Способ очистки трипторелина


 

C07K1/20 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2585105:

Индивидуальный предприниматель Михайлов Олег Ростиславович (RU)

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины. Способ очистки трипторелина, заключающийся в том, что растворяют трипторелин в 0,6% водном растворе уксусной кислоты, фильтруют методом ультрафильтрации, к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя градиентное элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК), затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 5% ИПС и 0,25% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием. Техническим результатом является высокий выход и чистота субстанции, которая имеет высокую биодоступность и может использоваться для получения медицинских препаратов.

 

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины.

Распространенным методом лечения ряда заболеваний в настоящее время является гормонотерапия - метод лечения, предполагающий воздействие с помощью гормонов или антигормонов.

Одним из хорошо исследованных и широко применяемых аналогов гонадотропин рилизинг-гормона, используемых для медикаментозной терапии, является Трипторелин (Triptorelin, Triptorelin pamoate, Triptorelin acetate) - противоопухолевый препарат, синтетический аналог гонадотропин-рилизинг гормона.

Трипторелин оказывает антигонадотропное, противоопухолевое, цитостатическое действие и используется при эндометриозе, миоме матки (для уменьшения размеров перед хирургическим удалением), в симптоматическом лечении прогрессирующего гормонозависимого рака предстательной железы (альтернатива хирургической кастрации, для подавления секреции тестостерона), раннем половом созревании, программе экстракорпорального оплодотворения, гипогонадотропной аменорее.

Для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты. Поэтому исследователи в данной области большое внимание уделяют разработке новых эффективных способов очистки гормональных препаратов.

Известен способ синтеза трипторелина, который описан в патенте US 4301066, опубл. 1981-11-17. Предпочтительный способ очистки согласно данному источнику включает следующие шаги. Декапептиды, полученные из реакции, обрабатывают раствором гидроксида аммония в водном метаноле и раствор выпаривают. Остаток помещают затем на колонку с силикагелем, используя раствор хлороформ-метанол-уксусная кислота в качестве элюанта. Очищенная фракция декапептидов подвергается другой хроматографии с использованием карбоксиметилцеллюлозы и буферного градиента водного ацетата аммония.

Заявка CN 103122023 А, 2013.05.29 описывает двустадийный метод очистки трипторелина. Метод включает в себя следующие шаги: растворение образца с использованием водного раствора, содержащего органические растворители, и проведение градиентного элюирования на образец, используя октадецилсилан химически связанного кремнезема в качестве неподвижной фазы, в качестве буфера солей фосфорной кислоты или серной кислоты в качестве фазы А, с ацетонитрилом в качестве фазы В; затем преобразование трипторелин фосфатов в ацетаты с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и сублимационную сушку полученных ацетатов, так что трипторелин ацетат с чистотой более чем 99,7%. Способ обеспечивает процесс очистки с низкой себестоимостью, высоким выходом, простой в технологическом процессе, уменьшением примесей.

В качестве ближайшего аналога может быть указан патент CN 103012564 В, 2013.11.13, который касается высокоочищенного трипторелина и способа его очистки. Способ включает следующие шаги: (а) растворение трипторелина, фильтрацию; (b) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, элюирование с подвижной фазой, преобразование трипторелина в соль и сбор основного пика элюата; (с) нагрузку элюата, полученного на этапе (b), на колонку из силикагеля, элюирование с подвижной фазой, собирая основной пик элюата, и удаление растворителя. Метод имеет высокий выход, стабильное качество продукции и низкую себестоимость.

Задача изобретения состоит в разработке нового оптимизированного способа очистки трипторелина.

Задача решается способом очистки трипторелина, включающим растворение трипторелина в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, фильтрование методом ультрафильтрации, добавление к раствору изопропилового спирта до концентрации 2% по объему и перемешивания, проведение жидкостной хроматографии низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0,2-2% УК до 8-15% ИПС+0, 2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0, 2-2%УК, проведение ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0, 2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

Технический результат: получение желаемого конечного продукта с высокими выходами, селективностью и степенью чистоты.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Растворение и фильтрование трипторелина-сырца

Готовят раствор «0,6% уксусной кислоты (УК)».

Растворяют трипторелин-сырец в «0,6% УК» из расчета 1,0 л на 100 г трипторелина-сырца.

В ходе растворения следует периодически измерять с помощью индикаторной бумаги рН раствора сырца. В случае если значение рН выше 5, следует понизить его, добавляя уксусную кислоту.

Образовавшийся в результате раствор фильтруют через стеклянный фильтр пор. 3. Закрытую емкость с отфильтрованным раствором убирают в холодильник на ночь.

Если после фильтрации и отстаивания в растворе образовался осадок, раствор подвергают осветлению на установке проточной ультрафильтрации «Pellicon» с мембранами 100 кДа.

К отфильтрованному раствору добавляют изопропиловый спирт (ИПС) до концентрации 2% по объему и тщательно перемешивают.

2. Предварительная очистка трипторелина-сырца с помощью жидкостной хроматографии низкого давления ЖХ НД на колонне с LPS-500

Уравновешивание колонны

Уравновешивают колонну с сорбентом LPS-500 до стабилизации базовой линии «2,0% ИПС и 0,6% УК».

Наносят раствор трипторелина-сырца на колонну с LPS-500 из расчета 20-70 г трипторелина-сырца на 1 л упакованного сорбента.

Элюция трипторелина с колонны LPS-500.

Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объемов колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК.

Объединенные фракции после предварительной очистки на LPS-500 подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонне, упакованной полиакрильным сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил (Сульфопропильные группы на сшитом полиакрилате).

3. Ионообменная хроматография низкого давления на колонне упакованной СПС-био

Уравновешивают колонну с сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил до стабилизации рН раствором «0,6% УК».

Наносят «раствор после предварительной очистки на LPS-500» на колонну с СПС-Био SP Сульфопропил из расчета 20-30 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.

Элюция трипторелина с колонны СПС-Био SP Сульфопропил.

Линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония

Объединенные фракции после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил подвергают дальнейшей очистке с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонне Kromasil С18.

4. Очистка трипторелина с помощью ВЭЖХ на колонне с Kromasil

Уравновешивание колонны.

Уравновешивают колонну с сорбентом Kromasil С18 до стабилизации базовой линии раствором «3% ИПС+0,25% УК».

К «раствору после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил» добавляют до 3% ИПС и подкисляют уксусной кислотой до рН=5.

Загружают полученный раствор на колонну с Kromasil С18 из расчета 4-7 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.

Элюируют трипторелин с колонны Kromasil «5% ИПС+0,25% УК».

Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

Ниже приведен конкретный пример осуществления очистки.

850 г трипторелина-сырца (чистота 18% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза трипторелина, содержащего 150 г целевого пептида перемешивают в 10 л 0,6% раствора уксусной кислоты в течение 8 часов и оставляют на 8 часов для отстаивания.

Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 0,5 л 0,6% раствором уксусной кислоты. К фильтрату добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% и наносят на колонну 200X500 мм, заполненную сополимером стирола с дивинилбензолом марки LPS-500 с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную раствором 2% ИПС+0,6%УК. Проводят градиентное элюирование: Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объема колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 40%. Выход трипторелина на стадии предварительной очистки составляет 85%.

Полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне 150×300 мм, упакованной СПС-Био SP Сульфопропил с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную 0,6% водным раствором уксусной кислоты. Проводят градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 60%. Выход трипторелина на стадии ионообменной хроматографии составляет 95%.

Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 л (со скоростью 200 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Kromasil С18 10 мкм 100А и уравновешенную буфером, представляющим собой водный раствор, содержащий 3% изопропилового спирта и 0,25% уксусной кислоты. Элюируют трипторелин водным раствором, содержащим 5% ИПС+0,25% УК, затем регенерируют сорбент водным раствором, содержащим 15% ИПС+0,25% УК и уравновешивают водным раствором, содержащим 3% ИПС+0,25% УК. Скорость элюирования 200 мл/мин. Детектирование ведут по УФ поглощению при 254 нм. Фракции собирают объемом не более 1 л. Чистоту фракций контролируют по аналитической ВЭЖХ.

Фракции с содержанием трипторелина более 98% объединяют, упаривают на роторном испарителе в 2 раза и концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируя смесью 25% ИПС+0,25% УК. Элюат собирают и упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Получают 104 г лиофильно высушенного продукта.

Степень очистки более 99,8%.

Биодоступность при в/м введении - 45,8%, при и/к - 76%. В интервале месяц повторные инъекции не вызывают повышения концентрации. Распределение по органам и тканям заканчивается через 4 ч, объем распределения - 104 л. Т1/2 - 7.6 ч. Плазменный клиренс - 161.5 мл/мин, двухфазный.

Способ очистки трипторелина, включающий растворение трипторелина, фильтрование и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что трипторелин растворяют в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, после фильтрования методом ультрафильтрации к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сорбентом, представляющим собой сферический полистирол, сшитый дивинилбензолом марки LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0, 2-2% УК до 8-15% ИПС+0,2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0,2-2% УК, затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфопропильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0,2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих.

Изобретение относится к способу получения дегареликса. Предложен постадийный синтез дегареликса, содержащего 0,3% по массе или менее аналога 4-([2-(5-гидантоил)]ацетиламино)-фенилаланина, на твердой подложке, содержащей аминогруппу, который включает стадии: обеспечение раствора аминокислоты или пептида, где α-аминогруппа защищена флуоренилметилоксикарбонильной группой (Fmoc); приведение подложки в контакт с этим раствором в присутствии реагента для образования пептидной связи между карбоксильной группой аминокислоты или пептида и твердой подложкой, содержащей аминогруппу, связанную с этой подложкой; удаление Fmoc путем приведения подложки в контакт с органическим основанием, в частности пиперидином, в органическом растворителе.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается фармацевтических форм для введения с замедленным высвобождением, содержащим, по меньшей мере, один фармакологически активный пептид.

Изобретение относится к пептидам-антагонистам GnRH, имеющим формулу: X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10, и их фармацевтически приемлемым солям, где Х = ацильная группа, имеющая более 7 атомов углерода; А = 4Cl или 4F; Хаа5 представляет собой Арh(Q1) или Аmf(Q1), где Q1 представляет собой Q или где Q представляет собой и где R представляет собой Н или низший алкил; Хаа6 представляет собой D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Cit или D-Pal, где Q2 представляет собой Аc или Q1; Xaa8 представляет собой Lys(ipr); и Хаа10 представляет собой D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2 или Ala-NH2, при условии, что, если Хаа5 содержит Q, Хаа6 также содержит Q; фармацевтической композиции для ингибирования секреции гонадотропинов у млекопитающих, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество антагониста по GnRH; способу ингибирования секреции гонадотропинов у млекопитающих и соединению X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser (X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys (ipr)(X4)-Pro-X5, гдe Х1 = -аминозащитная группа; А = 4Сl или 4F; Х2 = Н или гидроксизащитная группа; Хаа5 представляет собой Aph(Q1) или Amf(Q1), где Q1 = структуры I и II, или карбамоил, или метилкарбамоил; Хаа6 = D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) или D-Pal, где Q2 = Ас; X4 представляет собой восприимчивую к действию кислоты аминозащитную группу; и Х5 представляет собой D-Ala-, Gly-, Аlа-[полимерный носитель], N(Et)-[полимерный носитель], амид D-Ala, Gly или Аlа; или этиламид, являющемуся промежуточным соединением для получения пептида-антагониста GnRH.

Изобретение относится к вакцинному препарату модифицированного тандем-ЛГВГ-пептида. .

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской промышленности. Предложен способ получения террилитина.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу выделения очищенного концентрата тромбина. Способ получения концентрата тромбин, свободного от вирусов, заключающийся в криофракционировании свежезамороженной плазмы донорской крови человека, выделении протромбинового комплекса на анионообменном сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow, активации протромбина раствором СаСl2 в составе протромбинового комплекса с получением тромбина, вирусной инактивации сольвент-детергентным методом и очистке полученного тромбина на катионообменном сорбенте Fractogel EMD-SO3 с последующей стерильной фильтрацией и лиофилизацией.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению антител, и может быть использовано для снижения гетерогенности антител во время культивирования.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к сконструированным полипептидам со связывающей сывороточный альбумин аффинностью, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к однореакторному способу приготовления Микафунгина. Способ включает в себя ацилирование пептидного ядра Микафунгина без изолирования активированной боковой цепи Микафунгина из ее реакционной смеси.

Изобретение относится к области пептидной и фармацевтической химии, конкретно к способу получения HPyr-His-TrpOH (I), используемого в качестве ключевого полупродукта (1-3 фрагмента) при синтезе синтетических агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона, LH-RH (ЛГ-РГ).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Способ улучшения производительности вирусного фильтра во время очистки белков предусматривает обработку композиции, содержащей белок, подлежащий очистке, на стадии катионного обмена и на стадии удаления эндотоксинов, одновременно или в любом порядке, перед пропусканием через указанный вирусный фильтр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очистки полипептида, содержащего Сн2/Сн3-область. Способ включает связывание полипептида с белком А и элюирование полипептида с градиентом pH, начинающимся с 5,0 или менее, с использованием элюирующего буфера, причем элюирующий буфер включает буфер с высоким pH и буфер с низким pH, а градиент pH образуется в результате регулирования процентного содержания каждого pH-буфера в элюирующем буфере.

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки гозерелина, включающего растворение гозерелина-сырца в водном растворе уксусной кислоты, фильтрование полученного раствора и последующую трехстадийную хроматографическую очистку: жидкостную хроматографию низкого давления на колонне с полистиролдивинилбензольным сорбентом, ионообменную хроматографию низкого давления и ВЭЖХ.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа получения удлиненного имплантата, где соотношение диаметра к длине по оси имплантата составляет между 1:20 и 1:40, для контролируемого и замедленного высвобождения аналога GnRH ацетата трипторелина.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих.
Наверх