Способ определения карнозина в биологических материалах



Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах
Способ определения карнозина в биологических материалах

 


Владельцы патента RU 2585115:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр неврологии" (ФГБНУ НЦН) (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для количественного определения карнозина в тканях и физиологических жидкостях. Определение карнозина в биологических материалах осуществляют высокоселективным методом масс-спектрометрии с применением электроспрейной ионизации. При этом предварительно осуществляют депротеинизацию плазмы крови с помощью 10% водного раствора трихлоруксусной кислоты. Затем к депротеинизированному образцу добавляют аликвоту раствора внутреннего стандарта L-аланил-карнозина. А разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм с температурой разделения 35°C и скоростью подачи элюента 0,7 мл/мин. Причем в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 3.7, и смесь ацетонитрила с 10 мМ ацетатом аммония в соотношении 90:10, взятые в процентном соотношении 10:90 соответственно. Детектирование карнозина проводят по четырем дочерним ионам с m/z 110.0, 156.1, 180.0, 210.1, образующимся в результате распада молекулярного иона карнозина с m/z 227.1. А концентрацию карнозина рассчитывают по отношению площади хроматографического пика карнозина к площади пика внутреннего стандарта - L-аланил-карнозина. Изобретение обеспечивает высокоселективный и чувствительный хроматомасс-спектрометрический метод количественного определения карнозина в биологических субстратах. 6 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для количественного определения карнозина в тканях и физиологических жидкостях для решения задач экспериментальной и клинической фармакокинетики.

Природный карнозин экстрагируется из мышц крупного рогатого скота. Один из наиболее используемых способов химического синтеза карнозина - это конденсация при низкой температуре фталоил-β-аланилхлорида с L-гистидином в присутствии триэтиламина, что приводит к синтезу фталоил-β-аланилгистидина. При удалении фталоильной группировки гидразином образуется карнозин. В литературе описаны различные способы разделения и определения карнозина, в частности с использованием титрометрического метода, тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого давления, позволяющей определять следовые количества карнозина и его производных.

На сегодняшний день известен способ количественного определения карнозина путем прямого кислотного титрования 0,1 M раствором хлороводородной кислоты с последующим потенциометрическим определением точки эквивалентности (Фадеева Д.А., Халикова М.А., Новиков О.О. Применение прямой ацидометрии для количественного определения карнозина., Научные ведомости Белгородского государственного университета, Серия: Медицина. Фармация, 2010, вып. №12-2 (93), том №22, с. 98-100). Однако данный метод не адаптирован для работы с биологическим материалом.

Наиболее близким техническим решением является способ количественного определения карнозина путем масс-спектрометрии MALDI/TOF/MS, при этом получают водный раствор карнозина, который в количестве 0,5 µl наносят на мишень и после высыхания сверху капают каплю матрицы - α-цианокоричной кислоты. При регистрации масс-спектра наблюдается наиболее интенсивный пик молекулярного иона с зарядом m/z=227,489, что соответствует протонированной форме карнозина. Чувствительность методики составляет (0,221 пикомоль (2,21*1012 моль) (Писарев Д.И., Новиков О.О., Васильев Г.В., Селютин О.А. Опыт использования метода MALDI/TOF/MS в фармацевтическом анализе., Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация, 2012, вып. №10-2 (129), том 18, с. 1-11). Однако данный метод не учитывает влияние на эффективность ионизации компонентов биологического субстрата (плазма крови, ткань мозга и др.). Таким образом, данный метод также не адаптирован для работы с биоматериалами.

Технический результат заявленного нами способа заключается в создании высокоселективного и чувствительного хроматомасс-спектрометрического метода количественного определения карнозина в биологических субстратах, высокоселективность и чувствительность которого, в частности, обусловлена учетом влияния компонентов биологических материалов на эффективность ионизации. Надежность и точность количественного определения обеспечивается применением внутреннего стандарта L-аланил-карнозина. Все перечисленное делает данный метод удобным для изучения фармакокинетики карнозина в эксперименте и в клинике.

Технический результат достигается тем, что определение карнозина в биологических материалах осуществляют путем анализа вещества высокоселективным методом масс-спектрометрии с применением электроспрейной ионизации, при этом предварительно проводят депротеинизацию плазмы крови 10% водным раствором трихлоруксусной кислоты, затем к депротеинизированному образцу добавляют аликвоту раствора внутреннего стандарта L-аланил-карнозина, разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм с температурой разделения 35°C и скоростью подачи элюента 0,7 мл/мин, при этом в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 3.7, и смесь ацетонитрила с 10 мМ ацетатом аммония в соотношении 90:10, взятыми в процентном соотношении 10:90 соответственно, детектирование карнозина проводят по четырем дочерним ионам с m/z 110.0, 156.1, 180.0, 210.1, образующимся в результате распада молекулярного иона карнозина с m/z 227.1, а его концентрацию рассчитывают по отношению площади хроматографического пика карнозина к площади пика внутреннего стандарта - L-аланил-карнозина.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве биологической матрицы используют плазму крови и гомогенат ткани головного мозга мышей. Извлечение карнозина осуществляли методом депротеинизации. К образцу плазмы крови или образцу гомогената ткани мозга (1:2, m:v, мозг : бидистиллят) объемом 100 мкл добавляют 10 мкл раствора внутреннего стандарта L-аланил-карнозина с концентрацией 200 мкг/мл. К полученной смеси приливают 400 мкл 10% водного раствора трихлоруксусной кислоты с целью преципитации протеинов плазмы. Образовавшуюся взвесь денатурированных белков осаждают на ультрацентрифуге со скоростью 13000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и переносят в хроматографическую виалу, которую помещают в автосамплер хроматографа для дальнейшего хромато-масс-спектрометрического анализа. При этом для анализа используют Хроматограф - «Finnigan Surveyor LC Pump Plus». Детектор - масс-спектрометрический детектор «LCQ Fleet MS» (квадрупольная ионная ловушка). Аналитическую колонку - Ultrasphere 5 ODS фирмы Hichrom Ltd., Великобритания (150×4,6 мм; 5 мкм). Супернатант инжектируют в петлю хроматографа в объеме 10 мкл. Подвижная фаза состоит из двух растворов: 10 мМ ацетат аммония, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 3.7 (раствор А) и ацетонитрил с 10 мМ ацетатом аммония в соотношении (90:10) (раствор Б), взятых в процентном соотношении растворов А:Б 90:10 соответственно. Работу проводят в изократическом режиме элюирования. При этом скорость потока подвижной фазы составляет 0,7 мл/мин. Объем пробы - 25 мкл. Температура разделения 35°C. Продолжительность хроматографирования - 10 минут. Время удерживания аналита - 3,15±0,05 минут. Время удерживания внутреннего стандарта L-аланил-карнозин - 3,28±0,05 минут. Детектирование: масс-спектрометрическое, по дочерним ионам с m/z 110.0, 156.1, 180.0, 210.1, образующимся в результате распада молекулярного иона карнозина с m/z 227.1 при нормализованной энергии соударений 35 eV (масс-спектр второго порядка для карнозина представлен на фигуре 1). Внутренний стандарт L-аланил-карнозин детектируют по суммарному ионному току дочерних ионов в диапазоне m/z 75-300, образующихся в результате распада молекулярного иона L-аланил-карнозина с m/z 298.3. Масс-спектрометр работает в режиме регистрации ионов, положительно заряженных электроспреем (ESI), создаваемым напряжением в 5 кВ. Скорость потока газа-небулайзера (азота): 5 л/мин, давление на распылителе - 100 psi. Температура интерфейса капилляра составляет 350°C, температура нагревателя - 300°C. Амплитуда возбуждения на концевых электродах ловушки 0,1 В. В качестве демпфирующего газа в ионной ловушке использовался гелий. Данные обрабатывались с помощью Xcalibur 2.1 w/Foimdation 1.0.1.

Были проведены определения карнозина в плазме крови и гомогенате ткани мозга.

Приготовление реактивов.

Все растворители имели квалификацию «Для хроматографии», реактивы - не ниже «ч.д.а.». Для приготовления растворов стандартных образцов использовали субстанции стандартов карнозина и аланил-карнозина производства Hamati Chemicals Ltd. Для количественного определения готовили маточные растворы стандартов карнозина и аланил-карнозина в метаноле с концентрациями 1 мг/мл. Раствор карнозина применяли для приготовления растворов рабочих стандартных образцов на плазме крови с концентрациями 3,13 мкг/мл; 6,25 мкг/мл; 12,5 мкг/мл; 25 мкг/мл; 50 мкг/мл; 100 мкг/мл; 200 мкг/мл; 400 мкг/мл; 800 мкг/мл; 1600 мкг/мл.

На основании пилотного исследования было установлено, что в мозге максимальная тканевая концентрация карнозина была значительно меньше, чем в крови. Соответственно градуировку для количественного определения карнозина получали в концентрационном диапазоне: 0,39-50 мкг/мл: 0,39 мкг/мл; 0,78 мкг/мл; 1,56 мкг/мл; 3,13 мкг/мл; 6,25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл. Раствор внутреннего стандарта с концентрацией 1 мг/мл разбавляли в 5 раз для получения рабочего раствора аланил-карнозина с концентрацией 200 мкг/мл.

Типичные хроматограммы образцов интактной плазмы крови, гомогената интактного мозга и демонстрационная хроматограмма образца гомогената ткани мозга с концентрацией карнозина 50 мкг/мл представлены на фигуре 2а, б, в. На фиг. 2а представлена хроматограмма депротеинизированного образца интактной плазмы крови. На фиг. 2б, представлена хроматограмма депротеинизированного образца ткани мозга (пик с TR=4,25 мин - пик базального карнозина). На фигуре 2в представлена хроматограмма депротеинизированного образца гомогената ткани мозга с концентрацией карнозина 50 мкг/мл, верхний пик - пик аналита, нижний пик - пик внутреннего стандарта.

Количественное определение карнозина.

По причине того, что в интактной крови мышей карнозин отсутствует, а в мозге его базальная концентрация довольно высока, а также по причине существенных отличий в матричном эффекте со стороны разных биосубстратов, было принято решение сделать две самостоятельные градуировки для карнозина в мозге и карнозина в крови. Градуировочная зависимость для карнозина в плазме крови описывалась формулой:

С=158,230602×AR, где С - концентрация карнозина (мкг/мл), AR (Area Ratio) - отношение площадей пиков аналита и внутреннего стандарта. Коэффициент корреляции составил R2=0.9986, что соответствует надлежащей аналитической аппроксимации.

Поскольку в работе использовался гомогенат ткани мозга, полученный при гомогенизации мозга мышей в дистиллированной воде, взятой в соотношении 1:2 (m:v), концентрация, полученная при определении содержания вещества в гомогенате, должна быть перемножена на 3 (С(мкг/г)=3*С(мкг/мл). Кроме того, в связи с наличием довольно высокого содержания карнозина в ткани интактного мозга, для определения содержания экзогенного карнозина был использован следующий метод перерасчета, с учетом поправки на базальный карнозин:

Сэкз=(Sобщ-Sбаз)/SIS*0,0746885, где Сэкз - концентрация экзогенного карнозина, Sобщ - площадь хроматографического пика карнозина в образце гомогената мозга животного, получавшего экзогенный карнозин, Sбаз - рассчитанная средняя площадь пика базального карнозина, SIS - площадь пика внутреннего стандарта. За площадь пика базального карнозина принимали среднее значение, рассчитанное из площадей пиков карнозина в гомогенате мозга 8-ми интактных мышей.

Калибровочные кривые представлены на фиг. 3, 4. На фиг. 3 представлена калибровочная зависимость карнозина в плазме крови. На фиг. 4 представлена калибровочная зависимость карнозина в гомогенате ткани мозга.

Точность и воспроизводимость определения карнозина в биологических материалах.

Точность выражалась в виде коэффициента вариации (% C.V.) для каждой серии образцов согласно уравнению: S D x ¯ × 100 % , где

SD - стандартное отклонение серии определений карнозина;

x ¯ - среднее арифметическое значение полученных концентраций карнозина.

Воспроизводимость измерялась как процент отклонения (% dev.) от теоретического значения по формуле: x ¯ μ ¯ μ ¯ × 100 % , где

x ¯ - среднее арифметическое значение полученных концентраций;

Для метрологической валидации полученной методики определяли точность в течение рабочего дня. Каждый из образцов, предназначенных для контроля качества, анализировали в течение 1 рабочего дня (6 определений). Также провели контроль во время исследования и после его окончания.

Результаты представлены в таблице 1 и 2.

Относительная ошибка определения карнозина не превышала 10%.

Таким образом, заявленный способ обладает высокой селективностью и чувствительностью, не требует проведения многочисленных предварительных химических реакций и не предусматривает использование большого количества химических реактивов.

Высокая точность и воспроизводимость биоаналитического метода количественного определения карнозина в биологических жидкостях и тканях обеспечивает идентификацию вещества с установленными характеристиками погрешности, что позволяет использовать данную методику как в экспериментальной, так и клинической фармакокинетике.

Способ определения карнозина в биологических материалах, включающий анализ вещества высокоселективным методом масс-спектрометрии с применением электроспрейной ионизации, отличающийся тем, что предварительно осуществляют депротеинизацию плазмы крови с помощью 10% водного раствора трихлоруксусной кислоты, затем к депротеинизированному образцу добавляют аликвоту раствора внутреннего стандарта L-аланил-карнозина, разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм с температурой разделения 35°C и скоростью подачи элюента 0,7 мл/мин, при этом в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 3.7, и смесь ацетонитрила с 10 мМ ацетатом аммония в соотношении 90:10, взятые в процентном соотношении 10:90 соответственно, детектирование карнозина проводят по четырем дочерним ионам с m/z 110.0, 156.1, 180.0, 210.1, образующимся в результате распада молекулярного иона карнозина с m/z 227.1, а его концентрацию рассчитывают по отношению площади хроматографического пика карнозина к площади пика внутреннего стандарта - L-аланил-карнозина.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Сущность способа состоит в том, что проводят количественное определение в ядрах сперматозоидов тиоловых групп.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации.

Изобретение относится к области нанотехнологий и молекулярной биологии. Предложен способ детекции проникновения углеродных нанотрубок (УНТ) в биологическую ткань, геном клеток которой содержит промотор гена теплового шока, сшитый с кодирующей областью дрожжевого транскрипционного фактора Gal4, и генетическую репортерную конструкцию UAS-GFP.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования течения энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) путем обработки сыворотки крови 20% раствором поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000) при объемном соотношении сыворотка: ПВП (1:0,84), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, агрегаты ммЛНП осаждают центрифугированием, декантируют, осадок ммЛНП растворяют в буфере без ПВП, добавляют аутологичные отмытые стандартизованные эритроциты человека, инкубируют в течение 48 часов при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 620 нм, по калибровочному графику определяют степень лизиса и при лизисе более 10% констатируют повышенную литическую активность ммЛНП.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для неинвазивного определения сахара в крови. Для этого осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, при этом в качестве пробы применяют дозу слюны пациента, а в качестве реагента используют первичный конгломерат монореактива Глюкоза-Ново, где глюкозооксидаза дополнительно содержит мутаротазу.

Изобретение относится к поглощающему изделию, выполненному с возможностью определения ионной силы мочи. Изделие включает непроницаемый для жидкости слой; проницаемый для жидкости слой; поглощающий внутренний слой, расположенный между непроницаемым для жидкости слоем и проницаемым для жидкости слоем; устройство с латеральным потоком, интегрированное в изделие и расположенное таким образом, что оно находится в жидкостном соединении с потоком мочи, выделяемой пользователем изделия.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и представляет собой бактериальную клетку, способную реплицироваться в среде, содержащей по меньшей мере один тяжелый металл, выбранный из ртути, кадмия, цинка и свинца.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения кислотной устойчивости эритроцитов. Способ заключается в том, что в пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (трилон Б) из расчета 10 мкл на 2 мл крови.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих.

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к определению флуниксина в лекарственных препаратах. При осуществлении способа в ацетатно-аммиачный буферный раствор с рН 7.0-7.8 добавляют Твин-80 до концентрации 1·10-2 М, соль тербия Tb3+ до концентрации 1·10-3 М, лекарственный препарат триоктилфосфиноксид до концентрации 1·10-4 М, облучают раствор электромагнитным излучением с длиной волны λвозб=347 нм и по наличию флуоресценции на длине волны λфл=545 нм судят о наличии флуниксина.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения амина в образце. Сущность способа заключается в контактировании образца, содержащего амин, с раствором соли, содержащей 2,2',2”,6,6',6”-гексаметокситритильный карбокатион, и последующем определении конъюгатов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для поиска точки с дробным эффектом при определении эффективных доз веществ методом «одной точки» путем экспериментального определения зачетной дробной точки при введении животным вещества с n-кратным изменением последовательно вводимых доз с последующим расчетом дозы с заданным дробным эффектом по функции наклона линии токсичности.

Изобретение относится к аналитической химии и фармацевтике и описывает способ извлечения пролина из водных растворов, включающий приготовление водно-солевого раствора пролина путем его растворения в насыщенном растворе высаливателя, экстракцию и анализ равновесной водной фазы, где экстракцию пролина осуществляют раствором водорастворимого полимера, а именно сополимера поли-N-винилкапролактам-N-винилимидазол (ПВК-ВИ) в дистиллированной воде с концентрацией 1,15-1,20 г/см3 в течение 7-10 мин из водно-солевого раствора пролина, который имеет рН 9,7±0,3, при этом соотношение объемов водно-солевого раствора пролина и экстрагента 5:2 и в качестве высаливателя применяют раствор сульфата аммония, далее отделяют водно-солевую фазу от органической и анализ проводят методом УФ-спектрофотометрии при длине волны 450 нм, по градуировочному графику находят концентрацию пролина в анализируемом водном растворе, рассчитывают коэффициент распределения (D) и степень извлечения пролина (R, %).

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации азотсодержащих противомикробных препаратов (изиниазида, этамбутола и др.) и антибиотиков (цефалоспоринового ряда - цефазолина, цефатоксима, цефуроксима, цефалексина и др.) в исследуемых жидких средах.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу количественного определения тетрациклических тритерпенов в сырье чаги или препарате чаги.
Изобретение относится к области фармацевтики и представляет собой способ скрининга агента, пригодного для лечения синдрома сухого глаза и/или поражения роговицы и конъюнктивы при синдроме сухого глаза 3-й и более степени, который включает приготовление кроличьей модели поражения роговицы и конъюнктивы путем абразии эпителия роговицы и конъюнктивы инстилляцией раствора n-гептанола в глаз кролика; и введение испытуемого агента в глаз кролика модели и оценку эффекта восстановления ткани роговицы под действием испытуемого агента, в котором наносимый объем раствора n-гептанола составляет всего от 0,03 до 0,05 мл, который капают 2-4 раза, и в котором кролика заставляют моргать 2-4 раза, в котором стадия приготовления дополнительно включает принуждение кролика к закрытию глаза на период от около 1 до около 3 минут после инстилляции раствора n-гептанола в глаз.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного расстройства. Сущность способа состоит в том, что способ включает измерение в крови десмостерола, бета-амилоида, гельсолина.

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации водорастворимого лекарственного вещества путем сравнения с эталоном. Способ характеризуется проведением ионометрии, титрометрии и спектрофотометрии, при этом ионометрические исследования проводят с использованием различных концентраций лекарственного вещества, начиная от насыщенного раствора с уменьшением концентрации идентифицируемого вещества в каждом последующем растворе кратно по сравнению с предыдущим, титрометрические зависимости измеряют в различных концентрациях идентифицируемого лекарственного вещества, начиная от насыщенного раствора с уменьшением концентрации в каждом последующем титруемом растворе ниже, чем в предыдущем, в кратное число раз, титрующий раствор вводят равномерно в течение всего процесса титрования, дополнительное измерение спектрофотометрических зависимостей проводят не менее чем в двух разных концентрациях: насыщенного раствора и разбавленного в 10-20 раз, а измерения спектрофотометрических зависимостей проводят в двух растворителях: бидистиллированной воде и ином растворителе из ряда спиртов.

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения бенз(а)пирена в крови, для оценки риска здоровью человека и разработки мероприятий по обеспечению химической безопасности.
Наверх