим конъюгированием с биологическими распознающими молекулами. Создают детектирующие компоненты путем конъюгирования биологических детектирующих молекул с флуоресцентными красителями. Для оптического кодирования микросфер различного диаметра используют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы, которые наносят послойно на поверхность микросфер. При этом слой полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов одного цвета пространственно отделяют от соседнего слоя полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов другого цвета тремя и более слоями полиэлектролитов. Для формирования внешнего слоя полиэлектролита используют полимер, включающий функциональные группы для специфического и/или ориентированного конъюгирования биологических распознающих молекул. Для маркирования биологических детектирующих молекул используют флуоресцентные красители, возбуждаемые на одной длине волны с используемыми полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами. Изобретение позволяет создать тест-системы, позволяющие детектировать и количественно определять множество различных белковых маркеров, например онкологических заболеваний женской репродуктивной системы, методами проточной цитометрии на стандартных проточных цитометрах. 21 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и представляет собой способ определения в одной постановке цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале - кале, в смывах объектов окружающей среды и в почве, заключающийся в подготовке пробы, внесении в пробу иммуномагнитных частиц, иммунохимическом связывании, в результате чего образуются агрегаты цист и ооцист с магнитными частицами, улавливании агрегатов цист и ооцист в магнитном поле, отмывке зафиксированных агрегатов цист и ооцист буферным раствором, диссоциации меркаптоэтанолом или соляной кислотой, разделении цист, ооцист и магнитных частиц в магнитном поле, переносе выделенных цист и ооцист на предметное стекло для последующего иммунофлуоресцентного мечения и последующей оценки микроскопированием с применением насадки «Опти-Люм» на микроскоп, где результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных от 8 до 14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты же криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями. Изобретение обеспечивает повышение эффективности определения в одной постановке цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале - кале, в смывах с овощей и объектов окружающей среды, в почве и сокращение временных затрат на исследование одной пробы исследуемого материала адаптированным до 15 минут. 7 пр., 7 табл., 1 ил.

Изобретение относится к новым соединениям N,N'-диэтил-N,N'-ди(2-бром-4-R-фенил)амидам 2,2'-бипиридил-6,6'-дикарбоновой кислоты и 6,6'-диэтил-9,9'-диR-3,3'-дибензо[ƒ]-1,7-нафтиридин-5,5'(6H,6'H)-дионам формулы (1) и (2) соответственно: .Изобретение также относится к способу их получения. Технический результат – получены новые соединения, которые могут найти применение в качестве органических лигандов для комплексообразования с ионами f-элементов, что может быть использовано во времяразрешенном иммунофлуоресцентном и других видах флуоресцентного анализа. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 25 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения антител к аллогенным HLA-G в сыворотки крови. Для этого используют тест перекрестной совместимости мононуклеаров донора с сывороткой реципиента. Проводят анализ субпопуляций мононуклеаров с помощью проточной цитофлуорометрии на связывание моноклональных антител HLA-G и оценивают степень экспрессии HLA-G на опытных и контрольных мононуклеарах донора. При этом значимыми являются субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, по которым рассчитывают коэффициент подавления в опытной постановке по отношению к контрольной по формуле:КПHLA-GHLA−GКОНТ×100,где HLA-Gоп - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: в опытной постановке, ; HLA-Gконт - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: в контрольной постановке, . При этом наличие сенсибилизации к аллогенным HLA-G диагностируют при отрицательном значении КПHLA-G. Использование данного способа позволяет выявлять аллогенную сенсибилизацию к HLA-G с помощью проточной цитофлуориметрии, определяя субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+. 3 пр., 3 ил., 2 табл.

Наверх